МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФАКТОР IX, А ТАКЖЕ КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В КЛЕТКИ, ОРГАНЫ И ТКАНИ Российский патент 2024 года по МПК C12N9/64 C12N15/52 A61K38/48 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая патентная заявка заявляет приоритет на основании патентной заявки США № 62/183599, поданной 23 июня 2015 года, заявки № 62/315453, поданной 30 марта 2016 года, заявки № 62/338315, поданной 18 мая 2016 года, заявки № 62/348781, поданной 10 июня 2016 года, и заявки № 62/349572, поданной 13 июня 2016 года, где все указанные заявки специально включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

ВВЕДЕНИЕ

[0002] Генетические расстройства, вызванные отсутствием или дефектом нужного гена (потеря функции), или экспрессией нежелательного или дефектного гена (добавление функции), приводят к разным заболеваниям. Одним из примеров генетического расстройства с потерей функции является гемофилия, наследственное нарушение свертываемости крови, вызываемое дефицитом фактора коагуляции VIII (FVIII, гемофилия A) или фактора коагуляции IX (FIX, гемофилия B). Одним из примеров генетического расстройства с добавлением функции является болезнь Хантингтона, заболевание, вызываемое патологическим геном "HTT" (кодирует белок хантингтин), который кодирует мутантный белок, накапливающийся внутри нейронов и приводящий к постепенному их разрушению, особенно в базальных ганглиях и коре головного мозга.

[0003] Существующий в настоящее время способ лечения гемофилии включает внутривенное введение рекомбинантного фактора свертывания либо при необходимости, в случае кровотечения, либо профилактически. Однако данный терапевтический подход имеет несколько недостатков, таких как необходимость повторных инфузий, стоимость лечения, риск развития иммунных реакций против терапевтического фактора и риск потенциально смертельных кровотечений. Указанные ограничения простимулировали разработку способов генной терапии для лечения гемофилии. В данной связи гемофилия является идеальной мишенью для терапии, в основе которой лежит перенос генов, поскольку: 1) терапевтическое окно является очень широким, так как уровни, составляющие чуть более 1% от нормального уровня, уже могут привести к изменению фенотипа от тяжелого до умеренного, а уровни, соответствующие 100%, не вызывают никаких побочных эффектов; 2) отсутствуют строгие требования по тканеспецифичной экспрессии терапевтического трансгена; и 3) имеется значительный опыт в измерении конечных критериев терапевтической эффективности.

[0004] В настоящее время для переноса генов предпочтительно используют векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), поскольку они имеют наилучший профиль безопасности и эффективности при доставке генов in vivo. Из серотипов AAV, выделенных до настоящего момента, AAV2 и AAV8 используют для направления на печень людей, страдающих от тяжелой гемофилии B.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение предлагает нуклеотидные последовательности, векторы экспрессии (например, векторные геномы) и плазмиды, композиции и вирусные векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX (например, человеческий фактор IX). Нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, модифицируют, чтобы уменьшить число динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин) по сравнению со стандартной последовательностью, кодирующей FIX. В конкретном варианте осуществления модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, содержит меньше динуклеотидов CpG, чем последовательность дикого типа или нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.

[0002] Модифицированные нуклеиновые кислоты, кодирующие фактор IX, такие как FIX, модифицированные путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин), можно вводить в состав векторов, таких как вирусные векторы. Примеры вирусных векторов включают ленти- и парвовирусные векторы (например, аденовирусные векторы или векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV)), которые могут быть направлены, например, на клетки печени, среди клеток других типов. Векторы AAV, используемые для доставки нуклеотидных последовательностей, управляют экспрессией полинуклеотидов в клетках. Полинуклеотиды, кодирующие белки, такие как модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, после введения могут необязательно экспрессироваться на терапевтических уровнях.

[0003] Соответственно, изобретение предлагает рекомбинантные векторы на основе AAV, содержащие векторные геномы (заключенные в капсид, упакованные), которые, в свою очередь, содержат модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантная частица AAV содержит заключенный в капсид или упакованный векторный геном. Такие рекомбинантные частицы AAV настоящего изобретения включают геном вирусного вектора, который содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX, модифицированную путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин)). В одном варианте осуществления векторный геном, который содержит модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX, модифицированную путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин), заключен или упакован в капсид AAV или в вариант капсида AAV.

[0004] Гетерологичная полинуклеотидная последовательность, входящая в состав рекомбинантных векторов AAV настоящего изобретения, может транскрибироваться и затем транслироваться в белок. В разных аспектах гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок. В конкретных аспектах белок представляет собой фактор свертывания крови (например, фактор IX, фактор XIII, фактор X, фактор VIII, фактор VIIa или белок C). В более конкретных аспектах вектор содержит модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX (например, модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX, модифицированную путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин)).

[0005] AAV и варианты AAV, такие как капсидные варианты, могут доставлять полинуклеотиды и/или белки, которые обеспечивают желательное или терапевтическое улучшение и тем самым позволяют лечить разные заболевания. Например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, а также их варианты и капсидные варианты AAV (например, 4-1) представляют собой векторы, подходящие для доставки клеткам, тканям и органам терапевтических генов (например, фактора IX) для лечения гемофилии А, В и др.

[0006] Рекомбинантные вирусные и AAV-векторы настоящего изобретения, содержащие (заключенный в капсид или упакованный) векторный геном (геном вируса или AAV), также содержат дополнительные элементы, которые функционируют как цис- или транс-элементы. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор, содержащий (заключенный в капсид или упакованный) векторный геном, также содержит: одну или несколько последовательностей инвертированных концевых повторов (ITR), которые фланкируют 5'- или 3'-конец гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующий фактор IX, такой как FIX, модифицированная путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин)); элемент, регулирующий экспрессию, который управляет транскрипцией (например, промотор или энхансер) гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующий фактор IX, такой как FIX, модифицированная путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин)), такой как конститутивный или регулируемый регулирующий элемент, или тканеспецифичный регулирующий элемент; интронную последовательность, спейсерную или филлерную полинуклеотидную последовательность; и/или последовательность полиаденилирования, расположенную на 3'-конце гетерологичной полинуклеотидной последовательности.

[0007] Соответственно, векторы могут дополнительно содержать интрон, элемент, регулирующий экспрессию (например, конститутивный или регулируемый регулирующий элемент, или тканеспецифичный элемент, регулирующий экспрессию, или промотор, например, обеспечивающий экспрессию в печени, такой как промотор человеческого α1-антитрипсина (hAAT) и/или энхансер HCR-1 и/или HCR-2 аполипопротеина E (ApoE)), один или несколько инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) (например, последовательность ITR любого из следующих серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8) и/или филлерную полинуклеотидную последовательность. Положение таких дополнительных элементов может варьировать. В конкретных аспектах интрон находится внутри последовательности, кодирующей человеческий белок FIX, и/или элемент, регулирующий экспрессию, функционально связан с последовательностью, кодирующей человеческий белок FIX, и/или ITR AAV фланкирует (фланкируют) 5'- или 3'-конец последовательности, кодирующей человеческий белок FIX, и/или филлерная полинуклеотидная последовательность фланкирует 5'- или 3'-конец последовательности, кодирующей человеческий белок FIX.

[0008] В разных вариантах осуществления нуклеиновая кислота FIX, модифицированная путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин), может содержать на 1-5 меньше, на 5-10 меньше, на 10-15 меньше, на 15-20 меньше, на 20-25 меньше, на 25-30 меньше, на 30-40 меньше, 40-55, 55-75, меньше, на 75-100, 100-150 меньше, на 150-200 меньше динуклеотидов CpG, чем нативная последовательность или последовательность дикого типа, кодирующая человеческий фактор IX. В конкретных аспектах нуклеиновая кислота FIX, модифицированная, как указано в настоящем документе, кодирует человеческий белок FIX, который экспрессируется на уровне, превышающем уровень экспрессии, или равном уровню экспрессии последовательности дикого типа или нативной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, в которой число динуклеотидов CpG не уменьшено.

[0009] В дополнительных вариантах осуществления интрон, элемент, регулирующий экспрессию (например, конститутивный или регулируемый регулирующий элемент или тканеспецифичный элемент, регулирующий экспрессию, или промотор, например, обеспечивающий экспрессию в печени, такой как промотор человеческого α1-антитрипсина (hAAT) и/или энхансер HCR-1 и/или HCR-2 аполипопротеина E (ApoE)), один или несколько инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) (например, последовательность ITR одного из следующих серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8), и/или филлерную полинуклеотидную последовательность можно модифицировать путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин) по сравнению с нативными или дикого типа элементами, регулирующими экспрессию, инвертированными концевыми повторами (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или филлерными полинуклеотидными последовательностями. В конкретных аспектах число динуклеотидов CpG в элементе, регулирующем экспрессию, инвертированном концевом повторе (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или филлерной полинуклеотидной последовательности на 1-5 меньше, на 5-10 меньше, на 10-15 меньше, на 15-20 меньше, на 20-25 меньше, на 25-30 меньше, на 30-40 меньше, на 40-55 меньше, на 55-75 меньше, на 75-100 меньше, на 100-150 меньше, на 150-200 меньше, чем в соответствующей нативной последовательности или последовательности дикого типа.

[0010] Типичные векторы AAV содержат капсидную последовательность одного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV1, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, или вариант капсида AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8. Рекомбинантные частицы AAV настоящего изобретения также включают AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты. Конкретные капсидные варианты включают, например, варианты последовательностей капсидов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, содержащие замены, делеции или вставки/добавления аминокислот. В конкретных аспектах замену осуществляют в капсидной последовательности VP1 Rh74 (SEQ ID NO: 1), например, по любому из аминокислотных положений 195, 199, 201 или 202. В более конкретных аспектах замещенные остатки соответствуют аминокислотам A, V, P или N в любом из аминокислотных положений 195, 199, 201 или 202 последовательности капсида VP1 Rh74. В других конкретных аспектах капсидная последовательность содержит остаток А в аминокислотном положении 195; остаток V в аминокислотном положении 199, остаток P в аминокислотном положении 201 или остаток N в аминокислотном положении 202 капсидной последовательности VP1 Rh74. В других конкретных аспектах капсидная последовательность содержит любые две, три или все четыре из следующих модификаций: остаток А в аминокислотном положении 195; остаток V в аминокислотном положении 199, остаток P в аминокислотном положении 201 или остаток N в аминокислотном положении 202 капсидной последовательности VP1 Rh74.

[0011] В более конкретных аспектах вариант капсида содержит одну из последовательностей SEQ ID NO: 4-9. В других вариантах осуществления вектор AAV содержит капсидную последовательность VP1, VP2 и/или VP3 AAV, на 90% или более идентичную последовательности VP1, VP2 и/или VP3 любого серотипа AAV. В конкретных аспектах вектор AAV содержит капсидную последовательность VP1, VP2 и/или VP3, на 90% или более идентичную последовательностям VP1, VP2 и/или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8. В более конкретных аспектах вектор AAV содержит капсидную последовательность VP1, VP2 или VP3, полученную из любого из следующих серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV1, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

[0012] В других вариантах осуществления рекомбинантный векторный геном содержит модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX, модифицированная путем уменьшения числа динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин), и филлерную или спейсерную полинуклеотидную последовательность. В конкретных аспектах модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, имеет длину менее чем примерно 4,7 т.о. В других конкретных аспектах модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, имеет длину менее 4,7 т.о. и фланкируется одним или несколькими ITR AAV, или располагается в рамке из двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV). В дополнительных конкретных аспектах филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая при объединении с длиной модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, обеспечивает суммарную общую длину последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, и филлерной или спейсерной полинуклеотидной последовательности в диапазоне, составляющем примерно 3,0-5,5 т.о., или примерно 4,0-5,0 т.о., или примерно 4,3-4,8 т.о.

[0013] Филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность может находиться в любом желательном положении векторной последовательности, при условии, что при этом она не препятствует функции или активности вектора. В одном аспекте филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена между 5' и/или 3' ITR (например, ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 или их вариантов), которые фланкируют соответствующие 5'- и/или 3'-концы последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин). В другом аспекте филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность располагается внутри 5' и/или 3' ITR, которые фланкируют соответствующие 5'- и/или 3'-концы последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG. В другом аспекте филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность примыкает к 5' и/или 3' ITR, который фланкирует соответствующие 5'- и/или 3'-концы последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG. В следующем аспекте филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность находится внутри последовательности модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, например, аналогично интрону в геномной нуклеиновой кислоте.

[0014] Соответственно, в разных вариантах осуществления филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность примыкает к последовательности ITR AAV; находится внутри двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV); находится вне двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV); или присутствуют две филлерные или спейсерные полинуклеотидные последовательности, из которых первая филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность находится внутри двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV), а вторая филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность находится вне двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV).

[0015] В более конкретных аспектах филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая при объединении с длиной модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, обеспечивает суммарную общую длину гетерологичной полинуклеотидной последовательности и филлерной или спейсерной полинуклеотидной последовательности в диапазоне, составляющем примерно 3,0-5,5 т.о., или примерно 4,0-5,0 т.о., или примерно 4,3-4,8 т.о., если она находится в пределах двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV). В других более конкретных аспектах филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину более 4,7 т.о., примерно от 5,0 до 10,0 т.о., или примерно от 6,0 до 8,0 т.о., если она находится вне двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV).

[0016] Как правило, филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность является инертной или нетоксичной и не имеет функции или активности. В разных конкретных аспектах филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность не является бактериальной полинуклеотидной последовательностью, филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность не является последовательностью, которая кодирует белок или пептид, филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность представляет собой последовательность, отличную от любой из: гетерологичной полинуклеотидной последовательности (такой как модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX), последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, элемент, регулирующего экспрессию, точки начала репликации, селектируемого маркера или сигнальной последовательности полиаденилирования (полиA).

[0017] В разных других конкретных аспектах филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность представляет собой последовательность интрона, родственную или неродственную гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, модифицированной нуклеиновой кислоте, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG). В конкретных аспектах последовательность интрона находится внутри гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG). В других конкретных аспектах последовательность интрона является родственной гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, модифицированной нуклеиновой кислоте, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG), поскольку интрон находится в геномной ДНК, такой как геномная ДНК, кодирующая белок, который также кодируется гетерологичной полинуклеотидной последовательностью (такой как модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX).

[0018] Рекомбинантные ленти- и парвовирусные (например, AAV) векторы настоящего изобретения, такие как частицы AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8, и их вариантов, таких как капсидные варианты (например, 4-1), которые содержат (заключенный в капсид, упакованный) рекомбинантный геном вектора AAV, можно ввести в клетки. В таких вариантах осуществления клетки могут включать упаковывающие клетки, которые могут продуцировать вирусные частицы (AAV), или которые могут быть подвергнуты лизису с получением вирусных частиц (AAV), или клетки-мишени, в которых желательно экспрессировать гетерологичную полинуклеотидную последовательность. Соответственно, изобретение относится к клеткам, которые содержат модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, векторы и ленти- или парвовирусные векторы (например, AAV), такие как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты (например, такие как 4-1).

[0019] В других вариантах осуществления композиция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий белок FIX, где указанная нуклеиновая кислота содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с нативной последовательностью, кодирующей человеческий фактор IX, или вектор или плазмиду, обеспечивающие экспрессию и содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок FIX, где указанная нуклеиновая кислота содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с нативной последовательностью, кодирующей человеческий фактор IX. В конкретном аспекте такие нуклеотидные последовательности могут входить в состав фармацевтической композиции. Соответственно, в состав фармацевтических композиций могут входить рекомбинантные ленти- и парвовирусные (например, AAV) векторы настоящего изобретения, такие как частицы AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их вариантов (например, 4-1), которые содержат (заключенный в капсид, упакованный) векторный геном. Такие композиции можно использовать для введения индивидууму рекомбинантных векторных (например, AAV) и вирусных частиц, таких как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVl1, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты (например, 4-1), которые содержат (заключенный в капсид, упакованный) векторный (например, AAV) геном.

[0020] Рекомбинантные ленти- и парвовирусные векторы настоящего изобретения (например, AAV), такие как частицы AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их вариантов (например, таких как 4-1), содержащие (заключенный в капсид, упакованный) векторный геном, могут использоваться в разных способах и могут иметь разное применение. Соответственно, изобретение предлагает способы и варианты применения для доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CdG) в организм или клетку, например, в организм или клетку млекопитающего.

[0021] В одном варианте осуществления способ или применение включает введение ленти- или парвовирусного вектора (например, AAV), такого как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты, который содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG) в векторном геноме (заключенную в капсид, упакованную), в организм или клетку млекопитающего в условиях, подходящих для доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности в организм или клетку млекопитающего. В одном аспекте способ или применение обеспечивает перенос/доставку гетерологичного полинуклеотида (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG) в организм и/или клетку млекопитающего. В другом аспекте способ обеспечивает перенос/доставку гетерологичного полинуклеотида (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG) в клетку, последующую транскрипцию с образованием транскрипта и трансляцию с образованием генного продукта (такого как фактор IX).

[0022] В других вариантах осуществления способ или применение предназначается для лечения индивидуума (например, млекопитающего), дефицитного по экспрессии или функции белка, или нуждающегося в экспрессии или функции белка, и включает получение ленти- или парвовирусного (например, AAV) вектора, такого как частица AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8, или одного из их вариантов, или совокупности таких вирусных (например, AAV) частиц, или фармацевтической композиции, содержащей частицу ленти- или парвовирусного (например, AAV) вектора, такого как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVl1, Rh10, Rh74, AAV-2i8, или один из их вариантов, или совокупность таких вирусных (например, AAV) частиц; и введение вирусной частицы, совокупности вирусных частиц или фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу или совокупность вирусных частиц, индивидууму (например, млекопитающему). Введенная таким образом гетерологичная полинуклеотидная последовательность (например, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, такая как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG), может затем экспрессироваться в организме индивидуума (например, млекопитающего).

[0023] Способы и варианты применения, предназначенные для введения или доставки, включают любой режим, совместимый с индивидуумом. В конкретных вариантах осуществления ленти- или парвовирусный (например, AAV) вектор, такой как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты, или совокупность таких вирусных частиц, вводят или доставляют парентерально, например внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно или через катетер.

[0024] Индивидуумы включают млекопитающих, таких как люди и отличные от людей млекопитающие (например, приматы). В конкретных вариантах осуществления у индивидуума улучшается состояние в результате экспрессии гетерологичной полинуклеотидной последовательности, или индивидуум нуждается в экспрессии указанной последовательности. В более конкретном варианте осуществления состояние индивидуума, такого как индивидуум, в организме которого экспрессируется пониженное количество фактора IX, например, индивидуум с гемофилией B, улучшается благодаря экспрессии или функции фактора IX.

[0025] Настоящее изобретение предлагает способы получения рекомбинантных ленти- и парвовирусных (например, AAV) векторов, таких как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты, которые содержат (заключенный в капсид, упакованный) векторный геном. В одном варианте осуществления способ включает введение в упаковывающую клетку рекомбинантной векторной (например, AAV) плазмиды с достижением продуктивной вирусной инфекции; и культивирование упаковывающих клеток в условиях, обеспечивающих продукцию рекомбинантных вирусных частиц. В другом варианте осуществления способ получения рекомбинантных вирусных частиц или частиц AAV, позволяющий достичь продукции пониженного количества рекомбинантных вирусных частиц, содержащих рекомбинантный вирусный вектор, несущий загрязняющую нуклеиновую кислоту, включает введение в упаковывающую клетку рекомбинантной векторной (например, AAV) плазмиды; и культивирование упаковывающих клеток в условиях, обеспечивающих продукцию рекомбинантных вирусных частиц, где полученные рекомбинантные вирусные частицы содержат уменьшенное число вирусных частиц, векторные геномы которых содержат загрязняющую нуклеиновую кислоту, по сравнению с числом вирусных частиц, содержащих загрязняющую нуклеиновую кислоту, образующихся при использовании рекомбинантного вирусного вектора, который не содержит филлерной или спейсерной полинуклеотидной последовательности. В конкретных аспектах загрязняющая нуклеиновая кислота представляет собой бактериальную нуклеиновую кислоту; или последовательность, отличную от гетерологичной полинуклеотидной последовательности или последовательностей ITR, промотора, энхансера, точки начала репликации, полиаденилирования или селектируемого маркера.

[0026] Упаковывающие клетки включают клетки млекопитающих. В конкретных вариантах осуществления упаковывающая клетка способна выполнять вспомогательные (например, AAV) функции, обеспечивающие упаковку (гетерологичной полинуклеотидной) последовательности (например, модифицированный нуклеиновой кислоты, кодирующий фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG), вектора экспрессии (например, векторного генома), в вирусной частице (такой как частица AAV). В конкретных аспектах упаковывающая клетка продуцирует белки Rep и/или Cap AAV (например, белки Rep78 или/и Rep68); упаковывающая клетка стабильно или временно трансфицирована полинуклеотидом (полинуклеотидами), кодирующим последовательность (последовательности) белка Rep и/или Cap; и/или упаковывающая клетка стабильно или временно трансфицирована полинуклеотидной последовательностью (полинуклеотидными последовательностями), кодирующей Rep78 и/или Rep68.

[0027] В изобретении рекомбинантные ленти- или парвовирусные (например, AAV) векторы и сопутствующие цис-элементы (например, элементы, регулирующие экспрессию, ITR, полиA) или транс-элементы (например, капсидные белки, белки, выполняющие упаковывающие функции, такие как белок Rep/Cap), могут соответствовать любому организму, виду, штамму или серотипу. Для получения рекомбинантных вирусных (например, AAV) частиц настоящего изобретения обычно используют AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8 и их варианты, однако также можно использовать гибриды или химеры разных серотипов. Примеры серотипов AAV включают, без ограничений, серотипы AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 и AAV-2i8. Соответственно, рекомбинантные вирусные (например, AAV) частицы настоящего изобретения, несущие векторные геномы, могут содержать капсидный белок, который является белком другого серотипа, смеси серотипов или гибридом или химерой разных серотипов, такой как капсидный белок VP1, VP2 или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8. Кроме того, рекомбинантные ленти- или парвовирусные (например, AAV) векторы, такие как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV1, Rh10, Rh74 и AAV-2i8, последовательности, плазмиды, векторные геномы, могут содержать элементы, относящиеся к одному серотипу, смеси серотипов или гибридам или химерам разных серотипов. В разных вариантах осуществления рекомбинантный вектор AAV содержит: ITR, Cap, Rep и/или последовательность, полученную из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 и/или AAV-2i8, или из смеси, гибрида или химеры каких-либо из вышеуказанных серотипов AAV.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0028] На фигуре 1 показана аминокислотная последовательность VP1 Rh74.

[0029] На фигуре 2 показана аминокислотная последовательность VP2 Rh74.

[0030] На фигуре 3 показана аминокислотная последовательность VP3 Rh74.

[0031] На фигуре 4 показана аминокислотная последовательность капсидного варианта 4-1 белка VP 1.

[0032] На фигуре 5 показана аминокислотная последовательность капсидного варианта 15-1.

[0033] На фигуре 6 показана аминокислотная последовательность капсидного варианта 15-2.

[0034] На фигуре 7 показана аминокислотная последовательность капсидного варианта 15-3/15-5.

[0035] На фигуре 8 показана аминокислотная последовательность капсидного варианта 15-4.

[0036] На фигуре 9 показана аминокислотная последовательность капсидного варианта 15-6.

[0037] На фигуре 10 показана нуклеотидная последовательность FIX39.

[0038] На фигуре 11 показана нуклеотидная последовательность FIX19.

[0039] На фигуре 12А показана последовательность плазмиды FIX39.

[0040] На фигуре 12В показана последовательность плазмиды phFIX39v2.

[0041] На фигуре 13 показана карта плазмиды FIX39.

[0042] На фигуре 14 показана нуклеотидная последовательность интрона A.

[0043] На фигуре 15 показана нуклеотидная последовательность FIX39+интрон A.

[0044] На фигуре 16 показана эффективность трансдукции капсидного варианта AAV-4-1 (SEQ ID NO: 4), определенная с помощью анализа in vitro.

[0045] На фигуре 17 показаны уровни hFIX в плазме мышей дикого типа после внутривенной инъекции на 8-й неделе жизни 1×10¹¹ или 1×10¹² вг/кг AAV-FIX39-Padua (квадраты/кружки) и AAV-FIX19-Padua (ромбы/шестиугольники). Уровни человеческого FIX в плазме определяют методом ELISA и представляют в виде результатов нескольких измерений в ряде образцов крови, полученных от животных одной группы на протяжении исследования (n=5 мышей в каждой группе). Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку среднего значения.

[0046] На фигуре 18 показаны уровни человеческого FIX в плазме крови мышей через 24 часа после гидродинамической инъекции в хвостовую вену 5 мкг плазмид pFIX19-Padua или pFIX39-Padua. Р=0,3337.

[0047] На фигуре 19 приведены сводные данные, полученные от четырех пациентов-людей, страдающих от гемофилии B, получивших однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, и активность FIX (%) в течение последующих периодов наблюдения (183, 102, 69 и 50 дней, соответственно).

[0048] На фигуре 20А приведены значения активности FIX (%), определенные у первого пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 183-дневного периода наблюдения.

[0049] На фигуре 20B показаны результаты тестирования функции печени (уровни ферментов ALT, AST и LDH) у первого пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 183-дневного периода наблюдения. При построении графика значения LDH (LDH1) делят на 10, чтобы показать вместе со значениями ALT и AST.

[0050] На фигуре 21А приведены значения активности FIX (%), определенные у второго пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 102-дневного периода наблюдения.

[0051] На фигуре 21B показаны результаты тестирования функции печени (уровни ферментов ALT, AST и LDH) у второго пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 102-дневного периода наблюдения. При построении графика значения LDH (LDH1) делят на 10, чтобы показать вместе со значениями ALT и AST.

[0052] На фигуре 22А приведены значения активности FIX (%), определенные у третьего пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 69-дневного периода наблюдения.

[0053] На фигуре 22B показаны результаты тестирования функции печени (уровни ферментов ALT, AST и LDH) у третьего пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 69-дневного периода наблюдения. При построении графика значения LDH (LDH1) делят на 10, чтобы показать вместе со значениями ALT и AST.

[0054] На фигуре 23А приведены значения активности FIX (%), определенные у четвертого пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 50-дневного периода наблюдения.

[0055] На фигуре 23B показаны результаты тестирования функции печени (уровни ферментов ALT, AST и LDH) у четвертого пациента-человека с гемофилией В, получившего однократную инфузию вектора, несущего вариант AAV-FIX Padua (FIX39) настоящего изобретения, в течение 50-дневного аналитического периода. При построении графика значения LDH (LDH1) делят на 10, чтобы показать вместе со значениями ALT и AST.

[0056] На фигуре 24А показан профиль низкой иммуногенности AAV-FIX39-Padua у людей.

[0057] На фигуре 24В показан сравнительный профиль иммуногенности AAV-FIX39-Padua и AAV8-FIX19 у людей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0058] Изобретение основано, по меньшей мере, частично, на разработке модифицированных нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки, такие как человеческий белок FIX. В разных вариантах осуществления модифицированная нуклеиновая кислота содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG (цитозин-гуанин) по сравнению со стандартной нуклеиновой кислотой, кодирующей фактор IX, такой как нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX. В других вариантах осуществления такие модифицированные нуклеиновые кислоты, содержащие уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению со стандартной нуклеиновой кислотой, кодирующей фактор IX (такой как нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX), входят в состав экспрессирующих векторов (например, векторных геномов) или плазмид.

[0059] Изобретение также относится к композициям, таким как композиции, содержащие модифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий FIX. В таких композициях модифицированная нуклеиновая кислота содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению со стандартной последовательностью, такой как нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX. Композиции также содержат экспрессирующие векторы (например, вирусные векторы/векторные геномы) и плазмиды, в состав которых входят такие модифицированные нуклеотидные последовательности, кодирующие человеческий белок FIX, содержащие уменьшенное число динуклеотидов CpG.

[0060] В конкретных аспектах нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержит на 1-5 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 5-10 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 10-15 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 15-20 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 20-25 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 25-30 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 30-40 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она содержит на 40-55 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная (дикого типа) последовательность, кодирующая человеческий фактор IX; или она совсем не содержит динуклеотидов CpG.

[0061] Модифицированные нуклеиновые кислоты, кодирующие фактор IX, такие как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, могут также содержать один или несколько дополнительных цис-элементов. Примеры цис-элементов включают, без ограничения, элементы, регулирующие экспрессию, интроны, ITR, стоп-кодоны, последовательности полиА и/или филлерные полинуклеотидные последовательности. В конкретных вариантах осуществления такие цис-действующие элементы также могут быть модифицированы. Например, цис-действующие элементы, такие как элементы, регулирующие экспрессию, интроны, ITR, последовательности полиА и/или филлерные полинуклеотидные последовательности, могут содержать уменьшенное число динуклеотидов CpG. В одном аспекте один или несколько цис-действующих элементов, таких как элементы, регулирующие экспрессию, интроны, ITR, последовательности полиА и/или филлерные полинуклеотидные последовательности, не содержат динуклеотиды CpG. В конкретных аспектах один или несколько цис-действующих элементов, таких как элементы, регулирующие экспрессию, интроны, ITR, последовательности полиА и/или филлерные полинуклеотидные последовательности, содержат на 1-5 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 5-10 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 10-15 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 15-20 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 20-25 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 25-30 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 30-40 CpG динуклеотидов меньше, чем стандартный цис-действующий элемент; или содержат на 40-55 динуклеотидов CpG меньше, чем стандартный цис-элемент; или не содержат нуклеотиды CpG.

[0062] Изобретение также относится к вирусным векторам, содержащим модифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий белок FIX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG. В конкретных вариантах осуществления вектор включает ленти- или парвовирусный вектор, такой как аденовирусный вектор. В более конкретном варианте осуществления модифицированная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, такая как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, входит в состав вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

[0063] В других конкретных вариантах осуществления векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) содержат капсиды, полученные из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 и AAV-2i8, а также их вариантов (например, вариантов капсидов, полученных путем вставок, добавлений и замен аминокислот). Рядовым специалистам в данной области известно, что капсиды AAV обычно содержат белок VP1 и два более коротких белка, называемых VP2 и VP3, которые по существу являются результатом усечения VP1 по амино-концу. В зависимости от капсида и других факторов, известных рядовым специалистам, три капсидных белка VP1, VP2 и VP3 обычно присутствуют в капсиде в соотношении, составляющем примерно 1:1:10, соответственно, хотя это соотношение, в особенности для VP3, может значительно варьировать и не должно считаться ограничивающим ни в каких аспектах.

[0064] Варианты AAV включают варианты AAV-Rh74, например, варианты капсидной последовательности VP1 AAV Rh74 (SEQ ID NO: 1; фиг. 1), в том числе, без ограничения, варианты 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 и 15-6, описанные в таблице 1. Аминокислотные последовательности VP2 Rh74 и VP3 Rh74 описаны в SEQ ID NO: 2 (фиг. 2) и SEQ ID NO: 3 (фиг. 3) соответственно.

Таблица 1. Капсидные варианты AAV

Вариант Аминокислотные замены в указанных положениях капсидного белка VP1 Rh74 Обозначение последовательности Фигура 4-1 G195A-L199V-S201P-G202N SEQ ID NO:4 Фигура 4 15-1 G195A-L199V-S201P-G202N K(137/259/333/530/552/569/38/51/77/169/547)R SEQ ID NO:5 Фигура 5 15-2 G195A-L199V- S201P-G202N K(137/259/333/530/552/569/38/51/77/163/169)R SEQ ID NO:6 Фигура 6 15-3/15-5 G195A-L199V- S201P-G202N K(137/259/333/530/552/569/38/51/77/163/547)R (вариант 15-3)
G195A-L199V-S201P-G202N K(137/259/333/530/552/569/38/51/77/547/163)R (вариант 15-5) SEQ ID NO:7 Фигура 7 15-4 G195A-L199V-S201P-G202N K(137/259/333/530/552/569/38/51/77/163/668)R SEQ ID NO:8 Фигура 8 15-6 G195A-L199V-S201P-G202N K(137/259/333/530/552/569/38/51/77/547/688)R SEQ ID NO:9 Фигура 9

[0065] Вариант 4-1 (SEQ ID NO: 4) содержит замены на аланин, валин, пролин и аспарагин в аминокислотных положениях 195, 199, 201 и 202 капсида VP1, соответственно. Аминокислотная последовательность варианта 4-1 капсида VP1 с замещенными остатками a, v, p и n, подчеркнутыми и выделенными жирным шрифтом, показана на фигуре 4 (SEQ ID NO: 4). Последовательность VP2 варианта 4-1 описана в SEQ ID NO: 27, а последовательность VP3 описана в SEQ ID NO: 3, соответственно.

[0066] Варианты 15-1, 15-2, 15-3, 15-4, 1-5 и 15-6 также содержат замены на аланин, валин, пролин и аспарагин в аминокислотных положениях 195, 199, 201 и 202 капсида VP1, соответственно. Кроме того, указанные варианты содержат несколько замен лизина на аргинин в разных положениях. Вариант 15-1 аминокислотной последовательности капсида VP1 (SEQ ID NO: 5) показан на фиг. 5; вариант 15-2 аминокислотной последовательности капсида VP1 (SEQ ID NO: 6) показан на фиг. 6; вариант 15-3/15-5 аминокислотной последовательности капсида VP1 (SEQ ID NO: 7) показан на фиг. 7; вариант 15-4 аминокислотной последовательности капсида VP1 (SEQ ID NO: 8) показан на фиг. 8; и вариант 15-6 аминокислотной последовательности капсида VP1 (SEQ ID NO: 9) показан на фиг. 9. Примеры капсидов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, без ограничения, капсиды, описанные в публикации патента США № 2015/0023924.

[0067] Соответственно, изобретение предлагает ленти- и парвовирусные векторы, такие как векторы AAV, а также варианты вирусных векторов, такие как варианты AAV (например, капсидные варианты, такие как 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15- 4 и 15-6), которые содержат (заключенный в капсид или упакованный) векторный геном, содержащий модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок FIX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG.

[0068] В иллюстративных исследованиях обнаружено, что AAV-Rh74, опосредуя перенос/доставку генов, обеспечивает гораздо более высокие уровни экспрессии белков, чем другие серотипы. В частности, вектор и капсидные варианты AAV-Rh74 (например, 4-1) обеспечивают доставку генов в печень с эффективностью, по меньшей мере, сравнимой с золотым стандартом трансдукции печени, AAV8, у собак, и/или мышей, и/или макак с гемофилией B.

[0069] Как описано в настоящем документе, вирусные векторы, такие как ленти- и парвовирусные векторы, включая серотипы и варианты AAV, являются средством для доставки в клетки ex vivo, in vitro и in vivo полинуклеотидных последовательностей, которые могут кодировать белки и обеспечивать их последующую экспрессию в клетках. Например, рекомбинантный вектор AAV может содержать гетерологичный полинуклеотид, кодирующий целевой белок или пептид (например, фактор IX). Таким образом, доставка или введение вектора индивидууму (например, млекопитающему) обеспечивает присутствие кодируемых белков и пептидов в организме индивидуума. Таким образом, вирусные векторы, такие как ленти- и парвовирусные векторы, включая серотипы и варианты AAV, такие как капсидные варианты (например, 4-1), можно использовать для переноса/доставки гетерологичных полинуклеотидов с целью экспрессии и, необязательно, с целью лечения разных заболеваний.

[0070] В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вектор (например, AAV) представляет собой парвовирусный вектор. Парвовирусы представляют собой небольшие вирусы с одноцепочечным ДНК-геномом. "Аденоассоциированные вирусы" (AAV) относятся к семейству парвовирусов.

[0071] Парвовирусы, включая AAV, представляют собой вирусы, которые можно использовать в качестве генотерапевтических векторов, поскольку они могут проникать в клетки и вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал, так что нуклеиновая кислота/генетический материал может стабильно поддерживаться в клетках. Кроме того, данные вирусы могут вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал в конкретные участки, например, в конкретный участок хромосомы 19. Поскольку AAV не связаны с патогенными заболеваниями у людей, векторы AAV способны доставлять пациентам гетерологичные полинуклеотидные последовательности (например, терапевтические белки и средства), не вызывая существенного патогенеза или заболевания, обусловленного AAV.

[0072] Серотипы (например, последовательности VP1, VP2 и/или VP3) AAV и вариантов AAV (например, капсидных вариантов, таких как 4-1) могут отличаться или не отличаться от других серотипов AAV, включающих, например, AAV1-AAV11, Rh74 или Rh10 (например, они могут отличаться от последовательностей VP1, VP2 и/или VP3 любого из серотипов AAV1-AAV11, Rh74 или Rh10).

[0073] В настоящем описании термин "серотип" относится к отличию, используемому для обозначения AAV, содержащего капсид, серологически отличающийся от других серотипов AAV. Серологическое различие определяют по отсутствию перекрестной реакционноспособности среди антител против одного AAV и антител против другого AAV. Такие различия в перекрестной реакционноспособности обычно связаны с различиями в последовательностях капсидных белков/антигенных детерминант (например, с различиями в последовательностях VP1, VP2 и/или VP3 серотипов AAV). Несмотря на то, что варианты AAV, включая капсидные варианты, могут серологически не отличаться от исходного AAV или другого серотипа AAV, они отличаются по меньшей мере одним нуклеотидным или аминокислотным остатком по сравнению с исходной последовательностью или последовательностью другого серотипа AAV.

[0074] Согласно традиционному определению серотип означает, что при тестировании представляющего интерес вируса на нейтрализующую активность сыворотки, специфичной для всех существующих и охарактеризованных серотипов, не обнаруживают антител, способных нейтрализовать представляющий интерес вирус. Обнаруженные новые природные вирусные изоляты и/или полученные капсидные мутанты могут серологически отличаться или не отличаться от одного из известных в настоящее время серотипов. Таким образом, если новый вирус (например, AAV) серологически не отличается от известного серотипа, этот новый вирус (например, AAV) относят к подгруппе или варианту соответствующего серотипа. Зачастую серологическому тестированию на нейтрализующую активность подвергают мутантные вирусы с модификациями в капсидной последовательности, чтобы определить, относятся ли они к другому серотипу в соответствии с традиционным определением серотипа. Соответственно, для удобства и во избежание повторения термин "серотип" используется в широком смысле и относится к серологически различающимся вирусам (таким как AAV), а также к вирусам (например, AAV), которые серологически не различаются и могут относится к подгруппе или варианту конкретного серотипа.

[0075] Рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные (например, AAV) геномы, а также способы и их применение включают использование любого вирусного штамма или серотипа. В качестве неограничивающего примера рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида или векторный (например, AAV) геном может содержать геном любого AAV, такого как, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, - 10, -11, -rh74, -Rh10 или AAV-2i8. Такие векторы могут быть получены с использованием одного и того же штамма или серотипа (или подгруппы или варианта), или они могут отличаться друг от друга. В качестве неограничивающего примера рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида или векторный (например, AAV) геном, полученные с использованием одного серотипа, могут быть идентичными по одному или нескольким капсидным белкам, которые упаковывают вектор. Кроме того, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида или векторный (например, AAV) геном может быть получен с использованием генома серотипа AAV (например, AAV2), отличающегося по одному или нескольким капсидным белкам, которые упаковывают вектор, и в данном случае по меньшей мере один из трех капсидных белков может относиться к серотипу AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, или его варианту, такому как, например, вариант AAV-Rh74 (включающий капсидные варианты, такие как 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 и 15-6).

[0076] Таким образом, векторы AAV содержат генные/белковые последовательности, идентичные генным/белковым последовательностям, характерным для определенного серотипа. Используемый здесь термин "вектор AAV, родственный AAV1", означает, что один или несколько белков AAV (например, последовательности VP1, VP2 и/или VP3) имеют последовательности, в значительной степени идентичные одной или нескольким полинуклеотидным или полипептидным последовательностям, входящим в состав AAV1. Аналогично термин "вектор AAV, родственный AAV8", означает, что один или несколько белков AAV (например, последовательности VP1, VP2 и/или VP3) имеют последовательности, в значительной степени идентичные одной или нескольким полинуклеотидным или полипептидным последовательностям, входящим в состав AAV8. Термин "вектор AAV, родственный AAV-Rh74", означает, что один или несколько белков AAV (например, последовательности VP1, VP2 и/или VP3) имеют последовательности, в значительной степени идентичные одной или нескольким полинуклеотидным или полипептидным последовательностям, входящим в состав AAV-Rh74 (см., например, VP1, VP2, VP3 на фиг. 1-3). Следовательно, такие векторы AAV, родственные другому серотипу, такому как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVl1, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, могут содержать одну или несколько последовательностей, отличающихся от последовательностей AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVl1, Rh10, Rh74 и AAV-2i8, но могут обладать значительной степенью идентичности последовательностей по одному или нескольким генам и/или белкам, и/или могут иметь одну или несколько функциональных характеристик от AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 (например, клеточный/тканевый тропизм). Неограничивающие примеры последовательностей AAV-Rh74 и родственных вариантов AAV, таких как последовательности AAV-Rh74 или родственных AAV, таких как варианты AAV-Rh74 (например, капсидные варианты, такие как 4- 1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 и 15-6), включают последовательности VP1, VP2 и/или VP3, представленные здесь, например, на фиг. 1-9.

[0077] В разных иллюстративных вариантах осуществления вектор AAV, родственный исходному серотипу, содержит полинуклеотид, полипептид, или его последовательность, которая содержит последовательность, или состоит из последовательности, по меньшей мере, на 80% или более (например, на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.), идентичной одной или нескольким последовательностям AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 (например, таким как последовательности VP1, VP2 и/или VP3 AAV-Rh74, представленные на фиг. 1-9).

[0078] Способы и варианты применения настоящего изобретения включают использование последовательностей AAV (полипептидов и нуклеотидов), последовательностей AAV-Rh74 (полипептидов и нуклеотидов) и их подпоследовательностей, которые менее чем на 100% идентичны последовательности стандартного серотипа AAV, такого как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10 или AAV-2i8, например, генной или белковой последовательности AAV-Rh74 (такой как последовательности VP1, VP2 и/или VP3, представленные на фигурах 1-9), но отличаются от известных генов или белков AAV и не идентичны известным генам или белкам AAV, таким как гены или белки AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, и т.д. В одном варианте осуществления полипептид AAV или его подпоследовательность содержит последовательность или состоит из последовательности, по меньшей мере, на 80% или более, например, на 85, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д., т.е. до 100%, идентичной любой стандартной последовательности AAV, или ее подпоследовательности, такой как последовательность AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 (включающая последовательности VP1, VP2 и/или VP3, представленные на фигурах 1-9). В конкретных вариантах осуществления вариант AAV содержит одну, две, три или четыре из четырех аминокислотных замен (как, например, капсидный вариант 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 и 15-6).

[0079] Рекомбинантные векторы (например, AAV), включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 и их варианты, родственные, гибридные и химерные последовательности можно сконструировать с помощью рекомбинантных методов, известных специалистам в данной области, так, чтобы они содержали одну или несколько гетерологичных полинуклеотидных последовательностей (трансгенов), фланкированных одной или несколькими функциональными последовательностями ITR AAV. Из таких векторов можно полностью или частично удалить один или несколько генов AAV дикого типа, например, ген rep и/или cap, но сохранить по меньшей мере одну функциональную фланкирующую последовательность ITR, если это необходимо для сохранения, репликации и упаковки рекомбинантного вектора в векторной частице AAV. Полученный векторный геном AAV содержит последовательности, действующие как цис-элементы, необходимые для репликации и упаковки (например, функциональные последовательности ITR).

[0080] Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются здесь как взаимозаменяемые и обозначают все формы нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Полинуклеотиды включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, а также сплайсированную или нерасщепленную мРНК, рРНК-тРНК и ингибиторную ДНК или РНК (РНКи, например, малую или короткую шпилечную (кш) РНК, микроРНК (микроРНК), малую или короткую интерферирующую (ки) РНК, РНК, образовавшуюся в результате транс-сплайсинга или антисмысловую РНК). Полинуклеотиды включают природные, синтетические и специально модифицированные или измененные полинуклеотиды (например, содержащие уменьшенное число динуклеотидов CpG). Полинуклеотиды могут быть одиночные, двойные или тройные, линейные или циклические, и могут иметь любую длину. При обсуждении полинуклеотидов последовательность или структура конкретного полинуклеотида может быть описана здесь в соответствии с соглашением об обозначении последовательностей в направлении от 5'-конца к 3'-концу.

[0081] Термин "гетерологичный" полинуклеотид относится к полинуклеотиду, вставленному в вектор (например, AAV) с целью переноса/доставки вектором полинуклеотида в клетку. Гетерологичные полинуклеотиды обычно отличаются от нуклеиновой кислоты вектора (например, AAV) (например, AAV), то есть они не являются природными по отношению к нуклеиновой кислоте вируса (например, AAV). После переноса/доставки в клетку гетерологичный полинуклеотид, содержащийся внутри вектора, может экспрессироваться (например, транскрибироваться и транслироваться, если это необходимо). Альтернативно гетерологичный полинуклеотид, содержащийся внутри вектора и предназначенный для переноса/доставки в клетку, не обязательно должен быть экспрессироваться. Хотя термин "гетерологичный" не всегда используется здесь применительно к полинуклеотидам, предполагается, что ссылка на полинуклеотид даже в отсутствии определения "гетерологичный" включает гетерологичные полинуклеотиды, несмотря на опущение. Примером гетерологичной последовательности может служить нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, например, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX, такая как нуклеиновая кислота, содержащая уменьшенное число динуклеотидов CdG по сравнению со стандартной нуклеиновой кислотой.

[0082] Термины "полипептиды", "белки" и "пептиды", кодируемые "полинуклеотидными последовательностями", относятся к полноразмерным нативным последовательностям, таким как природные белки, а также к их функциональным подпоследовательностям, модифицированным формам или вариантам, если подпоследовательность, модифицированная форма или вариант сохраняет определенную степень функциональности нативного полноразмерного белка. В способах и вариантах применения настоящего изобретения такие полипептиды, белки и пептиды, кодируемые полинуклеотидными последовательностями, не обязательно должны быть идентичными эндогенному белку, который является дефектным или экспрессируется на недостаточном уровне, или дефицит которого наблюдается у млекопитающего, подлежащего лечению.

[0083] В настоящем изобретении ленти- и парвовирусные векторы, такие как аденовирусный вектор и векторы AAV, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, а также соответствующие варианты AAV, такие как варианты AAV-Rh74 (например, капсидные варианты, такие как 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 и 15-6), можно использовать для стабильного или временного введения/доставки полинуклеотидов в клетки и их потомство. Термин "трансген" используется здесь для удобного обозначения такого гетерологичного полинуклеотида, который предназначен для введения или введен в клетку или организм. Трансгены включают любой полинуклеотид, такой как ген, который кодирует полипептид или белок (например, фактор IX).

[0084] Например, трансген вводят/трансфицируют в клетку посредством векторной, например, опосредованной AAV, "трансдукции" или "трансфекции". Термины "трансдукция" и "трансфекция" относятся к введению молекулы, такой как полинуклеотид, в клетку или организм хозяина.

[0085] Клетка, в которую был введен трансген, называется "трансдуцированная клетка". Соответственно, термин "трансдуцированная" клетка (например, клетка млекопитающего, такая как клетка или клетка ткани или органа), относится к генетическому изменению клетки после введения в нее экзогенной молекулы, например, полинуклеотида или белка (например, трансгена). Таким образом, "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, в которую была введена, например, экзогенная молекула, или ее потомство. Клетку (клетки) можно размножить с последующей экспрессией введенного белка или транскрипцией нуклеиновой кислоты. При применении в способах генной терапии трансдуцированная клетка может находиться в организме индивидуума.

[0086] Введенный полинуклеотид может необязательно интегрироваться в нуклеиновую кислоту клетки-реципиента или организма-реципиента. Если введенный полинуклеотид интегрируется в нуклеиновую кислоту (геномную ДНК) клетки-реципиента или организма-реципиента, он может стабильно поддерживаться в этой клетке или в этом организме и затем передаваться клеткам или организмам, или наследоваться клетками или организмами, которые являются потомками клетки-реципиента или организма-реципиента. Наконец, введенная нуклеиновая кислота может существовать в клетке-реципиенте или в организме хозяина только временно.

[0087] Клетки, которые можно трансдуцировать, включают клетки ткани или органа любого типа и любого происхождения (например, мезодермы, эктодермы или энтодермы). Неограничивающие примеры клеток включают клетки печени (например, гепатоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки), клетки поджелудочной железы (например, клетки бета-островков), клетки легкого, клетки центральной или периферической нервной системы, такие как клетки головного мозга (например, нервные, глиальные или эпендимальные клетки) или клетки спинного мозга, клетки почки, клетки глаза (например, клеточные компоненты сетчатки), клетки селезенки, клетки кожи, клетки тимуса, клетки семенника, клетки легкого, клетки диафрагмы, клетки сердца (сердца), клетки мышцы или поясничной мышцы, или клетки кишечника (например, эндокринные клетки), клетки жировой ткани (белой, коричневой или бежевой), клетки мышцы (например, фибробласты), синовиоциты, хондроциты, остеокласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки слюнных желез, нервные клетки внутреннего уха или гемопоэтические (например, кровяные или лимфатические) клетки. Другие примеры включают стволовые клетки, такие как плюрипотентные или мультипотентные клетки-предшественники, которые развиваются или дифференцируются в клетки печени (например, гепатоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки), клетки поджелудочной железы (например, клетки бета-островков), клетки легкого, клетки центральной или периферической нервной системы, такие как клетки мозга (например, нервные, глиальные или эпендимальные клетки), или клетки позвоночника, клетки почки, клетки глаза (клеточные компоненты сетчатки), клетки селезенки, клетки кожи, клетки тимуса, клетки семенника, клетки легкого, клетки диафрагмы, клетки сердца (кардиальные клетки), клетки мышцы или поясничной мышцы, или клетки кишечника (например, клетки жировой ткани (белой, коричневой или бежевой), клетки мышцы (например, фибробласты), синовиоциты, хондроциты, остеокласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки слюнных желез, нервные клетки внутреннего уха или гемопоэтические (например, кровяные или лимфатические) клетки.

[0088] "Терапевтическая молекула" в одном варианте осуществления представляет собой пептид или белок, способный облегчать или уменьшать симптомы, которые являются результатом отсутствия или дефекта белка в клетке или организме индивидуума. Альтернативно термин "терапевтический" относится к кодируемому трансгеном пептиду или белку, который улучшает состояние индивидуума, например, путем коррекции генетического дефекта, дефицита (экспрессионного или функционального) гена.

[0089] Неограничивающие примеры гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих генные продукты (например, терапевтические белки) и подходящих для применения в настоящем изобретении, включают полинуклеотиды, которые можно использовать для лечения заболевания или расстройства, включающего, без ограничения, нарушение свертывания крови, такое как гемофилия A, гемофилия B, талассемия и анемия.

[0090] Все известные и неизвестные формы кодирующих генные продукты полинуклеотидов млекопитающих и не млекопитающих, включающие, без ограничения, раскрытые здесь гены и белки, в прямой форме включены в объем настоящего изобретения. Таким образом, изобретение относится к генам и белкам не млекопитающих, млекопитающих, отличных человека, и человека, которые функционируют по существу аналогично описанным здесь человеческим генам и белкам. Неограничивающие примеры последовательности фактора IX отличного от человека млекопитающего описаны в Yoshitake et al., 1985, см. выше; Kurachi et al, 1995, см. выше; Jallat et al., 1990, см. выше; Kurachi et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6461-6464; Jaye et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11: 2325-2335; Anson et al., 1984, EMBO J. 3: 1053-1060; Wu et al., 1990, Gene 86: 275-278; Evans et al., Proc Natl Acad Sci USA 86: 10095 (1989), Blood 74: 207-212; Pendurthi et al., 1992, Thromb. Res. 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics, 1990, 6: 133-143; и Katayama et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4990-4994.

[0091] Полинуклеотиды, полипептиды и их подпоследовательности включают модифицированные формы и варианты. Используемые здесь термины "модифицированная форма" или "вариант" и их грамматические вариации означают, что полинуклеотид, полипептид, или их подпоследовательности отличаются от исходной последовательности. Следовательно, модифицированные и вариантные последовательности могут обладать по существу такой же, более высокой или более низкой активностью или функцией, чем исходная последовательность, но по меньшей мере частично сохраняют активность или функцию исходной последовательности. В конкретных вариантах осуществления модифицированная нуклеиновая кислота кодирует фактор IX и содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с исходной нуклеиновой кислотой, кодирующей фактор IX (например, с последовательностью фактора IX дикого типа, такой как генная последовательность фактора IX человека или другого млекопитающего).

[0092] Варианты также включают варианты с увеличением и потерей функции. Например, последовательности ДНК человеческого фактора IX дикого типа, которые кодируют белковые варианты или мутанты, сохраняющие активность или являющиеся терапевтически эффективными, или обладающие сравнимой или даже более высокой терапевтической активностью, чем инвариантный человеческий фактор IX, можно использовать в способах и вариантах применения настоящего изобретения. Неограничивающим примером варианта природного человеческого фактора IX является "Padua", который получают из последовательности человеческого фактора IX путем введения L (лейцина) в положении 338 вместо R (аргинина). Padua FIX обладает более высокой каталитической и коагулирующей активностью, чем человеческий фактор IX, у которого отсутствует мутация Padua. Изменение остатка в положении 338 человеческого фактора IX с аргинина на аланин приводит к увеличению каталитической активности (Chang et al., J. Biol. Chem., 273: 12089-94 (1998)). В другом конкретном примере коллаген IV улавливает фактор IX, а это означает, что при введении в мышечную ткань млекопитающего часть фактора IX не может участвовать в свертывании крови, поскольку она остается в интерстициальном пространстве мышечной ткани. Мутация в последовательности фактора IX, которая приводит к получению белка, обладающего пониженной способностью к связыванию с коллагеном IV (например, с потерей функции), является полезной мутацией, например, для лечения гемофилии. Примером является мутантный ген фактора IX, который кодирует человеческий белок FIX, содержащий аминокислоту аланин вместо лизина в пятом аминокислотном положении от начала зрелого белка.

[0093] Неограничивающие примеры модификаций включают одну или несколько замен нуклеотидов или аминокислот (например, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 или более нуклеотидов или остатков), таких как замена CpG на альтернативный динуклеотид в трансгене (например, в гене, кодирующем фактор IX, таком как кодирующий FIX ген с уменьшенным числом динуклеотидов CpG). Примером аминокислотной замены является консервативная замена аминокислот в капсидной последовательности. Другим примером аминокислотной замены является замена аргинина на остаток лизина (например, можно осуществить одну или несколько замен аргинина на лизин, как указано в любом из 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 и/или 15-6). Другие модификации включают изменение исходной последовательности путем добавлений (например, вставок 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 или более нуклеотидов или остатков) и делеций (например, с получением подпоследовательностей или фрагментов). В конкретных вариантах осуществления модифицированная или вариантная последовательность сохраняет по меньшей мере часть функции или активности немодифицированной последовательности. Такие модифицированные формы и варианты могут обладать, например, такой же, более низкой или более высокой функцией или активностью, но, по меньшей мере, частью функции или активности исходной последовательности, как описано в настоящем документе.

[0094] Как указано здесь, вариант может содержать одну или несколько неконсервативных или консервативных модификаций или изменений аминокислотной последовательности, или и те, и другие. "Консервативная замена" представляет собой замену одной аминокислоты на биологически, химически или структурно подобный остаток. Термин "биологически подобный" означает, что замена не нарушает биологическую активность. Термин "структурно подобный" означает, что аминокислоты содержат боковые цепи подобной длины, как, например, аланин, глицин и серин, или подобного размера. Термин "химически подобный" означает, что остатки имеют одинаковый заряд или оба являются гидрофильными или гидрофобными. Конкретные примеры включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой, или замену одного полярного остатка на другой, например, замену аргинина на лизин, глутамина на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, серина на треонин и т.п. Конкретные примеры консервативных замен включают замену гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой, замену полярного остатка на другой, например, замену аргинина на лизин, глутамина на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин и т.п. Например, консервативные аминокислотные замены обычно включают замены внутри следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. Термин "консервативная замена" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты.

[0095] Соответственно, изобретение относится к генным и белковым вариантам (таким как полинуклеотиды, кодирующие описанные здесь белки), которые сохраняют одну или несколько биологических активностей (например, функцию свертывания крови и т.д.). Варианты могут отличаться от исходной последовательности, такой как последовательность природного полинуклеотида, белка или пептида. Такие варианты полинуклеотидов, белков или полипептидов включают белки или полипептиды, модифицированные, или которые могут быть модифицированы с использованием технологии рекомбинантной ДНК, с получением полинуклеотида, белка или полипептида, обладающего измененными или дополнительными свойствами.

[0096] На уровне нуклеотидной последовательности природный и не природный вариант гена обычно является по меньшей мере примерно на 50% идентичным, чаще примерно на 70% идентичным, еще чаще примерно на 80% идентичным исходному гену. Так, например, ген FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG может быть примерно на 80% или более идентичным гену FIX дикого типа, или на 80-85%, 85-90%, 90-95% или более идентичным гену FIX дикого типа, например, он может быть на 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичным гену FIX дикого типа.

[0097] На уровне аминокислотной последовательности природный и не природный вариант белка обычно является по меньшей мере примерно на 70% идентичным, чаще примерно на 80% идентичным, еще чаще примерно на 90% или более идентичным исходному белку, хотя допускается присутствие значительных участков неидентичности в неконсервативных участках (например, допускается идентичность менее 70%, например, менее 60%, 50% или даже 40%). В других вариантах осуществления последовательности являются по меньшей мере на 60%, 70%, 75% или более идентичными (например, на 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичными) исходной последовательности.

[0098] Термины "идентичность", "гомология" и их грамматические вариации означают, что "выравнивание" последовательностей демонстрирует, что два или более сравниваемых объектов являются одинаковыми. Так, например, если две полипептидные последовательности идентичны, они имеют одинаковые аминокислотные последовательности, по меньшей мере, в сравниваемом участке или его части. Если две полинуклеотидные последовательности идентичны, они имеют одинаковые полинуклеотидные последовательности, по меньшей мере, в сравниваемом участке или его части. Идентичность может наблюдаться в определенной области (участке или домене) последовательности. Термин "область" или "участок" идентичности относится к фрагментам двух или более сравниваемых объектов, которые являются одинаковыми. Таким образом, если две белковые или нуклеотидные последовательности являются идентичными на протяжении одной или нескольких областей или участков последовательности, они идентичны по данному участку. Термин "выравнивание" последовательностей относится к нескольким полинуклеотидным или белковым (аминокислотным) последовательностям, зачастую содержащим коррекции в случае недостающих или дополнительных оснований или аминокислот (в виде гэпов) по сравнению со стандартной последовательностью.

[0099] Идентичность может распространяться на всю длину или часть последовательности. В конкретных аспектах длина последовательности, разделяющей процент идентичности, составляет 2, 3, 4, 5 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д. смежных полинуклеотидов или аминокислот. В других конкретных аспектах длина последовательности, разделяющей идентичность, составляет 21 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 и т.д. смежных полинуклеотидов или аминокислот. В других конкретных аспектах длина последовательности, разделяющей идентичность, составляет 41 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50 и т.д. смежных полинуклеотидов или аминокислот. В еще более конкретных аспектах длина последовательности, разделяющей идентичность, составляет 50 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80 -85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-110 и т.д. смежных полинуклеотидов или аминокислот.

[0100] Термины "гомологичный" или "гомология" означают, что два или более сравниваемых объектов характеризуются, по меньшей мере, частичной идентичностью по заданному участку или фрагменту. Термин "области, участки или домены" гомологии или идентичности означают, что два или более сравниваемых объектов являются гомологичными или одинаковыми на протяжении части их последовательностей. Так, если две последовательности идентичны по одному или нескольким участкам их последовательностей, они обладают идентичностью по этим участкам. Термин "существенная гомология" означает, что молекула является структурно или функционально консервативной, так что она обладает, или предположительно обладает, по меньшей мере частично, структурой или функцией одной или нескольких структур или функций (например, биологической функцией или активностью) стандартной молекулы, или релевантного/соответствующего участка или фрагмента стандартной молекулы, которой она гомологична.

[0101] Степень идентичности (гомологии) двух последовательностей можно установить с помощью компьютерной программы и/или математического алгоритма. Такие алгоритмы, которые вычисляют процент идентичности (гомологии) последовательностей, обычно учитывают гэпы и несоответствия в последовательностях в участке или области сравнения. Например, алгоритм поиска BLAST (например, BLAST 2.0) (см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990), присутствующий в открытом доступе на сайте NCBI) имеет следующие иллюстративные параметры поиска: несоответствие -2; открытие гэпа 5; продолжение гэпа 2. Для сравнения полипептидных последовательностей обычно используют алгоритм BLASTP в комбинации с матрицей замен, такой как PAM100, PAM250, BLOSUM 62 или BLOSUM 50. Для количественной оценки степени идентичности также используют программы FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) и SSEARCH (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132: 185 (2000); и Smith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)). Кроме того, разработаны программы для количественного определения структурного подобия белков с использованием топологического картирования на основе метода Делоне (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304: 320 (2003)).

[0102] Полинуклеотиды содержат добавления и вставки, например, одного или нескольких гетерологичных доменов. Добавление (например, гетерологичного домена) можно осуществить путем ковалентного или нековалентного присоединения к композиции молекулы любого типа. Как правило, добавления и вставки (например, гетерологичного домена) придают дополнительную или другую функцию или активность.

[0103] В результате добавлений и вставок получают химерные и гибридные последовательности, которые представляют собой полинуклеотидные или белковые последовательности, содержащие одну или несколько молекул, ковалентно присоединенных к последовательности, которые обычно не присутствуют в исходной нативной (дикого типа) последовательности. Термины "гибридный" или "химерный" и их грамматические вариации при использовании в применении к молекуле означают, что фрагмент или часть молекулы содержит другой объект, отличный (гетерологичный) от молекулы, поскольку обычно они не существуют вместе в природе. То есть, например, одна часть гибрида или химеры содержит фрагмент или состоит из фрагмента, который не существует вместе с молекулой в природе и структурно отличается от нее.

[0104] Термин "вектор" относится к плазмиде, вирусу (например, вектору AAV) или другому средству, с которым можно манипулировать путем вставки или включения полинуклеотида. Такие векторы можно использовать для генетической манипуляции (то есть "клонирующие векторы"), обеспечивающей введение/перенос полинуклеотидов в клетки с последующей транскрипцией или трансляцией вставленного полинуклеотида в клетках. Нуклеотидная последовательность вектора обычно содержит по меньшей мере точку начала репликации, обеспечивающую размножение в клетке, и необязательно дополнительные элементы, такие как гетерологичная полинуклеотидная последовательность, элемент, регулирующий экспрессию (например, промотор, энхансер), интрон, ITR, селектируемый маркер (например, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам), полиадениновая последовательность (также называемая последовательность полиаденилирования).

[0105] Вирусный вектор получают из или на основе одного или нескольких элементов нуклеиновой кислоты, которые содержат вирусный геном. Конкретные вирусные векторы включают ленти- и парвовирусные векторы, такие как векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

[0106] Термин "рекомбинантный", используемый здесь в качестве определения вирусного вектора, например, рекомбинантные ленти- и парвовирусные (например, AAV) векторы, а также определения последовательностей, например, рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что композиции (например, AAV или последовательности) были подвергнуты манипуляциям (т.е. конструированию) таким способом, который обычно не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора, такого как вектор AAV, является полинуклеотид, обычно не присутствующий в геноме вируса дикого типа (например, AAV), который введен в вирусный геном. Примером рекомбинантного полинуклеотида может служить гетерологичный полинуклеотид (например, ген), кодирующий белок, клонированный в векторе, в присутствии или в отсутствии 5', 3' и/или интронных участков, где ген обычно ассоциирован с вирусным (например, AAV) геномом. Хотя термин "рекомбинантный" не всегда используется здесь в применении к векторам, таким как вирусные и AAV-векторы, а также к последовательностям, таким как полинуклеотиды и полипептиды, рекомбинантные формы вирусов, AAV и последовательностей, в том числе полинуклеотидов и полипептидов, в явной форме включены в настоящее изобретение, несмотря на такое опущение.

[0107] Рекомбинантный вирусный "вектор" или "вектор AAV" получают из генома вируса, такого как AAV, дикого типа с использованием молекулярных методов путем удаления генома дикого типа из вируса (например, AAV) и замены его на неприродную нуклеиновую кислоту, такую как гетерологичная полинуклеотидная последовательность (например, модифицированная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий FIX, такая как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG). Как правило, в векторе AAV сохраняют одну или обе последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) генома AAV. "Рекомбинантный" вирусный (например, AAV) вектор отличается от вирусного (например, AAV) генома, поскольку весь вирусный геном, или часть вирусного генома заменяют последовательностью, не являющейся нативной по отношению к вирусной (например, AAV ) геномной нуклеиновой кислоте, такой как гетерологичная полинуклеотидная последовательность (например, модифицированная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий FIX, такая как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG). После введения ненативной последовательности (например, модифицированной нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий FIX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG) вирусный (например, AAV) вектор называют "рекомбинантным" вектором и в случае AAV обозначают его "rAAV-вектор".

[0108] Упакованную последовательность рекомбинантного вектора (например, ленти-, парво-, AAV), называемую здесь "частица", можно использовать для последующего инфицирования (трансдукции) клетки ex vivo, in vitro или in vivo. Если в AAV-частицу инкапсидируют или упаковывают рекомбинантную векторную последовательность, такую частицу также можно обозначить "rAAV". Такие частицы содержат белки, которые инкапсидируют или упаковывают векторный геном. Конкретные примеры включают белки вирусной оболочки, а в случае AAV - капсидные белки.

[0109] В случае рекомбинантной плазмиды термин векторный "геном" относится к части рекомбинантной плазмидной последовательности, которая в конечном итоге упаковывается или инкапсидируется с образованием вирусной (например, AAV) частицы. Если рекомбинантные плазмиды используют для конструирования или изготовления рекомбинантных векторов, векторный геном не содержит часть "плазмиды", которая не соответствует векторной геномной последовательности рекомбинантной плазмиды. Такой невекторный геномный фрагмент рекомбинантной плазмиды называют "плазмидный скелет", который играет важную роль в клонировании и амплификации плазмиды, процесса, необходимого для размножения и продуцирования рекомбинантного вируса, но сам он не упаковывается или не инкапсидируется в вирусную частицу (например, AAV).

[0110] Таким образом, термин векторный "геном" относится к фрагменту векторной плазмиды, который упаковывается или инкапсидируется вирусом (например, AAV) и который содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность. Невекторный фрагмент генома рекомбинантной плазмиды представляет собой "плазмидный скелет", который играет важную роль в клонировании и амплификации плазмиды, например, содержит селектируемый маркер, например, обеспечивающий устойчивость к канамицину, но сам он не упаковывается или не инкапсидируется вирусом (например, AAV).

[0111] Количество rAAV, инкапсидирующих/упаковывающих векторные геномы, можно определить, например, методом количественной ПЦР. С помощью данного анализа можно измерить физическое число упакованных векторных геномов методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, которую можно проводить на разных стадиях способа промышленного получения/очистки, например, в исходном AAV-векторе и конечном продукте.

[0112] Рекомбинантные векторные последовательности подвергают манипуляциям путем вставки или введения полинуклеотида. Как описано в данном документе, векторная плазмида обычно содержит по меньшей мере точку начала репликации, чтобы обеспечить размножение в клетке, и один или несколько элементов, регулирующих экспрессию.

[0113] Векторные последовательности, включающие векторы AAV, могут содержать один или несколько "элементов, регулирующих экспрессию". Как правило, элементы, регулирующие экспрессию, представляют собой нуклеотидные последовательности, которые влияют на экспрессию функционально связанного полинуклеотида. Регулирующие элементы, в том числе описанные здесь элементы, регулирующие экспрессию, такие как промоторы и энхансеры, присутствующие внутри вектора, используют для обеспечения надлежащей транскрипции и, при необходимости, трансляции гетерологичного полинуклеотида (такие элементы включают, например, промотор, энхансер, сигнал сплайсинга для интронов, элемент, поддерживающий правильную рамку считывания гена, чтобы обеспечить трансляцию мРНК в рамке считывания, стоп-кодоны и др.). Такие элементы обычно действуют как цис-элементы, в этом случае их называют "цис-действующие" элементы, однако они могут действовать и как транс-элементы.

[0114] Регуляция экспрессии может осуществляться на уровне транскрипции, трансляции, сплайсинга, стабильности транскрипта и др. Как правило, элемент, управляющий экспрессией, который модулирует транскрипцию, располагается вблизи 5'-конца (то есть "выше") транскрибируемого полинуклеотида (например, модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG). Элементы, регулирующие экспрессию, также могут располагаться на 3'-конце (т.е. "ниже") транскрибируемой последовательности, или внутри транскрипта (например, в интроне). Элементы, регулирующие экспрессию, могут располагаться рядом с транскрибируемой последовательностью, или на расстоянии от нее (например, на расстоянии 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, от 100 до 500 или более нуклеотидов от полинуклеотида), даже на значительном расстоянии. Однако вследствие ограничений по длине полинуклеотидов некоторых векторов, таких как векторы AAV, такие регулирующие экспрессию элементы, как правило, находятся на расстоянии, составляющем от 1 до 1000 нуклеотидов, от транскрибируемого полинуклеотида.

[0115] Экспрессия функционально связанного гетерологичного полинуклеотида по меньшей мере частично функционально регулируется элементом (например, промотором), при этом элемент модулирует транскрипцию полинуклеотида и, при необходимости, трансляцию транскрипта. Конкретным примером элемента, регулирующего экспрессию, является промотор, который обычно располагается на 5'-конце транскрибируемой последовательности. Другим примером элемента, регулирующего экспрессию, является энхансер, который может располагаться на 5'-конце, 3'-конце транскрибируемой последовательности, или внутри транскрибируемой последовательности.

[0116] Используемый здесь термин "промотор" может относиться к нуклеотидной последовательности (например, последовательности ДНК), которая находится рядом с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей рекомбинантный продукт. Как правило, промотор функционально связан с соседней последовательностью, такой как гетерологичный полинуклеотид (например, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фактор IX). Промотор обычно увеличивает количество продукта экспрессии гетерологичного полинуклеотида, по сравнению с количеством продукта, экспрессируемым в отсутствии промотора.

[0117] Используемый здесь термин "энхансер" может относиться к последовательности, которая находится рядом с гетерологичным полинуклеотидом. Энхансерные элементы обычно располагаются выше промоторного элемента, однако они также могут функционировать, находясь ниже или внутри последовательности ДНК (например, гетерологичного полинуклеотида). Следовательно, энхансерный элемент может располагаться на 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или более пар оснований выше или ниже гетерологичного полинуклеотида. Энхансерные элементы обычно увеличивают уровень экспрессии гетерологичного полинуклеотида сверх повышенного уровня экспрессии, обеспечиваемого промоторным элементом.

[0118] Элементы, регулирующие экспрессию (например, промоторы), которые проявляют активность в ткани или клетке определенного типа, называют здесь "тканеспецифичные элементы/промоторы, регулирующие экспрессию". "Тканеспецифичные элементы, регулирующие экспрессию, обычно активны в определенных клетках или тканях (например, в печени, головном мозге, центральной нервной системе, спинном мозге, глазах, сетчатке, кости, мышцах, легких, поджелудочной железе, сердце, почках и др.). Элементы, регулирующие экспрессию, обычно проявляют активность в этих клетках, тканях или органах, потому что они распознаются белками, активирующими транскрипцию, или другими регуляторами транскрипции, которые являются уникальными для клеток, тканей или органов определенного типа.

[0119] Примеры промоторов, активных в скелетной мышце, включают промоторы генов, кодирующих скелетный α-актин, легкую цепь миозина 2А, дистрофин, мышечную креатинкиназу, а также синтетические мышечные промоторы, активность которых превышает активность природных промоторов (см., например, Li, et al., Nat. Biotech. 17: 241-245 (1999)). Примерами промоторов, специфичных для ткани печени, являются промотор человеческого альфа-1-антитрипсина (hAAT); промотор альбумина, Miyatake et al. J. Virol., 71: 5124-32 (1997); промотор кора вируса гепатита B, Sandig, et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996); промотор альфа-фетопротеина (AFP), Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7: 1503-14 (1996)], промоторы, специфичные для костной ткани (промотор остеокальцина, Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997); промотор костного сиалопротеина, Chen, et al., J Bone Miner. Res. 11: 654-64 (1996)), промоторы, специфичные для лимфоцитов (промотор CD2, Hansal et al., J. Immunol, 161: 1063-8 (1998); промотор тяжелой цепи иммуноглобулина; промотор α-цепи Т-клеточного рецептора), промоторы, специфичные для нейронов (промотор нейрон-специфичой энолазы (NSE), Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993); промотор гена легкой цепи нейрофиламента, Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991); промотор гена vgf, специфичного для нейронов, Piccioli, et al., Neuron, 15: 373-84 (1995); и др. Примерами энхансеров, активных в печени, являются энхансеры HCR-1 и HCR-2 аполипопротеина E (apoE) (Allan et al., J. Biol. Chem., 272: 29113-19 (1997)).

[0120] Элементы, регулирующие экспрессию, также включают универсальные или неизбирательные промоторы/энхансеры, которые могут стимулировать экспрессию полинуклеотида в клетках разных типов. Такие элементы включают, без ограничения, последовательности немедленно-раннего промотора/энхансера цитомегаловируса (CMV), последовательности промотора/энхансера вируса саркомы Рауса (RSV), а также другие вирусные промоторы/энхансеры, активные в клетках млекопитающих разных типов, или синтетические элементы, которые отсутствуют в природе (см., например, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)), промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор цитоплазматического β-актина и промотор фосфоглицеринкиназы (PGK).

[0121] Элементы, регулирующие экспрессию также могут обеспечивать экспрессию в регулируемой манере, то есть сигнал или стимул может увеличивать или уменьшать экспрессию функционально связанного гетерологичного полинуклеотида. Регулируемый элемент, который увеличивает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимул, также называют "индуцибельный элемент" (т.e., индуцируемый сигналом). Конкретные примеры включают, без ограничения, промотор, индуцируемый гормоном (например, стероидным гормоном). Регулируемый элемент, который уменьшает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимул, называют "репрессируемый элемент" (т.e., сигнал уменьшает экспрессию, а когда сигнал удаляется или отсутствует, экспрессия увеличивается). Как правило, степень увеличения или уменьшения, обусловленного такими элементами, пропорциональна количеству присутствующего сигнала или стимула; чем больше количество сигнала или стимула, тем больше увеличение или уменьшение экспрессии. Конкретные неограничивающие примеры включают цинк-индуцируемый промотор овечьего металлотионина (МТ); индуцируемый стероидным гормоном промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV); промоторную систему Т7 полимеразы (WO 98/10088); ингибируемую тетрациклином систему (Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)); тетрациклин-индуцируемую систему (Gossen, et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), см. также Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 512-518 (1998)); RU486-индуцируемую систему (Wang, et al., Nat. Biotech. 15: 239-243 (1997) и Wang, et al. Gene Ther. 4: 432-441 (1997)]; и рапамицин-индуцируемую систему (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100: 2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2: 1028-1032 (1996)). Другие индуцибельные регулирующие элементы, которые можно использовать в данном контексте, представляют собой элементы, которые регулируются конкретным физиологическим состоянием, например, температурой, острой фазой, развитием.

[0122] Элементы, регулирующие экспрессию, также включают нативные элементы гетерологичного полинуклеотида. Нативный регулирующий элемент (например, промотор) можно использовать, если желательно, чтобы экспрессия гетерологичного полинуклеотида имитировала нативную экспрессию. Нативный элемент можно использовать, если экспрессия гетерологичного полинуклеотида должна регулироваться временно, или в процессе развития, или в тканеспецифичной манере, или в ответ на специфические транскрипционные стимулы. Кроме того, можно использовать другие нативные элементы, регулирующие экспрессию, такие как интроны, участки полиаденилирования или консенсусные последовательности Козака.

[0123] Используемый здесь термин "функциональная связь", или "функционально связанный", относится к физическому или функциональному смежному размещению описанных компонентов, так, чтобы обеспечить их функционирование по назначению. В примере элемента, регулирующего экспрессию, находящегося в функциональной связи с нуклеиновой кислотой, связь такова, что регулирующий элемент модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Более конкретно, например, если две последовательности ДНК функционально связаны, это означает, что две ДНК расположены (цис или транс) в такой связи, что по меньшей мере одна из последовательностей ДНК способна оказывать физиологическое воздействие на другую последовательность.

[0124] Соответственно, модифицированные нуклеотидные последовательности, кодирующие человеческий белок FIX, а также векторы и плазмиды, включая вирусные векторы, такие как ленти- и парвовирусные векторы, в том числе векторы AAV, а также композиции на их основе могут содержать дополнительные нуклеотидные элементы. Такие элементы включают, без ограничения, одну или несколько копий последовательности ITR AAV, элемент, регулирующий экспрессию (например, промотор/энхансер), сигнал терминации транскрипции или стоп-кодон, 5'- или 3'-нетранслируемые участки (например, последовательности полиаденилирования (полиА)), которые фланкируют полинуклеотидную последовательность или интрон, например, весь интрон I геномной последовательности человеческого фактора IX (SEQ ID NO: 13), или его часть.

[0125] Нуклеотидные элементы дополнительно включают, например, филлерные или спейсерные полинуклеотидные последовательности, используемые, например, для улучшения упаковки и уменьшения присутствия загрязняющей нуклеиновой кислоты, например, для уменьшения упаковки плазмидного скелета. Как описано в данном документе, векторы AAV обычно содержат вставки ДНК, имеющие размеры в определенном диапазоне, который обычно составляет примерно от 4 до 5,2 т.п.о., или немного больше. Следовательно, если вставляемый фрагмент имеет более короткую последовательность, в него вводят спейсерную или филлерную последовательность, чтобы скорректировать длину до значения близкого или равного нормальному размеру геномной последовательности вируса, приемлемого для упаковки вектора AAV в вирусную частицу. В разных вариантах осуществления филлерная/спейсерная нуклеотидная последовательность представляет собой нетранслируемый (не кодирующий белок) сегмент нуклеиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления вектора AAV гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину менее 4,7 т.п.о., а филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая при объединении (например, путем вставки в вектор) с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью имеет общую длину в диапазоне примерно 3,0-5,5 т.о. или примерно 4,0-5,0 т.о., или примерно 4,4-4,8 т.о.

[0126] Интрон также может функционировать как филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность, обеспечивая длину вектора AAV, позволяющую упаковывать его в вирусную частицу. Интроны и фрагменты интронов (например, фрагмент интрона I FIX), которые функционируют как филлерные или спейсерные полинуклеотидные последовательности, также могут усиливать экспрессию. Включение интронного элемента может усилить экспрессию по сравнению с экспрессией в отсутствии интронного элемента (Kurachi et al, 1995, выше).

[0127] Использование интронов не ограничивается включением последовательностей интрона I фактора IX, также можно использовать другие интроны, которые могут быть связаны с тем же геном (например, если нуклеиновая кислота кодирует фактор IX, интрон получают из интрона, присутствующего в геномной последовательности фактора IX), или с совершенно другим геном, или с другой последовательностью ДНК. Соответственно, другие нетранслируемые (не кодирующие белок) участки нуклеиновой кислоты, такие как интроны, обнаруженные в геномных последовательностях родственных (похожих) генов (гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует весь белок, кодируемый геномной последовательностью, или его часть) и неродственных (непохожих) генов (гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует белок, который отличается от белка, кодируемого геномной последовательностью), также могут функционировать в качестве филлерных или спейсерных полинуклеотидных последовательностей настоящего изобретения.

[0128] Используемый здесь термин "фрагмент интрона I" относится к участку интрона I, имеющему длину примерно от 0,1 т.о. до 1,7 т.о., причем такой участок способен усиливать экспрессию фактора IX, как правило, примерно в 1,5 раза или более, на матрице плазмидного или вирусного вектора по сравнению с экспрессией FIX в отсутствии фрагмента интрона I. Более конкретный фрагмент представляет собой фрагмент интрона I размером 1,3 т.о. Неограничивающим примером последовательности интрона I фактора IX является интрон А, химерная молекула, состоящий из 5'-фрагмента и 3'-фрагмента первого интрона FIX, описанного в SEQ ID NO: 13.

[0129] Элементы, регулирующие экспрессию, ITR, последовательности полиA, филлерные или спейсерные полинуклеотидные последовательности могут иметь разную длину. В конкретных аспектах элемент, регулирующий экспрессию, ITR, полиA или филлерная или спейсерная полинуклеотидная последовательность представляет собой последовательность, длина которой составляет примерно 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60 -75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000 или 2000-2500 нуклеотидов.

[0130] Согласно одному неограничивающему варианту осуществления вектор AAV содержит капсид AAV, содержащий капсидный вариант 4-1 белка VP1 (SEQ ID NO: 4), и геном, обеспечивающий экспрессию гетерологичного гена в трансдуцированной клетке млекопитающего.

[0131] Капсид данного вектора может дополнительно содержать белки VP2 и VP3 помимо капсидного варианта 4-1 (SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 3 соответственно). В соответствии с некоторыми неограничивающими вариантами осуществления белое VP1 и белок VP2 находятся в стехиометрическом соотношении, составляющем примерно 1:1 (или в каком-либо другом соотношении), а отношение белка VP3 к VP1 или VP2, или к обоим VP1 и VP2, составляет примерно 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1 или имеет какое-либо другое значение.

[0132] В некоторых вариантах осуществления геном вектора AAV, включающий, без ограничения, вектор, капсид которого содержит белки капсидного варианта 4-1 (VP1, VP2, VP3), содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий белок фактора IX (FIX). В некоторых вариантах осуществления, белок FIX является белком дикого типа, а в других вариантах осуществления белок FIX содержит заместительную мутацию или другую мутацию, которая изменяет активность белка. В некоторых вариантах осуществления мутация увеличивает каталитическую активность FIX и/или активность белка в качестве прокоагулянта. В некоторых вариантах осуществления белок FIX представляет собой белок Padua FIX с заменой Arg на Ala в положении 338 белка FIX. Согласно некоторым вариантам осуществления ген, кодирующий человеческий FIX (включая Padua FIX), является кодон-оптимизированным, например, путем уменьшения или даже устранения динуклеотидов CpG. Возможны и другие виды оптимизации по кодонам.

[0133] В некоторых вариантах осуществления геном вектора AAV дополнительно содержит инвертированные концевые повторы (ITR) AAV2, расположенные в левом и правом концах (то есть на 5'- и 3'-концах соответственно) генома. В некоторых вариантах осуществления левый ITR содержит нуклеотиды, или состоит из нуклеотидов 1-141 последовательности SEQ ID NO: 12 (описан здесь как SEQ ID NO: 13), а правый ITR содержит нуклеотиды, или состоит из нуклеотидов 4097-4204 последовательности SEQ ID NO: 12 (описан здесь как SEQ ID NO: 20). Каждый ITR может быть отделен от других элементов векторного генома последовательностью нуклеиновой кислоты переменной длины.

[0134] В других вариантах осуществления геном вектора AAV дополнительно содержит элемент, регулирующий экспрессию, такой как промотор и, необязательно, энхансер. В некоторых вариантах осуществления геном вектора AAV содержит как промотор, так и энхансер, которые могут быть конститутивными, индуцибельными или тканеспецифичными. В некоторых вариантах осуществления промотор, или энхансер, или они оба являются тканеспецифичными. Согласно иллюстративному варианту осуществления и энхансер, и промотор предпочтительно проявляют активность в гепатоцитах, в отличие от клеток некоторых других типов. Согласно одному варианту осуществления энхансер представляет собой энхансер HCR-1 человеческого ApoE или его фрагмент, а промотор представляет собой промотор человеческого α-1-антитрипсина (AAT), или его часть. В некоторых вариантах осуществления геном вектора AAV содержит энхансер HCR-1 человеческого ApoE, содержащий нуклеотиды, или состоящий из нуклеотидов 152-472 последовательности SEQ ID NO: 12 (описан здесь как SEQ ID NO: 14), и промотор человеческого AAT, содержащий нуклеотиды, или состоящий из нуклеотидов 482-878 последовательности SEQ ID NO: 12 (описан здесь как SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления энхансер HCR-1 ApoE располагается на 5'-конце промотора AAT, причем последовательности могут быть смежными или они могут разделяться другой нуклеотидной последовательностью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления энхансер и промотор располагаются на 5'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор IX, и могут быть непосредственно присоединены к первому экзону гена фактора IX или они могут быть отделены от него 5'-нетранслируемой последовательностью (UTR) гена человеческого фактора IX, или какой-либо другой последовательностью, выполняющей роль спейсера. В иллюстративном неограничивающем варианте осуществления последовательность 5'-UTR содержит нуклеотиды или состоит из нуклеотидов 879-907 последовательности SEQ ID NO: 12.

[0135] В некоторых вариантах осуществления ген, кодирующий FIX, в том числе природный Padua FIX, содержит один или несколько интронов, присутствующих в геномной последовательности человеческого фактора IX. В других вариантах осуществления все интроны могут быть исключены, как в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10, которую здесь называют последовательность, кодирующая "FIX39". В случае присутствия интрон может функционировать как спейсерная или филлерная последовательность, как описано в данном документе. Полноразмерный ген может быть кодон-оптимизированным в результате уменьшения или устранения динуклеотидов CpG.

[0136] В конкретном неограничивающем варианте осуществления ген, кодирующий человеческий фактор IX, используемый в векторе AAV, содержит нуклеотиды или состоит из нуклеотидов 908-3731 последовательности SEQ ID NO: 12, которая кодирует FIX Padua и оптимизирована по кодонам путем устранения динуклеотидов CpG. Эта последовательность содержит экзон 1 (нуклеотиды 908-995 последовательности SEQ ID NO: 12), первый интрон (иногда известный как интрон I; нуклеотиды 996-2433 последовательности SEQ ID NO: 12) и экзоны 2-8 (нуклеотиды 2434-3731 последовательности SEQ ID NO: 12).

[0137] В некоторых вариантах осуществления за 3'-концом гена, кодирующего фактор IX, может следовать последовательность 3'-UTR гена человеческого фактора IX (например, без ограничения нуклеотиды 3732-3779 последовательности SEQ ID NO: 12 и/или полиаденилатная последовательность (полиА) гена фактора IX или другого гена. В одном неограничивающем примере последовательность полиA может быть получена из гена бычьего гормона роста (bGH) и может содержать нуклеотиды или состоять из нуклеотидов 3820-4047 последовательности SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления 3'UTR может быть пространственно отделен разными способами от последовательности полиA промежуточной последовательностью нуклеотидов.

[0138] В некоторых вариантах осуществления описанные выше элементы могут быть объединены в одном векторном геноме AAV. В соответствии с одним неограничивающим примером вектор AAV может иметь геном, содержащий в направлении от 5'-конца к 3'-концу левый ITR AAV, энхансер HCR-1 ApoE (или его фрагмент), промотор hAAT (или его фрагмент), фрагмент 5'UTR человеческого фактора IX, нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий фактор IX Padua (в том числе, необязательно, один или несколько интронов, таких как интрон I), фрагмент 3'UTR человеческого фактора IX, последовательность полиA bGH (или ее фрагмент), и справа - ITR AAV2. В некоторых из указанных вариантов осуществления левый ITR AAV2 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13; энхансер АРОE HCR-1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14; промотор hAAT имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15; 5' UTR имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16; ген, кодирующий FIX Padua (включая интрон I), кодирует белок FIX, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 10; 3' UTR имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18; участок полиА имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19; и правый ITR AAV2 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20.

[0139] Согласно некоторым вариантам осуществления геном вектора AAV содержит нуклеотиды или состоит из нуклеотидов 1-4204 последовательности SEQ ID NO: 12 или последовательности, идентичной ей по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В некоторых из указанных вариантов осуществления капсид содержит вариант 4-1 капсидного белка VP1 (SEQ ID NO: 4) и соответствующие капсидные белки VP2 и VP2. В конкретном неограничивающем варианте осуществления вектора AAV, обозначаемого здесь "AAV-FIX39-Padua", вектор содержит капсид, образованный капсидными вариантными белками 4-1 (VP1, VP2, VP3), и одноцепочечный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидам 1-4204 последовательности SEQ ID NO: 12.

[0140] "Пустые капсиды" AAV в соответствии с данным описанием не содержат векторный геном (следовательно, используется термин "пустой"), в отличие от "геном-содержащих капсид", которые содержит векторный геном AAV. Пустые капсиды представляют собой вирусоподобные частицы, поскольку они способны взаимодействовать с одним или несколькими антителами, взаимодействующими с интактным вирусом (геном-содержащим вектором AAV).

[0141] Пустые капсиды могут быть включены в препараты вектора AAV. При необходимости пустые капсиды AAV можно добавить к векторным препаратам AAV, или ввести отдельно индивидууму в соответствии с описанными здесь способами.

[0142] Не желая связывать себя теорией, авторы полагают, что пустые капсиды AAV связываются или взаимодействуют с антителами против векторов AAV и в результате они могут функционировать как ловушка, уменьшая инактивацию вектора AAV. Такая ловушка абсорбирует антитела, направленные против вектора AAV, тем самым увеличивая или улучшая трансдукцию клеток AAV-векторным трансгеном (введение трансгена) и затем увеличивает экспрессию транскрипта и/или кодируемого белка в клетке.

[0143] Пустые капсиды можно получить, очистить до нужной степени, и определить их количество. Например, титр пустых капсидов можно определить методом спектрофотометрии путем измерения оптической плотностью при длине волны 280 нм (на основе Sommer et al., Mol. Ther. 2003 Jan; 7 (l): 122-8).

[0144] Пустые AAV или пустые капсиды иногда встречаются в природных препаратах вектора AAV. Такие природные смеси можно использовать в настоящем изобретении или, при необходимости, их можно подвергнуть манипуляциям с целью увеличения или уменьшения числа пустых капсидов и/или вектора. Например, количество пустого капсида необязательно можно скорректировать до уровня, который предположительно может уменьшать ингибиторный эффект антител, способных взаимодействовать с вектором AAV, используемым для опосредованной вектором трансдукции гена индивидууму. Применение пустых капсидов описано в публикации США 2014/0336245.

[0145] В разных вариантах осуществления пустые капсиды AAV включают в состав композиций, содержащих векторы AAV, и/или вводят индивидууму. В конкретных аспектах количество пустых капсидов AAV в композиции может быть меньше количества вектора или равно количеству вектора (например, количество векторов AAV может превышать количество пустых капсидов AAV примерно в 1,5-100 раз, или отношение количества векторов AAV к количеству пустых капсидов AAV может составлять примерно 1:1). В других конкретных аспектах пустые капсиды AAV присутствуют в композиции в избытке по отношению к векторам AAV (например, отношение количества пустых капсидов AAV более чем в 1 раз превышает количество векторов AAV, например, количество пустых капсидов AAV может превышать количество векторов AAV примерно в 1,5-100 раз). Необязательно индивидуумы с низким или отрицательным титром NAb против AAV могут получать меньшее количество пустых капсидов (отношение количества пустых капсидов AAV к количеству векторов AAV может находиться в диапазоне от 1 до 10, 2-6 или примерно 4-5).

[0146] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтические композиции, содержащие векторы AAV, включающие векторы, которые содержат белки капсидного варианта 4-1 (VP1, VP2 и VP3), также содержат пустые капсиды в концентрации, превышающей концентрацию векторов AAV (то есть векторов, содержащих векторный геном) в композиции. Отношение пустых капсидов к векторам AAV может составлять примерно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10 к 1, или оно может иметь другие значения.

[0147] В некоторых вариантах осуществления пустые капсиды содержат такие же капсидные белки VP1, VP2 и VP3, что и векторы AAV. В других вариантах осуществления пустые капсиды содержат белки VP1, VP2 и VP3, отличающиеся по аминокислотной последовательности от аналогичных белков, присутствующих в векторах AAV. Как правило, хотя и не обязательно, если последовательности капсидных белков пустых капсидов и капсидов векторов AAV не идентичны, они могут относится к одному серотипу.

[0148] Согласно некоторым вариантам осуществления композиция содержит вектор AAV, описанный здесь как AAV-FIX39-Padua (или вектор, который содержит такой же капсид и геномную последовательность, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную геномной последовательности указанного вектора) и необязательно избыток пустых капсидов, содержащих такие же капсидные белки, где отношение пустых капсидов к вектору AAV составляет примерно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10 к 1, или имеет какое-либо другое значение. В некоторых вариантах осуществления отношение AAV-FIX39-Padua к пустым капсидам в композиции составляет примерно 1:5. В других вариантах осуществления композиции, содержащие AAV-FIX39-Padua и пустые капсиды, вводят индивидууму, страдающему от гемофилии B, включающей тяжелую, умеренную или легкую гемофилию B.

[0149] Термин "селективный маркерный ген" относится к гену, который при экспрессии придает трансдуцированной клетке селектируемый фенотип, такой как устойчивость к антибиотикам (например, к канамицину). "Репортерный" ген представляет собой ген, который обеспечивает детектируемый сигнал. Неограничивающим примером репортерного гена является ген люциферазы.

[0150] Нуклеиновые кислоты, полинуклеотиды, экспрессирующие векторы (например, векторные геномы), плазмиды, в том числе их модифицированные формы, могут быть получены с использованием разных стандартных методов клонирования, технологий рекомбинантных ДНК, посредством экспрессии в клетках или трансляции in vitro и химического синтеза. Чистоту полинуклеотидов можно определить с помощью методов секвенирования, гель-электрофореза и т.п. Например, нуклеиновые кислоты можно выделить с помощью методов гибридизации или скрининга с использованием компьютерной базы данных. Такие методы включают, без ограничения: (1) гибридизацию библиотек геномной ДНК или кДНК с зондами с целью обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей; (2) скрининг с использованием антител с целью обнаружения полипептидов, имеющих общие структурные признаки, например, с использованием экспрессионной библиотеки; (3) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на матрице геномной ДНК или кДНК с использованием праймеров, способных к отжигу с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью; (4) компьютерный поиск родственных последовательностей в базах данных, содержащих информацию о последовательностях; и (5) дифференциальный скрининг вычитаемой библиотеки нуклеиновых кислот.

[0151] Термин "выделенный" при использовании в качестве определения композиции означает, что композиции получены руками человека, или отделены, полностью или частично, от их природной среды, присутствующей in vivo. Как правило, выделенные композиции практически не содержат одно или несколько веществ, с которыми они обычно связаны в природе, например, один или несколько белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, компонентов клеточной мембраны. Термин "выделенный" не исключает сочетаний, полученных руками человека, например, рекомбинантного последовательности вектора (например, rAAV) или вирусной частицы, которая упаковывает или инкапсидирует векторный геном, и фармацевтической композиции. Термин "выделенный" также не исключает альтернативные физические формы композиции, такие как гибриды/химеры, мультимеры/олигомеры, модифицированные (например, фосфорилированные, гликозилированные, липидированные) формы, дериватизированные формы или формы, экспрессированные в клетках-хозяевах, полученных руками человека.

[0152] Способы и варианты применения настоящего изобретения предоставляют средства доставки (трансдукции) гетерологичных полинуклеотидов (трансгенов) в клетки-хозяева, в том числе в делящиеся и/или неделящиеся клетки. Кроме того, последовательности рекомбинантных векторов (например, rAAV), векторные геномы, частицы рекомбинантных вирусов, способы, варианты применения и фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать в способе доставки, введения или предоставления нуклеиновой кислоты или белка индивидууму, нуждающемуся в этом, как в способе лечения. В данном аспекте белок может продуцироваться в результате транскрипции нуклеиновой кислоты in vivo в организме индивидуума. У индивидуума может наблюдаться улучшение состояния благодаря нуклеиновой кислоте или белку, или индивидуум может нуждаться в нуклеиновой кислоте или белке, поскольку у индивидуума присутствует дефицит нуклеиновой кислоты или белка, или поскольку продукция нуклеиновой кислоты или белка в организме индивидуума может привести к определенному терапевтическому эффекту, и может использоваться как способ лечения или иным образом.

[0153] Как правило, рекомбинантные последовательности ленти- или парвовирусных векторов (например, AAV), плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, способы и варианты применения можно использовать для доставки любого гетерологичного полинуклеотида (трансгена) с биологическим эффектом с целью лечения или улучшения одного или нескольких симптомов, связанных с любым расстройством, опосредованным недостаточной или нежелательной экспрессией генов. Рекомбинантные последовательности ленти- или парвовирусных векторов (например, AAV), плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, способы и варианты применения можно использовать для лечения разных болезненных состояний.

[0154] С помощью нуклеиновых кислот, векторов, рекомбинантных векторов (например, rAAV), векторных геномов и рекомбинантных вирусных частиц, способов и вариантов применения настоящего изобретения можно лечить генетические заболевания. Как правило, болезненные состояния делят на два класса: дефицитные состояния, зачастую характеризующиеся дефицитом ферментов, которые обычно наследуются рецессивным способом, и несбалансированные состояния, по меньшей мере иногда ассоциированные с регуляторными или структурными белками, которые наследуются доминантным способом. В случае заболеваний, обусловленных дефицитным состоянием, перенос гена можно использовать для введения нормального гена в пораженные ткани с целью заместительной терапии, а также для получения животных моделей заболевания с использованием антисмысловых мутаций. В случае несбалансированных болезненных состояний перенос гена можно использовать для создания болезненного состояния в модельной системе, которую затем можно использовать для борьбы с болезненным состоянием. Кроме того, сайт-специфическую интеграцию нуклеотидных последовательностей можно использовать для коррекции дефектов.

[0155] Иллюстративные примеры болезненных состояний включают, без ограничения: нарушения коагуляции крови, такие как гемофилия А, гемофилия В, талассемия и анемия.

[0156] Настоящее изобретение относится к способам лечения и вариантам применения, в которых используются нуклеиновые кислоты, векторы, рекомбинантные векторы (например, rAAV), векторные геномы и рекомбинантные вирусные частицы настоящего изобретения. Способы и варианты применения настоящего изобретения широко применяются для обеспечения, или усиления, или стимулирования экспрессии или функционирования гена, например, путем добавления или замены генов.

[0157] В одном варианте осуществления способ или вариант применения настоящего изобретения включает: (a) получение модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, например, в векторе или векторном геноме, где модифицированная нуклеотидная последовательность функционально связана с элементом, регулирующим экспрессию, обеспечивающим транскрипцию указанной последовательности; и (b) введение млекопитающему такого количества модифицированной нуклеиновой кислоты, которое обеспечивает экспрессию фактора IX в организме млекопитающего.

[0158] В другом варианте осуществления способ или вариант применения настоящего изобретения включает доставку или перенос модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность фактора IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, в организм или клетку млекопитающего путем введения в организм или клетку млекопитающего вирусной (например, AAV) частицы или нескольких вирусных (например, AAV) частиц (например, таких как капсидные варианты (например, 4-1)), содержащие векторный геном, где векторный геном, содержит модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор IX, такую как FIX, содержащая уменьшенное число динуклеотидов CpG (и, необязательно, ITR, интрон, полиA, филлерную/спейсерную полинуклеотидную последовательность), и тем самым обеспечения доставки или переноса модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, в организм или клетку млекопитающего.

[0159] В конкретных аспектах раскрытых здесь способов и вариантов применения настоящего изобретения экспрессия нуклеиновой кислоты обеспечивает терапевтическое улучшение у млекопитающего (такого как человек). В более конкретном аспекте экспрессия фактора IX обеспечивает терапевтическое улучшение у млекопитающего (такого как человек), которое страдает от гемофилии B. В разных других конкретных аспектах в векторную последовательность вставляют филлерную/спейсерную полинуклеотидную последовательность, так чтобы суммарная длина указанной последовательности и последовательности модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, такой как FIX с уменьшенным числом динуклеотидов CpG, находилась в диапазоне примерно от 3,0 до 5,5 т.о., или примерно от 4,0 до 5,0 т.о., или примерно от 4,3 до 4,8 т.о.

[0160] Способы и варианты применения настоящего изобретения включают способы лечения, обеспечивающие любой терапевтический или благоприятный эффект. Разные способы и варианты применения настоящего изобретения также включают ингибирование, снижение или уменьшение одного или нескольких неблагоприятных (например, физических) симптомов, расстройств, болезней, заболеваний или осложнений, вызванных или связанных с указанным заболеванием. В случае нарушения кровотечения, такого как гемофилия, терапевтический или благоприятный эффект включает, без ограничения, уменьшение синяков, уменьшение времени свертывания крови, уменьшение эпизодов кровотечения (их продолжительности, тяжести, частоты). Например, уменьшение продолжительности, тяжести или частоты эпизодов суставного или церебрального (мозгового) кровотечения. В случае таких нарушений кровотечения, как гемофилия, терапевтический или благоприятный эффект также включает, без ограничения, возможность уменьшения дозы дополнительного белкового фактора свертывания крови (например, белка фактора IX), или прекращения введения дополнительного белкового фактора свертывания крови (например, белка фактора IX).

[0161] Таким образом, терапевтический или благоприятный эффект лечения относится к любому объективному или субъективному измеримому или детектируемому улучшению или преимуществу, наблюдающемуся у конкретного индивидуума. Терапевтический или благоприятный эффект необязательно может представлять собой полное купирование всех неблагоприятных симптомов, расстройств, заболеваний или осложнений заболеваний, или одного из них. Таким образом, удовлетворительный клинический результат достигается, если наблюдается постепенное улучшение или частичное сокращение неблагоприятного симптома, расстройства, болезни или осложнения, вызванного или связанного с заболеванием, или наблюдается ингибирование, снижение, уменьшение, подавление, предотвращение, ограничение или сдерживание ухудшения или прогрессирования одного или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней или осложнений, вызванных или связанных с указанным заболеванием, в течение короткого или продолжительного периода времени (например, в течение нескольких часов, дней, недель, месяцев и т.д.).

[0162] Композиции, такие как нуклеиновые кислоты, векторы, рекомбинантные векторы (например, rAAV), векторные геномы и рекомбинантные вирусные частицы, содержащие векторные геномы, можно вводить индивидууму, нуждающемуся в этом, в достаточном или эффективном количестве. Термин "эффективное количество" или "достаточное количество" относится к количеству, которое при введении в виде одной или нескольких доз, отдельно или в сочетании с одной или несколькими другими композициями (терапевтическими средствами, такими как лекарственные средства), способами лечения, протоколами или терапевтическими режимами, обеспечивает детектируемый ответ в течение любого промежутка времени (длительный или кратковременный), ожидаемый или желательный результат, или улучшение у индивидууму любой измеряемой или детектируемой степени, или на протяжении любого периода времени (например, в течение нескольких минут, часов, дней, месяцев, лет или до излечения).

[0163] Специалист в данной области может определить, достаточно ли ввести одну дозу rAAV/вектора или следует ввести несколько доз rAAV/вектора. Например, если уровни FIX снижаются ниже заранее определенного уровня (например, меньше минимального, который обеспечивает терапевтическое преимущество), специалист в данной области может определить, нужно ли вводить дополнительные дозы rAAV/вектора.

[0164] Доза, необходимая для достижения терапевтического эффекта, например, доза в векторных геномах/на килограмм массы тела (вг/кг) может варьировать в зависимости от нескольких факторов, включающих, без ограничения: способ введения, уровень экспрессии гетерологичного полинуклеотида, необходимый для достижения терапевтического эффекта, конкретное заболевание, подлежащее лечению, иммунный ответ хозяина на вирусный вектор, иммунный ответ хозяина на гетерологичный полинуклеотид или продукт экспрессии (белок) и стабильность экспрессируемого белка. Специалист в данной области может определить диапазон доз rAAV/векторного генома, подходящий для лечения пациента, имеющего конкретное заболевание или расстройство, на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов. Как правило, дозы, позволяющие достичь терапевтического эффекта, варьируют, по меньшей мере, от 1×10⁸ или более, например, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹, 1×10¹², 1×10¹³, 1×10¹⁴, или более векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы индивидуума.

[0165] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV, такого как, например, AAV-FIX39-Padua, или вектор, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную его геномной последовательности, представляет собой дозу, которая при введения индивидууму, такому как человек, страдающий от гемофилии B, или от другого дефицита активности фактора IX, является достаточной для превращения тяжелой гемофилии B в умеренную или легкую гемофилию B, или даже к видимому отсутствию заболевания. В других вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой дозу, достаточную для того, чтобы позволить индивидууму-человеку с гемофилией B полностью отказаться от заместительной терапии фактора IX, или уменьшить частоту введения средства, замещающего FIX, используемого для поддержания адекватного гемостаза. Как известно специалистам в данной области, фактор-заместительная терапия является в настоящее время стандартным способом лечения гемофилии В, но требует частых инъекций полученного с помощью рекомбинантного метода человеческого фактора IX, чтобы компенсировать неспособность пациента продуцировать достаточные уровни функционального фактора свертывания крови.

[0166] Широко известно, что тяжелая гемофилия В характеризуется частыми кровотечениями (например, по меньшей мере один или два раза в неделю), обычно спонтанными (без предшествующей травмы), в мышцах или суставах индивидуума. При тяжелой гемофилии B наблюдается менее 1% активности FIX, присутствующей у здоровых людей. Общепризнанно, что у людей с умеренной гемофилией B кровотечения наблюдаются реже, чем у людей с тяжелой гемофилией B, например, примерно один раз в месяц, однако кровотечения длятся дольше, чем обычно после операции, травмы или лечения зубов. Общепризнанно также, что у индивидуумов-людей с умеренной формой заболевания спонтанные кровотечения наблюдаются редко. При умеренной гемофилии B активность FIX составляет l%-5% от нормального уровня. У индивидуумов-людей с легкой гемофилией B чрезмерные кровотечения, если они вообще присутствуют, наблюдаются только после операции или серьезной травмы. При легкой гемофилии активность FIX обычно составляет 6%-40% от нормального уровня. Как правило, у индивидуумов, которые считаются здоровыми и не имеют симптомов гемофилии B, активность FIX находится в диапазоне от 50 до 150% от нормального уровня. Дополнительную информацию можно найти в Fijnvandraat, et al., Diagnosis and management of hemophilia, Br. Med. J., 344: 36-40 (2012).

[0167] Активность фактора IX можно измерить разными способами, известными специалистам в данной области. Например, одним неограничивающим примером является одностадийный анализ времени образования и активности тромбопластина (APTT), используемый для определения коагулирующей активности FIX в образце плазмы, полученном от индивидуума. Активность FIX обычно выражают в международных единицах (МЕ), где 1 МЕ определяют как коагулирующую активность FIX, присутствующую в 1 мл объединенной плазмы, полученной от нормальных доноров. В соответствии с данным соглашением тяжелая гемофилия B характеризуется уровнем FIX менее 0,01 МЕ/мл, умеренное заболевание характеризуется уровнем FIX 0,02-0,05 МЕ/мл, легкое заболевание характеризуется уровнем FIX 0,06-0,40 МЕ/мл и отсутствие заболевания соответствует уровню FIX 0,50-1,50 МЕ/мл.

[0168] Как будет понятно специалисту в данной области, вариант фактора IX, такой как природный вариант FIX Padua, который обладает более высокой каталитической активностью, чем человеческий FIX дикого типа, может обеспечивать заданный уровень активности FIX (например, 1 МЕ/мл) при более низкой концентрации активного белка по сравнению с "отличным от Padua" FIX.

[0169] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV, включающего, например, AAV-FIX39-Padua, или вектор, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, представляет собой дозу, которая при введении индивидууму, например человеку, с тяжелой, умеренной или легкой гемофилией В, является достаточной для достижения в плазме активности FIX, составляющей примерно 1%, 2%, 3%, 4% 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% или более от нормальной активности FIX. В других вариантах осуществления терапевтически эффективная доза представляет собой дозу, которая позволяет достичь 1% или более активности FIX у индивидуума, в противном случае лишенного такой активности, например, 1,5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25% 25-30% или более активности FIX.

[0170] В случае лечения индивидуума с гемофилией B терапевтически эффективная доза вектора AAV, включающего, например, AAV-FIX39-Padua, или вектор, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора, по меньшей мере, на 98% или 99%, представляет собой дозу, позволяющую достичь желательный терапевтический эффект, которая может составлять по меньшей мере l×10¹⁰ векторных геномов (вг) на килограмм (вг/кг) массы тела индивидуума, или примерно от l×10¹⁰ до l×10¹¹ вг/кг массы тела индивидуума, или примерно от l×10¹¹ до l×10¹² вг/кг (например, от l×10¹¹ до 2×10¹¹ вг/кг, или примерно от 2×10¹¹ до 3×10¹¹ вг/кг, или примерно от 3×10¹¹ до 4×10¹¹ вг/кг или примерно от 4×10¹¹ до 5×10¹¹ вг/кг или примерно от 5×10¹¹ до 6×10¹¹ вг/кг, или примерно от 6×10¹¹ до 7×10¹¹ вг/кг, или примерно от 7×10¹¹ до 8×10¹¹ вг/кг, или примерно от 8×10¹¹ до 9×10¹¹ вг/кг, или примерно от 9×10¹¹ до 1×10¹² вг/кг) массы тела индивидуума, или примерно от l×10¹² до 1×10¹³ вг/кг массы тела индивидуума. Другие дозы, обеспечивающие достижение желательного терапевтического эффекта, могут находиться в диапазоне примерно от 5×10¹⁰ до 1×10¹⁰ векторных геномов (вг) на килограмм (вг/кг) массы тела индивидуума, или в диапазоне примерно от l×10¹⁰ до 5×10¹¹ вг/кг массы тела индивидуума, или в диапазоне примерно от 5×10¹¹ до 1×10¹² вг/кг массы тела индивидуума, или в диапазоне примерно от l×10¹² до 5×10¹³ вг/кг массы тела индивидуума. В других вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV составляет примерно 2,0×10¹¹ вг/кг, 2,1×10¹¹ вг/кг, 2,2×10¹¹ вг/кг, 2,3×10¹¹ вг/кг, 2,4×10¹¹ вг/кг, 2,5×10¹¹ вг/кг, 2,6×10¹¹ вг/кг, 2,7×10¹¹ вг/кг, 2,8×10¹¹ вг/кг, 2,9×10¹¹ вг/кг, 3,0×10¹¹ вг/кг, 3,1×10¹¹ вг/кг, 3,2×10¹¹ вг/кг, 3,3×10¹¹ вг/кг, 3,4×10¹¹ вг/кг, 3,5×10¹¹ вг/кг, 3,6×10¹¹ вг/кг, 3,7×10¹¹ вг/кг, 3,8×10¹¹ вг/кг, 3,9×10¹¹ вг/кг, 4,0×10¹¹ вг/кг, 4,1×10¹¹ вг/кг, 4,2×10¹¹ вг/кг, 4,3×10¹¹ вг/кг, 4,4×10¹¹ вг/кг, 4,5×10¹¹ вг/кг, 4,6×10¹¹ вг/кг, 4,7×10¹¹ вг/кг, 4,8×10¹¹ вг/кг, 4,9×10¹¹ вг/кг, 5,0×10¹¹ вг/кг, 5,1×10¹¹ вг/кг, 5,2×10¹¹ вг/кг, 5,3×10¹¹ вг/кг, 5,4×10¹¹ вг/кг, 5,5×10¹¹ вг/кг, 5,6×10¹¹ вг/кг, 5,7×10¹¹ вг/кг, 5,8×10¹¹ вг/кг, 5,9×10¹¹ вг/кг, 6,0×10¹¹ вг/кг, 6,1×10¹¹ вг/кг, 6,2×10¹¹ вг/кг, 6,3×10¹¹ вг/кг, 6,4×10¹¹ вг/кг, 6,5×10¹¹ вг/кг, 6,6×10¹¹ вг/кг, 6,7×10¹¹ вг/кг, 6,8×10¹¹ вг/кг, 6,9×10¹¹ вг/кг, 7,0×10¹¹ вг/кг, 7,1×10¹¹ вг/кг, 7,2×10¹¹ вг/кг, 7,3×10¹¹ вг/кг, 7,4×10¹¹ вг/кг, 7,5×10¹¹ вг/кг, 7,6×10¹¹ вг/кг, 7,7×10¹¹ вг/кг, 7,8×10¹¹ вг/кг, 7,9×10¹¹ вг/кг, или 8,0×10¹¹ вг/кг, или она может представлять собой какую-либо другую дозу. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua, или вектор, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции отдельно или в сочетании с пустыми капсидами такого же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющему примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющему какое-либо другое значение.

[0171] Дозы, содержащие "количество, эффективное" или "количество, достаточное" для лечения (например, для улучшения или обеспечения терапевтического эффекта или улучшения) обычно обеспечивают эффективный ответ по одному, нескольким или всем неблагоприятным симптомам, последствиям или осложнениям болезни, по одному или нескольким из неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий или осложнений, например, вызванных или связанных с указанным заболеванием, в измеримой степени, хотя уже уменьшение, снижение, ингибирование, подавление, ограничение или контролирование прогрессирования или ухудшения заболевания являются удовлетворительным результатом.

[0172] Эффективное количество или достаточное количество можно, но не обязательно, водить в один прием, а можно вводить его в несколько приемов и, необязательно, его можно вводить отдельно или в сочетании с другой композицией (например, с другим средством), другим способом лечения, протоколом или терапевтическим режимом. Например, количество можно пропорционально повысить, в зависимости от потребностей индивидуума, типа, статуса и степени тяжести заболевания, или побочных эффектов лечения (если таковые присутствуют). Кроме того, эффективное количество или достаточное количество может не быть эффективным или достаточным, если его вводят в один или несколько приемов в отсутствии второй композиции (например, другого лекарства или средства), другого способа лечения, протокола или терапевтического режима, поскольку, чтобы достичь эффективности или достаточности для данного индивидуума, могут потребоваться дополнительные дозы, количество или период введения которых может быть больше или меньше указанных значений, или другие композиции (например, лекарства или средства), способы лечения, протоколы или терапевтические режимы. Эффективные количества также включают количества, которые приводят к уменьшению использования другого способа лечения, терапевтического режима или протокола, такого как введение рекомбинантного белка фактора свертывания с целью лечения нарушения свертывания крови (например, гемофилии А или В).

[0173] Эффективное количество или достаточное количество не обязательно является эффективным для всех индивидуумов, подлежащих лечению, а также для большинства подлежащих лечению индивидуумов в данной группе или популяции. Эффективное количество или достаточное количество означает эффективность или достаточность для конкретного индивидуума, а не группы или популяции в целом. В таких способах у некоторых индивидуумов может наблюдаться более сильный или мене сильный ответ, нет ответ на данный способ лечения или вариант применения может совсем отсутствовать.

[0174] Термин "улучшать" относится к детектируемому или измеримому улучшению болезни или симптома индивидуума или лежащего в их основе клеточного ответа. Детектируемое или измеримое улучшение включает субъективное или объективное уменьшение, снижение, ингибирование, подавление, ограничение или контролирование проявления, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности заболевания или осложнений, вызванных или связанных с этим заболеванием, или улучшение симптома или основной причины или последствий заболевания, или обратный ход развития заболевания.

[0175] Таким образом, успешный результат лечения может приводить к "терапевтическому эффекту" или "улучшению" в результате снижения, уменьшения, ингибирования, подавления, ограничения, контролирования или предотвращения проявления, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности заболевания или одного или нескольких неблагоприятных симптомов, или лежащих в основе причин, или последствий заболевания у индивидуума. Поэтому способы лечения и применения, влияющие на одну или несколько лежащих в основе причин заболевания или на один или несколько неблагоприятных симптомов, считаются полезными. Снижение или уменьшение ухудшения, например, стабилизация заболевания или его неблагоприятного симптома, также является успешным результатом лечения.

[0176] Следовательно, терапевтическая польза или улучшение не обязательно представляют собой полное исчезновение заболевания или одного, большинства или всех неблагоприятных симптомов, осложнений, последствий или причин, связанных с данным заболеванием. Таким образом, удовлетворительный результат достигается при постепенном улучшении болезни индивидуума, или при частичном уменьшении, снижении, ингибировании, подавлении, ограничении, контролировании или предотвращении проявления, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности, или ингибирования или обратного хода заболевания (например, стабилизации одного или нескольких симптомов или осложнений) в течение короткого или длительного периода времени (нескольких часов, дней, недель, месяцев и т. д.). Эффективность способа или варианта применения, такого как лечение, обеспечивающее потенциальную терапевтическую пользу или улучшение заболевания, можно определить разными способами, например, путем измерения времени образования сгустка крови и т.д.

[0177] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой дозу, которая при введении индивидууму-человеку с гемофилией B является достаточной для того, чтобы обеспечить активность FIX выше определенного уровня в течение длительного периода времени. В некоторых из указанных вариантов осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 1% от нормальной активности FIX у людей с гемофилией B в течение продолжительного периода, составляющего по меньшей мере 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года, 3,5 года, 4 года, 4,5 года, 5 лет, 5,5 лет, 6 лет, 6,5 лет, 7 лет, 7,5 лет, 8 лет, 8,5 лет, 9 лет, 9,5 лет, 10 лет и более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 5% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 10% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет, или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 15% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 20% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 25% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 30% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза AAV-вектора обеспечивает по меньшей мере 35% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 40% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В других вариантах осуществления эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 45% от нормальной активности FIX в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 месяцев, или не менее 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 лет или более. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0178] В соответствии с другими вариантами осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой дозу, которая при введении человеку с тяжелой или умеренной гемофилией B, является достаточной для того, чтобы обеспечить активность FIX, которая составляет по меньшей мере 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% или 45% от нормального уровня, в течение продолжительного периода, составляющего не менее 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления доза AAV-FIX39-Padua или вектора AAV, содержащего такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, составляет примерно 5,0×10¹¹ вг/кг, причем указанный вектор можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0179] Можно видеть, что у некоторых индивидуумов-людей, которые получили терапевтически эффективную дозу вектора AAV, включающего, например, AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, активность FIX, обусловленная вектором, уменьшается в течение длительного периода времени (например, в течение нескольких месяцев или лет) до уровня, который больше не считается достаточным (например, когда индивидуум имеет симптомы и/или активность FIX, характерные для умеренной или тяжелой гемофилии B). В таком случае индивидууму можно снова ввести дозу вектора AAV такого же типа, что и при первоначальном введении. В других вариантах осуществления, особенно если у индивидуума развилась иммунная реакция на исходный вектор, пациенту можно ввести вектор AAV, предназначенный для экспрессии FIX в клетках-мишенях, но содержащий капсид другого или вариантного серотипа, который обладает меньшей иммунореактивностью, чем первый вектор AAV.

[0180] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой дозу, которая при введении индивидууму-человеку с гемофилией B является достаточной для того, чтобы уменьшить или даже исключить потребность индивидуума в заместительной терапии рекомбинантным человеческим фактором IX, обеспечивающей поддержание надлежащего гемостаза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV может уменьшить частоту, с которой средний человек, страдающий от умеренной или тяжелой гемофилии B, нуждается в заместительной терапии FIX для поддержания надлежащего гемостаза, примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. В соответствующих вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV позволяет уменьшить дозу рекомбинантного человеческого фактора IX, в которой нуждается средний индивидуум-человек с умеренной или тяжелой гемофилией В для поддержания надлежащего гемостаза, примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0181] В других вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой дозу, которая при введении индивидууму-человеку с тяжелой гемофилией B является достаточной для того, чтобы уменьшить или даже устранить спонтанные кровотечения в суставах. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV может уменьшить частоту случаев спонтанного кровотечения в суставах человека с тяжелой гемофилией B примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по сравнению со средним, не подвергавшимся лечению индивидуумом-человеком с тяжелой гемофилией B. Кровотечение в суставах можно детектировать методом магнитно-резонансной томографии или ультрасонографии суставов, или с помощью других методов, известных специалистам в данной области. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную геномной последовательности указанного вектора, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции отдельно или в сочетании с пустыми капсидами такого же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющему какое-либо другое значение.

[0182] Предыдущие попытки разработать векторы AAV для лечения гемофилии были безуспешными, как полагают, по меньшей мере частично вследствие сильного иммунного ответа на капсид AAV, обнаруженного в предыдущих клинических испытаниях. (см., например, Nathwani, et al, NEJM 2011; 365 (25): 2357-2365, и Manno et al., Nat Med 2006; 12 (3): 342-347). Проводимое в настоящее время клиническое испытание демонстрирует, что некоторые варианты осуществления векторов AAV, описанных в настоящем документе, могут обеспечивать высокий уровень активности FIX у людей с тяжелой гемофилией B при отсутствии или минимальном уровне иммунного ответа даже через 6 месяцев после введения векторов AAV (пример 5). Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой терапевтически эффективную дозу вектора AAV, которая при введении индивидууму с тяжелой или умеренной гемофилией B обеспечивает активность FIX, достаточную для поддержания гемостаза, при отсутствии или минимальном уровне иммунного ответа в течение значительного периода время. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ может представлять собой врожденный иммунный ответ, гуморальный иммунный ответ или клеточный иммунный ответ, или даже он может включать все три типа иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ может быть направлен против капсида, векторного генома и/или белка фактора IX, продуцируемого в трансдуцированных клетках.

[0183] Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV обеспечивает активность FIX, достаточную для поддержания гемостаза у индивидуума с гемофилией B, при отсутствии или минимальном уровне гуморального (т.е. опосредованного антителами) иммунного ответа против капсида, генома и/или белка фактора IX, продуцируемого в трансдуцированных клетках. Опосредованный антителами ответ на вирус или вирусоподобные частицы, такие как векторы AAV, можно определить путем измерения титра антител в сыворотке или плазме индивидуума с помощью методов, известных специалистам в области иммунологии. С помощью таких методов можно измерить титр антитела против любого компонента вектора AAV, такого как капсидный белок, или генный продукт, кодируемый векторным геномом и продуцирующийся в трансдуцированных клетках, такой как Factor IX Padua (или другой вариант FIX). Титры антител обычно выражают в виде отношения, указывающего разведение, при котором сигнал антитела перестает обнаруживаться с помощью конкретного анализа, используемого для детекции присутствия антитела. Можно использовать разные степени разведения, например, в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, или другую степень разведения. Можно использовать любой анализ, позволяющий определить присутствие антитела, включающий, без ограничения, ELISA, FACS или анализ с использованием репортерного гена, например, описанный в WO 2015/006743. Кроме того, можно использовать и другие анализы, известные специалистам в данной области. Титры антител можно измерять в разные моменты времени после первоначального введения вектора AAV.

[0184] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV обеспечивает по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или более активности FIX у индивидуумов с гемофилией В, при этом титр антител против капсида, генома и/или белка фактора IX (такого как FIX Padua), продуцируемого в трансдуцированных клетках, не превышает 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 и более, если его определяют через 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, или спустя более длительный период после введения индивидуумам вектора AAV. Согласно иллюстративному не ограничивающему варианту осуществления вектор AAV обеспечивает по меньшей мере 20% активности FIX у индивидуума с тяжелой гемофилией B, при этом титр антител против капсида и/или фактора IX, продуцируемого трансдуцированными клетками, не превышает 1:2, 1:3 или 1:4, если активность и титр измеряют через 6 месяцев после введения вектора AAV. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0185] Как указано выше, предыдущие исследования с использованием AAV-опосредованной генной терапии для лечения гемофилии B продемонстрировали индукцию самоограничивающегося иммунного ответа, который не позволяет терапии быть эффективной в течение значительного периода времени без введения высоких доз стероидов, вызывающих подавление иммунного ответа. Важным фактором, по-видимому, является клеточный иммунный ответ, который устраняет клетки печени, трансдуцированные исследуемыми векторами AAV. Данный эффект можно детектировать на основании повышения уровня ферментов печени, свидетельствующего о повреждении печени, а также на основании наличия капсид-специфичных Т-клеток у индивидуумов.

[0186] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV обеспечивает активность FIX, достаточную для поддержания гемостаза у индивидуума с гемофилией B, не индуцируя при этом клеточный иммунный ответ, или индуцируя минимальный клеточный иммунный ответ против белка капсида и/или фактора IX, продуцируемого в трансдуцированных клетках. Клеточный иммунный ответ можно детектировать, по меньшей мере, двумя способами: путем анализа активности Т-клеток, специфичных к капсидным белкам или к фактору IX, и путем определения повышенных уровней ферментов печени, свидетельствующих о повреждении гепатоцитов.

[0187] В некоторых вариантах осуществления клеточный иммунный ответ определяют путем анализа активности Т-клеток, специфичных для капсидных белков и/или белка фактора IX, продуцируемого трансдуцированными клетками печени. В данной области известны разные анализы активности Т-клеток. В одном иллюстративном неограничивающем варианте осуществления Т-клеточный ответ определяют путем сбора мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) у индивидуума, которому введен вектор AAV с целью лечения гемофилии В. Затем клетки инкубируют с пептидами, полученными из капсидного белка VP1, используемого для получения вектора, и/или из белка фактора IX, такого как FIX Padua, продуцируемого трансдуцированными клетками печени. Т-клетки, способные специфически распознавать капсидный белок или белок фактора IX, стимулируют высвобождение цитокинов, таких как гамма-интерферон или другой цитокин, которые затем можно обнаружить и количественно определить с помощью анализа ELISPOT или другого анализа, известного специалистам в данной области (см., например, Manno, et al., Nat Med 2006, 12 (3): 342-347). Т-клеточный ответ можно регистрировать до и через разные периоды времени после введения индивидууму вектора AAV с целью лечения гемофилии B, например, еженедельно, ежемесячно или с каким-либо другим временным интервалом. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV обеспечивает активность FIX, достаточную для поддержания гемостаза у индивидуума с гемофилией B (например, активность FIX, составляющую по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30% или более), и при этом индуцирует Т-клеточный ответ, который по данным ELISPOT не превышает 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 или более бляшкообразующих единиц на 1 миллион РВМС, где анализы проводят еженедельно, ежемесячно или с каким-либо другим интервалом времени после введения вектора AAV, или через 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 год, 2 года, или спустя некоторый другой период времени после введения вектора AAV. В некоторых из указанных вариантов осуществления с помощью анализа ELISPOT определяют продукцию интерферона-гамма (или какого-либо другого цитокина), стимулированную пептидами, полученными из белка капсида вектора AAV, или из белка фактора IX (включающего FIX Padua или другой вариант), продуцируемого трансдуцированными клетками печени. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0188] В качестве показателя клеточного иммунного ответа против трансдуцированных гепатоцитов можно использовать уровень ферментов печени, превышающий нормальный, который можно определить с помощью стандартных методов. Без связи с какой-либо теорией, авторы полагают, что Т-клетки, специфичные к определенным векторам AAV, таким как используемые в предыдущих клинических испытаниях, могут атаковать и уничтожать трансдуцированные гепатоциты, которые временно высвобождают печеночные ферменты в кровоток. Примеры ферментов печени включают аланинаминотрансферазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST) и лактатдегидрогеназу (LDH), однако также можно отслеживать уровни других ферментов, свидетельствующие о повреждении печени. Нормальный уровень указанных ферментов в кровотоке обычно определяют как диапазон, и уровень фермента, который превышает его верхний предел, считается повышенным и, следовательно, указывает на повреждение печени. Нормальный диапазон отчасти зависит от стандартов, используемых клинической лабораторией, проводящей анализ. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV обеспечивает активность FIX, достаточную для поддержания гемостаза у индивидуума с гемофилией B (например, активность FIX, составляющую по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30% или более), вызывая при этом увеличение в кровотоке уровня фермента печени, такого как ALT, AST или LDH, которое не превышает 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, 2000% от верхнего предела соответствующего нормального диапазона (ULN), определенного как среднее или максимальное значение в нескольких образцах, взятых у одного и того же индивидуума, подвергающегося лечению, в разные моменты времени (например, еженедельно или ежемесячно) после введения вектора AAV. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0189] В предыдущих клинических испытаниях с использованием векторов AAV для лечения гемофилии B исследователи вынуждены были также вводить иммуносупрессорное средство, такое как стероид, чтобы предотвратить развитие у индивидуумов, получающих лечение, иммунного ответа, приводящего к уничтожению трансдуцированных клеток, продуцирующих белок фактора IX. Однако вследствие ослабленного иммунного ответа, наблюдаемого у индивидуумов, подвергающихся экспериментальному лечению некоторыми векторами AAV, совместное введение иммуносупрессорного средства не требовалось. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV представляет собой дозу, достаточную для поддержания адекватного гемостаза у индивидуума с тяжелой или умеренной гемофилией B и не требующую совместного введения (до, одновременно или после) иммуносупрессорного средства (такого как стероид или другое иммуносупрессорное средство). Тем не менее, поскольку иммунный ответ отдельного индивидуума невозможно предсказать, описанные здесь способы лечения гемофилии В включают совместное ведение векторов AAV и иммуносупрессорного средства. Совместное введение иммуносупрессорного средства можно осуществлять до, одновременно или после введения векторов AAV индивидууму, страдающему от гемофилии B. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорное средство вводят индивидууму в течение нескольких дней, недель или месяцев после введения вектора AAV с целью лечения гемофилии B. Типичными иммуносупрессорными средствами являются стероиды (включающие, без ограничения, преднизон или преднизолон) и нестероидные иммунодепрессанты, такие как циклоспорин, рапамицин и другие. Дозы лекарственных средств и временные режимы лечения, необходимые для достижения достаточного подавления иммунного ответа, зависят от факторов, уникальных для каждого индивидуума, подвергающегося лечению, однако определение дозы и времени лечения относится к компетенции специалистов в данной области. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорное средство требуется вводить несколько раз.

[0190] Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV обеспечивает согласованное повышение активности FIX при введении группе людей с тяжелой или умеренной гемофилией B. Согласованность можно определить путем вычисления вариабельности ответа в группе людей с помощью таких статистических методов, как определение среднего и стандартного отклонения (SD), или с помощью другого статистического метода, известного специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза вектора AAV при введении группе людей с тяжелой или умеренной гемофилией В через 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 15 месяцев, 18 месяцев или 21 месяц после введения обеспечивает среднюю активность FIX 1-5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 2,5-7,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 5-10% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или l, среднюю активность FIX от 7,5 до 12,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 10-15% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 12,5-17,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 15-20% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 17,5-22,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, среднюю активность FIX 20-25% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 22,5-27,5% с SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 25-30% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 27,5-32,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 30-35% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 32,5-37,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 35-40% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 37,5-42,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 40-45% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; среднюю активность FIX 42,5-47,5% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1; или среднюю активность FIX 45-50% при SD менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1. В любом из этих вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0191] Способы и варианты применения настоящего изобретения можно объединять с любыми соединениями, средствами, лекарственными средствами, способами лечения или другими терапевтическими режимами или протоколами, обеспечивающими желательные терапевтические, благоприятные, аддитивные, синергические или комплементарные активности или эффекты. Примеры сочетанных композиций и способов лечения включают вторые активные средства, такие как биологические вещества (белки), средства и лекарственные средства. Такие биологические вещества (белки), средства, лекарственные средства, способы введения и способы лечения можно вводить или проводить до, практически одновременно или после любого другого способа или варианта применения настоящего изобретения, например, после способа терапевтического лечения индивидуума от нарушения свертывания крови.

[0192] Соединение, средство, лекарственное средство, способ лечения или другой терапевтический режим или протокол можно вводить в составе сочетанной композиции, или отдельно, например, одновременно, или поочередно, или последовательно (до или после) с доставкой или введением нуклеиновой кислоты, рекомбинантного вектора (например, rAAV), векторного генома или рекомбинантной вирусной частицы. Таким образом, изобретение предлагает сочетания, в которых способ или вариант применения настоящего изобретения используют в сочетании с любым из описанных здесь или известных специалистам в данной области соединений, средств, лекарственных средств, терапевтических режимов, протоколов лечения, процессов, лекарств или композиций. Соединение, средство, лекарственное средство, терапевтический режим, протокол лечения, процесс, лекарство или композицию можно вводить или проводить до, практически одновременно или после введения индивидууму нуклеиновой кислоты, вектора, рекомбинантного вектора (например, rAAV), векторного генома или рекомбинантной вирусной частицы настоящего изобретения.

[0193] В некоторых вариантах осуществления сочетанная композиция содержит одно или несколько иммуносупрессорных средств. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение или доставку одного или нескольких иммуносупрессорных средств млекопитающему. В некоторых вариантах осуществления сочетанная композиция содержит частицы AAV-FIX и одно или несколько иммуносупрессорных средств. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение или доставку частиц AAV-FIX млекопитающему и введение иммуносупрессорного средства млекопитающему. Специалист в данной области может определить, существует ли такая необходимость, или распределить во времени введение млекопитающему такой сочетанной композиции, содержащей одно или несколько иммуносупрессорных средств, и введение иммуносупрессорного средства.

[0194] Способы и варианты применения настоящего изобретения также включают, в числе прочего, способы и варианты применения, которые приводят к уменьшению потребности или применения другого соединения, средства, лекарственного средства, терапевтического режима, протокола лечения, процесса или лекарства. Например, в случае нарушения свертывания крови способ или применение настоящего изобретения обеспечивает терапевтическое улучшение, если позволяет вводить конкретному индивидууму рекомбинантный белковый фактор свертывания, используемый для восполнения дефицита или дефекта эндогенного фактора свертывания (аномального или мутантного) у индивидуума, с меньшей частотой, или в более низкой дозе, или совсем его не вводить. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способы и варианты применения, позволяющие снизить потребность в другом способе лечения или терапии, или уменьшить использование другого способа лечения или терапии.

[0195] Изобретение можно использовать для животных, оно включает медицинские и ветеринарные варианты применения. Таким образом, подходящие индивидуумы включают млекопитающих, таких как люди, а также отличные от человека млекопитающие. Термин "индивидуум" относится к животному, как правило, к млекопитающему, включающему людей, отличных от человека приматов (таких как обезьяны, гиббоны, гориллы, шимпанзе, орангутаны, макаки), домашних животных (таких как собаки и кошки), сельскохозяйственных животных (таких как домашняя птица, в том числе куры и утки, лошади, коровы, козы, овцы, свиньи) и лабораторных животных (таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки). Индивидуумы-люди включают эмбрионов, новорожденных, младенцев, несовершеннолетних и взрослых. Индивидуумы включают животные модели заболеваний, например мышиные и другие животные модели нарушения свертывания крови, и другие, известные специалистам в данной области.

[0196] Индивидуумы, подходящие для лечения, представляют собой индивидуумов, которые характеризуются продукцией недостаточного количества или дефицитом функционального генного продукта (белка), или продукцией аберрантного, частично функционального или нефункционального генного продукта (белка), который может приводить к развитию заболевания, или имеют риск такой продукции или дефицита. Индивидуумы, подходящие для лечения в соответствии с настоящим изобретением, также включают индивидуумов, которые характеризуются продукцией аберрантного или дефектного (мутантного) генного продукта (белка), или имеют риск такой продукции, которая приводит к развитию заболеванию, так что уменьшение количества, экспрессии или функции аберрантного или дефектного (мутантного) генного продукта (белка) приводит к излечению заболевания или уменьшению одного или нескольких симптомов или к улучшению болезненного состояния. Таким образом, подходящие индивидуумы включают индивидуумов, имеющих аберрантное, недостаточное или отсутствующее количество факторов свертывания крови, таких как гемофилии (например, гемофилия B).

[0197] Индивидуумы, подходящие для лечения в соответствии с настоящим изобретением, также включают индивидуумов, которые ранее подвергались, или в настоящее время подвергаются лечению дополняющим белком (например, рекомбинантным фактором свертывания крови, таким как FIX, используемым для лечения гемофилии). Кроме того, индивидуумы, подходящие для лечения в соответствии с настоящим изобретением, включают индивидуумов, у которых не развивается значительный или детектируемый иммунный ответ против белка FIX, или не образуются такие количества ингибирующих антител против белка FIX, которые будут препятствовать генной терапии на основе FIX, или блокировать ее.

[0198] В других вариантах осуществления детей, у которых диагностирована гемофилия B (например, путем генотипирования) но еще не появились ее симптомы, можно лечить профилактически вектором AAV, чтобы предотвратить появление таких симптомов в первом месте или, в других вариантах осуществления, от перехода их в тяжелую форму, какими они могли бы быть при отсутствии лечения. В некоторых вариантах осуществления возраст индивидуумов-людей, которые могут подвергаться такому профилактическому лечению, составляет по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или больше, когда им вводят вектор AAV, обеспечивающий продукцию и поддержание активности FIX, достаточной для поддержания гемостаза, и таким образом предотвращающий или уменьшающий тяжесть одного или нескольких симптомов гемофилии B. В любом из указанных вариантов осуществления вектор AAV может представлять собой AAV-FIX39-Padua или вектор AAV, содержащий такой же капсид и геномную последовательность, идентичную геномной последовательности указанного вектора по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, который можно вводить индивидууму в составе фармацевтически приемлемой композиции сам по себе, или вместе с пустыми капсидами того же капсидного типа при соотношении пустых капсидов к вектору, составляющем примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, или имеющем какое-либо другое значение.

[0199] Введение или доставку индивидууму in vivo можно осуществлять до развития неблагоприятного симптома, состояния, осложнения и т.д., вызванного или связанного с указанным заболеванием. Например, для идентификации индивидуумов, которые могут являться кандидатами для лечения с помощью композиций, способов и вариантов применения настоящего изобретения, можно использовать скрининг (например, генетический). Таким образом, такие индивидуумы включают индивидуумов, идентифицированных в процессе скрининга как положительные по недостаточному количеству или дефициту функционального генного продукта (белка), или индивидуумов, продуцирующих аберрантный, частично функциональный или нефункциональный генный продукт (белок).

[0200] Способы и варианты применения настоящего изобретения включают доставку и введение системно, регионально или локально, или любым способом, например, путем инъекции или инфузии. Такие доставка и введение включают парентеральное введение, например. внутрисосудистое, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутрикожное, подкожное или трансмукозальное введение. Примеры способов введения и доставки включают внутривенное (в.в.), внутрибрюшинное (в.б.), внутриартериальное, подкожное, внутриплевральное, интубационное, внутрилегочное, внутриполостное, ионтофоретическое, внутриорганное, внутрилимфатическое введение.

[0201] Альтернативно, или кроме того, вектор AAV можно доставлять в печень через портальную вену. В другом варианте осуществления для доставки векторов AAV в печень через печеночную артерию можно использовать катетер, введенный в бедренную артерию. Для доставки векторов AAV непосредственно в печень, что позволяет миновать кровоток и избежать воздействия нейтрализующих антител против AAV, также можно использовать нехирургические средства, такие как эндоскопическая ретроградная холангиопанкреатография (ERCP). Кроме того в качестве порталов для доставки векторов AAV в организм индивидуума, у которого образуются или присутствуют ранее образовавшиеся антитела против AAV, можно использовать другие протоковые системы, такие как протоки подчелюстной железы.

[0202] Дозы могут варьировать в зависимости от типа, начала, развития, тяжести, частоты, продолжительности или вероятности возникновения заболевания, на которое направлено лечение, желательного клинического результата, предшествующего или текущего лечения, общего состояния здоровья, возраста, пола, расы или иммунологической омпетентности индивидуума, а также от других факторов, известных квалифицированным специалистам. Величину дозы, число приемов, частоту или продолжительность введения можно пропорционально увеличивать или уменьшать, в зависимости от неблагоприятных побочных эффектов, осложнений или других факторов риска лечения или терапии, и состояния индивидуума. Опытному специалисту в данной области известны факторы, которые могут влиять на величину дозы и временной режим, необходимые для достижения количества, достаточного для обеспечения терапевтического или профилактического эффекта.

[0203] Описанные здесь способы и варианты применения настоящего изобретения можно осуществлять через 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 или 24-72 часов после того, как индивидуум был идентифицирован как имеющий заболевание, подлежащее лечению, имеющий один или несколько симптомов заболевания, или он был подвергнут скринингу и идентифицирован как положительный согласно данному описанию, даже если у индивидуума нет одного или нескольких симптомов заболевания. Разумеется, способы и варианты применения настоящего изобретения можно осуществлять через 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 или более дней, месяцев или лет после того, как индивидуум был идентифицирован как имеющий заболевание, подлежащее лечению, имеющий один или несколько симптомов заболевания, или он был подвергнут скринингу и идентифицирован как положительный согласно данному описанию.

[0204] Нуклеиновые кислоты, векторы, рекомбинантные векторы (например, rAAV), векторные геномы и рекомбинантные вирусные частицы, а также другие композиции, средства, лекарственные средства, биологические вещества (белки) могут быть включены в состав фармацевтических композиций, например, наряду с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Такие фармацевтические композиции можно использовать, в частности, для введения и доставки индивидууму in vivo или ex vivo.

[0205] Используемые здесь термины "фармацевтически приемлемый" и "физиологически приемлемый" относятся к биологически приемлемым композициям, газообразным, жидким или твердым, или их смесям, которые подходят для одного или нескольких способов введения, доставки контактирования in vivo. "Фармацевтически приемлемая" или "физиологически приемлемая" композиция представляет собой вещество, которое не является нежелательным с биологической или иной точки зрения, например, вещество при введении индивидууму не вызывает существенных нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такую фармацевтическую композицию можно использовать, например, для введения вирусного вектора или вирусной частицы индивидууму.

[0206] Такие композиции включают растворители (водные или неводные), растворы (водные или неводные), эмульсии (например, масло в воде или вода в масле), суспензии, сиропы, эликсиры, среды для дисперсий и суспензий, покрытия, средства, обеспечивающие изотоничность, и средства, стимулирующие или замедляющие абсорбцию, подходящие для фармацевтического введения, или приведения в контакт, или доставки in vivo. Водные и неводные растворители, растворы и суспензии могут содержать суспендирующие средства и загустители. Такие фармацевтически приемлемые носители включают таблетки (с покрытием или без покрытия), капсулы (твердые или мягкие), микрогранулы, порошки, гранулы и кристаллы. В состав композиции также могут входить другие активные соединения (например, консерванты, противобактериальные, противовирусные и противогрибковые средства).

[0207] Можно получить фармацевтические композиции, подходящие для конкретного способа введения или доставки, как описано здесь или известно специалистам в данной области. Таким образом, фармацевтические композиции могут содержать носители, разбавители или наполнители, подходящие для введения разными способами.

[0208] Композиции, подходящие для парентерального введения, содержат водные и неводные растворы, суспензии или эмульсии активного соединения, причем эти препараты обычно являются стерильными и могут быть изотоническими по отношению к крови предполагаемого реципиента. Неограничивающие иллюстративные примеры включают воду, физиологический раствор, декстрозу, фруктозу, этанол, животные, растительные или синтетические масла.

[0209] В композицию можно добавить сорастворители и адъюванты. Неограничивающие примеры сорастворителей включают соединения, содержащие гидроксильные группы или другие полярные группы, например спирты, такие как изопропиловый спирт; гликоли, такие как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, гликолевый эфир; глицерин; полиоксиэтиленовые спирты и сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот. Адъюванты включают, например, поверхностно-активные вещества, такие как соевый лецитин и олеиновая кислота; сложные эфиры сорбитана, такие как триолеат сорбитана; и поливинилпирролидон.

[0100] [0210] Фармацевтические композиции и системы доставки, подходящие для композиций, способов и вариантов применения настоящего изобретения, известны в данной области (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; and Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315).

[0211] Термин "единичная лекарственная форма" в настоящем описании относится к физически дискретным единицам, подходящим для однократного введения индивидууму, подлежащему лечению; причем каждая единица содержит предопределенное количество, необязательно в сочетании с фармацевтическим носителем (вспомогательным веществом, разбавителем, средой или наполнителем), которое рассчитывают так, чтобы при введении в один или несколько приемов достичь желательного эффекта (например, профилактического или терапевтического эффекта). Единичные лекарственные формы могут находиться, например, внутри ампул и флаконов, которые могут содержать жидкую композицию или композицию в виде высушенной из замороженного состояния или лиофилизированной формы; например, стерильный жидкий носитель можно добавить до введения или доставки in vivo. Отдельные единичные лекарственные формы могут входить в состав многодозовых наборов или контейнеров. Последовательности, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы рекомбинантных векторов (например, rAAV) и содержащие их фармацевтические композиции могут быть упакованы в единичную или многодозовую стандартную лекарственную форму для удобства и единообразия введения.

[0212] Изобретение предлагает наборы, содержащие упаковочный материал и в нем один или несколько компонентов. Набор обычно содержит этикетку или вкладыш в упаковку с описанием компонентов или инструкцией по применению компонентов набора in vitro, in vivo или ex vivo. Набор может содержать совокупность таких компонентов, например нуклеиновую кислоту, рекомбинантный вектор, вирус (например, AAV), векторный геном или вирусную частицу, и, необязательно, второе активное вещество, такое как другое соединение, средство, лекарственное средство или другая композиция.

[0213] Набор представляет собой физическую структуру, содержащую один или несколько компонентов набора. Упаковочный материал может поддерживать компоненты в стерильном состоянии и может быть изготовлен из материала, обычно используемого для таких целей (например, из бумаги, гофрированной фибры, стекла, пластика, фольги, ампул, флаконов, пробирок и т.д.).

[0214] Этикетки или вкладыши могут содержать идентификационную информацию по одному или нескольким компонентам набора, величинам доз, клинической фармакологии активного ингредиента (активных ингредиентов), включая механизм действия, фармакокинетике и фармакодинамике. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, указывающую производителя, номер партии, местонахождение и дату производства, дату истечения срока годности. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, указывающую производителя, номер партии, местонахождение и дату производства. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о заболевании, для лечения которого можно использовать компонент набора. Этикетки или вкладыши могут содержать инструкции для врача или индивидуума по использованию одного или нескольких компонентов набора в способе, варианте применения, или протоколе лечения, или схеме лечения. В инструкции могут быть указаны величины доз, частота или продолжительность введения, а также руководство по практическому применению любого из описанных здесь способов, вариантов применения, протоколов лечения или профилактических или терапевтических схем.

[0215] Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о любых улучшениях, обеспечиваемых компонентом, например, о профилактических или терапевтических улучшениях. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о возможных неблагоприятных побочных эффектах, осложнениях или реакциях, например, предупреждения индивидууму или клиницисту относительно ситуаций, в которых нецелесообразно использовать конкретную композицию. Неблагоприятные побочные эффекты или осложнения также могут возникать в тех случаях, если индивидуум принимал, будет принимать или принимает в настоящее время одно или несколько других лекарственных средств, которые могут быть несовместимы с композицией, или если индивидуум подвергался, будет подвергаться, или в настоящее время подвергается другой схеме лечения или терапии, которая может быть несовместимой с композицией, и, следовательно, инструкции могут содержать информацию о такой несовместимости.

[0216] Этикетки или вкладыши включают "печатную продукцию", например, бумагу или картон, либо прилагаемую отдельно, либо приклеенную к компоненту, набору или упаковочному материалу (например, коробке), либо прикрепленную к ампуле, пробирке или флакону, содержащему компонент набора. Этикетки или вкладыши могут дополнительно включать машиночитаемый носитель, такой как печатная этикетка с штрих-кодом, диск, оптический диск, такой как CD- или DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, магнитная лента или электрический запоминающий носитель, такой как RAM и ROM, или их гибриды, такие как магнитные/оптические запоминающие носители, FLASH-носители или карты памяти.

[0217] Если не указано иное, все используемые здесь технические и научные термины имеют стандартные значения, известные специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. В настоящем документе описаны подходящие способы и материалы, хотя при осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь.

[0218] Все упомянутые здесь заявки, публикации, патенты и другие ссылки, ссылки на GenBank и ссылки на ATCC, включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В случае конфликта описание, включая определения, будет иметь преимущество.

[0219] Все раскрытые здесь признаки могут быть объединены в любых сочетаниях. Каждый признак, раскрытый в описании, можно заменить альтернативным признаком, служащим для такой же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если явно не указано иное, раскрытые признаки (например, модифицированная нуклеиновая кислота, вектор, плазмида, последовательность рекомбинантного вектора (например, rAAV), векторный геном или рекомбинантная вирусная частица) являются примером группы эквивалентных или сходных признаков.

[0220] В настоящем описании формы, используемые в единственном числе также включают отнесение к множественному числу, если контекст явно не указывает иначе. Так, например, при упоминании "нуклеиновой кислоты" подразумевается множество таких нуклеиновых кислот, при упоминании "вектора" подразумевается множество таких векторов, а при упоминании "вируса" или "частицы" подразумевается множество таких вирионов/частиц.

[0221] В настоящем описании все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа и дробные значения целых чисел в пределах диапазонов, если контекст явно не указывает иначе. Так, например, ссылка на идентичность, составляющую 80% или более, включает идентичность, составляющую 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% и т.д., а также 81,1%, 81,2%, 81,3% 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д.

[0222] Ссылка на целое число с добавлением "более чем (больше)" или "менее чем" включает любое число больше или меньше указанного значения, соответственно. Так, например, выражение "менее 100" включает числа 99, 98, 97 и т.д., вплоть до числа один (1); а выражение "менее 10" включает 9, 8, 7 и т.д., вплоть до числа один (1).

[0223] В настоящем описании все численные значения или диапазоны включают целые числа в таких диапазонах и дробные значения целых чисел в таких диапазонах, если контекст явно не указывает иначе. Так, например, ссылка на числовой диапазон, такой как 1-10, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, и т. д. Ссылка на диапазон 1-50, следовательно, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, и т.д., вплоть до 50, включая 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д.

[0224] Ссылка на ряд диапазонов включает диапазоны, которые объединяют значения границ разных диапазонов внутри ряда. Так, например, ссылка на ряд диапазонов, например, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500 -4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000, включает диапазоны 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000 и т.д.

[0225] Изобретение, как правило, раскрывается здесь с использованием утвердительного языка для описания многочисленных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также специально включает варианты осуществления с полным или частичным исключением конкретных предметов, таких как вещества или материалы, стадия и условия способа, протоколы или процедуры. Например, в некоторых вариантах осуществления или аспектах изобретения материалы и/или стадии способа исключаются. Таким образом, даже если не указано, что изобретение в целом не содержит аспекты, которые в явной форме исключены из изобретения, это также входит в объем настоящего описания.

[0226] Описан ряд вариантов осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, специалист в данной области, не отступая от сущности и объема изобретения, может осуществлять разные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к разным способам применения и условиям.

[0227] Соответственно, нижеследующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1. Конструирование/получение вектора

[0228] Конструируют новую нуклеиновую кислоту фактора IX ("FIX39-Padua"; SEQ ID NO: 10; фигура 10), кодирующую человеческий белок фактора IX с высокой специфической активностью, содержащий вариант 338L Padua (Simioni P, et al., N Engl J Med 2009, 361: 1671). FIX39-Padua полностью лишен динуклеотидов CpG, содержащихся в кодирующих и интронных последовательностях FIX. Для проведения сравнительного тестирования получают FIX19 (Mingozzi et al. Sci. Transl Med. 2013) и модифицируют его с получением FIX Padua, чтобы исключить любые потенциальные затрудняющие интерпретацию эффекты, обусловленные FIX Padua ("FIX19-Padua"; SEQ ID NO: 11; фигура 11).

[0229] Синтезируют плазмиду ("pAAV-ApoE_hAAT-FIX39", 11125 п. о., SEQ ID NO: 12, фигура 12A), которая содержит кассету, обеспечивающую экспрессию FIX39-Padua, а также элементы, описанные в таблице 2. Карта pAAV-ApoE_hAAT-FIX39 показана на фигуре 13.

Таблица 2. pAAV-ApoE_hAAT-FIX39

5'AAV2 ITR SEQ ID NO:13 Энхансер (гепатоспецифичный участок) SEQ ID NO:14 Промотор hAAT SEQ ID NO:15 5'UTR SEQ ID NO:16 FIX39-Padua CDS SEQ ID NO:10 (фигура 10) Интрон A SEQ ID NO:17 (фигура 14) 3'UTR SEQ ID NO:18 полиA SEQ ID NO:19 3'AAV2 ITR SEQ ID NO:20 Лямбда-спейсерная последовательность SEQ ID NO:21 Точка начала репликации F1 SEQ ID NO:22 Участок устойчивости к канамицину SEQ ID NO:23 Точка начала репликации pUC SEQ ID NO:24

[0230] Последовательность, кодирующая FIX39-Padua, и последовательность интрона А описаны в SEQ ID NO: 25 (фигура 15). Кроме того, синтезируют плазмиду, которая содержит FIX19-Padua CDS и такие же регуляторные элементы, такие же инвертированные концевые повторы аденоассоциированного вируса (ITR) и такой же гепатоспецифичный промотор ApoE/hAAT, как и pAAV-ApoE_hAAT-FIX39.

[0231] Вектор AAV, содержащий капсидный вариант 4-1 (SEQ ID NO: 4), получают для трансгенов FIX39-Padua ("AAV-FIX39-Padua") и FIX19-Padua ("AAV-FIX19-Padua"), используя тройную трансфекцию с последующим двойным центрифугированием в градиенте хлорида цезия (Ayuso E. M. et al. Gene Ther 2010. 17:503). Векторы титруют методом количественной ПЦР с использованием линеаризованной плазмиды в качестве стандарта. В исследовании, описанном в примере 3, вектор, разбавленный PBS, содержащим 5% сорбита, 0,001% F68, до конечного объема 200 мкл на мышь, используют для инъекции в хвостовую вену.

Пример 2. In vitro трансдукция варианта AAV 4-1

[0232] Первичные гепатоциты яванского макака и человека трансдуцируют капсидным вариантом 4-1 (SEQ ID NO: 4), экспрессирующим люциферазу, при четырех разных значениях множественности заражения (MOI) в диапазоне от 500 до 62500 векторных геномов на клетку. Через семьдесят два часа после трансдукции анализируют экспрессию люциферазы. Как показано на фигуре 16, отношение трансдуцированных гепатоцитов человека к гепатоцитам приматов, отличных от человека, варьирует от 0,8 до 1,5, в зависимости от используемого значения MOI. Эти данные, полученные in vitro, явно согласуются с результатами предыдущих исследований in vivo, в которых сравнивается экспрессия фактора коагуляции IX у яванских макак и людей.

Пример 3. Исследование активности

[0233] Проводят исследование, в котором оценивают активность AAV-FIX39-Padua по сравнению с AAV-FIX19-Padua у мышей. Группам из 5 мышей возрастом 8-10 недель вводят либо 1×10¹¹, либо 1×10¹² вг/кг AAV-FIX39-Padua и AAV-FIX19-Padua. После введения векторов кровь собирают путем ретроорбитального кровопускания с использованием гепаринизированных капиллярных трубочек; плазму получают центрифугированием при 9000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, замораживают при -80°С и хранят до анализа.

[0234] Собранную плазму используют для анализа экспрессии трансгена hFIX. Уровни человеческого FIX в плазме измеряют с использованием набора ELISA (Affinity Biologicals, Ancaster, ON, Canada).

[0235] Уровни активности человеческого FIX измеряют путем анализа времени образования и активности тромбопластина (aPTT). Анализ aPTT проводят путем смешивания образца плазмы в объемном соотношении 1:1:1 с человеческой FIX-дефицитной плазмой (George King Biomedical, Inc) и реагентом aPTT (Trinity Biotech) с последующей инкубацией в течение 180 с при 37°C. Коагуляцию инициируют добавлением 25 мМ хлорида кальция. Время образования сгустка измеряют с использованием прибора для измерения свертывания STart 4 (Diagnostica Stago). Стандартную кривую получают с использованием объединенной нормальной плазмы от George King, начиная с разведения 1:5 в TBS, pH 7,4 (48 мкл+192 мкл) с последующими серийными разведениями 1:2 (120 мкл+120 мкл). Человеческую стандартную кривую используют для расчета активности каждого образца на 17 неделе после введения вектора; кроме того, измеряют активность у двух необработанных мышей. Определяют среднее значение активности FIX у необработанных мышей и затем вычитают его из значений активности в образцах обработанных мышей, получая таким образом значение дополнительной (то есть человеческой) активности, обусловленной белком FIX Padua.

[0236] Как показано на фигуре 17, AAV-FIX39-Padua и AAV-FIX19-Padua обеспечивают экспрессию практически эквивалентных уровней FIX.

[0237] Через 17 недель после введения вектора активность человеческого FIX измеряют у мышей, получающих дозу вектора 1×10¹² вг/кг. Отношение активности к антигену варьирует от 5,2 до 7,5, со средним значением 6,4 для групп FIX19-Padua и FIX39-Padua (таблица 3).

Таблица 3. Значения активности человеческого FIX

№ животного Антиген
(% от нормы) Активность
(% от нормы) Отношение 01 - FIX19 53,9 352,7 6,5 02 - FIX19 95,6 631,8 6,6 03 - FIX19 120,6 882,3 7,3 04 - FIX19 132,9 797,1 6,0 05 - FIX19 105,2 599,7 5,7 06 - FIX39 163,1 1092,8 6,7 07 - FIX39 108,2 670,3 6,2 08 - FIX39 121,1 781,2 6,4 09 - FIX39 152,3 1147,8 7,5 10 - FIX39 134,1 702,1 5,2 Среднее Антиген
(% от нормы) Активность
(% от нормы) Отношение AAV-FIX19-Padua 101,7 652,7 6,4 AAV-FIX39-Padua 135,8 878,8 6,4

[0238] Хотя полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективность обеих экспрессионных кассет практически одинакова, две конструкции также анализируют при введении плазмиды путем гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Уровни FIX после in vivo введения голой ДНК определяют на основе сравнения обеих экспрессионных кассет без потенциальной интерференции различий в титре AAV, производстве вектора и т.д.

[0239] Как показано на фигуре 18, обе оголенные экспрессионные кассеты одинаково эффективно обеспечивают управление экспрессией FIX, что подтверждает результаты, полученные при введении AAV. Полученные результаты демонстрируют, что экспрессионные кассеты FIX19-Padua и FIX39-Padua обладают сходной эффективностью.

Пример 4. Генная терапия с использованием AAV-FIX39-Padua

[0240] Клиническое исследование проводят с целью определения безопасности и кинетики после однократной инфузии AAV-FIX39-Padua. В доклинических исследованиях показано, что используемый капсидный вариант AAV 4-1 имеет хорошую безопасность и эффективность, способность достигать устойчивых уровней активности FIX ~35% в NHP при 1×10¹² вг/кг через 3 месяца после инфузии вектора; причем перекрестные реакции нейтрализующих антител (Ab) против капсидного варианта AAV 4-1 примерно на 10% ниже, чем у антител против AAV8. Схема исследования приведена в таблице 4.

Таблица 4. Схема клинического исследования AAV-FIX39-Padua

Безопасность и переносимость AAVFIX39-Padua Клинически значимые по показателям жизненно важных функций, лабораторным показателям и результатам клинических анализов (включая число кровотечений и QoL) по сравнению с фоновым уровнем Кинетика AAVFIX39-Padua Уровни активности трансгена FIX и уровни антигена при максимальном значении и равновесном состоянии Дозирование Все группы, получающие исходную, среднюю и максимальную дозы, состоят из 2-5 индивидуумов Схема Открытое нерандомизированное исследование с повышением дозы Участвующие страны США и, возможно, Европа, Япония и Канада Размер образца До 15 индивидуумов Пригодность Возраст, подходящий для исследования: 18 лет и старше Пол, подходящий для исследования: мужской Прием здоровых добровольцев: нет Критерии включения в исследование Способность давать информированное согласие и соответствие требованиям исследования Мужчины возрастом ≥18 лет с подтвержденным диагнозом гемофилия B (≤2 м.ед./дл или ≤2% эндогенного фактора IX) Получают ≥50 дней воздействия продуктов фактора IX В среднем минимум 4 события кровотечения в год, требующих эпизодического лечения инфузиями фактора IX, или профилактических инфузий фактора IX Отсутствие на измеримом уровне ингибитора фактора IX, определяемое в центральной лаборатории, и отсутствие предыдущей истории получения ингибиторов белка фактора IX Согласие на применение надежной барьерной контрацепции до того, как 3 последовательных образца будут отрицательными по векторным последовательностям Критерии исключения из исследования Наличие активного гепатита B или C Текущая противовирусная терапия по поводу гепатита B или C Значительное лежащее в основе заболевание печени Существует серологическое доказательство* присутствия ВИЧ-1 или ВИЧ-2 при числе CD4 ≤200/мм³ (* индивидуумы, идентифицированные как ВИЧ+, но имеющие стабильное число CD4 >200/мм³ и недетектируемую вирусную нагрузку, могут принимать участие в исследовании) Наличие на детектируемом уровне антител, реакционноспособных по отношению к капсидному варианту AAV 4-1 (SEQ ID NO:4) Участие в исследовании с переносом генов в течение последних 52 недель, или в исследовании экспериментального лекарственного средства в течение последних 12 недель Неспособность или нежелание давать согласие на методы оценки, используемые в исследовании Визит скрининга Оценка пригодности Титр NAb против AAV, определенный в рамках скрининга, является основной причиной для отсева (настоятельно рекомендуется отсылать индивидуумов к протоколу CHOP, содержащему титры NAb против AAV, для телефонного скрининга) Визит на 0 день Постепенное восстановление продукта FIX и затем инфузия вектора Визиты последующего наблюдения (~17 визитов) Безопасность и кинетические анализы Визит после окончания исследования (на 52 неделе) Окончательная оценка безопасности

Пример 5. Клинические результаты

[0241] Четырем пациентам с гемофилией В вводят одну внутривенную инфузию вектора AAV-FIX39-Padua. Первые два индивидуума возрастом 23 и 18 лет, соответственно, не имеют предшествующей истории заболевания печени, а третий, 47 лет, имеет историю заражения HCV, но выздоровел спонтанно. Все четыре индивидуума по результатам скрининга на нейтрализующие антитела против нового капсида AAV являются отрицательными.

[0242] Индивидуумам вводят внутривенно 5×10¹¹ вг/кг вектора AAV-FIX39-Padua в течение ~1 часа. Каждому индивидууму вводят целый вектор AAV-FIX39-Padua, показанный на фигурах 20-23, в сочетании с указанным количеством пустых капсидов AAV.

[0243] На фигурах 19-23 показаны результаты исследования, в котором вектор AAV-FIX39-Padua вводят на 0 день. Результаты демонстрируют увеличение продукции фактора IX у всех четырех индивидуумов, что иллюстрируется увеличением активности FIX на протяжении всего периода оценки в данном исследовании.

[0244] Первоначальное увеличение активности FIX от 0 до примерно 3 дня обусловлено введением 100 МЕ/кг Alprolix™ или BeneFIX™, которые представляют собой рекомбинантный гибридный белок FIX-Fc, имеющий период полужизни примерно 82 часа. Активность фактора IX, обусловленная вектором AAV-FIX39 Padua, появляется примерно через 6-8 дней после инфузии вектора AAV.

[0245] Как показано на фигуре 19 и для каждого отдельного индивидуума на фигурах 20, 21А, 22А и 23А, активность фактора IX постепенно увеличивается и является стабильной на протяжении всех оценочных периодов продолжительностью 183, 102, 69 и 50 дней для всех четырех индивидуумов. Полученные результаты демонстрируют, что однократная инфузия вектора AAV-FIX39-Padua в количестве 5×10¹¹ вг/кг приводит к достаточной и устойчивой продукции и активности фактора IX у пациентов с гемофилией B, обеспечивая значительную и полезную активность, связанную со свертыванием крови, и поддержание гемостаза.

[0246] Как показано на фигурах 19, 20А, 21А, 22А и 23А, уровни активности фактора IX составляют 28%, 41%, 26% и 33% от нормы у индивидуумов 1-4 соответственно, через 183, 102, 69 и 50 дней после инфузии. Индивидуум № 3 самостоятельно лечился продуктом с увеличенным периодом полужизни от ожидаемого кровотечения в голеностопном суставе через 2 дня после инфузии вектора; кроме этого, в течение периода оценки никакие инфузии факторов не проводились и кровотечения не наблюдались.

[0247] Иммуносупрессорные средства (стероиды) ни одному из индивидуумов не вводят. Кроме того, в целом устойчивое повышение уровня трансаминаз выше верхнего предела нормы отсутствует, что указывает на отсутствие побочных эффектов лечения (фигуры 20B, 21B, 22B и 23).

[0248] Результаты анализа ответов Т-клеток на AAV и FIX у всех четырех индивидуумов методом ELISPOT демонстрируют отсутствие ответов или очень низкие уровни ответов. Следует отметить, что повышение уровней фактора IX с течением времени до уровня плато в значительной степени согласуется с полученными результатами (фигура 19). Умеренные колебания уровней антигена приводят к более сильным сдвигам уровней активности, например, к 8-кратному увеличению специфической активности варианта фактора IX Padua.

[0249] Опубликованные данные (Nathwani et al., N Engl J Med., 371 (21): 1994-2004 (2014)) демонстрируют долговременную экспрессию фактора IX у мужчин с гемофилией B, которым был введен путем инфузии вектор AAV8, экспрессирующий фактор IX дикого типа. Однако уровни экспрессии мало варьируют: от 1,4%-2,2% от нормы при минимальной дозе (2×10¹¹ векторных геномов [вг]/кг массы тела) до 2,9-7,2% при максимальной дозе (2×10¹² вг/кг). Более того, 4 из 6 индивидуумов, получивших максимальную дозу, требуется курс иммуносупрессорного средства (преднизолона) для снижения роста уровня трансаминаз, обусловленного максимальной дозой (но отсутствующего при более низких дозах 2×10¹¹ или 6×10¹¹ вг/кг). Результаты исследования естественного течения болезни пациентов с гемофилией позволяют предположить, что для уменьшения годового количества спонтанных суставных кровотечений до нулевого уровня уровень FIX должен составлять ~12% (den Uijl et al., Haemophilia 17 (1): 41-4 (2011)).

[0250] Это первые клинические результаты с использованием нового биоинженерного капсида AAV, экспрессирующего трансген, который обеспечивает высокоспецифичную активность фактора IX. Уровни активности фактора IX, наблюдаемые у индивидуумов 1-4, 28%, 41%, 26% и 33% от нормы, значительно превышают уровни фактора IX в кровотоке, наблюдающиеся в предыдущих исследованиях, в соответствии с опубликованными данными, и превышают уровни фактора IX в кровотоке, необходимые для уменьшения годового количества спонтанных суставных кровотечений до нуля.

[0251] Кроме того, существенные уровни активности фактора IX, наблюдаемые в данном исследовании, достигаются при отсутствии введения рекомбинантного фактора IX с момента инфузии вектора и при отсутствии иммуносупрессорных средств (стероидов). Полученные результаты демонстрируют, что разработка вектора AAV-FIX, который после введения в низких дозах может обеспечить высокий уровень экспрессии фактора свертывания, позволяющий избежать введения иммуносупрессорных средств, является важной целью генной терапии, направленной на печень. Уровни активности фактора IX, наблюдаемые в данном исследовании, поддерживаются на протяжении всего периода исследования.

Пример 6. Пониженная иммуногенность вектора AAV-FIX39-Padua

[0252] В текущей фазе исследования I/II у четырех индивидуумов, получивших 5e11 вг/кг AAV-FIX39-Padua, анализируют потенциальные иммунные ответы на вектор AAV с использованием утвержденного анализа интерферона-гамма (IFN-g) методом иммуноферментных пятен (ELISPOT). Очищенные РВМС, выделенные из образцов крови, полученных путем еженедельных заборов крови, тестируют путем анализа интерферона-гамма методом ELISPOT. Шесть пептидных пулов капсида AAV, каждый из которых содержит 24-25 пептидов, инкубируют с 2e5 клеток с тремя повторами. Т-клеточные ответы детектируют с использованием биотинилированного антитела против IFN-g с последующим колориметрическим анализом и выражают в виде пятнообразующих единиц (SFU) на миллион клеток. Пул с максимальным ответом в каждый момент времени показан как SFU/миллион клеток. Исторически используемая граница положительного ответа составляет >50 SFU и 3-кратное превышение контрольного уровня (синяя линия). Индивидуумов 840-003-001, 840-001-002, 840-001-004 и 840-001-005 (показаны черным) обследуют вплоть до 26, 14, 11 и 8 недели соответственно. Результаты анализа ELISPOT, проведенного в предыдущем исследовании, в котором два индивидуума, CP-16 и PT17, получают 1e12 вг/кг вектора AAV8-FIX19, а один индивидуум получает 2e12 вг/кг AAV8-FIX19, показаны красным цветом.

[0253] Используя исторически принятое значение >50 SFU и 3-кратное превышение фонового уровня в контрольном образце (среде) в качестве критериев положительного Т-клеточного ответа, устанавливают, что у трех индивидуумов ответ был очень низким или отсутствовал вплоть до 26 недели после инфузии (фигура 24А). Это резко контрастирует с результатами ранее проведенного нашей группой неопубликованного исследования, в котором используют кодон-оптимизированный вектор AAV8 для доставки кассеты трансгена FIX 3 индивидуумам, у которых устойчивые Т-клеточные ответы, определенные путем измерения IFN-g, наблюдаются уже на 2-й неделе (фигура 24B). Другие ранее опубликованные исследования с использованием самокомплементарных векторов AAV-2 (Manno et al., 2006 Nat Med) и AAV-8 (Nathwani et al., 2011 NEJM) также демонстрируют наличие ранних Т-клеточных ответов на капсид AAV. Важно отметить, что в настоящем исследовании ответы против трансгенного продукта не наблюдаются.

[0254] Полагают, что активация опосредованного Т-клетками иммунного ответа против трансдуцированных гепатоцитов, презентирующих Т-клеточные эпитопы капсида AAV, может опосредовать кратковременную и зависящую от обстоятельств утрату экспрессии трансгена у индивидуумов. Следовательно профиль пониженной иммуногенности вектора AAV-FIX39-Padua является перспективным признаком, приводящим к улучшению общей эффективности.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> THE CHILDREN'S HOSPITAL OF PHILADELPHIA

HIGH, Katherine A.

ANGUELA, Xavier

<120> Модифицированный фактор IX, а также композиции, способы и

варианты применения

переноса генов в клетки, органы и ткани

<130> 074659-0447746

<140> To Be Assigned

<141> 2016-06-23

<150> 62/183,599

<151> 2015-06-23

<150> 62/315,453

<151> 2016-03-30

<150> 62/338,315

<151> 2016-05-18

<150> 62/348,781

<151> 2016-06-10

<150> 62/349,572

<151> 2016-06-13

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 2

<211> 601

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 2

Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser

1 5 10 15

Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys

20 25 30

Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp

35 40 45

Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu

65 70 75 80

Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser

85 90 95

Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala

100 105 110

Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro

130 135 140

Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg

145 150 155 160

Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg

165 170 175

Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn

180 185 190

Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val

195 200 205

Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His

210 215 220

Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln

225 230 235 240

Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser

245 250 255

Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly

260 265 270

Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser

275 280 285

Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile

290 295 300

Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr

305 310 315 320

Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met

325 330 335

Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln

340 345 350

Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp

355 360 365

Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn

370 375 380

Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe

385 390 395 400

Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp

405 410 415

Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys

420 425 430

Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn

435 440 445

Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln

450 455 460

Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln

465 470 475 480

Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro

485 490 495

Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile

500 505 510

Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn

515 520 525

Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val

530 535 540

Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp

545 550 555 560

Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val

565 570 575

Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile

580 585 590

Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

595 600

<210> 3

<211> 535

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 3

Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala

1 5 10 15

Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp

20 25 30

Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro

35 40 45

Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly

50 55 60

Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly

65 70 75 80

Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp

85 90 95

Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn

100 105 110

Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly

115 120 125

Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr

130 135 140

Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly

145 150 155 160

Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly

165 170 175

Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe

180 185 190

Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn

195 200 205

Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr

210 215 220

Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln

225 230 235 240

Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly

245 250 255

Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala

260 265 270

Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val

275 280 285

Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly

290 295 300

Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly

305 310 315 320

Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser

325 330 335

Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val

340 345 350

Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr

355 360 365

Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln

370 375 380

Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala

385 390 395 400

Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro

405 410 415

Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro

420 425 430

Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile

435 440 445

Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala

450 455 460

Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val

465 470 475 480

Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro

485 490 495

Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe

500 505 510

Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr

515 520 525

Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

530 535

<210> 4

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 4

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 5

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 5

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Arg Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Arg Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Arg Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Arg Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Arg Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Arg Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Arg Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 6

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 6

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Arg Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Arg Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Arg Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Arg Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Arg Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Arg Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Arg Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 7

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 7

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Arg Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Arg Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Arg Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Arg Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Arg Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Arg Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Arg Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Arg Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 8

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 8

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Arg Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Arg Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Arg Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Arg Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Arg Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Arg Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Arg Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Arg Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 9

<211> 738

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 9

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Arg Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Arg Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Arg Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Arg Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Arg Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Arg Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Arg Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Arg Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 10

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 10

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg

60

ggctacctgc tgtctgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaatgc caacaaaatt

120

ctgaatagac caaagaggta taactctggc aagcttgaag agtttgtaca ggggaatctg

180

gagagagagt gtatggaaga gaagtgcagc tttgaggaag ccagagaagt gtttgaaaat

240

acagagagaa caactgaatt ttggaagcag tatgtggatg gtgatcaatg tgagagcaat

300

ccctgcttga atggggggag ctgtaaagat gatatcaaca gctatgaatg ttggtgtccc

360

tttggatttg aggggaaaaa ctgtgagctt gatgtgacct gtaatatcaa gaatggcagg

420

tgtgagcaat tttgcaagaa ttctgctgat aacaaagtgg tctgtagctg cactgaggga

480

tataggctgg ctgaaaacca gaagagctgt gaacctgcag tgccttttcc ctgtgggaga

540

gtgtctgtga gccaaaccag caagctgact agggctgaag cagtctttcc tgatgtagat

600

tatgtgaata gcactgaggc tgagacaatc cttgacaata tcactcagag cacacagagc

660

ttcaatgact tcaccagggt ggtaggaggg gaggatgcca agcctgggca gttcccctgg

720

caggtagtgc tcaatggaaa agtggatgcc ttttgtggag gttcaattgt aaatgagaag

780

tggattgtga ctgcagccca ctgtgtggaa actggagtca agattactgt ggtggctgga

840

gagcacaata ttgaggaaac tgagcacact gagcagaaga ggaatgtgat caggattatc

900

ccccaccaca actacaatgc tgctatcaac aagtacaacc atgacattgc cctcctggaa

960

ctggatgaac ccctggtctt gaacagctat gtgacaccca tctgtattgc tgataaagag

1020

tacaccaaca tcttcttgaa atttgggtct ggatatgtgt ctggctgggg cagggtgttc

1080

cataaaggca ggtctgccct ggtattgcag tatttgaggg tgcctctggt ggatagagca

1140

acctgcttgc tgagcaccaa gtttacaatc tacaacaata tgttctgtgc agggttccat

1200

gaaggtggta gagacagctg ccagggagat tctgggggtc cccatgtgac tgaggtggag

1260

ggaaccagct tcctgactgg gattatcagc tggggtgagg agtgtgctat gaagggaaag

1320

tatgggatct acacaaaagt atccagatat gtgaactgga ttaaggagaa aaccaagctg

1380

acttga

1386

<210> 11

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 11

atgcagcgcg tgaacatgat catggccgag agccctggcc tgattaccat ctgcctgtta

60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatc

120

ctgaaccggc ccaagcggta caactcaggc aagctggaag agttcgtgca gggcaacctg

180

gaacgggagt gcatggaaga gaagtgcagc ttcgaggaag cccgggaggt gttcgagaac

240

accgagcgga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagtcaaac

300

ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gatatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc

360

ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgc

420

tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgctcatg cactgagggc

480

taccggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcaga

540

gtgtccgtga gccagaccag caagctgacc agggccgagg ccgtgttccc tgacgtggac

600

tacgtgaact caaccgaggc cgagacaatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc

660

ttcaacgact tcacccgggt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccttgg

720

caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gctcaatcgt gaacgagaag

780

tggatcgtga cagccgccca ctgcgtggag acaggcgtga agatcaccgt ggtggccggc

840

gaacacaata tcgaggaaac cgagcacacc gagcagaaac ggaacgtgat ccggattatc

900

ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgatatcgc cctgctggaa

960

ctggacgagc ctctggtgct gaattcatac gtgaccccca tctgtatcgc cgacaaagag

1020

tacaccaaca tctttctgaa gttcggcagc ggctacgtgt ccggctgggg cagggtgttc

1080

cacaagggcc gcagcgccct ggtgctgcag tacctgcggg tgcccctggt ggacagagcc

1140

acctgcctgc ggtcaaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac

1200

gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggac cccacgtgac cgaggtggag

1260

ggcaccagct ttctgaccgg catcatctca tggggcgagg aatgcgccat gaagggcaag

1320

tacggaatct acactaaggt gtcaagatac gtgaactgga tcaaagagaa aaccaagctg

1380

acctga

1386

<210> 12

<211> 11125

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 12

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc tgcggcctag taggctcaga ggcacacagg agtttctggg

180

ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc

240

ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt

300

gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag

360

aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt

420

cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg

480

ggatcttgct accagtggaa cagccactaa ggattctgca gtgagagcag agggccagct

540

aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact cacgccaccc cctccacctt ggacacagga

600

cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac

660

actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac

720

ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc

780

tcccccgttg cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc

840

tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga cagtgaatac cactttcaca atctgctagc

900

aaaggttatg cagagggtga acatgatcat ggctgagagc cctggcctga tcaccatctg

960

cctgctgggc tacctgctgt ctgctgaatg tacaggtttg tttccttttt tataatacat

1020

tgagtatgct tgccttttag atatagaaat atctgattct gtcttcttca ctaaattttg

1080

attacatgat ttgacagcaa tattgaagag tctaacagcc agcacccagg ttggtaagta

1140

ctggttcttt gttagctagg ttttcttctt cttcactttt aaaactaaat agatggacaa

1200

tgcttatgat gcaataaggt ttaataaaca ctgttcagtt cagtatttgg tcatgtaatt

1260

cctgttaaaa aacagtcatc tccttggttt aaaaaaatta aaagtgggaa aacaaagaaa

1320

tagcagaata tagtgaaaaa aaataaccac agtatttttg tttggactta ccactttgaa

1380

atcaaattgg gaaacaaaag cacaaacagt ggccttattt acacaaaaag tctgatttta

1440

agatatgtga caattcaagg tttcagaagt atgtaaggag gtgtgtctct aattttttaa

1500

attatatatc ttcaatttaa agttttagtt aaaacataaa gattaacctt tcattagcaa

1560

gctgttagtt atcaccaaag cttttcatgg attaggaaaa aatcattttg tctctatctc

1620

aaacatcttg gagttgatat ttggggaaac acaatactca gttgagttcc ctaggggaga

1680

aaagcaagct taagaattga cacaaagagt aggaagttag ctattgcaac atatatcact

1740

ttgttttttc acaactacag tgactttatt tatttcccag aggaaggcat acagggaaga

1800

aattatccca tttggacaaa cagcatgttc tcacagtaag cacttatcac acttacttgt

1860

caactttcta gaatcaaatc tagtagctga cagtaccagg atcaggggtg ccaaccctaa

1920

gcacccccag aaagctgact ggccctgtgg ttcccactcc agacatgatg tcagctgtga

1980

aatccacctc cctggaccat aattaggctt ctgttcttca ggagacattt gttcaaagtc

2040

atttgggcaa ccatattctg aaaacagccc agccagggtg atggatcact ttgcaaagat

2100

cctcaatgag ctattttcaa gtgatgacaa agtgtgaagt taagggctca tttgagaact

2160

ttctttttca tccaaagtaa attcaaatat gattagaaat ctgacctttt attactggaa

2220

ttctcttgac taaaagtaaa attgaatttt aattcctaaa tctccatgtg tatacagtac

2280

tgtgggaaca tcacagattt tggctccatg ccctaaagag aaattggctt tcagattatt

2340

tggattaaaa acaaagactt tcttaagaga tgtaaaattt tcatgatgtt ttcttttttg

2400

ctaaaactaa agaattattc ttttacattt cagtttttct tgatcatgaa aatgccaaca

2460

aaattctgaa tagaccaaag aggtataact ctggcaagct tgaagagttt gtacagggga

2520

atctggagag agagtgtatg gaagagaagt gcagctttga ggaagccaga gaagtgtttg

2580

aaaatacaga gagaacaact gaattttgga agcagtatgt ggatggtgat caatgtgaga

2640

gcaatccctg cttgaatggg gggagctgta aagatgatat caacagctat gaatgttggt

2700

gtccctttgg atttgagggg aaaaactgtg agcttgatgt gacctgtaat atcaagaatg

2760

gcaggtgtga gcaattttgc aagaattctg ctgataacaa agtggtctgt agctgcactg

2820

agggatatag gctggctgaa aaccagaaga gctgtgaacc tgcagtgcct tttccctgtg

2880

ggagagtgtc tgtgagccaa accagcaagc tgactagggc tgaagcagtc tttcctgatg

2940

tagattatgt gaatagcact gaggctgaga caatccttga caatatcact cagagcacac

3000

agagcttcaa tgacttcacc agggtggtag gaggggagga tgccaagcct gggcagttcc

3060

cctggcaggt agtgctcaat ggaaaagtgg atgccttttg tggaggttca attgtaaatg

3120

agaagtggat tgtgactgca gcccactgtg tggaaactgg agtcaagatt actgtggtgg

3180

ctggagagca caatattgag gaaactgagc acactgagca gaagaggaat gtgatcagga

3240

ttatccccca ccacaactac aatgctgcta tcaacaagta caaccatgac attgccctcc

3300

tggaactgga tgaacccctg gtcttgaaca gctatgtgac acccatctgt attgctgata

3360

aagagtacac caacatcttc ttgaaatttg ggtctggata tgtgtctggc tggggcaggg

3420

tgttccataa aggcaggtct gccctggtat tgcagtattt gagggtgcct ctggtggata

3480

gagcaacctg cttgctgagc accaagttta caatctacaa caatatgttc tgtgcagggt

3540

tccatgaagg tggtagagac agctgccagg gagattctgg gggtccccat gtgactgagg

3600

tggagggaac cagcttcctg actgggatta tcagctgggg tgaggagtgt gctatgaagg

3660

gaaagtatgg gatctacaca aaagtatcca gatatgtgaa ctggattaag gagaaaacca

3720

agctgacttg atgaaagatg gatttccaag gttaattcat tggaattgaa aattaacaga

3780

gatctagagc tgaattcctg cagccagggg gatcagcctc tactgtgcct tctagttgcc

3840

agccatctgt tgtttgcccc tcccccttgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca

3900

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcacattg tctgagtagg tgtcattcta

3960

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc

4020

atgctgggga tgcagtgggc tctatggctt ctgaggcaga aagaaccagc tggggctcga

4080

gatccactag ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct

4140

cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

4200

gcagctgcct gcaggggcag cttgaaggaa atactaaggc aaaggtactg caagtgctcg

4260

caacattcgc ttatgcggat tattgccgta gtgccgcgac gccgggggca agatgcagag

4320

attgccatgg tacaggccgt gcggttgata ttgccaaaac agagctgtgg gggagagttg

4380

tcgagaaaga gtgcggaaga tgcaaaggcg tcggctattc aaggatgcca gcaagcgcag

4440

catatcgcgc tgtgacgatg ctaatcccaa accttaccca acccacctgg tcacgcactg

4500

ttaagccgct gtatgacgct ctggtggtgc aatgccacaa agaagagtca atcgcagaca

4560

acattttgaa tgcggtcaca cgttagcagc atgattgcca cggatggcaa catattaacg

4620

gcatgatatt gacttattga ataaaattgg gtaaatttga ctcaacgatg ggttaattcg

4680

ctcgttgtgg tagtgagatg aaaagaggcg gcgcttacta ccgattccgc ctagttggtc

4740

acttcgacgt atcgtctgga actccaacca tcgcaggcag agaggtctgc aaaatgcaat

4800

cccgaaacag ttcgcaggta atagttagag cctgcataac ggtttcggga ttttttatat

4860

ctgcacaaca ggtaagagca ttgagtcgat aatcgtgaag agtcggcgag cctggttagc

4920

cagtgctctt tccgttgtgc tgaattaagc gaataccgga agcagaaccg gatcaccaaa

4980

tgcgtacagg cgtcatcgcc gcccagcaac agcacaaccc aaactgagcc gtagccactg

5040

tctgtcctga attcattagt aatagttacg ctgcggcctt ttacacatga ccttcgtgaa

5100

agcgggtggc aggaggtcgc gctaacaacc tcctgccgtt ttgcccgtgc atatcggtca

5160

cgaacaaatc tgattactaa acacagtagc ctggatttgt tctatcagta atcgacctta

5220

ttcctaatta aatagagcaa atccccttat tgggggtaag acatgaagat gccagaaaaa

5280

catgacctgt tggccgccat tctcgcggca aaggaacaag gcatcggggc aatccttgcg

5340

tttgcaatgg cgtaccttcg cggcagatat aatggcggtg cgtttacaaa aacagtaatc

5400

gacgcaacga tgtgcgccat tatcgcctag ttcattcgtg accttctcga cttcgccgga

5460

ctaagtagca atctcgctta tataacgagc gtgtttatcg gctacatcgg tactgactcg

5520

attggttcgc ttatcaaacg cttcgctgct aaaaaagccg gagtagaaga tggtagaaat

5580

caataatcaa cgtaaggcgt tcctcgatat gctggcgtgg tcggagggaa ctgataacgg

5640

acgtcagaaa accagaaatc atggttatga cgtcattgta ggcggagagc tatttactga

5700

ttactccgat caccctcgca aacttgtcac gctaaaccca aaactcaaat caacaggcgc

5760

cggacgctac cagcttcttt cccgttggtg ggatgcctac cgcaagcagc ttggcctgaa

5820

agacttctct ccgaaaagtc aggacgctgt ggcattgcag cagattaagg agcgtggcgc

5880

tttacctatg attgatcgtg gtgatatccg tcaggcaatc gaccgttgca gcaatatctg

5940

ggcttcactg ccgggcgctg gttatggtca gttcgagcat aaggctgaca gcctgattgc

6000

aaaattcaaa gaagcgggcg gaacggtcag agagattgat gtatgagcag agtcaccgcg

6060

attatctccg ctctggttat ctgcatcatc gtctgcctgt catgggctgt taatcattac

6120

cgtgataacg ccattaccta caaagcccag cgcgacaaaa atgccagaga actgaagctg

6180

gcgaacgcgg caattactga catgcagatg cgtcagcgtg atgttgctgc gctcgatgca

6240

aaatacacga aggagttagc tgatgctaaa gctgaaaatg atgctctgcg tgatgatgtt

6300

gccgctggtc gtcgtcggtt gcacatcaaa gcagtctgtc agtcagtgcg tgaagccacc

6360

accgcctccg gcgtggataa tgcagcctcc ccccgactgg cagacaccgc tgaacgggat

6420

tatttcaccc tcagagagag gctgatcact atgcaaaaac aactggaagg aacccagaag

6480

tatattaatg agcagtgcag atagagttgc ccatatcgat gggcaactca tgcaattatt

6540

gtgagcaata cacacgcgct tccagcggag tataaatgcc taaagtaata aaaccgagca

6600

atccatttac gaatgtttgc tgggtttctg ttttaacaac attttctgcg ccgccacaaa

6660

ttttggctgc atcgacagtt ttcttctgcc caattccaga aacgaagaaa tgatgggtga

6720

tggtttcctt tggtgctact gctgccggtt tgttttgaac agtaaacgtc tgttgagcac

6780

atcctgtaat aagcagggcc agcgcagtag cgagtagcat ttttttcatg gtgttattcc

6840

cgatgctttt tgaagttcgc agaatcgtat gtgtagaaaa ttaaacaaac cctaaacaat

6900

gagttgaaat ttcatattgt taatatttat taatgtatgt caggtgcgat gaatcgtcat

6960

tgtattcccg gattaactat gtccacagcc ctgacgggga acttctctgc gggagtgtcc

7020

gggaataatt aaaacgatgc acacagggtt tagcgcgtac acgtattgca ttatgccaac

7080

gccccggtgc tgacacggaa gaaaccggac gttatgattt agcgtggaaa gatttgtgta

7140

gtgttctgaa tgctctcagt aaatagtaat gaattatcaa aggtatagta atatctttta

7200

tgttcatgga tatttgtaac ccatcggaaa actcctgctt tagcaagatt ttccctgtat

7260

tgctgaaatg tgatttctct tgatttcaac ctatcatagg acgtttctat aagatgcgtg

7320

tttcttgaga atttaacatt tacaaccttt ttaagtcctt ttattaacac ggtgttatcg

7380

ttttctaaca cgatgtgaat attatctgtg gctagatagt aaatataatg tgagacgttg

7440

tgacgtttta gttcagaata aaacaattca cagtctaaat cttttcgcac ttgatcgaat

7500

atttctttaa aaatggcaac ctgagccatt ggtaaaacct tccatgtgat acgagggcgc

7560

gtagtttgca ttatcgtttt tatcgtttca atctggtctg acctccttgt gttttgttga

7620

tgatttatgt caaatattag gaatgttttc acttaatagt attggttgcg taacaaagtg

7680

cggtcctgct ggcattctgg agggaaatac aaccgacaga tgtatgtaag gccaacgtgc

7740

tcaaatcttc atacagaaag atttgaagta atattttaac cgctagatga agagcaagcg

7800

catggagcga caaaatgaat aaagaacaat ctgctgatga tccctccgtg gatctgattc

7860

gtgtaaaaaa tatgcttaat agcaccattt ctatgagtta ccctgatgtt gtaattgcat

7920

gtatagaaca taaggtgtct ctggaagcat tcagagcaat tgaggcagcg ttggtgaagc

7980

acgataataa tatgaaggat tattccctgg tggttgactg atcaccataa ctgctaatca

8040

ttcaaactat ttagtctgtg acagagccaa cacgcagtct gtcactgtca ggaaagtggt

8100

aaaactgcaa ctcaattact gcaatgccct cgtaattaag tgaatttaca atatcgtcct

8160

gttcggaggg aagaacgcgg gatgttcatt cttcatcact tttaattgat gtatatgctc

8220

tcttttctga cgttagtctc cgacggcagg cttcaatgac ccaggctgag aaattcccgg

8280

accctttttg ctcaagagcg atgttaattt gttcaatcat ttggttagga aagcggatgt

8340

tgcgggttgt tgttctgcgg gttctgttct tcgttgacat gaggttgccc cgtattcagt

8400

gtcgctgatt tgtattgtct gaagttgttt ttacgttaag ttgatgcaga tcaattaata

8460

cgatacctgc gtcataattg attatttgac gtggtttgat ggcctccacg cacgttgtga

8520

tatgtagatg ataatcatta tcactttacg ggtcctttcc ggtgatccga caggttacgg

8580

ggcggcgacc tgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg

8640

catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg

8700

gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgcct tagcgcccgc tcctttcgct

8760

ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg

8820

ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg

8880

ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg

8940

gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caactctatc

9000

tcgggctatt cttttgattt agacctgcag gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt

9060

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc

9120

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt

9180

gcgcagcctg aatggcgaat gcgatttatt caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg

9240

taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca

9300

tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc

9360

gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt

9420

atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa

9480

aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca

9540

aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa

9600

aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata

9660

cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca

9720

ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg

9780

ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat

9840

gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg

9900

taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct

9960

tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat

10020

acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cttcgagcaa gacgtttccc

10080

gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg

10140

ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacaacgt

10200

ggctttgttg aataaatcga acttttgctg agttgaagga tcagatcacg catcttcccg

10260

acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa agttcaaaat caccaactgg tccacctaca

10320

acaaagctct catcaaccgt ggctccctca ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg

10380

cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac gaggcagacc tctcgacgga gttccactga

10440

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta

10500

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa

10560

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact

10620

gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca

10680

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt

10740

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg

10800

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag

10860

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta

10920

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat

10980

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg

11040

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc

11100

ttttgctggc cttttgctca catgt

11125

<210> 13

<211> 141

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 13

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc t

141

<210> 14

<211> 321

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 14

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc

60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc

120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc

180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc

240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt

300

ggtttaggta gtgtgagagg g

321

<210> 15

<211> 397

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 15

gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta

60

agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac

120

gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca

180

ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact

240

tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct

300

cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct

360

cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat

397

<210> 16

<211> 29

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 16

accactttca caatctgcta gcaaaggtt

29

<210> 17

<211> 1438

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 17

gtttgtttcc ttttttataa tacattgagt atgcttgcct tttagatata gaaatatctg

60

attctgtctt cttcactaaa ttttgattac atgatttgac agcaatattg aagagtctaa

120

cagccagcac ccaggttggt aagtactggt tctttgttag ctaggttttc ttcttcttca

180

cttttaaaac taaatagatg gacaatgctt atgatgcaat aaggtttaat aaacactgtt

240

cagttcagta tttggtcatg taattcctgt taaaaaacag tcatctcctt ggtttaaaaa

300

aattaaaagt gggaaaacaa agaaatagca gaatatagtg aaaaaaaata accacagtat

360

ttttgtttgg acttaccact ttgaaatcaa attgggaaac aaaagcacaa acagtggcct

420

tatttacaca aaaagtctga ttttaagata tgtgacaatt caaggtttca gaagtatgta

480

aggaggtgtg tctctaattt tttaaattat atatcttcaa tttaaagttt tagttaaaac

540

ataaagatta acctttcatt agcaagctgt tagttatcac caaagctttt catggattag

600

gaaaaaatca ttttgtctct atctcaaaca tcttggagtt gatatttggg gaaacacaat

660

actcagttga gttccctagg ggagaaaagc aagcttaaga attgacacaa agagtaggaa

720

gttagctatt gcaacatata tcactttgtt ttttcacaac tacagtgact ttatttattt

780

cccagaggaa ggcatacagg gaagaaatta tcccatttgg acaaacagca tgttctcaca

840

gtaagcactt atcacactta cttgtcaact ttctagaatc aaatctagta gctgacagta

900

ccaggatcag gggtgccaac cctaagcacc cccagaaagc tgactggccc tgtggttccc

960

actccagaca tgatgtcagc tgtgaaatcc acctccctgg accataatta ggcttctgtt

1020

cttcaggaga catttgttca aagtcatttg ggcaaccata ttctgaaaac agcccagcca

1080

gggtgatgga tcactttgca aagatcctca atgagctatt ttcaagtgat gacaaagtgt

1140

gaagttaagg gctcatttga gaactttctt tttcatccaa agtaaattca aatatgatta

1200

gaaatctgac cttttattac tggaattctc ttgactaaaa gtaaaattga attttaattc

1260

ctaaatctcc atgtgtatac agtactgtgg gaacatcaca gattttggct ccatgcccta

1320

aagagaaatt ggctttcaga ttatttggat taaaaacaaa gactttctta agagatgtaa

1380

aattttcatg atgttttctt ttttgctaaa actaaagaat tattctttta catttcag

1438

<210> 18

<211> 48

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 18

tgaaagatgg atttccaagg ttaattcatt ggaattgaaa attaacag

48

<210> 19

<211> 228

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 19

ctactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccttg ccttccttga

60

ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcacatt

120

gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg

180

attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcagtggg ctctatgg

228

<210> 20

<211> 108

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 20

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag

108

<210> 21

<211> 3631

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 21

agcttgaagg aaatactaag gcaaaggtac tgcaagtgct cgcaacattc gcttatgcgg

60

attattgccg tagtgccgcg acgccggggg caagatgcag agattgccat ggtacaggcc

120

gtgcggttga tattgccaaa acagagctgt gggggagagt tgtcgagaaa gagtgcggaa

180

gatgcaaagg cgtcggctat tcaaggatgc cagcaagcgc agcatatcgc gctgtgacga

240

tgctaatccc aaaccttacc caacccacct ggtcacgcac tgttaagccg ctgtatgacg

300

ctctggtggt gcaatgccac aaagaagagt caatcgcaga caacattttg aatgcggtca

360

cacgttagca gcatgattgc cacggatggc aacatattaa cggcatgata ttgacttatt

420

gaataaaatt gggtaaattt gactcaacga tgggttaatt cgctcgttgt ggtagtgaga

480

tgaaaagagg cggcgcttac taccgattcc gcctagttgg tcacttcgac gtatcgtctg

540

gaactccaac catcgcaggc agagaggtct gcaaaatgca atcccgaaac agttcgcagg

600

taatagttag agcctgcata acggtttcgg gattttttat atctgcacaa caggtaagag

660

cattgagtcg ataatcgtga agagtcggcg agcctggtta gccagtgctc tttccgttgt

720

gctgaattaa gcgaataccg gaagcagaac cggatcacca aatgcgtaca ggcgtcatcg

780

ccgcccagca acagcacaac ccaaactgag ccgtagccac tgtctgtcct gaattcatta

840

gtaatagtta cgctgcggcc ttttacacat gaccttcgtg aaagcgggtg gcaggaggtc

900

gcgctaacaa cctcctgccg ttttgcccgt gcatatcggt cacgaacaaa tctgattact

960

aaacacagta gcctggattt gttctatcag taatcgacct tattcctaat taaatagagc

1020

aaatcccctt attgggggta agacatgaag atgccagaaa aacatgacct gttggccgcc

1080

attctcgcgg caaaggaaca aggcatcggg gcaatccttg cgtttgcaat ggcgtacctt

1140

cgcggcagat ataatggcgg tgcgtttaca aaaacagtaa tcgacgcaac gatgtgcgcc

1200

attatcgcct agttcattcg tgaccttctc gacttcgccg gactaagtag caatctcgct

1260

tatataacga gcgtgtttat cggctacatc ggtactgact cgattggttc gcttatcaaa

1320

cgcttcgctg ctaaaaaagc cggagtagaa gatggtagaa atcaataatc aacgtaaggc

1380

gttcctcgat atgctggcgt ggtcggaggg aactgataac ggacgtcaga aaaccagaaa

1440

tcatggttat gacgtcattg taggcggaga gctatttact gattactccg atcaccctcg

1500

caaacttgtc acgctaaacc caaaactcaa atcaacaggc gccggacgct accagcttct

1560

ttcccgttgg tgggatgcct accgcaagca gcttggcctg aaagacttct ctccgaaaag

1620

tcaggacgct gtggcattgc agcagattaa ggagcgtggc gctttaccta tgattgatcg

1680

tggtgatatc cgtcaggcaa tcgaccgttg cagcaatatc tgggcttcac tgccgggcgc

1740

tggttatggt cagttcgagc ataaggctga cagcctgatt gcaaaattca aagaagcggg

1800

cggaacggtc agagagattg atgtatgagc agagtcaccg cgattatctc cgctctggtt

1860

atctgcatca tcgtctgcct gtcatgggct gttaatcatt accgtgataa cgccattacc

1920

tacaaagccc agcgcgacaa aaatgccaga gaactgaagc tggcgaacgc ggcaattact

1980

gacatgcaga tgcgtcagcg tgatgttgct gcgctcgatg caaaatacac gaaggagtta

2040

gctgatgcta aagctgaaaa tgatgctctg cgtgatgatg ttgccgctgg tcgtcgtcgg

2100

ttgcacatca aagcagtctg tcagtcagtg cgtgaagcca ccaccgcctc cggcgtggat

2160

aatgcagcct ccccccgact ggcagacacc gctgaacggg attatttcac cctcagagag

2220

aggctgatca ctatgcaaaa acaactggaa ggaacccaga agtatattaa tgagcagtgc

2280

agatagagtt gcccatatcg atgggcaact catgcaatta ttgtgagcaa tacacacgcg

2340

cttccagcgg agtataaatg cctaaagtaa taaaaccgag caatccattt acgaatgttt

2400

gctgggtttc tgttttaaca acattttctg cgccgccaca aattttggct gcatcgacag

2460

ttttcttctg cccaattcca gaaacgaaga aatgatgggt gatggtttcc tttggtgcta

2520

ctgctgccgg tttgttttga acagtaaacg tctgttgagc acatcctgta ataagcaggg

2580

ccagcgcagt agcgagtagc atttttttca tggtgttatt cccgatgctt tttgaagttc

2640

gcagaatcgt atgtgtagaa aattaaacaa accctaaaca atgagttgaa atttcatatt

2700

gttaatattt attaatgtat gtcaggtgcg atgaatcgtc attgtattcc cggattaact

2760

atgtccacag ccctgacggg gaacttctct gcgggagtgt ccgggaataa ttaaaacgat

2820

gcacacaggg tttagcgcgt acacgtattg cattatgcca acgccccggt gctgacacgg

2880

aagaaaccgg acgttatgat ttagcgtgga aagatttgtg tagtgttctg aatgctctca

2940

gtaaatagta atgaattatc aaaggtatag taatatcttt tatgttcatg gatatttgta

3000

acccatcgga aaactcctgc tttagcaaga ttttccctgt attgctgaaa tgtgatttct

3060

cttgatttca acctatcata ggacgtttct ataagatgcg tgtttcttga gaatttaaca

3120

tttacaacct ttttaagtcc ttttattaac acggtgttat cgttttctaa cacgatgtga

3180

atattatctg tggctagata gtaaatataa tgtgagacgt tgtgacgttt tagttcagaa

3240

taaaacaatt cacagtctaa atcttttcgc acttgatcga atatttcttt aaaaatggca

3300

acctgagcca ttggtaaaac cttccatgtg atacgagggc gcgtagtttg cattatcgtt

3360

tttatcgttt caatctggtc tgacctcctt gtgttttgtt gatgatttat gtcaaatatt

3420

aggaatgttt tcacttaata gtattggttg cgtaacaaag tgcggtcctg ctggcattct

3480

ggagggaaat acaaccgaca gatgtatgta aggccaacgt gctcaaatct tcatacagaa

3540

agatttgaag taatatttta accgctagat gaagagcaag cgcatggagc gacaaaatga

3600

ataaagaaca atctgctgat gatccctccg t

3631

<210> 22

<211> 307

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 22

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc

60

ttagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc

120

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc

180

gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg

240

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact

300

ggaacaa

307

<210> 23

<211> 813

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 23

gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc

60

atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag

120

gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat

180

taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga

240

atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc

300

attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc

360

ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg

420

caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc

480

ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc

540

aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag

600

tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa

660

ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt

720

atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggctt

780

cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cat

813

<210> 24

<211> 668

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 24

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg

60

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact

120

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg

180

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg

240

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac

300

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca

360

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga

420

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc

480

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct

540

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg

600

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct

660

tttgctca

668

<210> 25

<211> 2824

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 25

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg

60

ggctacctgc tgtctgctga atgtacaggt ttgtttcctt ttttataata cattgagtat

120

gcttgccttt tagatataga aatatctgat tctgtcttct tcactaaatt ttgattacat

180

gatttgacag caatattgaa gagtctaaca gccagcaccc aggttggtaa gtactggttc

240

tttgttagct aggttttctt cttcttcact tttaaaacta aatagatgga caatgcttat

300

gatgcaataa ggtttaataa acactgttca gttcagtatt tggtcatgta attcctgtta

360

aaaaacagtc atctccttgg tttaaaaaaa ttaaaagtgg gaaaacaaag aaatagcaga

420

atatagtgaa aaaaaataac cacagtattt ttgtttggac ttaccacttt gaaatcaaat

480

tgggaaacaa aagcacaaac agtggcctta tttacacaaa aagtctgatt ttaagatatg

540

tgacaattca aggtttcaga agtatgtaag gaggtgtgtc tctaattttt taaattatat

600

atcttcaatt taaagtttta gttaaaacat aaagattaac ctttcattag caagctgtta

660

gttatcacca aagcttttca tggattagga aaaaatcatt ttgtctctat ctcaaacatc

720

ttggagttga tatttgggga aacacaatac tcagttgagt tccctagggg agaaaagcaa

780

gcttaagaat tgacacaaag agtaggaagt tagctattgc aacatatatc actttgtttt

840

ttcacaacta cagtgacttt atttatttcc cagaggaagg catacaggga agaaattatc

900

ccatttggac aaacagcatg ttctcacagt aagcacttat cacacttact tgtcaacttt

960

ctagaatcaa atctagtagc tgacagtacc aggatcaggg gtgccaaccc taagcacccc

1020

cagaaagctg actggccctg tggttcccac tccagacatg atgtcagctg tgaaatccac

1080

ctccctggac cataattagg cttctgttct tcaggagaca tttgttcaaa gtcatttggg

1140

caaccatatt ctgaaaacag cccagccagg gtgatggatc actttgcaaa gatcctcaat

1200

gagctatttt caagtgatga caaagtgtga agttaagggc tcatttgaga actttctttt

1260

tcatccaaag taaattcaaa tatgattaga aatctgacct tttattactg gaattctctt

1320

gactaaaagt aaaattgaat tttaattcct aaatctccat gtgtatacag tactgtggga

1380

acatcacaga ttttggctcc atgccctaaa gagaaattgg ctttcagatt atttggatta

1440

aaaacaaaga ctttcttaag agatgtaaaa ttttcatgat gttttctttt ttgctaaaac

1500

taaagaatta ttcttttaca tttcagtttt tcttgatcat gaaaatgcca acaaaattct

1560

gaatagacca aagaggtata actctggcaa gcttgaagag tttgtacagg ggaatctgga

1620

gagagagtgt atggaagaga agtgcagctt tgaggaagcc agagaagtgt ttgaaaatac

1680

agagagaaca actgaatttt ggaagcagta tgtggatggt gatcaatgtg agagcaatcc

1740

ctgcttgaat ggggggagct gtaaagatga tatcaacagc tatgaatgtt ggtgtccctt

1800

tggatttgag gggaaaaact gtgagcttga tgtgacctgt aatatcaaga atggcaggtg

1860

tgagcaattt tgcaagaatt ctgctgataa caaagtggtc tgtagctgca ctgagggata

1920

taggctggct gaaaaccaga agagctgtga acctgcagtg ccttttccct gtgggagagt

1980

gtctgtgagc caaaccagca agctgactag ggctgaagca gtctttcctg atgtagatta

2040

tgtgaatagc actgaggctg agacaatcct tgacaatatc actcagagca cacagagctt

2100

caatgacttc accagggtgg taggagggga ggatgccaag cctgggcagt tcccctggca

2160

ggtagtgctc aatggaaaag tggatgcctt ttgtggaggt tcaattgtaa atgagaagtg

2220

gattgtgact gcagcccact gtgtggaaac tggagtcaag attactgtgg tggctggaga

2280

gcacaatatt gaggaaactg agcacactga gcagaagagg aatgtgatca ggattatccc

2340

ccaccacaac tacaatgctg ctatcaacaa gtacaaccat gacattgccc tcctggaact

2400

ggatgaaccc ctggtcttga acagctatgt gacacccatc tgtattgctg ataaagagta

2460

caccaacatc ttcttgaaat ttgggtctgg atatgtgtct ggctggggca gggtgttcca

2520

taaaggcagg tctgccctgg tattgcagta tttgagggtg cctctggtgg atagagcaac

2580

ctgcttgctg agcaccaagt ttacaatcta caacaatatg ttctgtgcag ggttccatga

2640

aggtggtaga gacagctgcc agggagattc tgggggtccc catgtgactg aggtggaggg

2700

aaccagcttc ctgactggga ttatcagctg gggtgaggag tgtgctatga agggaaagta

2760

tgggatctac acaaaagtat ccagatatgt gaactggatt aaggagaaaa ccaagctgac

2820

ttga

2824

<210> 26

<211> 10659

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 26

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc tgcggcctag taggctcaga ggcacacagg agtttctggg

180

ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc

240

ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt

300

gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag

360

aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt

420

cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg

480

ggatcttgct accagtggaa cagccactaa ggattctgca gtgagagcag agggccagct

540

aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact cacgccaccc cctccacctt ggacacagga

600

cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac

660

actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac

720

ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc

780

tcccccgttg cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc

840

tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga cagtgaatac cactttcaca atctgctagc

900

aaaggttatg cagagggtga acatgatcat ggctgagagc cctggcctga tcaccatctg

960

cctgctgggc tacctgctgt ctgctgaatg tacaggtttg tttccttttt tataatacat

1020

tgagtatgct tgccttttag atatagaaat atctgattct gtcttcttca ctaaattttg

1080

attacatgat ttgacagcaa tattgaagag tctaacagcc agcacccagg ttggtaagta

1140

ctggttcttt gttagctagg ttttcttctt cttcactttt aaaactaaat agatggacaa

1200

tgcttatgat gcaataaggt ttaataaaca ctgttcagtt cagtatttgg tcatgtaatt

1260

cctgttaaaa aacagtcatc tccttggttt aaaaaaatta aaagtgggaa aacaaagaaa

1320

tagcagaata tagtgaaaaa aaataaccac agtatttttg tttggactta ccactttgaa

1380

atcaaattgg gaaacaaaag cacaaacagt ggccttattt acacaaaaag tctgatttta

1440

agatatgtga caattcaagg tttcagaagt atgtaaggag gtgtgtctct aattttttaa

1500

attatatatc ttcaatttaa agttttagtt aaaacataaa gattaacctt tcattagcaa

1560

cctcaatgag ctattttcaa gtgatgacaa agtgtgaagt taagggctca tttgagaact

1620

ttctttttca tccaaagtaa attcaaatat gattagaaat ctgacctttt attactggaa

1680

ttctcttgac taaaagtaaa attgaatttt aattcctaaa tctccatgtg tatacagtac

1740

tgtgggaaca tcacagattt tggctccatg ccctaaagag aaattggctt tcagattatt

1800

tggattaaaa acaaagactt tcttaagaga tgtaaaattt tcatgatgtt ttcttttttg

1860

ctaaaactaa agaattattc ttttacattt cagtttttct tgatcatgaa aatgccaaca

1920

aaattctgaa tagaccaaag aggtataact ctggcaagct tgaagagttt gtacagggga

1980

atctggagag agagtgtatg gaagagaagt gcagctttga ggaagccaga gaagtgtttg

2040

aaaatacaga gagaacaact gaattttgga agcagtatgt ggatggtgat caatgtgaga

2100

gcaatccctg cttgaatggg gggagctgta aagatgatat caacagctat gaatgttggt

2160

gtccctttgg atttgagggg aaaaactgtg agcttgatgt gacctgtaat atcaagaatg

2220

gcaggtgtga gcaattttgc aagaattctg ctgataacaa agtggtctgt agctgcactg

2280

agggatatag gctggctgaa aaccagaaga gctgtgaacc tgcagtgcct tttccctgtg

2340

ggagagtgtc tgtgagccaa accagcaagc tgactagggc tgaagcagtc tttcctgatg

2400

tagattatgt gaatagcact gaggctgaga caatccttga caatatcact cagagcacac

2460

agagcttcaa tgacttcacc agggtggtag gaggggagga tgccaagcct gggcagttcc

2520

cctggcaggt agtgctcaat ggaaaagtgg atgccttttg tggaggttca attgtaaatg

2580

agaagtggat tgtgactgca gcccactgtg tggaaactgg agtcaagatt actgtggtgg

2640

ctggagagca caatattgag gaaactgagc acactgagca gaagaggaat gtgatcagga

2700

ttatccccca ccacaactac aatgctgcta tcaacaagta caaccatgac attgccctcc

2760

tggaactgga tgaacccctg gtcttgaaca gctatgtgac acccatctgt attgctgata

2820

aagagtacac caacatcttc ttgaaatttg ggtctggata tgtgtctggc tggggcaggg

2880

tgttccataa aggcaggtct gccctggtat tgcagtattt gagggtgcct ctggtggata

2940

gagcaacctg cttgctgagc accaagttta caatctacaa caatatgttc tgtgcagggt

3000

tccatgaagg tggtagagac agctgccagg gagattctgg gggtccccat gtgactgagg

3060

tggagggaac cagcttcctg actgggatta tcagctgggg tgaggagtgt gctatgaagg

3120

gaaagtatgg gatctacaca aaagtatcca gatatgtgaa ctggattaag gagaaaacca

3180

agctgacttg atgaaagatg gatttccaag gttaattcat tggaattgaa aattaacaga

3240

gatctagagc tgaattcctg cagccagggg gatcagcctc tactgtgcct tctagttgcc

3300

agccatctgt tgtttgcccc tcccccttgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca

3360

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcacattg tctgagtagg tgtcattcta

3420

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc

3480

atgctgggga tgcagtgggc tctatggctt ctgaggcaga aagaaccagc tggggctcga

3540

gatccactag ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct

3600

cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg

3660

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc ccatgggcag atgcaccacc

3720

tgtctcagtg caaagccctg cctaagtagg ctggtcataa gaccatgtgt ctggctgtaa

3780

ctccaattga ttgtcagcat caataaaact tggccaacac tgttatatac tggtattgat

3840

agttacaact gaacatattt gtttaagcaa ttggaattaa gaattcacat gcaatgatat

3900

cagggtcctt ctcctctggt tagtgtattg gggggaaatt ggacatctct cagctcagta

3960

ggctagttag gccaggatgg atgacatcca cagcccctgg gcagagagat tatgatgtag

4020

ctagtctgac tcctgacaaa gacttgcttc ctggagcttc tactactttc tggtggatgg

4080

ctaagaaata tggttgtgtt cttttaagtc tgaagagcat tatttttgcc aacccctgac

4140

caaacatcct tgccaaggaa aaggcctaaa atatatttgc atttaaagat attacaaact

4200

acttggtttt ggaatgtttg gcctttcagg atcatagcta tcaaaatatt agctatttgg

4260

ggtatgagat gtctgcttgg tcaaggacaa gttcttaaag acatcatgtt ggggaataat

4320

ggggaaaatg ggaaggctta tgctctgagt aagacatctg agttatcatc tgtcaaacat

4380

ttttgttagt catagtctaa tgggagcctg ttttccctct ttaatataca ttcacatctg

4440

aatttatgct cttcattgac aatgccagcc cagaacaaca gctcttaccc tttggttttc

4500

ttcctaacct ttaactccaa tgtaaccatt acctgccatt tcagtaaaac cattattctc

4560

cctacttacc cacccaagtt gtacaataaa gagtgtttgc tctcactcat atacaaagca

4620

aattcatttg tttgtgatgt acagcttgct atgcccacag atgtggtttg cctagtcctt

4680

tgctctaggt catttgactg ggaacagatg ggatgctcac tttggttttt aatggttaac

4740

tagtcattga aatgcatttc atcaaataat cttagaggat aattgtttaa atgtctgtcc

4800

agactagctt tgtagagcca ggtgccatta cacatgtcac cttcttattt ctcttaattg

4860

aatttttatc atctgagata ggaataatag agggcttttt caagtgaaga tattactata

4920

gtctaaagac cttagtgtaa catcctggcc cctaaggaaa aacaagttct ggttcataca

4980

tataataact ttgcatgtta tctgccactg agatgtgtcc taatccaaca gaaaggattg

5040

aatctctgta gctaggtgta cagggcaaga gctgtacagg gaacctttaa agatagcttc

5100

aggccaaagc tgaggaaagt ggatggagac tggggaaaat gctaagacat tttaaagatt

5160

ttctttaggt caaaaataga ataagaaata gaccatttcc ctggacattt tctgtaggtt

5220

aatactgtta actattggta aatgcatatg ctacaactta atatgtctgc tttgtgagtt

5280

tagcattgtc tccttgtcat tccagaaatg aaatggcaaa tacatttaaa tcagaactaa

5340

aaaggggaac agggtataaa ggctcaattt agtcacatca tttccctttc tcacccaccc

5400

cctttaaacc agatgtttgc caatgcatta acaatgcaga tgtttcctga aagaaagttt

5460

agtaactcaa gcagacacct tattttcttt tcaagcagaa aagactatga gatggtggtt

5520

gtggttgttc tgggagggag aagatataaa tgatacacat tatttcaaat catttcatga

5580

cctcactgca cacttatagt tattgtacct gttgtctttt tgctgtcaag cctagctaag

5640

atcatttgga atgttcaaga tcactcatac atgcatgtgc acacatacac atgcacatat

5700

gttcactccc tatttcatcc acatgaacta agattactga tgtgtacaga ttcaaagcac

5760

ttttattctt ttccaaaggc aagaagctga gctactttcc agaatagttg tgaaagaccc

5820

tgtcatactt ctgcattgtt tcctccacac cacctccatc cagttcctta tgaatggtta

5880

ctggttttca aaaatatgag ataaattgag tgtataaaag tcatttttag acaaaatgaa

5940

acaggaaatg aaagaaacca gaatctctcc tcatttgtgg atgggccagc tccaccatgt

6000

catggttaat ctgcagggag gaaatactag atttgattgc agatcagact gcagcaaacc

6060

tgctgtgact aaggcatcaa gagaaagcaa gcaacagctg gggcttcagt ggtgaaaaca

6120

ttatatatct agctttgaaa tatgaaatac tgtttagcag tgtcacctag aaaagagtgt

6180

ttcaaaatgc tgatgcttca taagaacctt tctcttcaga gttgtttctt ttatctttca

6240

aattagccag ggtgggaaat aaagtgatca cttggtgaag aaatctcaca aagaagaaca

6300

tagagagttc actttcatct ggagtaatga acagattgaa caaactagaa atggttagtc

6360

tgttaaagaa aaggtgtagg tgagctgttt gcaagagcca caagggaaag gggaagacaa

6420

cttctttgtg gacttaaggg tgaaagttgc aagcaggcaa gaccattctg acctccatta

6480

agaaagccct ttccaaccaa caaccactgg gttggttact caggttgggc agcattggga

6540

gcaaatgttg attgaacaaa tgtttgtcag aattgttgac ttaaagagct gttctgtcac

6600

tggggacagc agcagctaga tagccccatt cagggagagg gcatttgttc acctggccag

6660

agatcagagc aggctaaggg actgctggga tcctgtccag ctttgagacc ctacagagcc

6720

atgttcacct agcaggtatc ccttctgagg tcactctcat ttcttacctt attccagggc

6780

tttcacctca gcttgccagg ctggagccaa gggccaaggc agcctcacct tgttggctat

6840

ggtagcttcc caggagcccc ctatggttca ggaacagctc tgcctgcccc atcctgtttg

6900

ctacctccta aagccaaagg cactggtggg ccaggccagc ttctaaagtc acacaaggtt

6960

agaaggttcc tgacaggaag ggcttgaggc caatggaagg aggtacttca gtttccctcc

7020

agatgcccag tgatgggctc agagctcctt gagaacttgg gaaaggaagc agggtctctg

7080

aagaaatact tcaggagtag aaagaggaag ctagagggtt aaatgcacta cacaggaaca

7140

gaaatgagtt tttcttagag ttagtatatg tctagaggtg tagtaaacta aaacaagtct

7200

tgaattgcat acagccactt agggaagaaa tgaaaacctt tgaatattag tgaaaaaagg

7260

gaaactgcaa cccctgtatt actagatagc tttcatcaac agctcaaaac agacagattt

7320

ttataggttt actgtgtgca ctttaataca agggcagtgg ttcagaacta gtcaggtcct

7380

gaaaaggatt taccaaatgt tgagtgtgcc ctctagtgtt cacacttccc agctttcttc

7440

ctataaaggt ggatcaaggc acttgcttac aactggaact gaaatcctcc aagtggaact

7500

agacattgag atggagaaaa tattcattgt ccactgtaat tatgcaagga atatccagtt

7560

gagataatgg acttgcctct tatctaataa tacccaggct caatgggtca ctgctttgtc

7620

cactttgccc aaaattcaag cacagctaag ttgatatttt aggacaaagg cagcttacta

7680

tccagccaga ggggagtaga atatggttaa gagagagtgg aaagaatgaa tgagccctgc

7740

tattcctcac tgcctggatg gctataagca cagcccttat ggaggcctta ggtcttgctt

7800

cataatattc cagtttgaaa agggtttgaa aagacctcct agaaaaatca gtagtttttc

7860

tcttttgagt aacatgtagc aaaaaaaatt tcatcatgta ggtacaggga acaccctaat

7920

aactattaat ctcaaggagt caagccagtg tgtttcctaa tgtatctgct gtatccccat

7980

gaagcaaatt ttgccatcag agaaactgac tcatggggaa aaaatccaag gacctcaaat

8040

caccaaaaga agccattcct cagatttgcc taagcttaag cttccctgtc tctcattgtg

8100

tgttgctttc aatgcagtta cataaatggc ttttttgttt atgcaccaaa aacactaatt

8160

catctgcaaa gctataggtc aaagcaacca tagtatgcac cctgctagct ggcgcattaa

8220

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccttagcgc

8280

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag

8340

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca

8400

aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc

8460

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa

8520

cactcaactc tatctcgggc tattcttttg atttagacct gcaggcatgc aagcttggca

8580

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc

8640

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc

8700

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgcgatt tattcaacaa agccgccgtc

8760

ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa

8820

aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata

8880

tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat

8940

ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa

9000

tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc

9060

cggtgagaat ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt

9120

acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg

9180

agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa

9240

ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc

9300

taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg

9360

agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct

9420

gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc

9480

tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc

9540

gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcttcga

9600

gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc

9660

agacagtttt attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt

9720

ttgagacaca acgtggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat

9780

cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa

9840

ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga

9900

tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctctcga

9960

cggagttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt

10020

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt

10080

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc

10140

agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg

10200

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg

10260

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt

10320

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac

10380

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg

10440

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg

10500

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat

10560

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt

10620

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt

10659

<210> 27

<211> 601

<212> Белок

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 27

Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser

1 5 10 15

Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys

20 25 30

Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp

35 40 45

Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro

50 55 60

Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu

65 70 75 80

Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser

85 90 95

Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala

100 105 110

Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro

130 135 140

Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg

145 150 155 160

Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg

165 170 175

Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn

180 185 190

Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val

195 200 205

Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His

210 215 220

Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln

225 230 235 240

Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser

245 250 255

Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly

260 265 270

Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser

275 280 285

Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile

290 295 300

Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr

305 310 315 320

Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met

325 330 335

Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln

340 345 350

Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp

355 360 365

Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn

370 375 380

Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe

385 390 395 400

Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp

405 410 415

Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys

420 425 430

Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn

435 440 445

Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln

450 455 460

Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln

465 470 475 480

Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro

485 490 495

Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile

500 505 510

Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn

515 520 525

Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val

530 535 540

Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp

545 550 555 560

Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val

565 570 575

Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile

580 585 590

Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

595 600

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий белок фактора IX, для лечения гемофилии B, где указанная нуклеиновая кислота не содержит динуклеотиды CpG. Изобретение относится также к плазмиде для производства вирусных векторов для лечения гемофилии В и к фармацевтической композиции для лечения гемофилии В. Изобретение позволяет эффективно лечить гемофилию В. 10 н. и 83 з.п. ф-лы, 24 ил., 4 табл., 6 пр.

1. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок фактора IX, для лечения гемофилии B, где указанная нуклеиновая кислота не содержит динуклеотиды CpG.

2. Вектор или плазмида экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий белок фактора IX, для лечения гемофилии B, где указанная нуклеиновая кислота не содержит динуклеотиды CpG и/или где, если одна или несколько нуклеотидных последовательностей, вспомогательных по отношению к нуклеиновой кислоте, кодирующей человеческий фактор IX, присутствуют в указанном векторе или плазмиде, указанные вспомогательные последовательности необязательно не содержат динуклеотиды CpG.

3. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок фактора IX, по п.1, вектор или плазмида экспрессии по п.2, дополнительно содержащие интрон, элемент, регулирующий экспрессию, один или несколько инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или филлерную полинуклеотидную последовательность, необязательно, где указанный интрон, элемент, регулирующий экспрессию, и/или филлерная полинуклеотидная последовательность не содержат динуклеотиды CpG.

4. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок фактора IX, вектор или плазмида экспрессии по п.3, где интрон находится в нуклеиновой кислоте, кодирующей человеческий белок фактора IX, или где элемент, регулирующий экспрессию, функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей человеческий белок фактора IX, или где ITR AAV фланкирует 5'- или 3'-конец нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий фактор IX, или где филлерная полинуклеотидная последовательность фланкирует 5'- или 3'-конец нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок фактора IX.

5. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность совсем не содержат динуклеотиды CpG.

6. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, содержит последовательность, на 80% или более идентичную SEQ ID NO: 10, и кодирует функциональный фактор IX согласно анализу свертывания крови.

7. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, содержит нуклеотидную последовательность, на 90% или более идентичную SEQ ID NO: 10, и кодирует функциональный фактор IX согласно анализу свертывания крови.

8. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, содержит последовательность, на 95% или более идентичную SEQ ID NO: 10, и кодирует функциональный фактор IX согласно анализу свертывания крови.

9. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, содержит SEQ ID NO: 10, 25 или 26.

10. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX, содержит нуклеиновую кислоту, описанную в SEQ ID NO: 11.

11. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где интронная нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 17.

12. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит энхансерную нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 14.

13. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит промоторную нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, описанную в SEQ ID NO: 15.

14. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, обладает пониженной способностью индуцировать иммунный ответ.

15. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, экспрессируется на уровнях, превышающих уровень или сравнимых с уровнем нативной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX.

16. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок человеческого фактора IX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит конститутивный или регулируемый контролирующий элемент, или тканеспецифический элемент, регулирующий экспрессию, или промотор.

17. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок человеческого фактора IX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где элемент, регулирующий экспрессию, обеспечивает экспрессию в печени.

18. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит промотор человеческого α1-антитрипсина (hAAT), и/или энхансер аполипопротеина E (ApoE) HCR-1, и/или HCR-2.

19. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок человеческого фактора IX, вектор или плазмида экспрессии по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность полиаденилирования, расположенную на 3'-конце нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий фактор IX.

20. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок человеческого фактора IX, по п.19, где нуклеотидная последовательность полиаденилирования расположена на 3'-конце нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий фактор IX, и содержит нуклеотидную последовательность полиаденилирования bGH.

21. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, по п.19, где нуклеотидная последовательность полиаденилирования расположена на 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, содержит нуклеотидную последовательность полиаденилирования, содержащую все динуклеотиды CpG, удаленные из нее.

22. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, по п.21, где нуклеотидная последовательность полиаденилирования содержит нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 19.

23. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, по п.4, где филлерная полинуклеотидная последовательность расположена на 3'-конце нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок FIX.

24. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, по п.4, где ITR AAV фланкируют 3'-конец нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок FIX.

25. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, по п.24, где филлерная полинуклеотидная последовательность расположена на 3'-конце ITR AAV, фланкирующих 3'-конец нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий белок FIX.

26. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий белок FIX, по п.4, где филлерная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность фага лямбда.

27. Плазмида для производства вирусных векторов для лечения гемофилии В, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий белок FIX, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий белок FIX, по любому из пп. 1-26, где указанная плазмида дополнительно содержащая одну или несколько точек начала репликации и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивость к антибиотику.

28. Вирусный вектор для лечения гемофилии В у человека, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий белок FIX по любому из пп. 1-4.

29. Вирусный вектор по п.28, где указанный вирусный вектор представляет собой ленти- или аденовирусный вектор.

30. Вирусный вектор по п.29, где указанный вирусный вектор представляет собой вектор, полученный из аденоассоциированного вируса (AAV).

31. Вектор AAV по п.30, содержащий нуклеотидную последовательность ITR любого из серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

32. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит последовательность капсидного белка VP1, VP2 и/или VP3, на 90% или более идентичную последовательностям белков VP1, VP2 и/или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

33. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит последовательность капсидного белка VP1, VP2 или VP3, выбранную из любого из серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

34. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит последовательность белка VP1, на 90% или более идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или содержит 1-50 аминокислотных замен, делеций или добавлений по отношению к указанной последовательности; последовательность белка VP2, на 90% или более идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или содержит 1-50 аминокислотных замен, делеций или добавлений по отношению к указанной последовательности; и/или последовательность белка VP3, на 90% или более идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или содержит 1-50 аминокислотных замен, делеций или добавлений по отношению к указанной последовательности.

35. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит аминокислотную замену в одном из аминокислотных положений 195, 199, 201 или 202 последовательности капсидного белка VP1, описанной в SEQ ID NO: 1, или аминокислотную замену аргинина на лизин в последовательности капсидного белка VP1, описанной в SEQ ID NO: 1.

36. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит остатки одной из аминокислот A, V, P или N в одном из аминокислотных положений 195, 199, 201 или 202 последовательности VP1 капсидного белка, описанной в SEQ ID NO: 1.

37. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит остаток A в аминокислотном положении 195; остаток V в аминокислотном положении 199, остаток P в аминокислотном положении 201 или остаток N в аминокислотном положении 202 последовательности капсидного белка VP1, описанной в SEQ ID NO: 1.

38. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит два, три или четыре остатка А в аминокислотном положении 195; остаток V в аминокислотном положении 199, остаток P в аминокислотном положении 201 или остаток N в аминокислотном положении 202 последовательности капсидного белка VP1, описанной в SEQ ID NO: 4.

39. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит последовательность капсидного белка VP1, на 90% или более идентичную одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-9.

40. Вектор AAV по п.30, где последовательность капсидного белка вектора содержит последовательность капсидного белка VP1, состоящую из одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-9.

41. Фармацевтическая композиция для лечения гемофилии В, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий белок FIX, по любому из пп.1-26 и/или вирусный вектор по любому из пп.28-40.

42. Фармацевтическая композиция по п.41, дополнительно содержащая пустой капсид AAV.

43. Фармацевтическая композиция по п.42, где пустой капсид выбран из капсидов серотипов AAV AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11.

44. Способ доставки или переноса нуклеиновой кислоты в клетку, включающий приведение нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп. 1-43 в контакт с указанной клеткой млекопитающего в условиях, обеспечивающих трансдукцию указанной клетки, тем самым обеспечивая доставку или перенос нуклеиновой кислоты в клетку млекопитающего.

45. Способ доставки или переноса нуклеиновой кислоты в организм или клетку млекопитающего, включающий введение нуклеотидной последовательности, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп. 1-43 в организм или клетку указанного млекопитающего, тем самым обеспечивая доставку или перенос нуклеиновой кислоты в организм или клетку млекопитающего.

46. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в белке фактора IX, включающий: (a) получение нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп. 1-43; и (b) введение млекопитающему количества нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп. 1-43, где указанный фактор IX экспрессируется в организме млекопитающего.

47. Способ по любому из пп. 44-46, где указанный белок фактора IX экспрессируется в клетке, ткани или органе указанного млекопитающего.

48. Способ по п.47, где клетка включает секреторную клетку.

49. Способ по п.47, где клетка включает эндокринную клетку.

50. Способ по п.47, где клетка включает гепатоцит, нейронную клетку, глиальную клетку, клетку сетчатки, эпителиальную клетку, клетку легкого или тотипотентную, плюрипотентную или мультипотентную стволовую клетку.

51. Способ по п.47, где ткань или орган указанного млекопитающего включает печень, головной мозг, центральную нервную систему, спинной мозг, глаз, сетчатку или легкое.

52. Способ по любому из пп. 44-51, где млекопитающее продуцирует недостаточное количество белка фактора IX или дефектный или аберрантный белок фактора IX.

53. Способ по любому из пп. 44-51, где млекопитающее страдает от гемофилии B.

54. Способ по любому из пп. 44-51, где нуклеиновую кислоту, вектор экспрессии или вирусный вектор доставляют млекопитающему внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, перорально, путем интубации, через катетер, дермально, интракраниально, посредством ингаляции, внутрь полости или через слизистую оболочку.

55. Способ по любому из пп. 44-51, где млекопитающее представляет собой человека.

56. Способ по любому из пп. 44-51, где млекопитающее является сероположительным или сероотрицательным по серотипу AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или AAV-Rh74.

57. Способ по любому из пп. 44-51, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV.

58. Способ по любому из пп. 44-51, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и/или AAV-Rh74.

59. Способ по любому из пп. 44-51, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV, который относится к тому же серотипу, что и вектор AAV.

60. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающего на уровнях, обеспечивающих терапевтический эффект у млекопитающего.

61. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающего на уровнях, обеспечивающих терапевтический эффект в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, недель или месяцев.

62. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX присутствует в организме млекопитающего на уровнях, соответствующих примерно 20% активности FIX или более 20% активности, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

63. Способ по любому из пп. 44-51, где вирусный вектор вводят в дозе, находящейся в диапазоне примерно 1×10¹⁰-1×10¹¹, 1×10¹¹-1×10¹², 1×10¹²-1×10¹³, или 1×10¹³-1×10¹⁴ векторных геномов на килограмм (вг/кг) млекопитающего.

64. Способ по любому из пп. 44-51, где вирусный вектор вводят в дозе, составляющей менее 1×10¹² векторных геномов на килограмм (вг/кг) тела млекопитающего, причем указанный белок фактора IX продуцируется в организме млекопитающего на уровнях, соответствующих примерно 20% активности или более 20% активности, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

65. Способ по любому из пп. 44-51, где вирусный вектор вводят в дозе, составляющей менее 5×10¹¹ векторных геномов на килограмм (вг/кг) тела млекопитающего, причем указанный белок фактора IX продуцируется в организме млекопитающего на уровнях, соответствующих примерно 20% активности или более 20% активности, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

66. Способ по любому из пп. 44-51, где указанная нуклеиновая кислота, вектор экспрессии или вирусный вектор при введении млекопитающему не вызывают значительного иммунного ответа против белка фактора IX и/или вирусного вектора.

67. Способ по любому из пп. 44-51, в котором значительный иммунный ответ против белка фактора IX и/или вирусного вектора не индуцируется в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

68. Способ по любому из пп. 44-51, где у млекопитающего отсутствует значительный иммунный ответ против белка фактора IX.

69. Способ по п. 44-51, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ против белка фактора IX, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX.

70. Способ по любому из пп. 44-51, где у млекопитающего не развивается значительный иммунный ответ против белка фактора IX, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

71. Способ по любому из пп. 44-51, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ против белка фактора IX, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

72. Способ по любому из пп. 44-51, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ на вектор AAV, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX.

73. Способ по любому из пп. 44-51, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ на вектор AAV, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

74. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающим в количествах или на уровнях активности, обеспечивающих терапевтический эффект в отношении млекопитающего без введения иммуносупрессорного средства (например, стероида).

75. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающим в количествах или на уровнях активности, обеспечивающих терапевтический эффект в отношении млекопитающего без введения иммуносупрессорного средства (например, стероида), в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, недель или месяцев.

76. Способ по любому из пп. 44-51, где у указанного млекопитающего не наблюдаются аномально высокие уровни ферментов печени ALT, AST и/или LDH в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

77. Способ по любому из пп. 44-51, где у указанного млекопитающего не наблюдаются аномально высокие, требующие использования иммуносупрессорного средства (например, стероида), уровни ферментов печени ALT, AST и/или LDH в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

78. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX экспрессируется у млекопитающего на уровнях, превышающих уровни FIX в кровотоке, необходимые для уменьшения продолжительности, тяжести или частоты спонтанных суставных кровотечений или мозгового кровотечения, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.

79. Способ по любому из пп. 44-51, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающего в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев на уровнях, позволяющих избежать применения или введения рекомбинантного белка FIX после введения вектора AAV.

80. Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор, содержащий капсид и геном, где указанный капсид включает белок VP1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и где указанный геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок фактор IX (FIX), где кодирующая последовательность по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:10 и кодирует тот же человеческий белок FIX, кодируемый SEQ ID NO:10.

81. Вектор rAAV по п. 80, где указанный геном дополнительно включает по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).

82. Вектор rAAV по любому из пп. 80 или 81, где указанный геном дополнительно включает элемент, регулирующий экспрессию, функционально связанный с указанной последовательностью, кодирующей человеческий белок FIX.

83. Вектор rAAV по п. 82, где указанный элемент, регулирующий экспрессию, включает промотор и необязательно энхансер.

84. Вектор rAAV по п. 83, где указанный элемент, регулирующий экспрессию, является специфичным для ткани печени.

85. Вектор rAAV по по любому из пп. 80-84, где указанный геном дополнительно включает терминатор транскрипции.

86. Вектор rAAV по по любому из пп. 80-85, где указанный геном дополнительно включает интрон.

87. Вектор rAAV по по любому из пп. 80-85, где указанный геном включает следующие элементы:

(a) первый ITR AAV,

(b) энхансер аполипопротеина E (ApoE) HCR-1 или его часть,

(c) промотор гена альфа1-антитрипсина (AAT) или его часть,

(d) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок FIX, где кодирующая последовательность по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:10, кодирует тот же человеческий белок FIX, кодируемый SEQ ID NO:10, и необязательно прерывается интроном,

(e) последовательность полиаденилирования; и

(f) второй ITR AAV.

88. Вектор rAAV по п. 87, где указанный геном включает Интрон A человеческого белка FIX или его часть, и последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста или ее часть.

89. Вектор rAAV по любому из пп. 80-88, где указанный ITR AAV представляет собой ITR AAV2.

90. Вектор rAAV по любому из пп. 80-89, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующей человеческий белок FIX.

91. Вектор rAAV по любому из пп. 87-90, где

(a) последовательность нуклеиновой кислоты указанного первого ITR AAV включает нуклеотиды 12-141 SEQ ID NO:26,

(b) последовательность нуклеиновой кислоты указанного энхансера включает нуклеотиды 152-472 SEQ ID NO:12,

(c) последовательность нуклеиновой кислоты указанного промотора включает нуклеотиды 482-878 SEQ ID NO:12,

(d) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, состоит из нуклеотидов 908-995 и 2434-3731 SEQ ID NO:12,

(e) последовательность нуклеиновой кислоты указанного интрона включает нуклеотиды 996-2433 SEQ ID NO:12,

(f) последовательность нуклеиновой кислоты указанной последовательности полиаденилирования включает нуклеотиды 3820-4047 SEQ ID NO:12; и

(g) последовательность нуклеиновой кислоты указанного второго ITR AAV включает нуклеотиды 3557-3686 SEQ ID NO:26.

92. Способ лечения субъекта, являющегося человеком, с гемофилией B, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества вектора rAAV по любому из пп. 80-91.

93. Способ по п.92, где указанный субъект имеет тяжелые симптомы гемофилии В и где указанное лечение эффективно для снижения указанных симптомов с тяжелых до симптомов умеренной или легкой гемофилии В.