СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ, ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ Российский патент 2020 года по МПК C12N5/09 C12Q1/02 C12Q1/68 G01N33/574 A61K31/435 A61P35/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области способов лечения, диагностики и прогнозирования.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гематологические или гематопоэтические злокачественные новообразования представляют собой онкологические заболевания крови или костного мозга, включая лейкоз и лимфому. Лейкоз характеризуется неконтролируемым накоплением клеток крови и подразделяется на четыре типа: острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ).

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), который также называют нелимфоидным, миелобластным, гранулоцитарным или миелоцитарным лейкозом, поражает различные типы лейкоцитов, включая гранулоциты и моноциты. Острый лейкоз представляет собой быстро прогрессирующее заболевание, которое приводит к накоплению в костном мозге и крови незрелых нефункциональных клеток; в костном мозге часто прекращается образование достаточного количества нормальных эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, и лейкозные клетки распространяются в печень, селезенку, лимфатические узлы, центральную нервную систему, почки и половые железы. Вследствие этого у пациента, имеющего ОМЛ, может развиться один или несколько симптомов ОМЛ, таких как, например, анемия, утомляемость, гриппоподобные симптомы, боль в костях, потеря аппетита, снижение массы тела, подверженность к появлению синяков, кровотечение и восприимчивость к инфекциям.

Во всем мире у более четверти миллиона взрослых людей ежегодно диагностируют острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в течение последних 3 десятилетий в терапии ОМЛ, две трети молодых людей и 90% пожилых людей все еще умирают от данного заболевания.

Опыт терапии пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и, в особенности, пациентов, страдающих от ОМЛ, свидетельствует о том, что системные профили цитокинов в плазме/сыворотке можно использовать как в качестве диагностического инструмента, так и при составлении прогноза для пациентов. Однако цитокины/хемокины высвобождаются множеством клеток и принимают участие в широком диапазоне биологических процессов; вследствие этого изменение уровней указанных соединений может, главным образом, отражать интенсивность и природу биологических процессов, и по этой причине для оптимального клинического применения анализа хемокинов/цитокинов может потребоваться комбинация с орган-специфичными биомаркерами. Клинические процедуры, терапевтические вмешательства и общее состояние пациентов также влияют на уровни хемокинов (Reikvam Н. et al., Toxins (Basel). Feb 2013; 5(2): 336-362). Таким образом, для обеспечения оптимальной оценки и терапии гематологических злокачественных новообразований необходимы новые способы диагностики и прогнозирования.

Принятые на сегодняшний день варианты лечения ОМЛ могут включать химиотерапию, лучевую терапию, иммунотерапию, переливание крови и трансплантацию костного мозга. Основа терапии первой линии, арабинозид цитозина (ara-С) в сочетании с антрациклином, была разработана приблизительно 40 лет назад и остается всемирным стандартом лечения; либо, в качестве альтернативы, применяют комбинацию из трех - восьми лекарственных препаратов, таких как, например, цитарабин, даунорубицин, идарубицин, тиогуанин, митоксантрон, этопозид и метотрексат. Несмотря на то, что принятая на сегодняшний день химиотерапия может привести к полной ремиссии, процент долгосрочной выживаемости без признаков заболевания в случае лейкоза, в частности, в случае ОМЛ, является низким.

Альтернативные подходы к лечению направлены на разработку менее токсичных и более эффективных средств терапии. При ОМЛ оценивали множество новых химиотерапевтических средств, включая ингибиторы топоизомеразы I, такие как топотекан и кампотецин, средства, содержащие платину (карбоплатин), и новые антиметаболиты, включая гемцитабин, троксцитабин и клофарабин (Smith М, et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2004; 50(3): 197-222). Все данные средства обладают активностью против лейкозных бластных клеток, однако пока что указанные средства применялись только в рамках исследований. Подход на основе блокады MDR-1 с применением циклоспорина А или PSC 833 не продемонстрировал преимуществ и может приводить к увеличению токсичности или приводить к необходимости уменьшить дозу, а вследствие этого приводить к снижению общей продолжительности химиотерапии (Larson RA. et al, Leukemia 2003; 17: 488-91).

Поскольку химиотерапия обычно также зачастую вызывает гибель нормальных клеток, пациенты, получающие химиотерапию, часто испытывают побочные эффекты, такие как, например, тошнота, утомляемость и повышенный риск инфекций.

Вследствие этого существует однозначная неудовлетворенная потребность в эффективных вариантах терапии (терапевтических средствах) с уменьшенной токсичностью для лечения гематологических злокачественных новообразований, включая лейкозы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору рецептора серотонина (5-HTR), при этом указанный ингибитор выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 1 и ингибитор 5-HTR типа 2, для применения при предотвращении и/или лечении злокачественных гематологических новообразований.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы, причем указанный способ включает обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в указанной клетке.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro диагностики гематологического злокачественного новообразования у субъекта, причем указанный способ включает идентификацию злокачественных клеток способом согласно настоящему изобретению.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro выделения малигнизированной (претерпевшей злокачественную трансформацию) клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы, причем указанный способ включает обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в указанной клетке и выделение указанной клетки, экспрессирующей указанный 5-HTR.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro определения прогноза для субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, причем указанный способ включает:

(а) определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крова и лимфатических узлов, и

(b) сравнение указанного уровня с эталонным уровнем, причем уменьшение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъект характеризуется благоприятным прогнозом, или

причем увеличение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъект характеризуется неблагоприятным прогнозом.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro оценки эффективности терапии у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования и получающего лечение указанной терапией, причем указанный способ включает:

a) определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

b) сравнение указанного уровня с уровнем экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта в более ранний момент времени,

причем уменьшение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с уровнем, определенным в образце от указанного субъекта в более ранний момент времени, свидетельствует, что терапия является эффективной, или причем увеличение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с уровнем, определенным в образце от указанного субъекта в более ранний момент времени, свидетельствует, что терапия является неэффективной.

Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro разработки персонализированной терапии для субъекта, у которого было диагностировано гематологическое злокачественное новообразование, причем указанный способ включает:

a) определение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, в образце от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

b) сравнение указанных уровней с эталонным уровнем,

причем увеличение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, по сравнению с эталонным уровнем свидетельствует, что субъекта следует лечить ингибитором 5-HTR типа 1 и/или ингибитором 5-HTR типа 2.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Обработка апоморфином снижает жизнеспособность клеток ОМЛ. 10⁶ клеток HL-60, KG-1, MonoMac-1 и Kasumi-1 на мл в полной среде RPMI обрабатывали 0,1, 1 и 10 мкМ апоморфина в течение 72 ч. Клетки инкубировали при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Клетки окрашивали 7-аминоактиномицином D (7-AAD, № CAS 7240-37-1) и красителем Хехстом 33342 (№ CAS 23491-52-3) и анализировали методом проточной цитометрии. Ядросодержащие клетки определяли на основании положительного окрашивания Хехстом, мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. Количество клеток определяли объемным методом подсчета. А. Представлены среднее арифметическое (символ) для каждой линии клеток ОМЛ и стандартное отклонение (планки погрешностей), полученные в 6 различных биологических повторах. В. Представлено среднее значение, соответствующее четырем различным линиям клеток ОМЛ. * р<0,05.

Фигура 2. Антагонисты 5HTR типа 1 и 2 вызывают гибель клеток в линиях клеток ОМЛ. 10⁶ клеток ОМЛ линий HL-60, KG-1, MonoMac-1 и Kasumi-1 на мл инкубировали с апоморфином, метиотепином, амперозидом или GR113808 в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в течение 72 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Ядросодержащие клетки определяли на основании положительного окрашивания Хехстом, мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. Количество клеток определяли объемным методом подсчета. А. Представлены среднее арифметическое (символ) для каждой линии клеток ОМЛ и стандартное отклонение (планки погрешностей), полученные в 6 различных биологических повторах. В. Линии клеток ОМЛ обрабатывали 10 мкМ апоморфина или метиотепина в присутствии или при отсутствии 5-СТ или 5-НТ. * р<0,05. Апо: апоморфин; Метио: метиотепин.

Фигура 3. Антагонисты 5HTR снижают жизнеспособность клеток в образцах от пациента с первичным ОМЛ в течение 24 ч. 5×10⁶ клеток первичного ОМЛ на мл обрабатывали апоморфином или метиотепином в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 24 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Суммарную популяцию ОМЛ идентифицировали на основании экспрессии CD45 и профиля SSC (side scatter, боковое рассеивание), определенного методом цитометрии. Примитивную популяцию ОМЛ идентифицировали в суммарной популяции ОМЛ на основании положительного окрашивания в отношении CD34 и отрицательного окрашивания в отношении CD38. Ядросодержащие клетки определяли на основании положительного окрашивания Хехстом, мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. Количество клеток определяли объемным методом подсчета. 11 образцов первичного ОМЛ анализировали в трех повторах. Каждый символ представляет собой конкретного пациента, страдающего от ОМЛ. Столбцы представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора. * р<0,05

Фигура 4. Антагонисты 5HTR снижают жизнеспособность клеток в образцах от пациента с первичным ОМЛ в течение 72 ч. 5×10⁶ клеток первичного ОМЛ на мл обрабатывали апоморфином или метиотепином в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 72 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Суммарную популяцию ОМЛ идентифицировали на основании экспрессии CD45 и профиля SSC, определенного методом цитометрии. Примитивную популяцию ОМЛ идентифицировали в суммарной популяции ОМЛ на основании положительного окрашивания в отношении CD34 и отрицательного окрашивания в отношении CD38. Ядросодержащие клетки определяли на основании положительного окрашивания Хехстом, мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. Количество клеток определяли объемным методом подсчета. 11 образцов первичного ОМЛ анализировали в трех повторах. Каждый символ представляет собой конкретного пациента, страдающего от ОМЛ. Столбцы представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора. * р<0,05.

Фигура 5. Антагонисты 5HTR индуцируют миелоидную дифференциацию на линиях клеток ОМЛ. 10⁶ клеток ОМЛ HL-60, KG-1, MonoMac-1 и Kasumi-1 на мл обрабатывали апоморфином и метиотепином в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в течение 72 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5% в полной среде RPMI. Экспрессию CD11c, CD11b и CD14 на поверхности обнаруживали методом проточной цитометрии. Мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. * р<0,05. СИФ: Средняя интенсивность флуоресценции.

Фигура 6. Антагонист 5HTR апоморфин индуцирует миелоидную дифференциацию в образцах от пациента с первичным ОМЛ. 5×10⁶ клеток первичного ОМЛ на мл обрабатывали апоморфином в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 72 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Суммарную популяцию ОМЛ идентифицировали на основании экспрессии CD45 и профиля SSC, определенного методом цитометрии. Экспрессию CD11b, CD14 и CD15 на поверхности обнаруживали методом проточной цитометрии. Мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. 9 образцов первичного ОМЛ анализировали в трех повторах. Каждый символ представляет собой конкретного пациента, страдающего от ОМЛ. Столбцы представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора. * р<0,05.

Фигура 7. Антагонист 5HTR метиотепин индуцирует миелоидную дифференциацию в образцах от пациента с первичным ОМЛ. 5×10⁶ клеток первичного ОМЛ на мл обрабатывали метиотепином в концентрации ОД, 1 и 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 72 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Суммарную популяцию ОМЛ идентифицировали на основании экспрессии CD45 и профиля SSC, определенного методом цитометрии. Экспрессию CD11b, CD14 и CD15 на поверхности обнаруживали методом проточной цитометрии. Мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. 9 образцов первичного ОМЛ анализировали в трех повторах. Каждый символ представляет собой конкретного пациента, страдающего от ОМЛ. Линии представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора. * р<0,05.

Фигура 8. Жизнеспособность здоровых клеток крови не изменяется после обработки антагонистами 5HTR. 5×10⁶ выделенных фиколом мононуклеарных клеток из образцов периферической крови, полученных от здоровых доноров, обрабатывали апоморфином или метиотепином в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ на 6 мл в полной среде RPMI в течение 24 ч (А) или 72 ч (В) при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Клетки крови идентифицировали на основании экспрессии CD45 и профиля SSC, определенного методом цитометрии. Ядросодержащие клетки определяли на основании положительного окрашивания Хехстом, мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. Количество клеток определяли объемным методом подсчета. 4 образца от первичных доноров анализировали в трех повторах. Столбцы представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора, и планки погрешностей указывают стандартное отклонение. * р<0,05.

Фигура 9. Обработка антагонистом 5HTR не оказывает влияния на здоровые гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки. 2×10⁵ выделенных фиколом мононуклеарных клеток без линий дифференцировки из образцов крови пупочного канатика, полученных от здоровых доноров, обрабатывали апоморфином в концентрации 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 24 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Клетки крови идентифицировали на основании экспрессии CD45 и профиля SSC, определенного методом цитометрии. Для идентификации субпопуляции проводили поверхностное окрашивание в отношении CD34 и CD38. Ядросодержащие клетки определяли на основании положительного окрашивания Хехстом, мертвые клетки исключали на основании положительного окрашивания 7-AAD. Количество клеток определяли объемным методом подсчета. 3 первичных образца крови пупочного канатика анализировали в трех повторах. Столбцы представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора, планки погрешностей указывают стандартное отклонение.

Фигура 10. Клоногенная способность образцов первичного ОМЛ снижается после обработки антагонистом 5HTR. 5×10⁵ клеток крови пациента с первичным ОМЛ на мл обрабатывали апоморфином или метиотепином в концентрации 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 18 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Затем клетки культивировали в метилцеллюлозе с добавками гематопоэтических цитокинов в течение 14 дней. Количества полученных КОЕ-Б измеряли микроскопическим методом на основании морфологических критериев. Анализировали 7 образцов крови первичного ОМЛ. Каждый символ представляет собой образец от конкретного пациента. Линии представляют медиану. * р<0,05. КОЕ-Б: колониеобразующие единицы бластных клеток.

Фигура 11. Обработка антагонистом 5HTR не снижает клоногенную способность здоровых гематопоэтических стволовых клеток. 1×10³ первичных клеток крови пупочного канатика без линий дифференцировки на мл обрабатывали апоморфином или метиотепином в концентрации 10 мкМ в полной среде IMDM в течение 18 ч при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Затем клетки культивировали в метилцеллюлозе с добавками гематопоэтических цитокинов в течение 14 дней. Количества полученных колоний измеряли микроскопическим методом на основании морфологических критериев. А. Представлено суммарное количество колоний. КОЕ: колониеобразующие единицы. В. Представлена частота встречаемости колоний каждого подтипа (КОЕ-Смеш., колония со смешанной линией дифференцировки; КОЕ-ГМ, гранулоцитарно-моноцитарная колония; КОЕ-Г, колония гранулоцитов; КОЕ-М, колония моноцитов; БОЕ-Э бластная колония эритроцитов). Анализировали 4 первичных образца крови пупочного канатика. Столбцы представляют среднее арифметическое жизнеспособности клеток для каждого повтора, планки погрешностей указывают стандартное отклонение. * р<0,05.

Фигура 12. Образцы ОМЛ дифференциально экспрессируют 5HTR. Проводили поверхностное окрашивание образцов крови первичного ОМЛ, образцов здоровой периферической крови и линий клеток ОМЛ (HL-60, KG-1, МоnоМас-1 и Kasumi-1) в отношении 5HTR 1А и HTR 1В. Образцы анализировали методом проточной цитометрии; представлена частота встречаемости положительных клеток. Представлены 18 образцов периферической крови пациента с первичным ОМЛ и 16 образцов периферической крови здорового донора. Круги: линии клеток ОМЛ, квадраты: ОМЛ, ромбы: здоровые зрелые клетки крови * р<0,05; *** р<0,001.

Фигура 13. Уровни мРНК 5HTR коррелируют с клиническим исходом ОМЛ. Из образцов крови пациента с первичным ОМЛ выделяли суммарную РНК, и уровни мРНК 5HTR1A (А) и 5HTR1B (В) измеряли методом полуколичественной ПЦР. Уровень экспрессии нормировали к ГАФДГ (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и рассчитывали согласно способу 2^-ΔCt. 6 образцов ОМЛ, соответствующих группе благоприятного прогноза, и 8 образцов ОМЛ, соответствующих группе неблагоприятного прогноза, представлены в трех повторах. * р<0,05.

Фигура 14. Обработка антагонистами 5HTR вызывает уменьшение вторичных КОЕ. 10⁶ клеток пациента с первичным ОМЛ на мл из первичных КОЕ, предварительно обработанных 10 мкМ апоморфина, 10 мкМ метиотепина или контролем - наполнителем, повторно высевали в метилцеллюлозе с добавками гематопоэтических цитокинов в течение 14 дней. Количества полученных КОЕ-Б измеряли микроскопическим методом на основании морфологических критериев. Исследовали три образца первичного ОМЛ. * р<0,05, *** р<0,005, **** р<0,001.

Фигура 15. Обработка антагонистами 5HTR1 уменьшает нагрузку ОМЛ на модели ксенотрансплантата на мышах in vivo. Мышам NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) в возрасте 6-8 недель в день 0 вводили бусульфан (30 мг/кг и.п., интраперитонеально) для удаления клеток миелоидной линии. В день 1 в.в. (внутривенно) инъецировали 10⁶ клеток MonoMac-1. В дни 7-14 мышам через день и.п.вводили апоморфин (5 мг/кг) или метиотепин (0,1 мг/кг), в то время как контрольным мышам вводили наполнитель - солевой раствор (0,9% NaCl). В день 15 мышей умерщвляли, и кости (гребень подвздошной кости, бедренную кость и большую берцовую кость) отбирали и анализировали для определения наличия клеток человека. Образцы костного мозга изучали методом проточной цитометрии. Представлена частота встречаемости клеток, положительных в отношении CD45 человека (верхний чертеж), и суммарное количество клеток, положительных в отношении CD45 человека (нижний чертеж), в костном мозге по сравнению с контролем. Столбцы представляют среднее арифметическое значение. Планки погрешностей представляют СОС (стандартную ошибку среднего). ** р<0,01; *** р<0,001.

Фигура 16. Обработка антагонистом 5HTR снижает способность регенерации лейкоза в клетках первичного ОМЛ, при этом не оказывая влияния на здоровые гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки. 1 - 10×10⁶ клеток пациента с первичным ОМЛ или 10 - 14×10⁴ клеток ПК (пуповинной крови) без линий дифференцировки обрабатывали ex vivo (10 мкМ апоморфина, 10 мкМ метиотепина или контролем - наполнителем) в течение 18 ч в IMDM с добавками 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и гематопоэтических цитокинов. Клетки инъецировали в.в. мышам NSG, предварительно кондиционированным бусульфаном (30 мг/кг), и в течение 8 недель не вводили каких-либо соединений. Мышей умерщвляли, и кости (гребень подвздошной кости, бедренную кость и большую берцовую кость) отбирали и анализировали для определения наличия лейкоза человека (верхний чертеж) или здоровых клеток крови (нижний чертеж) методом проточной цитометрии. Исследовали четыре образца от пациентов, страдающих от ОМЛ, и три образца крови пупочного канатика (КПК). * р<0,05; ** р<0,01.

Фигура 17. Варианты лечения антагонистами 5HTR снижают способность регенерации лейкоза в образцах первичного ОМЛ у вторичного реципиента, не оказывая влияния на нормальный гематопоэз. Верхний чертеж. 3 - 10×10⁵ пересаженных клеток костного мозга от мыши с первичной трансплантацией инъецировали внутривенно вторичным реципиентам (кондиционированным мышам NSG) и в течение 8 недель не вводили каких-либо соединений. Клетки костного мозга анализировали, как представлено на фигуре 16. Представлена частота встречаемости клеток, положительных в отношении CD45 человека, по сравнению с контролем. Нижний чертеж. Проводили скрининг 50×10³ пересаженных клеток человека для определения КОЕ. Представлено нормированное количество полученных КОЕ. * р<0,05; *** р<0,005; **** р<0,0001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что гематологические злокачественные клетки, в частности, клетки ОМЛ, экспрессируют рецепторы серотонина (5HTR), и что ингибирование 5HTR типа 1 и/или типа 2 оказывает цитотоксический эффект на клетки ОМЛ, как показано в примерах 1 и 2, уменьшает клоногенную способность бластных клеток ОМЛ, при этом не оказывая влияния на здоровые гематопоэтические стволовые клетки (пример 5), и что ингибиторы 5-HTR типа 1 и/или типа 2 не оказывают эффекта ни на здоровые клетки крови, ни на здоровые гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки (пример 4). Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 можно использовать для идентификации злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования (пример 6), и что уменьшение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в образце от пациента, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, коррелирует с благоприятным прогнозом (пример 7).

Определения

«Серотониновые рецепторы (рецепторы серотонина)», также известные как 5-гидрокситриптаминовые рецепторы, или 5-НТ-рецепторы, или 5-HTR, в настоящей заявке представляют собой группу рецепторов, сопряженных с G-белками (G protein-coupled receptors, GPCR) и лиганд-управляемыми ионными каналами (ligand-gated ion channels, LGIC), которые были обнаружены в центральной и периферической нервной системе.

Термин «5-НТ-рецептор типа 1». или «5-HTR типа 1», или «5-НТ1-рецептор», или «5-HTR1» в настоящей заявке означает подсемейство рецепторов 5-НТ, которые связываются с эндогенным нейромедиатором серотонином (5-гидрокситриптамин, 5-НТ). Подсемейство рецепторов 5-НТ1 состоит из пяти сопряженных с G-белками рецепторов (GPCR), которые сопряжены с Gi/Go, и данный термин включает в себя 5-HTR1A, 5-HTR1B, 5-HTR1D, 5-HTR1E и 5-HTR1F. Данные рецепторы опосредуют ингибиторную нейропередачу посредством уменьшения клеточных уровней цАМФ. Полная белковая последовательность 5-НТ-рецептора человека типа 1А характеризуется учетным номером UniProt Р08908 (16 апреля 2014 г). Полная белковая последовательность 5-НТ-рецептора человека типа 1В характеризуется учетным номером UniProt Р28222 (16 апреля 2014 г). Полная белковая последовательность 5-НТ-рецептора человека типа 1D характеризуется учетным номером UniProt Р28221 (16 апреля 2014 г). Полная белковая последовательность 5-НТ-рецептора человека типа 1Е характеризуется учетным номером UniProt Р28566 (14 мая 2014 г). Полная белковая последовательность 5-НТ-рецептора человека типа 1F характеризуется учетным номером UniProt Р30939 (16 апреля 2014 г).

Термин «5-НТ-рецептор типа 2», или «5-HTR типа 2», или «5-НТ2-рецептор», или «5-HTR2» в настоящей заявке означает подсемейство рецепторов 5-НТ, которые связываются с эндогенным нейромедиатором серотонином (5-гидрокситриптамин, 5-НТ). Подсемейство рецепторов 5-НТ2 состоит из трех сопряженных с G-белками рецепторов (GPCR), которые сопряжены с Gq/G11, и данный термин включает в себя 5-HTR2A, 5-HTR2B и 5-HTR2C. Данные рецепторы опосредуют возбуждающую нейропередачу посредством увеличения клеточных уровней IP3 и DAG. Полная белковая последовательность 5-НТ-рецептора человека типа 2А характеризуется учетным номером UniProt Р28223 (14 мая 2014 г), 5-НТ-рецептор человека типа 2В характеризуется учетным номером UniProt Р41595 (14 мая 2014 г), и 5-НТ-рецептор человека типа 2С характеризуется учетным номером UniProt Р28335 (14 мая 2014 г).

Термин «ингибитор» в настоящей заявке означает соединение, ингибирующее активность 5-НТ-рецептора. Термин «ингибитор» включает, без ограничения, антагонисты 5-НТ-рецептора, антитела против 5-НТ-рецептора, соединения, которые предотвращают экспрессию 5-НТ-рецептора, и соединения, приводящие к уменьшению уровней мРНК или белка 5-НТ-рецептора. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой антагонист. В контексте настоящего изобретения термин «антагонист» означает соединение, которое связывается с 5-НТ-рецептором и не обладает какой-либо существенной способностью самостоятельно активировать рецептор. Тем самым антагонист может предотвращать или уменьшать функциональную активацию или оккупацию рецептора агонистом или природным лигандом в том случае, когда присутствует агонист. Термин «антагонист 5-НТ-рецептора» в настоящей заявке охватывает как нейтральные антагонисты, так и обратные агонисты. «Нейтральный антагонист» представляет собой соединение, которое блокирует действие агониста, но не оказывает эффекта на естественную или спонтанную активность рецептора. «Обратный агонист» способен как блокировать действие агониста на рецептор, так и ослаблять конститутивную активность рецептора. Термин «антагонист» также включает в себя конкурентные антагонисты, которые представляют собой лекарственные препараты, связывающиеся с тем же сайтом, что и природный лиганд; неконкурентные антагонисты, которые связываются с отличным сайтом на рецепторе, чем природный лиганд; обратимые антагонисты, которые связываются и отсоединяются от рецептора со скоростями, определяемыми кинетикой взаимодействия рецептор-лиганд; и необратимые антагонисты, которые связываются с рецептором необратимо посредством образования ковалентной связи с активным сайтом или непосредственно путем настолько сильного связывания, что скорость диссоциации фактически равна нулю.

Термин «ингибитор 5-HTR типа 1» в настоящей заявке означает любое соединение, способное ингибировать активность 5-HTR1 (например, посредством связывания с 5-HTR1 и отсутствия какой-либо существенной способности самостоятельно активировать рецептор; либо посредством предотвращения или уменьшения экспрессии мРНК 5-HTR1 или белка 5-HTR1). Данный термин включает селективные ингибиторы 5-HTR1 или любого из подтипов 5-HTR1 (5-HTR1A, 5-HTR1B, 5-HTR1D, 5-HTR1E и 5-HTR1F) и неселективные ингибиторы, которые также способны выступать в качестве ингибиторов в отношении 5-НТ-рецепторов других подсемейств.

Термин «ингибитор 5-HTR типа 2» в настоящей заявке означает любое соединение, способное ингибировать активность 5-HTR2 (например, посредством связывания с 5-HTR2 и отсутствия какой-либо существенной способности самостоятельно активировать рецептор; либо посредством предотвращения или уменьшения экспрессии мРНК 5-HTR2 или белка 5-HTR2). Данный термин включает селективные ингибиторы 5-HTR2 или любого из подтипов 5-HTR2 (5-HTR2A, 5-HTR2B и 5-HTR2C) и неселективные ингибиторы, которые также способны выступать в качестве ингибиторов в отношении 5-НТ-рецепторов других подсемейств.

«Апоморфин» в настоящей заявке означает (6aR)-6-метил-5,6,6a,7-тетрагидро-4H-дибензо[de,g]хинолин-10,11-диол, номер CAS 314-19-2. Апоморфин представляет собой антагонист 5-HTR типа 1 и типа 2 (Millan M.J. et al. 2002. J Pharmacol Exp Ther, 303(2):791-804). Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой апоморфин.

«Метиотепин» или метитепин означает 1-метил-4-(8-метилсульфанил-5,6-дигидробензо[b][1]бензотиепин-6-ил)пиперазин, номер CAS 74611-28-2. Метиотепин представляет собой антагонист 5-HTR типа 1 и типа 2 (Kawano Н. et al. 2001. Blood, 97(6): 1697-1702), в частности, обратный агонист. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой метиотепин.

«Амперозид» в настоящей заявке означает 4-[4,4-бис(4-фторфенил)бутил]-N-этилпиперазин-1-карбоксамид, номер CAS 75558-90-6. Амперозид представляет собой антагонист 5-HTR типа 2 (Svartengren J. and Simonsson P. Pharmacol Toxicol, 1990; 66 suppl 1:8-11). Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой амперозид.

Термин «гематологическое злокачественное новообразование» означает типы рака, которые поражают кровь, костный мозг и лимфатические узлы. Гематологические злокачественные новообразования могут развиваться из одной из двух основных линий клеток крови: клеток миелоидной и лимфоидной линий. Из клеток миелоидной линии в норме образуются гранулоциты, эритроциты, тромбоциты, макрофаги и тучные клетки; из клеток лимфоидной линии образуются В-, Т-клетки, клетки-естественные киллеры и плазматические клетки. Лимфомы, лимфоцитарные лейкозы и миеломы развиваются из лимфоидной линии, тогда как острый и хронический миелогенный лейкоз, миелодиспластические синдромы и миелопролиферативные синдромы являются по своему происхождению миелоидными. Неограничивающие иллюстративные примеры гематологических злокачественных новообразований представляют собой острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), острый моноцитарный лейкоз (ОМоЛ), ходжкинские лимфомы, неходжкинские лимфомы и миеломы.

«Лейкоз» в настоящей заявке означает тип рака крови или костного мозга, который характеризуется аномальным увеличением незрелых лейкоцитов, называемых «бластными клетками». Лейкоз представляет собой широкий термин, охватывающий целый спектр заболеваний. В свою очередь, лейкоз является частью еще более обширной группы заболеваний, поражающих кровь, костный мозг и лимфоидную систему, которые все вместе известны как гематологические новообразования. Существует четыре основных вида лейкоза: острый лимфобластный лейкоз, или ОЛЛ; острый миелоидный лейкоз, или ОМЛ; хронический лимфоцитарный лейкоз, или ХЛЛ; хронический миелогенный лейкоз, или ХМЛ.

«Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). или острый лимфоидный лейкоз» представляет собой острую форму лейкоза, или рака лейкоцитов, которая характеризуется гиперпродукцией раковых незрелых лейкоцитов, известных как лимфобласты.

«Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), или острый миелогенный лейкоз, или острый нелимфоцитарный лейкоз (ОНЛЛ)» представляет собой рак клеточных элементов крови миелоидной линии, характеризующийся быстрым ростом аномальных лейкоцитов (миелобластов), которые аккумулируются в костном мозге и препятствуют образованию нормальных клеток крови. Симптомы ОМЛ вызваны замещением нормального костного мозга лейкозными клетками, которое вызывает уменьшение количества эритроцитов, тромбоцитов и нормальных лейкоцитов. Комбинация окрашивания миелопероксидазой или судановым черным и неспецифичного окрашивания эстеразой в крови и мазках костного мозга способствует различению ОМЛ и ОЛЛ.

«Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) или хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеток (В-ХЛЛ)» представляет собой тип рака, который вызывает продукцию организмом больших количеств лейкоцитов (клеток В-лимфоцитов).

«Хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ)». также известный как «хронический гранулоцитарный лейкоз (ХГЛ)». представляет собой тип рака, который вызывает продукцию организмом больших количеств лейкоцитов (миелоцитов). При ХМЛ была обнаружена пролиферация зрелых гранулоцитов (нейтрофилов, эозинофилов и базофилов) и предшественников указанных клеток. ХМЛ связан с характерной хромосомной транслокацией, называемой филадельфийской хромосомой.

«Образец» в настоящей заявке означает образец, который выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов.

«Периферическая кровь» в настоящей заявке означает образец, содержащий клеточные компоненты крови, включающие эритроциты, лейкоциты и тромбоциты, которые обнаруживаются в циркулирующем пуле крови и не секвестрируются в лимфатической системе, селезенке, печени или костном мозге.

«Злокачественная клетка» в настоящей заявке представляет собой «опухолевую клетку» или «раковую клетку» и означает клетки, которые растут и делятся неконтролируемыми ускоренными темпами.

Термин «субъект», или «индивидуум», или «животное», или «пациент» включает любого субъекта, в частности, субъекта-млекопитающего, терапия которого является желательной. Субъекты-млекопитающие включают людей, ручных животных, сельскохозяйственных животных и зоопарковых или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и т.п.

«Иммуноцитохимия» означает методику, используемую для локализации присутствия специфичного белка или антигена в клетках посредством применения специфичного первичного антитела, которое связывается с указанным белком или антигеном, причем внеклеточный матрикс и другие стромальные компоненты были удалены, и окрашивание проводится только в отношении цельных клеток.

Термин «уменьшение уровня экспрессии» означает уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, который является меньшим, чем эталонное значение. Уровень экспрессии считают меньшим, чем эталонное значение, если указанный уровень экспрессии является по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 110%», по меньшей мере на 120%, по меньшей мере на 130%, по меньшей мере на 140%, по меньшей мере на 150% или еще более меньшим, чем эталонное значение.

Термин «увеличение уровня экспрессии» означает уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, который превышает эталонное значение. Уровни экспрессии считают превышающими эталонное значение, когда указанные уровни экспрессии по меньшей мере на 1,5%, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 110%, по меньшей мере на 120%, по меньшей мере на 130%, по меньшей мере на 140%, по меньшей мере на 150% или более превышают эталонное значение.

Термин «эталонное значение» в настоящей заявке означает заранее определенный критерий, используемый в качестве эталона для оценки значений или данных, полученных при анализе образцов, отобранных от субъекта. Эталонное значение или эталонный уровень может представлять собой абсолютное значение; относительное значение; значение, которое характеризуется верхней или нижней границей; диапазон значений; среднее значение; медианное значение; среднее арифметическое значение; или значение по сравнению с конкретным контрольным или исходным значением. В основе эталонного значения может лежать значение в образце от индивидуума, такое как, например, значение, полученное при анализе образца от субъекта, исследование которого было проведено, но в более ранний момент времени. В основе эталонного значения может лежать анализ большого количества образцов, таких как образцы, полученные от популяции парной группы субъектов сопоставимого хронологического возраста, или может лежать анализ пула образцов, включая или исключая образец, исследование которого будет проведено.

«Благоприятный прогноз» в настоящей заявке означает исход, который будет расцениваться как положительный для пациента и который зависит от типа прогноза; например, благоприятный прогноз 1-летней выживаемости (1ЛВ) означает, что пациент будет жить в течение по меньшей мере 1 года. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения благоприятный прогноз относится к вероятности 5-летней выживаемости более 40% после диагностики заболевания.

«Неблагоприятный прогноз» в настоящей заявке означает исход, который будет расцениваться как отрицательный для пациента и который зависит от типа прогноза; например, неблагоприятный прогноз 1-летней выживаемости означает, что пациент не выживет в течение по меньшей мере 1 года. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения неблагоприятный прогноз относится к вероятности 5-летней выживаемости менее 40% после диагностики заболевания.

«Более ранняя временная точка» в настоящей заявке означает любой момент времени перед введением терапии субъекту, страдающему от гематологического злокачественного новообразования.

«Эффективная терапия» в настоящей заявке означает терапию, которая приводит к уменьшению уровней 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в образце от пациента, страдающего от гематологического злокачественного новообразования и получающего лечение указанной терапией.

«Неэффективная терапия» в настоящей заявке означает терапию, которая не способствует уменьшению уровня 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в образце от пациента, страдающего от гематологического злокачественного новообразования и получающего лечение указанной терапией.

1 - Варианты медицинского применения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибиторы 5-HTR типа 1 и 5-HTR типа 2 являются терапевтически эффективными при лечении гематологических злокачественных новообразований, предпочтительно, ОМЛ, и что указанные ингибиторы не оказывают эффекта ни на здоровые клетки крови, ни на здоровые гематопоэтические стволовые клетки, тем самым, в отличие от классических химиотерапевтических вариантов лечения, не вызывая токсичности в отношении нормальных клеток.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору рецептора серотонина (5-HTR), который выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 1 и ингибитор 5-HTR типа 2, для применения при предотвращении и/или лечении гематологических злокачественных новообразований.

В качестве альтернативы, настоящее изобретение относится к применению ингибитора рецептора серотонина (5-HTR), который выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 1 и ингибитор 5-HTR типа 2, для получения лекарственного препарата для предотвращения и/или лечения гематологических злокачественных новообразований.

В качестве альтернативы, настоящее изобретение относится к способу предотвращения и/или лечения гематологического злокачественного новообразования, причем указанный способ включает введение ингибитора рецептора серотонина (5-HTR), который выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 1 и ингибитор 5-HTR типа 2, субъекту, который нуждается в таком предотвращении и/или лечении.

Термин «предотвращение» или «предотвращать» в настоящей заявке относится к введению ингибитора согласно настоящему изобретению или лекарственного препарата, содержащего указанный ингибитор, субъекту, которому не был поставлен вероятный диагноз гематологического злокачественного новообразования в момент введения, но у которого, как ожидается, при обычных обстоятельствах будет развиваться указанное заболевание, или который подвержен повышенному риску развития указанного заболевания. Цель предотвращения заключается в том, чтобы избежать возникновения указанного заболевания. Предотвращение может являться полным (например, полное отсутствие заболевания). Предотвращение может также являться частичным, таким, что, например, частота возникновения заболевания у субъекта становится меньшей, чем частота возникновения без введения ингибитора согласно настоящему изобретению. Предотвращение также означает снижение подверженности клиническому состоянию.

Термин «лечение» в настоящей заявке относится к введению ингибитора согласно настоящему изобретению или лекарственного препарата, содержащего указанный ингибитор, субъекту, страдающему от гематологического злокачественного новообразования, включая введение на исходной или ранней стадии заболевания, причем целью такого введения является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или нарушения. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничены указанными, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию (будь то частичную или полную), обнаруживаемые либо необнаруживаемые. Лечение также означает продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в случае отсутствия лечения.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR типа 1 выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 1А, типа 1В, типа 1D, типа 1Е и типа 1F; предпочтительно, представляет собой ингибитор 5-HTR типа 1А.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR типа 2 выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 2А, типа 2В и типа 2С; предпочтительно, выбран из ингибиторов 5-HTR типа 2В и типа 2С; более предпочтительно, представляет собой ингибитор 5-HTR типа 2С.

Специалистам в данной области техники известно, как определить аффинность конкретной молекулы в отношении 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, а также как определить, является ли данная конкретная молекула ингибитором указанного рецептора. Например, аффинность молекулы 5-HTR можно определить с применением методологии, описанной в публикации Millan et al. (Millan et al. J Pharmacol Exp Ther. 2002; 303(2): 791-804) (анализ связывания радиолиганда) Анализ для оценки того, является ли соединение ингибитором 5-HTR типа 1, заключается в определении статуса активации Gi и измерении продукции цАМФ, а также активации аденилилциклазы (Nichols D.E. and Nichols С.Е. Chem Rev, 2008; 108(5): 1614-41). Анализ для оценки того, является ли соединение ингибитором 5-HTR типа 2, заключается в измерении гидролиза мембранных фосфоинозитидов и активации протеинкиназы С (Nichols D.E. and Nichols C.E. Chem Rev, 2008; 108(5): 1614-41). Анализы, которые может провести специалист в данной области техники для определения того, является ли ингибитор 5-HTR типа 1 ингибитором 5-HTR типа 1А, типа 1В, типа 1D, типа 1Е или типа 1F, представляют собой конкурентные анализы активации подтип-специфичными агонистами. Анализы, которые может провести специалист в данной области техники для определения того, является ли ингибитор 5-HTR типа 2 ингибитором 5-HTR типа 2А, типа 2В и типа 2С, представляют собой конкурентные анализы активации с применением подтип-специфичных агонистов.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR представляет собой неселективный ингибитор, который может выступать в качестве ингибитора в отношении различных типов 5-HTR. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR является селективным в отношении 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2.

Ингибиторы 5-HTR типа 1 или типа 2 могут представлять собой, среди прочего, белки, пептиды, интерферирующую РНК, антисмысловые олигонуклеотиды или малые органические молекулы.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR типа 1 и/или ингибитор 5-HTR типа 2 выбран из соединений таблицы 1 или фармацевтически приемлемых солей указанных соединений.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой антагонист и, более предпочтительно, антагонист, который выбран из группы, включающей апоморфин, метиотепин, амперозид и фармацевтически приемлемую соль указанных соединений. Термин «антагонист» был определен выше. Активность 5-HTR типа 1 можно определить посредством обнаружения уменьшения уровней цАМФ (Williams С. Nat Rev Drug Discovery, 2004; 3(2): 125-35) и увеличения уровней фосфорилированной киназы Akt (Suni M.A. and Maino V.C. Methods Mol Biol 2011; 717: 155-69); и активность 5-HTR типа 2 можно определить посредством обнаружения увеличения уровней ИФ3 (инозитолтрифосфата) и ДАГ (диацилглицерола). (Thomsen W., Frazer J. et al. Curr Opin Biotechnol, 2005; 16(6): 655-65), а также увеличения уровней фосфорилированной киназы ERK1/2 (Suni M.A. and Maino V.C. Methods Mol Biol 2011; 717: 155-69).

Термин «фармацевтически приемлемая соль указанных соединений» в настоящей заявке означает производные соединений таблицы 1, в которых родительское соединение модифицировано посредством получения кислых или основных солей указанного соединения. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничены указанными, соли минеральных или органических кислот и щелочных оснований, таких как амины; щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты; и т.п. Фармацевтически приемлемые соли включают общепринятые нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли исходного соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, такие общепринятые нетоксичные соли включают, но не ограничены указанными, соли, полученные из неорганических и органических кислот, выбранных из 1,2-этандисульфоновой, 2-ацетоксибензойной, 2-гидроксиэтансульфоновой, уксусной, аскорбиновой, бензолсульфоновой, бензойной, бикарбоновой, карбоновой, лимонной, эдетовой, этандисульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гликолиларсаниловой, гексилрезорциновой, гидрабаминовой, бромистоводородной, хлористоводородной, иодистоводородной, гидроксималеиновой, гидроксинафтойной, изэтионовой, молочной, лактобионовой, лаурилсульфоновой, малеиновой, яблочной, миндальной, метансульфоновой, напсиловой, азотной, щавелевой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фосфорной, полигалактуроновой, пропионовой, салициловой, стеариновой, субуксусной, янтарной, сульфаминовой, сульфаниловой, серной, дубильной, винной и толуолсульфоновой кислот.

Фармацевтически приемлемые соли соединений таблицы 1 могут быть синтезированы из родительского соединения, которое содержит основную или кислотную группировку, посредством общепринятых химических способов. Как правило, такие соли могут быть получены путем осуществления реакции свободных кислотных или основных форм данных соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе либо в смеси указанных веществ; как правило, пригодными являются неводные среды, подобные эфиру, этилацетату, этанолу, изопропанолу или ацетонитрилу. Перечни подходящих солей приведены в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990, p. 1445.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой ингибирующее антитело. Термин «ингибирующее антитело» согласно настоящему изобретению означает антитело, способное связываться с 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2 и вызывать ингибирование активации указанных рецепторов природным лигандом последних. Антитела могут быть получены с применением любого способа, известного специалисту в данной области техники. Так, поликлональные антитела получают посредством иммунизации животного белком, который необходимо ингибировать. Моноклональные антитела могут быть получены с применением способа, описанного в публикации Kohler, Milstein et al (Nature, 1975, 256: 495). После идентификации антител, способных к связыванию с 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2, будут отобраны те антитела, которые способны ингибировать активность 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2, с применением вышеуказанных анализов для определения активности 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2. Подходящие антитела в настоящем изобретении включают интактные антитела, содержащие антиген-связывающую вариабельную область и константную область, фрагменты «Fab», «F(ab')2», «Fab», Fv, scFv, диатела и биспецифичные антитела.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой интерферирующую РНК. В настоящей заявке термин «интерферирующая РНК» или «РНКи» означает молекулы РНК, способные подавлять экспрессию гена 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2 или любого гена, необходимого для осуществления функции 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2. С данной целью РНКи, как правило, представляют собой двухцепочечные олигонуклеотиды, составляющие по меньшей мере 30 пар оснований в длину, и, более предпочтительно, содержащие приблизительно 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 или 17 пар оснований рибонуклеиновой кислоты. В технологии РНКи было эффективно использовано несколько различных типов молекул, включая малую интерферирующую РНК (миРНК), которую иногда называют короткой интерферирующей РНК или сайленсерной РНК, микроРНК, которая в норме отличается от миРНК, поскольку образуется из одноцепочечных предшественников РНК и, как было показано, является лишь частично комплементарной целевой мРНК, и короткую шпилечную РНК (кшРНК).

Средства на основе малой интерферирующей РНК (миРНК) способны ингибировать экспрессию гена-мишени посредством РНК-интерференции. миРНК можно синтезировать химическим способом или можно получить посредством транскрипции in vitro либо можно синтезировать в клетке-мишени in vivo. Как правило, миРНК состоит из двухцепочечных РНК, составляющих от 15 до 40 нуклеотидов в длину, и может содержать область выпячивания на 3'- и/или 5'-конце, составляющую от 1 до 6 нуклеотидов в длину. Длина области выпячивания не зависит от общей длины молекулы миРНК. миРНК действует посредством посттранскрипционной деградации или подавления целевой матричной РНК.

миРНК может обозначаться кшРНК (короткая шпилечная РНК) и характеризуется тем, что антипараллельные цепи, образующие миРНК, соединены областью петли, или шпильки. миРНК образована короткой антисмысловой последовательностью (от 19 до 25 нуклеотидов), за которой следует петля, содержащая 5-9 нуклеотидов, и кодирующая нить. кшРНК могут кодироваться плазмидами или вирусом, в частности, ретровирусом и, более конкретно, могут кодироваться ретровирусом и находиться под контролем промоторов, таких как промотор U6 РНК-полимеразы III.

миРНК согласно настоящему изобретению являются по существу гомологичными мРНК 5-HTR типа 1 или типа 2 либо геномной последовательности, кодирующей данный белок. Термин «по существу гомологичный» означает, что миРНК содержит последовательность, в достаточной степени комплементарную или аналогичную целевой мРНК, так что миРНК может быть способна вызывать деградацию мРНК посредством РНК-интерференции. Подходящие миРНК для обеспечения интерференции включают миРНК, образованные РНК, а также миРНК, содержащие различные с химической точки зрения модификации, такие как:

- миРНК, в которой связи между нуклеотидами отличаются от таковых, возникающих в природе, например, фосфотиоатные связи.

- Конъюгаты цепей РНК с функциональным реактивом, таким как флуорофор.

- Модификацию концов спиралей РНК, в частности, 3'-конца, посредством комбинации с различными функциональными гидроксильными группами в положении 2'.

- Нуклеотиды с модифицированным сахаром, такие как О-алкилированные радикалы в положении 2', такие как 2'-O-метилрибоза или 2'-O-фторрибоза.

- Нуклеотиды с модифицированным основанием, такие как галогенизированные основания (например, 5-бромурацил и 5-иодурацил) или алкилированные основания (например, 7-метилгуанозин).

миРНК и кшРНК согласно настоящему изобретению можно получить с применением набора методик, известных специалисту в данной области техники. Например, миРНК можно синтезировать химическим способом из защищенных рибонуклеозидфосфорамидитов в общепринятом синтезаторе ДНК/РНК. В качестве альтернативы, миРНК можно получить с применением рекомбинантного дайсера из плазмидных и вирусных векторов, в которых кодирующая область спирали или спиралей миРНК находится под функциональным контролем промоторов РНК-полимеразы III. В клетках дайсер РНКазы процессирует кшРНК в миРНК.

Область, которую берут за основу при разработке миРНК, является неограничивающей и может содержать область кодирующей последовательности (между кодоном инициации и кодоном терминации) или, в качестве альтернативы, может содержать последовательности 5'- или 3'-нетранслируемой области, предпочтительно, составляющие от 25 до 50 нуклеотидов в длину и находящиеся в любом положении в 3'-направлении относительно кодона инициации. Процедура разработки миРНК включает обнаружение мотива последовательности AA(N19)TT, где N может представлять собой любой нуклеотид в последовательности, представляющей интерес, и отбор такого мотива последовательности, в котором наблюдается высокое содержание G/C. Если указанный мотив последовательности не найден, возможно идентифицировать мотив последовательности NA(N21), где N может представлять собой любой нуклеотид.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения ингибитор согласно настоящему изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, специфичный к 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR 1 типа 2, т.е. к молекулам, последовательность которых является комплементарной мРНК, кодирующей 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2, т.е. комплементарной кДНК кодирующей нити. Антисмысловой олигонуклеотид может являться комплементарным полной кодирующей области или части указанной области, включая как кодирующую область, так и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Антисмысловые олигонуклеотиды могут составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более нуклеотидов в длину. Антисмысловые олигонуклеотиды можно получить посредством химического синтеза или посредством реакций ферментативного связывания, широко известных специалисту в данной области техники. Например, антисмысловой олигонуклеотид может дополнительно содержать модифицированные нуклеотиды, которые увеличивают биологическую стабильность указанного антисмыслового олигонуклеотида или стабильность двухцепочечных комплексов ДНК-РНК, образованных между антисмысловым олигонуклеотидом и полинуклеотидом-мишенью, такие как фосфотиоатные производные, пептидные нуклеиновые кислоты и акридин-замещенные олигонуклеотиды. Модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать для получения антисмысловых нуклеиновых кислот, включают 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-иодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбокси-гидроксиметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламино-метилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеозин, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5 -метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбокси-метилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый сложный эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил и 2,6-диаминопурин. В качестве альтернативы, антисмысловую нуклеиновую кислоту можно получить биологическим способом с применением вектора экспрессии, который кодирует нуклеиновую кислоту, ориентированную в антисмысловом направлении.

Другая группа ингибиторов, которую можно использовать в настоящем изобретении, представляет собой каталитически активные нуклеиновые кислоты, известные как рибозимы. Рибозимы содержат каталитическую область и вторую область, последовательность которой является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени и придает рибозиму субстратную специфичность. После взаимодействия между рибозимом и его субстратом посредством гибридизации и сочетания между комплементарными областями нуклеиновой кислоты-мишени и рибозима осуществляется активация каталитической области, которая вызывает образование меж- или внутримолекулярного разрыва в нуклеиновой кислоте-мишени. Основные концепции для разработки рибозимов широко известны специалисту в данной области техники (см., например, публикацию Doherty and Doudna (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001; 30: 457- 75)).

Другие соединения, способные ингибировать экспрессию 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают аптамеры и шпигельмеры. Аптамеры и шпигельмеры представляют собой одноцепочечные или двухцепочечные D- или L-нуклеиновые кислоты, которые специфично связываются с белком, что приводит к модификации биологической активности белка. Аптамеры и шпигельмеры составляют от 15 до 80 нуклеотидов в длину, предпочтительно, от 20 до 50 нуклеотидов в длину.

Подходящие способы определения того, способен ли ингибитор уменьшать уровни мРНК, включают, без ограничения, стандартные анализы определения уровней экспрессии мРНК, такие как кПЦР, ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией), анализ с помощью защиты от РНКаз, нозерн-блоттинг, РНК-дот-блот, гибридизация in situ, технология микроматриц, способы на основе меток, такие как серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression, SAGE), включая его варианты, такие как LongSAGE и SuperSAGE, микроматрицы, флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), включая ее варианты, такие как Flow-FISH, qFiSH и FISH на основе двойного слияния (D-FISH), и т.п.

Подходящие способы определения того, действует ли ингибитор посредством уменьшения уровней белка 5-HTR типа 1 или типа 2, включают количественное определение посредством общепринятых способов, например, посредством применения антител, обладающих способностью специфично связываться с белками, кодируемыми геном (или с фрагментами указанных белков, содержащими антигенные детерминанты), и последующего количественного определения полученных в результате комплексов антитело-антиген.

Ингибитор согласно настоящему изобретению может ингибировать активность 5-HTR типа 1 или типа 2 по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 90% и во всех диапазонах от 5% до 100%. Подходящие способы определения того, действует ли ингибитор посредством уменьшения активности 5-HTR типа 1 или типа 2, были описаны выше.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой ингибитор 5-HTR типа 1, предпочтительно, антагонист.

Согласно настоящему изобретению ингибитор рецептора серотонина (5-HTR), который выбран из группы, включающей ингибитор 5-HTR типа 1 и ингибитор 5-HTR типа 2, является пригодным для предотвращения и/или лечения субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой млекопитающее. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека любой расы и пола. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ).

Как известно специалистам в данной области техники, эффективность ингибитора 5-HTR типа 1 и ингибитора 5-HTR типа 2 при терапии гематологического злокачественного новообразования можно продемонстрировать посредством анализа гематологического ответа (измерения количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов и уровней гемоглобина и гематокрита), цитогенетического ответа и/или серологических маркеров опухоли.

Даже несмотря на то, что потребности индивидуума варьируют, определение оптимальных диапазонов терапевтически эффективных количеств ингибитора для применения согласно настоящему изобретению относится к общему опыту специалистов в данной области техники. В целом, доза, необходимая для обеспечения эффективного лечения, которая может быть откорректирована специалистом в данной области техники, будет варьировать в зависимости от возраста, здоровья, физического состояния, пола, рациона, массы тела, степени изменения рецептора, частоты лечения, природы и состояния поражения, природы и степени патологии или заболевания, медицинского состояния субъекта, пути введения, фармакологических соображений, таких как активность, эффективность, фармакокинетика и токсикологический профиль конкретного используемого соединения в случае использования системной доставки лекарственного препарата и в случае, когда ингибитор вводят в качестве части комбинации лекарственных препаратов.

Ингибитор согласно настоящему изобретению можно вводить любым подходящим путем введения, например, но не ограничиваясь указанными, парентеральным, пероральным, местным, интраназальным, ректальным путем. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор, описанный в настоящей заявке, вводят парентеральным путем, например, посредством внутривенного, интратекального, интраперитонеального, подкожного, интрадермального, внутримышечного или эпидурального введения.

2 - Способ идентификации злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что злокачественные клетки из гематологического злокачественного новообразования, в частности, из ОМЛ, экспрессируют 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в значительно более высоком количестве по сравнению со здоровыми донорами. Вследствие этого обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках крови можно использовать для идентификации злокачественных клеток из гематологического злокачественного новообразования.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro идентификации злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы, причем указанный способ включает обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в указанной клетке.

Как известно специалисту в данной области техники, экспрессию 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 можно также обнаружить посредством обнаружения экспрессии функционально эквивалентного варианта указанных рецепторов.

«Функционально эквивалентный вариант» означает все белки, происходящие из последовательности 5-HTR типа 1 или 5-HTR типа 2 посредством модификации, вставки и/или делеции одной или нескольких аминокислот в случаях, когда функция по существу сохраняется.

Активность 5-HTR типа 1 можно определить посредством обнаружения уменьшения уровней цАМФ и увеличения уровней фосфорилированной киназы Akt; и активность 5-HTR типа 2 можно определить посредством обнаружения увеличения уровней ИФ3 и ДАГ, а также увеличения уровней фосфорилированной киназы ERK1/2.

Предпочтительно, варианты 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 представляют собой (i) полипептиды, в которых один или несколько остатков аминокислот заменены консервативным или неконсервативным остатком аминокислоты (предпочтительно, консервативным остатком аминокислоты), и такие замененные аминокислоты могут кодироваться или могут не кодироваться генетическим кодом, (ii) полипептиды, в которых присутствует один или несколько модифицированных остатков аминокислоты, например, остатков, модифицированных посредством присоединения заместителя, (iii) полипептиды, полученные в результате альтернативного процессинга аналогичной мРНК, (iv) полипептидные фрагменты и/или (v) полипептиды, полученные в результате слияния 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 или полипептида согласно пунктам с (i) по (iii) с другим полипептидом, таким как секреторная лидерная последовательность или последовательность, которую используют для очистки (например, метка His) или для обнаружения (например, эпитопная метка Sv5). Фрагменты включают полипептиды, полученные в результате протеолитического расщепления (включая мультисайтный протеолиз) исходной последовательности. Варианты могут являться модифицированными посттрансляционным или химическим способом. Подразумевается, что такие варианты являются известными специалисту в данной области техники.

Как известно в данной области техники, «подобие» между двумя полипептидами определяют посредством сравнения аминокислотной последовательности и замененных аминокислот, сохраненных в полипептиде, с последовательностью второго полипептида. Варианты согласно определению включают полипептидные последовательности, отличные от исходной последовательности, предпочтительно, отличные от исходной последовательности менее чем на 40% остатков на сегмент, о котором идет речь, более предпочтительно, отличные от исходной последовательности менее чем на 25% остатков на сегмент, о котором идет речь, более предпочтительно, отличные от исходной последовательности менее чем на 10% остатков на сегмент, о котором идет речь, более предпочтительно, отличные от исходной последовательности всего лишь на несколько остатков на сегмент, о котором идет речь, и в то же время в достаточной степени гомологичные исходной последовательности для сохранения функциональности исходной последовательности. Настоящее изобретение включает аминокислотные последовательности, которые являются по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% или 95% аналогичными или идентичными исходной аминокислотной последовательности. Степень идентичности между двумя полипептидами можно определить с применением компьютерных алгоритмов и способов, широко известных специалисту в данной области техники. Идентичность между двумя аминокислотными последовательностями предпочтительно определяют с применением алгоритма BLASTP [BLASTManual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

Уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы.

Образец костного мозга можно получить способами аспирации и трепанобиопсии, известными в данной области техники. Образцы крови можно получить посредством общепринятых способов с применением процессов, известных в существующем уровне техники специалисту в данной области техники, таких как экстракция крови посредством пункции артерии или вены, как правило, - вены с внутренней стороны локтя или с тыльной стороны руки; образец крови собирают в герметичную пробирку или шприц. Лимфатические узлы получают посредством биопсии всего лимфатического узла или его части (эксцизионная биопсия лимфатического узла или инсцизионная биопсия лимфатического узла).

Выражение «обнаружение экспрессии» означает обнаружение присутствия в образце гематологической клетки, несущей на своей поверхности 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 или экспрессирующей мРНК 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2. Указанное обнаружение может являться качественным или количественным.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения для способа идентификации злокачественной клетки согласно настоящему изобретению не требуется определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ идентификации злокачественной клетки согласно настоящему изобретению включает определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2.

Выражение «определение уровня экспрессии» в настоящей заявке означает определение уровня экспрессии биомаркера (5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2) и/или количества клеток, несущих на своей поверхности данный биомаркер (т.е. маркер поверхности клетки). В этом отношении уровень экспрессии означает уровень мРНК и/или уровень белка, и/или количество клеток, несущих на своей поверхности биомаркер.

Способы обнаружения экспрессии могут основываться на обнаружении мРНК или белка 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 либо также могут основываться на определении уровней мРНК или уровней белка и уровней вариантов указанных соединений в образце в целом, в клетках образца и/или в неклеточной фракции образца.

Способы обнаружения мРНК хорошо известны в данной области техники и включают, например, методы ПЦР в реальном времени (рвПЦР) и нозерн-блоттинга, метод на основе нанострун и технологии микроматриц.

В качестве неограничивающего примера уровни экспрессии определяют посредством количественного определения уровней мРНК, кодируемой указанными генами. Уровни мРНК можно количественно определить посредством применения общепринятых способов, например, способов, включающих амплификацию мРНК и количественное определение продукта амплификации указанной мРНК методами электрофореза и окрашивания, или, в качестве альтернативы, методом нозерн-блоттинга с применением подходящих зондов мРНК для гена, представляющего интерес, или соответствующей кДНК/кРНК указанного гена, с применением картирования нуклеазой S1, методов ОТ-ПЦР, гибридизации, микроматриц и т.д. Аналогично, уровни кДНК/кРНК, соответствующие указанной мРНК, кодируемой маркерным геном, можно также количественно определить посредством применения общепринятых методик; в данном случае способ согласно настоящему изобретению включает этап синтеза соответствующей кДНК посредством обратной транскрипции (ОТ) соответствующей мРНК после синтеза (РНК-полимеразой) и амплификации кРНК, комплементарной указанной кДНК.

С целью нормирования значений экспрессии мРНК среди различных образцов можно провести сравнение уровней экспрессии мРНК, представляющей интерес, в исследуемых образцах с экспрессией контрольной РНК. «Контрольная РНК» в настоящей заявке означает РНК, уровни экспрессии которой не изменяются или изменяются лишь в ограниченной степени. Предпочтительно, контрольная РНК представляет собой мРНК, полученную из генов домашнего хозяйства, кодирующих белки, которые экспрессируются конститутивно и выполняют важные функции в клетке. Предпочтительные для применения в настоящем изобретении гены домашнего хозяйства включают 18-S рибосомный белок, β-2-микроглобулин, убиквитин, циклофилин, ГАФДГ, PSMB4, тубулин и β-актин.

В качестве альтернативы, также возможно определить уровни экспрессии генов 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 посредством определения уровней экспрессии белков, кодируемых указанными генами, поскольку, если экспрессия генов увеличена, должно наблюдаться увеличение количества соответствующих белков, и, если экспрессия генов уменьшена, должно наблюдаться уменьшение количества соответствующих белков.

Практически любой общепринятый способ можно использовать в рамках настоящего изобретения для обнаружения и количественного определения уровней белков. В качестве неограничивающего примера уровни экспрессии определяют с применением антител, обладающих способностью к специфичному связыванию с белком, определение которого проводят (или с фрагментами указанного белка, содержащими антигенные детерминанты), и последующего количественного определения полученных в результате комплексов антиген-антитело. Антитела, которые планируется использовать в данном типе анализа, могут представлять собой, например, поликлональную сыворотку, супернатанты гибридомы или моноклональные антитела, фрагменты антител, Fv, Fab, Fab' и F(ab')2, scFv, диатела, триатела, тетратела и гуманизированные антитела. В то же время антитела могут являться или могут не являться меченными. Иллюстративные, но не ограничивающие примеры маркеров, которые можно использовать, включают радиоактивные изотопы, ферменты, флуорофоры, хемолюминесцентные реактивы, кофакторы или субстраты ферментов, ингибиторы ферментов, частицы, красители и т.д. Существует широкое множество хорошо известных анализов, которые можно использовать в настоящем изобретении, в основе которых лежит применение немеченных антител (первичное антитело), меченных антител (вторичные антитела) или меченных антагонистов или агонистов 5-HTR типа 1 или 2; данные методики включают вестернблоттинг или иммуноблоттинг, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, твердофазный иммуноферментный анализ), РИА (радиоиммуноанализ), конкурентный ИФА (иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (double antibody sandwich ELISA, «сэндвич»-метод ELISA на основе двойных антител), иммуноцитохимические и иммуногистохимические методики, иммунофлуоресценцию, методики, в основе которых лежит применение биодатчиков или микроматриц белков, включая специфичные антитела, или анализы, в основе которых лежит коллоидная преципитация в таких форматах, как индикаторные полоски. Другие формы обнаружения и количественного определения белков включают методики аффинной хроматографии, анализы связывания лигандов и т.д.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения клетки, экспрессирующие 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, обнаруживают методом иммуноцитохимии, предпочтительно, методом иммунофлуоресценции.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения обнаружение экспрессии или определение уровней 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 осуществляют методом иммунофлуоресценции. Иммунофлуоресценция (ИФ) представляет собой методику, которую используют в сочетании с методом световой микроскопии на основе флуоресцентного микроскопа, преимущественно для анализа биологических образцов. В данной методике специфичность антител к антигену используют для нацеливания флуоресцентных красителей к специфичным биомолекулам-мишеням в клетке, что позволяет проводить визуализацию распределения молекулы-мишени в образце. ИФ представляет собой широко используемый вариант иммуноокрашивания и является конкретным примером метода иммуногистохимии (ИГХ) или иммуноцитохимии (ИЦХ), в котором для визуализации локализации антитела используются флуорофоры. ИФ можно использовать на срезах тканей, культивируемых клеточных линиях или отдельных клетках. ИФ можно использовать в сочетании с другими способами флуоресцентного окрашивания, в основе которых не лежат антитела, например, в сочетании с применением для мечения ДНК DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндола). При анализе образцов методом ИФ можно использовать несколько конструкций микроскопов; наиболее простым является эпифлуоресцентный микроскоп, также широко используется конфокальный микроскоп. Также можно использовать различные конструкции микроскопов со сверхвысоким разрешением, способные обеспечить значительно более высокое разрешение. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения идентификацию злокачественной клетки осуществляют посредством проточной цитометрии, которая представляет собой лазерную биофизическую технологию, применяемую при подсчете клеток, сортировке клеток и обнаружении биомаркеров посредством суспендирования клеток в потоке жидкости и пропускания клеток через электронный детектор.

Согласно настоящему изобретению обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы, является пригодным для идентификации злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения образец крови представляет собой периферическую кровь.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения 5-HTR типа 1 представляет собой 5-HTR 1А, и 5-HTR типа 2 выбран из группы, включающей 5-HTR 2A, 5-HTR 2В и 5-HTR 2С. Согласно более предпочтительному варианту реализации 5-HTR типа 2 представляет собой 5-HTR 2С.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ идентификации злокачественной клетки согласно настоящему изобретению включает обнаружение экспрессии 5-HTR1A и 5-HTR2C.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз.

Все термины и варианты реализации, описанные выше, в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.

3 - Способ диагностики гематологического злокачественного новообразования

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro диагностики гематологического злокачественного новообразования у субъекта, причем указанный способ включает идентификацию злокачественных клеток способом согласно настоящему изобретению, в частности, идентификацию злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы, причем указанный способ включает обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в указанной клетке.

Диагностика в настоящей заявке означает как процесс попытки определения и/или идентификации возможного заболевания у субъекта, т.е. диагностическую процедуру, так и мнение, достигнутое в результате данного процесса, т.е. диагностическое заключение. В связи с этим диагностику можно также рассматривать в качестве попытки классификации состояния индивидуума на отдельные и различные категории, позволяющие принимать врачебные решения относительно лечения и прогноза. Как понимают специалисты в данной области техники, диагноз гематологических злокачественных новообразований, хотя, предпочтительно, должен, но может и не быть правильным для 100% субъектов, диагностику или оценку которых проводят. Данный термин, однако, требует, чтобы статистически значимую часть субъектов можно было идентифицировать как страдающих от гематологического злокачественного новообразования. Специалист в данной области техники может с легкостью определить то, является ли субъект статистически значимым, с применением различных известных статистических инструментов оценки, например, определения доверительных интервалов, определения р-значения, t-критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т.д. Подробную информацию можно найти в руководстве Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. р-значения составляют, предпочтительно, 0,05, 0,01, 0,005 или ниже.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ диагностики гематологического злокачественного новообразования у субъекта включает:

(a) определение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, в образце от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

(b) сравнение указанных уровней с эталонным уровнем,

причем увеличение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъект страдает от гематологического злокачественного новообразования.

Эталонные значения получают из выборки образцов, предпочтительно образованной посредством смешивания образцов, анализ которых проводят, полученных от нормальных индивидуумов, не пораженных гематологическим злокачественным новообразованием. Указанное эталонное значение можно определить посредством методики, хорошо известной в современном уровне техники, например, посредством определения среднего арифметического уровня белков 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, измеренных в образце, отобранном от здоровых субъектов. Эталонное значение можно также получить на основании конститутивно экспрессируемых белков, отобранных от того же субъекта, анализ которого проводят.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения образец крови представляет собой образец периферической крови. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения 5-HTR типа 1 представляет собой 5-HTR 1А, и 5-HTR типа 2 выбран из группы, включающей 5-HTR 2А, 5-HTR 2В и 5-HTR 2С. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения 5-HTR типа 2 представляет собой 5-HTR 2С.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ диагностики гематологического злокачественного новообразования согласно настоящему изобретению включает обнаружение экспрессии 5-HTR 1А и 5-HTR 2С.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения клетки, экспрессирующие 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, обнаруживают методом иммуноцитохимии, предпочтительно, методом иммунофлуоресценции, более предпочтительно, методом проточной цитометрии.

Все термины и варианты реализации, описанные выше, в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.

4 - Способ выделения злокачественной клетки

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro выделения злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, который выбран из группы, включающей костный мозг, кровь и лимфатические узлы, причем указанный способ включает обнаружение экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в указанной клетке и выделение указанной клетки, экспрессирующей указанный 5-HTR.

Термин «выделение» в настоящей заявке означает идентификацию и отделение или удаление злокачественной клетки от остальных компонентов, присутствующих в образце, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения образец крови представляет собой образец периферической крови.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения 5-HTR типа 1 представляет собой 5-HTR 1А, и 5-HTR типа 2 выбран из группы, включающей 5-HTR 2А, 5-HTR 2В и 5-HTR 2С. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения 5-HTR типа 2 представляет собой 5-HTR 2С.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ выделения злокачественной клетки согласно настоящему изобретению включает обнаружение экспрессии 5-HTR 1А и 5-HTR 2С.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения клетки, экспрессирующие 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, обнаруживают методом иммуноцитохимии, предпочтительно, методом иммунофлуоресценции, более предпочтительно, методом проточной цитометрии.

Все термины и варианты реализации, описанные выше, в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.

5 - Способ определения прогноза

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro определения прогноза для субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, причем указанный способ включает:

(a) определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

(b) сравнение указанного уровня с эталонным уровнем,

причем уменьшение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъект характеризуется благоприятным прогнозом, или причем увеличение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъект характеризуется неблагоприятным прогнозом.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз и, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз.

Термин «определение» в настоящей заявке означает определение любого параметра, который можно использовать для определения динамики пациента. Как понимают специалисты в данной области техники, предсказание исхода, хотя, предпочтительно, должно, но может и не быть правильным для 100% субъектов, диагностику или оценку которых проводят. Данный термин, однако, требует, чтобы статистически значимую часть субъектов можно было идентифицировать как характеризующихся увеличенной вероятностью возникновения данного исхода. Специалист в данной области техники может с легкостью определить то, является ли субъект статистически значимым, с применением различных известных статистических инструментов оценки, например, определения доверительных интервалов, определения р-значения, t-критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т.д. Подробную информацию можно найти в руководстве Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, 90% или по меньшей мере 95%. р-значения составляют, предпочтительно, 0,05, 0,01, 0,005 или ниже.

Термин «прогноз» в настоящей заявке означает вероятность возвращения к норме после заболевания или прогнозирование вероятного развития или исхода заболевания, включая, но не ограничиваясь указанными, прогнозирование длительности общей выживаемости (OB), 1-летней выживаемости (1ЛВ), ответа на терапию (ОТ), выживаемости без признаков заболевания, выживаемости без прогрессирования заболевания и бессобытийной выживаемости. Как понимают специалисты в данной области техники, прогнозирование, хотя, предпочтительно, должно, но может и не быть правильным для 100% субъектов, диагностику или оценку которых проводят. Данный термин, однако, требует, чтобы статистически значимую часть субъектов можно было идентифицировать как характеризующихся увеличенной вероятности возникновения данного исхода. Специалист в данной области техники может с легкостью определить то, является ли субъект статистически значимым, с применением различных известных статистических инструментов оценки, например, определения доверительных интервалов, определения р-значения, t-критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т.д. Подробную информацию можно найти в руководстве Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% по меньшей мере 95%. р-значения составляют, предпочтительно 0,05, 0,02, 0,01 или ниже.

В данном случае для оценки клинического исхода пациента в ответ на терапию можно использовать стандартные критерии (Miller, et al. Cancer, 1981; 47(1): 207-14). Для определения клинического исхода пациента в ответ на лечение можно использовать любой из параметров, которые широко применяются для определения эффективности вариантов лечения и которые включают, без ограничения:

- Прогрессирование без признаков заболевания, которое в настоящей заявке описывает долю субъектов с полной ремиссией, у которых в течение исследуемого периода времени не наблюдалось повторного проявления заболевания.

- Выживаемость без признаков заболевания (ВБПЗ), означающую в настоящей заявке период времени после лечения заболевания, в течение которого субъект живет без признаков заболевания.

- Объективный ответ, который в настоящем изобретении описывает долю субъектов, получивших лечение, у которых наблюдается полный или частичный ответ.

- Контроль новообразования, который в настоящем изобретении означает долю субъектов, получивших лечение, у которых наблюдается полный ответ, частичный ответ, незначительный ответ или стабильное заболевание в течение ≥6 месяцев.

- Выживаемость без прогрессирования заболевания, которую в настоящей заявке определяют, как период времени от начала лечения до первого измерения, определившего рост рака.

- Время до прогрессирования заболевания, которое в настоящей заявке относится к периоду времени от момента, когда заболевание подвергли лечению, до момента, когда заболевание начало ухудшаться. Определение термина «прогрессирование» было приведено выше.

- Выживаемость без прогрессирования заболевания в течение шести месяцев, относящуюся в настоящей заявке к проценту субъектов, у которых отсутствует прогрессирование в первые шесть месяцев после начала терапии.

- Общую выживаемость (ОВ), которую в настоящей заявке определяют, как процент пациентов, которые выжили после постановки первичного диагноза рака.

- Медиану выживаемости, относящуюся в настоящей заявке к периоду времени, в течение которого половина субъектов, включенных в исследование, еще остаются живыми, и

- Цитогенетическую стратификацию риска, которая в настоящей заявке относится к вероятности 5-летней выживаемости на основании структуры хромосом лейкозных клеток.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения клинический исход у пациента измеряют посредством определения цитогенетической стратификации риска.

Первый этап способа in vitro определения прогноза включает определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов. Определение уровня экспрессии биомаркера означает определение уровня экспрессии биомаркера и/или количества клеток, несущих на своей поверхности биомаркер (т.е. маркер поверхности клетки). В этом отношении уровень экспрессии означает уровень мРНК и/или уровень белка, и/или количество клеток, несущих на своей поверхности биомаркер. Примеры способов определения уровня экспрессии биомаркера были описаны выше.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ in vitro определения прогноза для субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, включает определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 посредством измерения уровня мРНК, кодируемой генами 5-HTR типа 1 и/или генами 5-HTR типа 2 либо вариантами указанных генов. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют посредством измерения уровня белков 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 либо вариантов указанных белков. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии мРНК определяют методом ПЦР. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии белков или вариантов указанных соединений определяют методом вестернблоттинга или иммуноцитохимии. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют методом полуколичественной ПЦР.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения образец крови представляет собой образец периферической крови.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ in vitro определения прогноза для субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, включает определение уровня 5-HTR типа 1. Согласно более предпочтительному варианту реализации 5-HTR типа 1 выбран из группы, включающей 5-HTR 1А и 5-HTR-1B.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ включает определение уровня экспрессии 5-HTR 1А и 5-HTR-1B.

На втором этапе способ in vitro определения прогноза включает проведение сравнения уровня 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 с эталонным уровнем. Указанное сравнение позволяет сделать заключение о том, что субъект характеризуется благоприятным или неблагоприятным прогнозом.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения прогноз, который определяют способом in vitro согласно настоящему изобретению, представляет собой вероятность 5-летней выживаемости.

Все термины и варианты реализации, описанные выше, в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.

6 - Способ оценки эффективности терапии

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro оценки эффективности терапии у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования и получающего лечение указанной терапией, причем указанный способ включает:

a) определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

b) сравнение указанного уровня с уровнем экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 в клетках образца от указанного субъекта в более ранний момент времени,

причем уменьшение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с уровнем, определенным в образце от указанного субъекта в более ранний момент времени, свидетельствует, что терапия является эффективной, или причем увеличение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 по сравнению с уровнем, определенным в образце от указанного субъекта в более ранний момент времени, свидетельствует, что терапия является неэффективной.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз и, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз.

Как понимает специалист в данной области техники, терапия направлена на лечение гематологического злокачественного новообразования. В качестве неограничивающего примера можно использовать комбинацию цитарабина (ara-С) и даунорубицина (дауномицина) или идарубицина, флударабина или топотекана. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения терапия представляет собой ингибитор 5-HTR типа 1 или ингибитор 5-HTR типа 2.

Способы определения уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 были подробно описаны выше.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ in vitro оценки эффективности терапии у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, включает определение уровня 5-HTR типа 1. Согласно более предпочтительному варианту реализации 5-HTR типа 1 выбран из группы, включающей 5-HTR 1А и 5-HTR-1B.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ включает определение уровня экспрессии 5-HTR 1А и 5-HTR-1B.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения образец крови представляет собой образец периферической крови.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ in vitro оценки эффективности терапии у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, включает определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 посредством измерения уровня мРНК, кодируемой генами 5-HTR типа 1 и/или генами 5-HTR типа 2 либо вариантами указанных генов. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют посредством измерения уровня белков 5-HTR типа 1 и/или белков 5-HTR типа 2 либо вариантов указанных белков.

Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии мРНК определяют методом ПЦР. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии белков или вариантов белков определяют методом вестернблоттинга или иммуноцитохимии. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют методом полуколичественной ПЦР.

Все термины и варианты реализации, описанные выше, в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.

7 - Способ разработки персонализированной терапии

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу in vitro разработки персонализированной терапии для субъекта, у которого было диагностировано гематологическое злокачественное новообразование, причем указанный способ включает:

a) определение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, в образце от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

b) сравнение указанных уровней с эталонным уровнем,

причем увеличение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2, по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъекта следует лечить ингибитором 5-HTR типа 1 и/или ингибитором 5-HTR типа 2.

Разработку персонализированной терапии для субъекта, у которого было диагностировано гематологическое злокачественное новообразование, понимают как принятие решения на основании экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 о введении в качестве соответствующей терапии ингибитора 5-HTR типа 1 и/или ингибитора 5-HTR типа 2.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR выбран из соединений таблицы 1 или фармацевтической соли указанных соединений.

Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ингибитор 5-HTR выбран из группы, включающей апоморфин, метиотепин, амперозид и фармацевтически приемлемую соль указанных соединений.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ in vitro разработки персонализированной терапии у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, включает определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения 5-HTR типа 1 выбран из группы, включающей 5-HTR 1А и 5-HTR-1В.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ включает определение уровня экспрессии 5-HTR 1А и 5-HTR 1В.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз и, более предпочтительно, острый миелоидный лейкоз.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения образец крови представляет собой образец периферической крови.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ in vitro оценки эффективности терапии у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, включает определение уровня экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 посредством измерения уровня мРНК, кодируемой генами 5-HTR типа 1 и/или генами 5-HTR типа 2 либо вариантами указанных генов. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют посредством измерения уровня белков 5-HTR типа 1 и/или белков 5-HTR типа 2 либо вариантов указанных белков. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии мРНК определяют методом ПЦР. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии белков или вариантов белков определяют методом вестернблоттинга или иммуноцитохимии. Согласно более предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровень экспрессии 5-HTR типа 1 и/или 5-HTR типа 2 определяют методом полуколичественной ПЦР.

Все термины и варианты реализации, описанные выше, в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.

Настоящее изобретение описано посредством следующих примеров, которые следует рассматривать исключительно в качестве иллюстрации, а не ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пример 1. Антагонисты рецептора серотонина (5HTR) типа 1 и 2 оказывают цитотоксический эффект на линии клеток ОМЛ.

С целью исследования антилейкозного эффекта антагонистов 5HTR клеточные линии ОМЛ (острого миелоидного лейкоза) HL-60 (Collins, Gallo et al. Nature. 1977; 270(5635): 347-9), MonoMac-1 (Steube, Teepe et al. Leuk Res. 1997; 21(4): 327-35), KG-1 (Koeffler and Golde. Science. 1978; 200(4346): 1153-4) и Kasumi-1 (Asou, Tashiro et al. Blood. 1991; 77(9): 2031-6) обрабатывали широко известным антагонистом 5HTR апоморфином (№ CAS 314-19-2) в различных дозах в течение 72 ч. Один миллион клеток на мл высевали в полной среде RPMI с добавкой 10% фетальной бычьей сыворотки в 96-луночном планшете. Концентрация, которую использовали при обработке апоморфином, составляла 0,1, 1 и 10 мкМ. Как представлено на фигуре 1, во всех исследованных линиях клеток ОМЛ было обнаружено дозозависимое уменьшение жизнеспособности клеток.

Семейство 5HTR человека включает 7 подтипов (от 1 до 7) рецепторов (Nichols and Nichols. Chem Rev 2008, 108: 16414-41). Линии клеток ОМЛ HL-60, KG-1, MonoMac-1 и Kasumi-1 инкубировали с подтип-специфичными антагонистами 5HTR: апоморфином (типы 1, 2 и 5), метиотепином (типы 1 и 2) (№ CAS 74611-28-2), амперозидом (тип 2) (№ CAS 75558-90-6), GR113808 (тип 4) (№ CAS 144625-51-4). Через 72 ч после обработки определяли жизнеспособность клеток методом проточной цитометрии. Клетки окрашивали 7-AAD (№ CAS 7240-37-1) и Хехстом 33342 (№ CAS 23491-52-3). Жизнеспособность клеток определяли посредством исключения на основании окрашивания 7-AAD и наличия положительного окрашивания Хехстом. Число клеток измеряли в объемном отношении. Только апоморфин, метиотепин и амперозид вызывали гибель клеток в линиях клеток ОМЛ (фигура 2); следовательно, ингибирование 5THR типа 1 и 2 оказывает цитотоксический эффект на клетки ОМЛ. Фактически, антилейкозный эффект являлся обратимым при наличии конкурентного агониста, такого как природный лиганд 5-НТ (№ CAS 153-98-0) или 5-СТ (№ CAS 74885-72-6).

Пример 2. Антагонисты рецептора серотонина (5HTR) типа 1 и 2 оказывают цитотоксический эффект на образцы от пациента с первичным ОМЛ.

Образцы от пациента с первичным ОМЛ обрабатывали антагонистами HTR подтипа 1 и 2 в течение 24 и 72 ч в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкМ. Пятьсот тысяч клеток на мл высевали в среде IMDM с добавками инсулина, трансферрина, бычьего сывороточного альбумина, ИЛ-3 и заменимых аминокислот. Жизнеспособность клеток измеряли методом проточной цитометрии, как описано выше. Как и в случае линий клеток ОМЛ, обработка апоморфином и метиотепином дозозависимым образом вызывала гибель бластных клеток первичного ОМЛ (фигура 3 и 4).

Как и нормальная гематопоэтическая система, ОМЛ, как считают, организована в виде иерархии различных и функционально гетерогенных классов клеток, которые в конечном счете поддерживаются небольшим количеством лейкозных стволовых клеток (ЛСК), характеризующихся усиленной способностью к самообновлению, нарушенной способностью к дифференциации и повышенной устойчивостью к лекарственным препаратам (Bonnet and Dick Nat Med. 1997; 3(7): 730-7). Было обнаружено, что популяция ЛСК является обогащенной в пределах популяции CD34+CD38- бластных клеток ОМЛ. Апоморфин и метиотепин снижают жизнеспособность клеток наиболее примитивной обогащенной ЛСК популяции бластных клеток (фигура 3 и 4), что было обнаружено методом проточной цитометрии на основании наличия CD34 и отсутствия CD38. Фактически, уменьшение примитивной фракции было значительно более высоким, чем в суммарной популяции; таким образом, антагонисты 5HTR селективно поражают ЛСК.

Пример 3. Антагонисты 5HTR вызывают дифференциацию линий клеток ОМЛ

Линии клеток HL-60, KG-1, MonoMac-1 и Kasumi-1 ОМЛ обрабатывали апоморфином и метиотепином в различных концентрациях в течение 72 ч, как описано выше. Экспрессию связанных с дифференциацией маркеров поверхности измеряли методом проточной цитометрии. Во всех линиях клеток ОМЛ присутствие антагонистов 5HTR вызывало экспрессию CD11c, CD11b и CD14 (фигура 5).

Аналогично, апоморфин и метиотепин вызывали нарушение регуляции миелоидных маркеров в образцах от пациента с первичным ОМЛ (фигура 6 и 7).

Пример 4. Антагонисты 5HTR не оказывают эффекта ни на здоровые клетки крови, ни на здоровые гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки

Клетки периферической крови от здоровых доноров выделяли и обрабатывали антагонистами 5HTR с применением тех же условий, что и в случае образцов от пациента с первичным ОМЛ. В отличие от последних образцов, здоровые клетки крови остаются непораженными после обработки апоморфином или метиотепином (фигура 8).

С целью исследования эффекта обработки антагонистом 5HTR на гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки из образцов крови пупочного канатика от здоровых доноров выделяли мононуклеарные клетки, и фракцию отрицательной линии дифференцировки культивировали в присутствии апоморфина. В отличие от клеток ОМЛ, первичные гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки оставались непораженными после обработки. Каких-либо значительных изменений жизнеспособности клеток не наблюдалось в отношении как частоты встречаемости каждой популяции, так и абсолютного количества клеток (фигура 9).

Пример 5. Антагонисты 5HTR уменьшают клоногенную способность бластных клеток ОМЛ с одновременным отсутствием воздействия на здоровые гематопоэтические стволовые клетки

Принимая во внимание то, что антагонисты 5HTR снижали жизнеспособность клеток наиболее примитивной популяции ОМЛ, было проведено исследование клоногенной способности после обработки. Образцы от пациента с первичным ОМЛ культивировали в присутствии апоморфина и метиотепина в течение 18 ч и высевали в полутвердой среде на основе метилцеллюлозы в течение 14 дней в присутствии соответствующих цитокинов в концентрации пятьдесят тысяч клеток на мл. Колонии подсчитывали в световом микроскопе на основании морфологии и насыщенности клетками. Как представлено на фигуре 10, оба антагониста 5HTR снижали клоногенную способность образцов первичного ОМЛ, которую измеряли на основании количества полученных КОЕ-В.

Затем клетки крови пупочного канатика без линий дифференцировки обрабатывали апоморфином или метиотепином, как описано выше в случае клеток ОМЛ. Через 14 дней после высевания колонии подсчитывали в световом микроскопе на основании морфологии и насыщенности клетками. Ни один из антагонистов 5HTR не оказывал влияния на клоногенную способность здоровых гематопоэтических стволовых/прогениторных клеток, которую измеряли на основании суммарного количества колоний или частоты встречаемости каждого подтипа КОЕ (фигура 11).

Пример 6. 5HTR дифференциально экспрессируются в образцах от пациента с ОМЛ

Для определения того, действительно ли 5HTR дифференциально экспрессируется в образцах от пациента с ОМЛ по сравнению с образцами здоровой крови, экспрессию данных рецепторов в образцах периферической крови пациента с первичным ОМЛ, образцах периферической крои здорового донора и линиях клеток ОМЛ исследовали методом проточной цитометрии. Как представлено на фигуре 12, клетки периферической крови пациента с первичным ОМЛ экспрессировали 5HTR в значительно большем количестве по сравнению со здоровыми донорами.

Пример 7. Экспрессия 5HTR коррелирует с клиническим исходом у пациентов с ОМЛ

В образцах от пациента с первичным ОМЛ измеряли уровни экспрессии мРНК 5HTR1A и 5HTR1B и определяли корреляцию с клиническим исходом. На основании цитогенетического риска были определены две группы пациентов: благоприятная (благоприятная молекулярная группа) и неблагоприятная (неблагоприятная молекулярная группа). В обоих случаях существовала взаимосвязь между высокой экспрессией мРНК каждого 5HTR и худшим клиническим исходом (фигура 13).

Пример 8. Антагонисты рецептора серотонина (5HTR) уменьшают клоногенную способность клеток ОМЛ во вторичных КОЕ

С целью анализа клоногенной способности in vitro эквивалентные первичные КОЕ-В от пациентов с ОМЛ, обработанные апоморфином, метиотепином и наполнителем (как поясняется в примере 5), высевали сериями в полутвердой среде на основе метилцеллюлозы в течение 14 дней в присутствии соответствующих цитокинов в концентрации пятьдесят тысяч клеток на мл, но при отсутствии какого-либо лекарственного препарата. Колонии подсчитывали в световом микроскопе на основании морфологии и насыщенности клетками. Как представлено на фигуре 14, после обработки наблюдалось снижение клоногенной способности.

Пример 9. Обработка антагонистами рецептора серотонина снижает нагрузку ОМЛ на модели ксенотрансплантата на мышах in vivo, не оказывая влияния на здоровые клетки крови

Клетки лейкоза преимущественно находятся в костном мозге, нише, в которой компартмент стромальных клеток обеспечивает паракринную передачу сигналов, в высокой степени опосредующую выживаемость, пролиферацию и защиту указанных клеток от апоптоза (). Соответственно, кондиционированным иммунодефицитным мышам NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) (Sanchez et al Leukemia. 2009 Nov; 23(11): 2109-17) трансплантировали клетки ОМЛ человека и оставляли в течение 7 дней для установления лейкоза. Затем мышам каждые 2 дня вводили суммарно 4 интраперитонеальные дозы апоморфина (5 мг/кг массы) (Schmidt et al J Neurosci. 1982 Mar; 2(3): 376-80) или метиотепина (0,1 мг/кг массы) (Ginawi et al J Physiol Pharmacol. 2004 Jun; 55(2): 357-69) в течение 7 дней. Оба антагониста 5HTR1 обеспечивали значительное снижение нагрузки ОМЛ в костном мозге (КМ) по сравнению с мышами, получавшими наполнитель (фигура 15).

Лейкоз-инициирующие клетки (leukemia-initiating cells, LIC) или ЛСК отвечают за приживление клеток ОМЛ на моделях ксенотрансплантата на мышах и, как считают, запускают и поддерживают заболевание у людей. Образцы от пациента с первичным ОМЛ обрабатывали ex vivo антагонистами 5HTR в течение 18 ч и трансплантировали кондиционированным иммунодефицитным мышам NSG. Через восемь недель после трансплантации определяли наличие клеток ОМЛ человека в костном мозге мыши. Как представлено на фигуре 16, клетки ОМЛ, обработанные апоморфином и метиотепином, продемонстрировали меньшую способность к хомингу и приживлению по сравнению с обработанными наполнителем клетками ОМЛ. Интересно отметить, что после обработки апоморфином и метиотепином наблюдался незначительный эффект в отношении нормальной гематопоэтической способности к регенерации клеток КПК без линий дифференцировки (фигура 16).

С целью анализа in vivo способности к самообновлению, сохранившейся в приживленных образцах, проводили вторичную трансплантацию. Менее 35% клеток ОМЛ были обнаружены у мышей, которым вводили клетки, обработанные апоморфином или метиотепином (фигура 17). Однако здоровые гематопоэтические стволовые клетки сохраняли способность к самообновлению и дифференциации после обработки, что подтверждается потенциалом регенерации данных клеток во вторичных трансплантатах (фигура 17). Более того, клоногенная способность приживленных образцов была значительно снижена в клетках ОМЛ, обработанных антагонистами 5HTR1, что измеряли на основании анализов КОЕ. Интересно отметить, что небольшой эффект наблюдался на приживленных здоровых ГСК (гематопоэтических стволовых клетках) (фигура 17).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу обнаружения злокачественной клетки в образце, включающему определение уровней экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B, и может быть использовано в медицине. Определение уровней экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B может быть использовано для диагностики гематологического злокачественного новообразования, определения прогноза, контроля эффекта терапии или разработки персонализированной терапии. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 17 ил., 1 табл., 9 пр.

1. Способ in vitro обнаружения присутствия злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, выбранном из группы, состоящей из костного мозга, крови и лимфатических узлов, причем указанный способ включает обнаружение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B в указанной клетке.

2. Способ in vitro выделения злокачественной клетки из гематологического злокачественного новообразования в образце, выбранном из группы, состоящей из костного мозга, крови и лимфатических узлов, причем указанный способ включает обнаружение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B в указанной клетке и дополнительно включает выделение указанной клетки, экспрессирующей указанный 5-HTR.

3. Способ in vitro диагностики гематологического злокачественного новообразования у субъекта, причем указанный способ включает:

(a) определение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR1A и/или 5-HTR1B, в образце от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, включающей образец костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

(b) сравнение указанных уровней с эталонным уровнем,

причем увеличение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR1A и/или 5-HTR1B, по сравнению с эталонным значением свидетельствует, что субъект страдает от гематологического злокачественного новообразования.

4. Способ по любому из пп. 1 и 3, отличающийся тем, что указанный 5-HTR типа 1 представляет собой 5-HTR 1A.

5. Способ in vitro определения прогноза для субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования, причем указанный способ включает:

(a) определение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B в клетках образца, полученного от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, состоящей из костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

(b) сравнение указанного уровня с эталонным уровнем,

при этом уменьшение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B по сравнению с указанным эталонным уровнем свидетельствует, что указанный субъект характеризуется благоприятным прогнозом, или

при этом увеличение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B по сравнению с эталонным уровнем свидетельствует, что указанный субъект характеризуется неблагоприятным прогнозом.

6. Способ in vitro мониторинга эффекта терапии для лечения гематологического злокачественного новообразования у субъекта, страдающего от гематологического злокачественного новообразования и получающего лечение посредством указанной терапии, причем указанный способ включает:

a) определение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B в клетках образца, полученного от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, состоящей из костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

b) сравнение указанного уровня с уровнем экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B в клетках образца, полученного от указанного субъекта в более ранний момент времени,

при этом уменьшение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B по сравнению с уровнем, определенным в образце, полученном от указанного субъекта в более ранний момент времени, свидетельствует о том, что указанная терапия является эффективной, или

при этом увеличение уровня экспрессии 5-HTR1A и/или 5-HTR1B по сравнению с уровнем, определенным в образце, полученном от указанного субъекта в более ранний момент времени, свидетельствует о том, что указанная терапия является неэффективной.

7. Способ in vitro разработки персонализированной терапии для субъекта, у которого было диагностировано гематологическое злокачественное новообразование, причем указанный способ включает:

a) определение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR1A и/или 5-HTR1B, в образце, полученном от указанного субъекта, причем указанный образец выбран из группы, состоящей из костного мозга, крови и лимфатических узлов, и

b) сравнение указанных уровней с эталонным уровнем,

причем увеличение уровней клеток, экспрессирующих 5-HTR1A и/или 5-HTR1B, по сравнению с эталонным уровнем свидетельствует, что указанного субъекта следует лечить ингибитором 5-HTR1A и/или ингибитором 5-HTR1B.

8. Способ по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что определяют уровень экспрессии 5-HTR1A.

9. Способ по любому из пп. 1-3, 5, 6 или 7, отличающийся тем, что указанное гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный лейкоз представляет собой острый миелоидный лейкоз.

11. Способ по любому из пп. 1-3, 5, 6 или 7, отличающийся тем, что указанный образец крови представляет собой периферическую кровь.