ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам получения растений с увеличенной биомассой корней.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Корни сосудистых растений имеют множество функций. Они включают: 1) всасывание воды и неорганических питательных веществ, 2) заякоривание растения в почве и поддержание его, 3) запасание питательных веществ и нутриентов и 4) вегетативное размножение. В зависимости от концентрации питательных веществ корни также синтезируют цитокинин, который выступает в качестве сигнала, влияющего на скорость роста побегов.

Таким образом, растения с увеличенной биомассой корней потенциально будут иметь ряд преимуществ, включающих улучшенное заякоривание, более эффективное поглощение воды, более эффективное поглощение питательных веществ и повышенную толерантность к засухе. Комбинация этих признаков также может приводить к увеличению урожая, включая увеличение биомассы зерен или плодов и/или увеличение биомассы листьев.

В настоящее время понимание генетических механизмов, контролирующих биомассу корней в растениях, ограничено.

Было бы полезным наличие доступных альтернативных способов контроля биомассы корней в растениях.

Таким образом, задачей изобретения является предоставление способов и материалов для повышения продукции биомассы корней в растениях и/или по меньшей мере предоставление обществу приемлемого выбора.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ранее White (2006) выявил два соседних гомологичных гена в Arabidopsis (названных PEAPOD, PPD1 и PPD2), которые регулируют клеточную пролиферацию меристемоидов на последних стадиях развития листьев и семянок. Делеция этих генов в арабидопсисе приводила к увеличенным листьям и широким семянкам, в то время как сверхэкспрессия PPD1 приводила к уменьшению размера листьев и стручков (White, 2006).

Заявители в рамках изобретения неожиданно обнаружили, что сверхэкспрессия генов PEAPOD в растениях приводит к увеличению продукции биомассы корней.

Таким образом, изобретение заявителя относится к способу увеличения биомассы корней в растениях посредством эктопической экспрессии PEAPOD. В частности, изобретение относится к эктопической экспрессии белков PEAPOD, которые характеризуются присутствием консенсусных аминокислотных мотивов, общих для всех белков PEAPOD, описанных для широкого диапазона видов растений.

Способы

В первом аспекте изобретение относится к способу увеличения биомассы корней в растении, причем способ включает стадию увеличения экспрессии по меньшей мере одного белка PEAPOD в растении.

В одном варианте осуществления биомасса корней увеличивается относительно биомассы корней в контрольном растении того же вида или сорта.

В одном варианте осуществления увеличенная экспрессия по меньшей мере одного белка PEAPOD является следствием трансформации растения, или растения-предшественника или клетки растения-предшественника, полинуклеотидом, кодирующим белок PEAPOD.

В следующем варианте осуществления растение является трансгенным по меньшей мере по одному полинуклеотиду, кодирующему и экспрессирующему белок PEAPOD.

В следующем аспекте изобретение относится к способу продуцирования растения с увеличенной биомассой корней, причем способ включает стадию повышения экспрессии по меньшей мере одного белка PEAPOD в растении.

В одном варианте осуществления растение трансформируют по меньшей мере одним полинуклеотидом, кодирующим белок PEAPOD.

В следующем варианте осуществления способ включает стадию трансформации растения или трансформацию клетки растения, которая регенерирует в растение, полинуклеотидом, кодирующим белок PEAPOD.

В одном варианте осуществления способ включает дополнительную стадию тестирования или оценки растения в отношении увеличенной биомассы корней.

В следующем варианте осуществления способ включает стадию продуцирования дополнительных растений с увеличенной биомассой корней посредством бесполого или полового размножения растений, исследованных в отношении увеличенной биомассы.

Белки PEAPOD

В одном варианте осуществления белок PEAPOD представляет собой полипептид, содержащий последовательность согласно по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 28, 29, 31, 32, 34 и 35.

В следующем варианте осуществления белок PEAPOD содержит последовательность SEQ ID NO: 28. В следующем варианте осуществления белок содержит PEAPOD последовательность SEQ ID NO: 29. В следующем варианте осуществления белок PEAPOD содержит последовательность SEQ ID NO: 31. В следующем варианте осуществления белок PEAPOD содержит последовательность SEQ ID NO: 32. В следующем варианте осуществления белок PEAPOD содержит последовательность SEQ ID NO: 34. В следующем варианте осуществления белок PEAPOD содержит последовательность SEQ ID NO: 35.

В следующем варианте осуществления белок PEAPOD представляет собой полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 70% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 1-26.

В следующем варианте осуществления белок PEAPOD представляет собой полипептид, содержащий последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1-26.

В следующем варианте осуществления белок PEAPOD представляет собой полипептид, содержащий последовательность по меньшей мере с 70% идентичностью с SEQ ID NO: 1.

В следующем варианте осуществления белок PEAPOD представляет собой полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1.

Экспрессия PEAPOD

Способы экспрессии белков в растениях хорошо известны специалистам в данной области и описаны в настоящем описании. Все такие способы входят в объем изобретения.

Повышение экспрессии PEAPOD путем введения полинуклеотида

В одном варианте осуществления экспрессию повышают путем введения по меньшей мере одного полинуклеотида в клетку растения или в растение.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид кодирует белок PEAPOD, как определено в настоящем описании.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность по меньшей мере с 70% идентичностью с кодирующей последовательностью согласно любой из SEQ ID NO: 83-107.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность по меньшей мере с 70% идентичностью с последовательностью согласно любой из SEQ ID NO: 83-107.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид содержит кодирующую последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 83-107.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 83-107.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид содержит фрагмент последовательностей, описанных выше, который способен кодировать полипептид с той же функцией, что и у белка PEAPOD. В одном варианте осуществления фрагмент кодирует полипептид, способный увеличивать биомассу корней.

Экспрессия PEAPOD посредством экспрессирующей конструкции

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид вводят в растение в качестве части экспрессирующей конструкции.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующая конструкция содержит промотор, функционально связанный с полинуклеотидом.

Промотор для повышения экспрессии PEAPOD

В одном варианте осуществления промотор способен запускать или запускает конститутивную экспрессию функционально связанного полинуклеотида во всех тканях растения.

В следующем варианте осуществления промотор представляет собой тканепредпочтительный промотор.

В следующем варианте осуществления промотор способен запускать или запускает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в подземных тканях растения.

В одном варианте осуществления промотор представляет собой тканепредпочтительный промотор для подземных тканей.

В следующем варианте осуществления промотор представляет собой тканеспецифический промотор для подземных тканей.

В одном варианте осуществления промотор представляет собой репрессируемый светом промотор.

В следующем варианте осуществления промотор способен запускать или запускает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в корнях растения.

В одном варианте осуществления промотор представляет собой предпочтительный для корней промотор.

В следующем варианте осуществления промотор представляет собой специфический для корней промотор.

Источник полинуклеотидов и полипептидов

Полинуклеотиды и варианты полинуклеотидов по изобретению или используемые в способах по изобретению могут происходить из любого вида. Полинуклеотиды и варианты также могут быть продуцированными способами синтеза или рекомбинантными способами, а также они могут быть продуктами подходов "шаффлинга генов".

Полипептиды и варианты полипептидов по изобретению или используемые в способах по изобретению могут происходить из любого вида. Полипептиды и варианты также могут быть продуцированы рекомбинантными способами, а также могут экспрессироваться с продуктов подходов "шаффлинга генов".

В одном варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида растения.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида голосеменных растений.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида покрытосеменных растений.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида двудольного растения.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида эвдикот.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида растений группы эвдикот.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид, полипептид или вариант происходит из вида однодольного растения. Предпочтительные однодольные растения включают: виды пальмы, банана, ряски и орхидей.

Клетки растений и растения, подлежащие трансформации

Клетки растений и растения по изобретению или используемые в способах по изобретению происходят из любого вида растений.

В одном варианте осуществления клетки растений или растения происходят из вида голосеменных растений.

В следующем варианте осуществления клетки растения или растения происходят из вида покрытосеменных растений.

В следующем варианте осуществления клетки растений или растения происходят из вида двудольных растений.

Предпочтительные роды однодольных растений включают: Agropyron, Allium, Alopecurus, Andropogon, Arrhenatherum, Asparagus, Avena, Bambusa, Bothrichloa, Bouteloua, Bromus, Calamovilfa, Cenchrus, Chloris, Cymbopogon, Cynodon, Dactylis, Dichanthium, Digitaria, Eleusine, Eragrostis, Fagopyrum, Festuca, Helianthus, Hordeum, Lolium, Miscanthis, Miscanthus x giganteus, Oryza, Panicum, Paspalum, Pennisetum, Phalaris, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Setaria, Sorgahastum, Sorghum, Triticum, Vanilla, X Triticosecale Triticale и Zea.

Предпочтительный вид однодольных растений включает: Agropyron cristatum, Agropyron desertorum, Agropyron elongatum, Agropyron intermedium, Agropyron smithii, Agropyron spicatum, Agropyron trachycaulum, Agropyron trichophorum, Allium ascalonicum, Allium cepa, Allium chinense, Allium porrum, Allium schoenoprasum, Allium fistulosum, Allium sativum, Alopecurus pratensis, Andropogon gerardi, Andropogon Gerardii, Andropogon scoparious, Arrhenatherum elatius, Asparagus officinalis, Avena nuda, Avena sativa, Bambusa vulgaris, Bothrichloa barbinodis, Bothrichloa ischaemum, Bothrichloa saccharoides, Bouteloua curipendula, Bouteloua eriopoda, Bouteloua gracilis, Bromus erectus, Bromus inermis, Bromus riparius, Calamovilfa longifilia, Cenchrus ciliaris, Chloris gayana, Cymbopogon nardus, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Dichanthium annulatum, Dichanthium aristatum, Dichanthium sericeum, Digitaria decumbens, Digitaria smutsii, Dioscorea rotundata, Dicsorea alata, Dicscorea opposita, Dicscorea bulbifera, Dioscorea esculenta, Dioscorea trifida, Eleusine coracan, Elymus angustus, Elymus junceus, Eragrostis curvula, Eragrostis tef, Fagopyrum esculentum, Fagopyrum tataricum, Festuca arundinacea, Festuca ovina, Festuca pratensis, Festuca rubra, Helianthus annuus sunflower, Hordeum distichum, Hordeum vulgare, Lolium multiflorum, Lolium perenn, Miscanthis sinensis, Miscanthus x giganteus, Oryza sativa, Panicum italicium, Panicum maximum, Panicum miliaceum, Panicum purpurascens, Panicum virgatum, Panicum virgatum, Paspalum dilatatum, Paspalum notatum, Pennisetum clandestinum, Pennisetum glaucum, Pennisetum purpureum, Pennisetum spicatum, Phalaris arundinacea, Phleum bertolinii, Phleum pratense, Poa fendleriana, Poa pratensis, Poa. nemoralis, Saccharum officinarum, Saccharum robustum, Saccharum sinense, Saccharum spontaneum, Secale cereale, Setaria sphacelata, Sorgahastum nutans, Sorghastrum nutans, Sorghum dochna, Sorghum halepense, Sorghum sudanense, Sorghum vulgare, Sorghum vulgare, Triticum aestivum, Triticum dicoccum, Triticum durum, Triticum monococcum, Vanilla fragrans, X Triticosecale и Zea mays.

Предпочтительным семейством однодольных растений является семейство злаковых.

Предпочтительные подсемейства злаковых включают: Anomochlooideae, Pharoideae, Puelioideae, Bambusoideae, Pooideae, Ehrhartoideae, Aristidoideae, Arundinoideae, Chloridoideae, Panicoideae, Danthonioideae и Micrairoideae.

Предпочтительным подсемейством злаковых является подсемейство Pooideae. Предпочтительные растения Pooideae включают пшеницу, ячмень, овес, костер и вейник тростниковый.

Другим предпочтительным подсемейством злаковых является подсемейство Ehrhartoideae. Предпочтительные растения Ehrhartoideae включают рис.

Другим предпочтительным подсемейством злаковых является подсемейство Panicoideae. Предпочтительные растения Panicoideae включают петушье просо, кукурузу, сорго, сахарный тростник, энергетический тростник, миллет, фонио и бородатую траву.

Другим предпочтительным подсемейством злаковых является подсемейство Arundinoideae. Предпочтительные растения Arundinoideae включают Arundo donax.

Другим предпочтительным семейством злаковых является подсемейство Bambusoideae. Предпочтительные растения Bambusoideae включают бамбук.

Предпочтительные виды злаковых включают виды рода Lolium. Предпочтительные виды Lolium включают Lolium longiflorum, Lolium multiflorum, Lolium perenne, Lolium westerwoldicum, Lolium temulentum и Lolium hybridum.

Другие предпочтительные виды злаковых включают виды рода Festuca. Предпочтительные виды Festuca включают Festuca arundinacea, Festuca ovina, Festuca pratensis и Festuca rubra.

Предпочтительно клетки растений или растения происходят из видов двудольных растений.

Предпочтительные роды двудольных растений включают: Amygdalus, Anacardium, Arachis, Brassica, Cajanus, Cannabis, Carthamus, Carya, Ceiba, Cicer, Cocos, Coriandrum, Coronilla, Cossypium, Crotalaria, Dolichos, Elaeis, lycine, Gossypium, Helianthus, Lathyrus, Lens, Lespedeza, Linum, Lotus, Lupinus, Macadamia, Medicago, Melilotus, Mucuna, Olea, Onobrychis, Ornithopus, Papaver, Phaseolus, Phoenix, Pistacia, Pisum, Prunus, Pueraria, Ribes, Ricinus, Sesamum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Vicia и Vigna.

Предпочтительные виды двудольных растений включают: Amygdalus communis, Anacardium occidentale, Arachis hypogaea, Arachis hypogea, Brassica napus Rape, Brassica. nigra. Brassica campestris, Cajanus cajan, Cajanus indicus, Camelina sativa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Ceiba pentandra, Cicer arietinum, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Coronilla varia, Cossypium hirsutum, Crotalaria juncea, Dolichos lablab, Elaeis guineensis, Gossypium arboreum, Gossypium nanking, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Glycine ussuriensis, Glycine gracilis, Helianthus annus, Jatropha cuneata, Jatropha curcas, Lupinus angustifolius, Lupinus luteus, Lupinus mutabilis, Lespedeza sericea, Lespedeza striata, Lotus uliginosus, Lathyrus sativus, Lens culinaris, Lespedeza stipulacea, Linum usitatissimum, Lotus corniculatus, Lupinus albus, Lupinus angustifolius, Lupinus luteus, Medicago arborea, Medicago falcate, Medicago hispida, Medicago officinalis, Medicago. sativa Alfalfa, Medicago tribuloides, Macadamia integrifolia, Medicago arabica, Melilotus albus, Millettia pinnata, Mucuna pruriens, Olea europaea, Onobrychis viciifolia, Ornithopus sativus, Phaseolus aureus, Prunus cerasifera, Prunus cerasus, Phaseolus coccineus, Prunus domestica, Phaseolus lunatus, Prunus. maheleb, Phaseolus mungo, Prunus. persica, Prunus. pseudocerasus, Phaseolus vulgaris, Papaver somniferum, Phaseolus acutifolius, Phoenix dactylifera, Pistacia vera, Pisum sativum, Prunus amygdalus, Prunus armeniaca, Pueraria thunbergiana, Ribes nigrum, Ribes rubrum, Ribes grossularia, Ricinus communis, Sesamum indicum, Solanum tuberosum, Trifolium augustifolium, Trifolium diffusum, Trifolium hybridum, Trifolium incarnatum, Trifolium ingrescens, Trifolium pratense, Trifolium repens, Trifolium resupinatum, Trifolium subterraneum, Theobroma cacao, Trifolium alexandrinum, Trigonella foenumgraecum, Vernicia fordii, Vicia angustifolia, Vicia atropurpurea, Vicia calcarata, Vicia dasycarpa, Vicia ervilia, Vaccinium oxycoccos, Vicia pannonica, Vigna sesquipedalis, Vigna sinensis, Vicia villosa, Vicia faba, Vicia sative и Vigna angularis.

Растения и части растений

В следующем аспекте изобретение относится к растению, которое имеет увеличенную биомассу корней в результате повышенной экспрессии белка PEAPOD или его фрагмента.

В одном варианте осуществления экспрессия белка PEAPOD или его фрагмента повышается вследствие трансформации растения, или его растения-предшественника или клетки растения-предшественника, полинуклеотидом, кодирующим белок PEAPOD или его фрагмент.

В следующем варианте осуществления растение является трансгенным по полинуклеотиду, экспрессирующему белок PEAPOD или его фрагмент.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид или его фрагмент представляет собой полинуклеотид, функционально связанный с тканепредпочтительным промотором.

В следующем варианте осуществления промотор является предпочтительным для корней промотором.

В следующем варианте осуществления промотор является специфическим для корней промотором.

В следующем варианте осуществления белок PEAPOD является таким, как определено в настоящем описании.

В следующем варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий белок PEAPOD, является таким, как определено в настоящем описании.

В следующем аспекте изобретение относится к клетке, части, сеянцу или потомству растения, которое является трансгенным по меньшей мере по одному из:

a) полинуклеотида, и

b) полинуклеотида и функционально связанного промотора.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем описании, когда упоминаются описания патентов, другие внешние документы или другие источники информации, это, как правило, предназначено для предоставления контекста обсуждения признаков изобретения. Если нет иных конкретных указаний, упоминание таких внешних документов не следует истолковывать как допущение того, что такие документы или такие источники информации, в любой юрисдикции, являются уровнем техники или формируют часть общей информации в данной области.

Термин "содержащий", как используют в настоящем описании, означает "по меньшей мере частично состоящий из". При интерпретации каждого утверждения в настоящем описании, который включает термин "содержащий", также могут присутствовать признаки, отличные от признаков, предшествующих термину. Родственные термины, такие как "содержать" и "содержат" следует интерпретировать аналогичным образом.

Увеличенная биомасса корней

Растение с "увеличенной биомассой корней" продуцирует больше биомассы, чем контрольное растение того же типа и возраста. Таким образом, "увеличенный" означает увеличенный относительно контрольного растения того же типа и возраста.

Предпочтительно растение с "увеличенной биомассой корней" продуцирует по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 100%, более предпочтительно по меньшей мере на 150%, более предпочтительно по меньшей мере на 200%, более предпочтительно по меньшей мере на 300%, более предпочтительно по меньшей мере на 400% больше биомассы корней, чем контрольное растение того же типа и возраста.

В одном варианте осуществления растение с "увеличенной биомассой корней" имеет по меньшей мере одно из: более крупных корней, большего количества корней или более мощной корневой системы, чем контрольное растение.

Биомасса корней

Термин "биомасса корней" относится к общей массе ткани корней, продуцируемой растением. Ее можно оценивать посредством сухой массы или влажной массы.

Корень

Термин "корень", как используют в рамках изобретения, означает то же, что и стандартно употребляемый термин. Термин "корень" охватывает первичный корень, вторичные корни, адвентивные корни, ветви корней и корневые волоски. Корни обычно находятся под землей, однако термин также охватывает воздушные корни. В одном варианте осуществления термин "корень" охватывает части растения, не несущие листьев и узлов.

Увеличенная толерантность к засухе

В одном варианте осуществления растение с "увеличенной биомассой корней" также имеет увеличенную толерантность к засухе. Вновь, "увеличенный" означает увеличенный относительно контрольного растения того же типа и возраста.

Термин "увеличенная толерантность к засухе" описывает растение или растения, которые демонстрируют более благоприятные качества в любом аспекте их роста и развития в субоптиальных условиях увлажнения, чем подходящие контрольные растения в тех же условиях.

Контрольное растение

В одном варианте осуществления контрольное растение представляет собой растение дикого типа. В следующем варианте осуществления контрольное растение представляет собой нетрансформированное растение. В следующем варианте осуществления контрольное растение представляет собой растение, не трансформированное полинуклеотидом PEAPOD. В следующем варианте осуществления контрольное растение представляет собой растение, не трансформированное конструкцией. В следующем варианте осуществления контрольное растение представляет собой растение, трансформированное контрольной конструкцией. В одном варианте осуществления конструкция представляет собой пустую векторную конструкцию.

Эктопическая экспрессия

Термин "эктопическая экспрессия" следует интерпретировать широко. Термин относится к экспрессии полинуклеотида или полипептида в любом из:

- клетки, органа, ткани или растения, в которых они обычно не экспрессируются,

- клетки, органа, ткани или растения в момент времени или на стадии развития, когда они обычно не экспрессируются, и

- клетки, органа, ткани или растения на уровне, превышающем уровень, в котором они обычно экспрессируются в этой клетке, органе, ткани или растении.

Тканепредпочтительные промоторы

В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие белок PEAPOD, экспрессируются под контролем тканепредпочтительных промоторов. Термин "предпочтительный" в отношении тканепредпочтительных промоторов означает, что промотор в основном запускает экспрессию в данной ткани. Таким образом, например, предпочтительный для корней промотор запускает более высокий уровень экспрессии функционально связанного полинуклеотида в ткани корней, чем в других тканях, или органах, или растении.

Предпочтительные для корней промоторы

Предпочтительный для корней промотор запускает более высокий уровень экспрессии функционально связанного полинуклеотида в ткани корней, чем в других тканях, или органах, или растении.

Предпочтительные для корней промоторы могут включать промоторы, предпочтительные для не фотосинтезирующих тканей, и репрессируемые светом регулируемые промоторы.

Промоторы, предпочтительные для не фотосинтезирующих тканей

Промоторы, предпочтительные для не фотосинтезирующих тканей, включают промоторы, предпочтительно экспрессируемые в не фотосинтезирующих тканях/органах растения.

Промоторы, предпочтительные для не фотосинтезирующих тканей, также могут включать репрессируемые светом промоторы.

Репрессируемые светом промоторы

Пример репрессируемого светом промотора находится в US 5639952 и в US 5656496.

Специфические для корней промоторы

Пример специфического для корней промотора находится в US 5837848; и US 2004/0067506 и US 2001/0047525.

Термин "предпочтительно экспрессируемый" в отношении промотора, предпочтительно экспрессируемого в определенной ткани, означает, что промотор экспрессируется на более высоком уровне в данной ткани, чем в других тканях растения.

Термин "тканеспецифический" в отношении промотора означает, что промотор экспрессируется по существу только в данной ткани, но не в других тканях растения.

В одном варианте осуществления предпочтительный для корней промотор представляет собой специфический для корней промотор.

Термин "ген", как используют в рамках изобретения, означает эндогенную геномную последовательность, которая включает кодирующую последовательность, которая кодирует полипептид или белок. Кодирующая последовательность может прерываться одним или несколькими интронами. Ген, как правило, также включает промоторную последовательность, 5'-нетранслируемую последовательность, 3'-нетранслируемую последовательность, и последовательность терминатора. Геномные последовательности, которые регулируют экспрессию белка, также можно считать частью гена.

Полинуклеотиды и фрагменты

Термин "полинуклеотид(ы)", как используют в рамках изобретения, означает одноцепочечный или двухцепочечный дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер любой длины, но предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидов, и он включает в качестве неограничивающих примеров кодирующие и некодирующие последовательности гена, смысловые и антисмысловые последовательности, комплементарные последовательности, экзоны, интроны, геномную ДНК, кДНК, пре-мРНК, мРНК, рРНК, миРНК, миРНК, тРНК, рибозимы, рекомбинантные полипептиды, выделенные и очищенные встречающиеся в природе последовательности ДНК или РНК, синтетические последовательности РНК и ДНК, зонды нуклеиновых кислот, праймеры и фрагменты.

"Фрагмент" полинуклеотида относится к непрерывной подпоследовательности более крупной полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно фрагмент имеет по меньшей мере 15 нуклеотидов предпочтительно по меньшей мере 16 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 17 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 21 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 22 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 23 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 24 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 26 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 27 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 28 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 29 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 31 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 32 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 33 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 34 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 35 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 36 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 37 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 38 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 39 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 40 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 41 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 42 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 43 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 44 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 45 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 46 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 47 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 48 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 49 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 51 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 52 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 53 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 54 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 55 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 56 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 57 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 58 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 59 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 60 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 61 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 62 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 63 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 64 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 65 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 66 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 67 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 68 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 69 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 70 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 71 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 72 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 73 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 74 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 75 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 76 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 77 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 78 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 79 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 80 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 81 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 82 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 83 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 84 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 85 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 86 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 87 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 88 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 89 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 90 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 91 нуклеотид, более предпочтительно по меньшей мере 92 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 93 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 94 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 95 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 96 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 97 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 98 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 99 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 150 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 250 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 300 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 350 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 400 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 450 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 500 нуклеотидов из непрерывных нуклеотидов описанного полинуклеотида. Фрагмент последовательности полинуклеотида можно использовать в антисмысловой технологии, РНК-интерференции (РНК-i), сайленсинге генов, трехспиральной или рибозимной технологии, или в качестве праймера, зонда, включенного в микрочип, или можно использовать в способах по изобретению для селекции на основе полинуклеотидов.

В одном варианте осуществления фрагмент кодирует полипептид, который выполняет или способен выполнять ту же функцию, что и полипептид, кодируемый более крупным полинуклеотидом, частью которого является фрагмент.

Термин "праймер" относится к короткому полинуклеотиду, обычно имеющему свободную группу 3'-OH, который гибридизуется или может гибридизоваться с матрицей и может использоваться в качестве затравки для полимеризации полинуклеотида, комплементарного мишени.

Термин "зонд" относится к короткому полинуклеотиду, который используют или может быть использован для обнаружения полинуклеотидной последовательности, которая комплементарна зонду, в анализе не основе гибридизации. Зонд может состоять из "фрагмента" полинуклеотида, как определено в настоящем описании.

Полипептиды и фрагменты

Термин "полипептид", как используют в рамках изобретения, охватывает цепи аминокислот любой длины, но предпочтительно по меньшей мере 5 аминокислот, включая полноразмерные белки, в которых аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями. Полипептиды по настоящему изобретению, или используемые в способах по изобретению, могут представлять собой очищенные природные продукты или их можно продуцировать частично или полностью с использованием рекомбинантных технологий или технологий синтеза. Термин может относиться к полипептиду, агрегату полипептидов, такому как димер или другой мультимер, слитый полипептид, фрагмент полипептида, вариант полипептида или их производное.

"Фрагмент" полинуклеотида относится к непрерывной подпоследовательности из более крупной полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно фрагмент имеет длину по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 40, более предпочтительно по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 150, более предпочтительно по меньшей мере 200, более предпочтительно по меньшей мере 250, более предпочтительно по меньшей мере 300, более предпочтительно по меньшей мере 350, более предпочтительно по меньшей мере 400.

В одном варианте осуществления фрагмент выполняет или способен выполнять ту же функцию, что и полипептид, частью которого фрагмент является.

Предпочтительно фрагмент выполняет функцию, которая требуется для биологической активности и/или обеспечивает трехмерную структуру полипептида.

Термин "выделенный", как используют в отношении полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, описанных в настоящем описании, относится к последовательностям, которые удалены из их естественной клеточной среды. В одном варианте осуществления последовательность отделена от фланкирующих ее последовательностей, встречающихся в природе. Выделенную молекулу можно получать любым способом или комбинацией способов, включая биохимические, рекомбинантные способы и способы синтеза.

Термин "рекомбинантный" относится к полинуклеотидной последовательность, которую синтетически продуцируют или извлекают из последовательностей, которые окружают ее в ее природном контексте. Рекомбинантная последовательность может быть рекомбинирована с последовательностями, которые не присутствуют в ее природном контексте.

"Рекомбинантная" полипептидная последовательность продуцируется путем трансляции "рекомбинантной" полинуклеотидной последовательности.

Термин "происходящий из" в отношении полинуклеотидов или полипептидов по изобретению, происходящих из конкретного рода или вида, означает, что полинуклеотид или полипептид имеет ту же последовательность, что и полинуклеотид или полипептид, встречающийся в природе в данном роде или виде. Таким образом, полинуклеотид или полипептид, происходящий из конкретного рода или вида, можно продуцировать способами синтеза или рекомбинантными способами.

Варианты

Как используют в рамках изобретения, термин "вариант" относится к полинуклеотидным или полипептидным последовательностям, отличающимся от конкретно идентифицированных последовательностей, где один или несколько нуклеотидных или аминокислотных остатков удалены, замещены или вставлены. Варианты могут представлять собой встречающиеся в природе аллельные варианты или не встречающиеся в природе варианты. Варианты могут происходить из того же или из другого вида, и они могут охватывать гомологи, паралоги и ортологи. В определенных вариантах осуществления, варианты полипептидов и полинуклеотидов, описанных в настоящем описании, обладают видами биологической активности, которые являются такими же или сходными с видами биологической активности описанных полипептидов или полинуклеотидов. Термин "вариант" в отношении полипептидов и полинуклеотидов охватывает все формы полипептидов и полинуклеотидов, как определено в настоящем описании.

Варианты полинуклеотидов

Варианты полинуклеотидных последовательностей предпочтительно демонстрируют по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 51%, более предпочтительно по меньшей мере 52%, более предпочтительно по меньшей мере 53%, более предпочтительно по меньшей мере 54%, более предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 56%, более предпочтительно по меньшей мере 57%, более предпочтительно по меньшей мере 58%, более предпочтительно по меньшей мере 59%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 61%, более предпочтительно по меньшей мере 62%, более предпочтительно по меньшей мере 63%, более предпочтительно по меньшей мере 64%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 66%, более предпочтительно по меньшей мере 67%, более предпочтительно по меньшей мере 68%, более предпочтительно по меньшей мере 69%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 71%, более предпочтительно по меньшей мере 72%, более предпочтительно по меньшей мере 73%, более предпочтительно по меньшей мере 74%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 76%, более предпочтительно по меньшей мере 77%, более предпочтительно по меньшей мере 78%, более предпочтительно по меньшей мере 79%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 81%, более предпочтительно по меньшей мере 82%, более предпочтительно по меньшей мере 83%, более предпочтительно по меньшей мере 84%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность с последовательностью по настоящему изобретению. Идентичность определяют на протяжении окна сравнения из по меньшей мере 20 нуклеотидных положений, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидных положений, более предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидных положений и наиболее предпочтительно на протяжении всей длины полинуклеотида по изобретению.

Идентичность полинуклеотидных последовательностей можно определять следующим образом. Рассматриваемую полинуклеотидную последовательность сравнивают с полинуклеотидной последовательностью-кандидатом с использованием BLASTN (из пакета программ BLAST, версия 2.2.5 [ноябрь 2002 года]), в bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), который является общедоступным от NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). В одном варианте осуществления используют параметры bl2seq по умолчанию. В следующем варианте осуществления используют параметры bl2seq по умолчанию, за исключением того, что фильтрация частей низкой комплексности должна быть выключена.

Идентичность полинуклеотидных последовательностей также можно вычислять по всей длине перекрывания между последовательностью-кандидатом и рассматриваемой полинуклеотидной последовательностью с использованием программ для глобального выравнивания последовательностей (например, Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Полное исполнение алгоритма глобального выравнивания Needleman-Wunsch может быть найдено в программе needle пакета EMBOSS (Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277), которая может быть найдена на http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/. Сервер European Bioinformatics Institute также обеспечивает возможность для выполнения глобального выравнивания EMBOSS-needle между двумя последовательностями через Интернет на http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/.

Альтернативно можно использовать программу GAP, которая проводит оптимальное глобальное выравнивание двух последовательностей без штрафа за концевые пропуски. GAP описана в следующей статье: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.

Предпочтительный способ вычисления % идентичности полинуклеотидных последовательностей основан на выравнивании сравниваемых последовательностей с использованием Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5).

Полинуклеотидные варианты по настоящему изобретению также охватывают варианты, которые демонстрируют сходство с одной или несколькими из конкретно идентифицированных последовательностей, которые, вероятно, сохраняют функциональную эквивалентность с этими последовательностями и от которых нельзя ожидать, что они появятся случайным образом. Такое сходство последовательностей в отношении полипептидов можно определять с использованием общедоступной программы bl2seq из пакета программ BLAST (версии 2.2.5 [Nov 2002]) от NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/).

Альтернативно варианты полинуклеотидов по настоящему изобретению гибридизуются с определенными полинуклеотидными последовательностями или комплементарными им последовательностями в жестких условиях.

Термин "гибридизуются в жестких условиях" и его грамматические эквиваленты относится к способности полинуклеотидной молекулы гибридизоваться с молекулой полинуклеотида-мишени (такой как молекула полинуклеотида-мишени, иммобилизованная на ДНК- или РНК-блоте, таком как саузерн-блот или нозерн-блот) в определенных условиях температуры и концентрации соли. Способность гибридизоваться в жестких условиях гибридизации можно определять посредством первоначальной гибридизации в менее жестких условиях, а затем повышения жесткости до желаемой жесткости.

Что касается полинуклеотидных молекул длиной более чем приблизительно 100 оснований, типичные жесткие условия гибридизации представляют собой условия, не более чем на 25-30°C (например, 10°C) ниже температуры плавления (Tm) нативного дуплекса (см., главным образом, Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing). Tm для полинуклеотидных молекул, имеющих размер более чем приблизительно 100 оснований, можно вычислять по формуле Tm=81,5+0,41%(G+C-log (Na+)). (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). Типичные жесткие условия для полинуклеотида длиной более 100 оснований представляют собой такие условия гибридизации, как предварительное промывание в растворе 6× SSC, 0,2% SDS; гибридизация при 65°C, 6× SSC, 0,2% SDS, в течение ночи; а затем два промывания по 30 минут в каждом случае в 1× SSC, 0,1% SDS, при 65°C и два промывания по 30 минут в каждом случае в 0,2X SSC, 0,1% SDS, при 65°C.

Что касается полинуклеотидных молекул, имеющих длину менее 100 оснований, иллюстративные жесткие условия гибридизации представляют собой условия на 5-10°C ниже Tm. В среднем, Tm полинуклеотидной молекулы длиной менее 100 п.н. снижают приблизительно на (500/длина олигонуклеотида)°C.

Что касается миметиков ДНК, известных как пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК) (Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6;254(5037):1497-500), их величины Tm являются более высокими, чем для гибридов ДНК-ДНК или ДНК-РНК, и их можно вычислять с использованием формулы, описанной в Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1; 26(21):5004-6. Иллюстративные жесткие условия гибридизации для гибрида ДНК-ПНК, имеющего длину менее 100 оснований, представляют собой условия на 5-10°C ниже Tm.

Варианты полинуклеотидов по настоящему изобретению также охватывают полинуклеотиды, которые отличаются от последовательностей по изобретению, но которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид, обладающий сходной активностью с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом по настоящему изобретению. Изменение последовательности, которое не изменяет аминокислотную последовательность полипептида, представляет собой "молчащее изменение". За исключением ATG (метионин) и TGG (триптофан), кодоны для одной и той же аминокислоты могут быть заменены общепринятыми способами, например, для оптимизации экспрессии кодонов в конкретном организме-хозяине.

Также изобретение включает изменения полинуклеотидной последовательности, которые приводят к консервативным заменам одной или нескольких аминокислот в кодируемой полипептидной последовательности без значительного изменения ее биологической активности. Квалифицированному специалисту известны способы получения фенотипически молчащих аминокислотных замен (см., например, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

Варианты полинуклеотидов вследствие молчащих изменений и консервативных замен в кодируемой полипептидной последовательности можно определять с использованием общедоступной программы bl2seq из пакета программ BLAST (версия 2.2.5 [ноябрь 2002 года]) от NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) через алгоритм tblastx, как описано ранее.

Варианты полипептидов

Термин "вариант" в отношении полипептидов охватывает встречающиеся в природе, продуцированные рекомбинантными способами и способами синтеза полипептиды. Варианты полипептидных последовательностей предпочтительно демонстрируют по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 51%, более предпочтительно по меньшей мере 52%, более предпочтительно по меньшей мере 53%, более предпочтительно по меньшей мере 54%, более предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 56%, более предпочтительно по меньшей мере 57%, более предпочтительно по меньшей мере 58%, более предпочтительно по меньшей мере 59%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 61%, более предпочтительно по меньшей мере 62%, более предпочтительно по меньшей мере 63%, более предпочтительно по меньшей мере 64%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 66%, более предпочтительно по меньшей мере 67%, более предпочтительно по меньшей мере 68%, более предпочтительно по меньшей мере 69%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 71%, более предпочтительно по меньшей мере 72%, более предпочтительно по меньшей мере 73%, более предпочтительно по меньшей мере 74%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 76%, более предпочтительно по меньшей мере 77%, более предпочтительно по меньшей мере 78%, более предпочтительно по меньшей мере 79%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 81%, более предпочтительно по меньшей мере 82%, более предпочтительно по меньшей мере 83%, более предпочтительно по меньшей мере 84%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность с последовательностями по настоящему изобретению. Идентичность определяют на протяжении окна сравнения по меньшей мере из 20 аминокислотных положений, предпочтительно по меньшей мере из 50 аминокислотных положений, более предпочтительно, по меньшей мере 100 аминокислотных положений и наиболее предпочтительно по всей длине полипептида по изобретению.

Идентичность полипептидных последовательностей можно определять следующим образом. Рассматриваемую полипептидную последовательность сравнивают с полипептидной последовательностью-кандидатом с использованием BLASTP (из пакета программ BLAST, версия 2.2.5 [ноябрь 2002 года]) в bl2seq, который является общедоступным от NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). В одном варианте осуществления используют параметры bl2seq по умолчанию. В следующем варианте осуществления, используют параметры bl2seq по умолчанию, за исключением того, что фильтрация частей низкой комплексности должна быть выключена.

Идентичность полипептидных последовательностей также можно вычислять по всей длине перекрывания между последовательностью-кандидатом и рассматриваемой полинуклеотидной последовательностью с использованием программ для глобального выравнивания последовательностей. EMBOSS-needle (доступная http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) и GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235), как рассмотрено выше, также являются подходящими программами для выравнивания последовательностей для вычисления идентичности полипептидных последовательностей.

Предпочтительный способ вычисления % идентичности полипептидных последовательностей основан на выравнивании последовательностей, подлежащих сравнению, с использованием Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5).

Вариант полипептида включает полипептид, в котором аминокислотная последовательность отличается от полипептида, описанного в настоящем описании, одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами, делециями, вставками или инсерциями, которые не влияют на биологическую активность пептида. Консервативные замены, как правило, включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками, например, замены в следующих группах: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.

Неконсервативные замены охватывают замену представителем одного из этих классов представителя другого класса.

Анализ эволюционировавших биологических последовательностей показал, что не все изменения последовательностей являются равновероятными, что отражает по меньшей мере частично отличия консервативных замен относительно неконсервативных замен на биологическом уровне. Например, определенные аминокислотные замены могут встречаться часто, в то время как другие являются очень редкими. Эволюционные изменения или замены аминокислотных остатков можно моделировать с помощью оценочной матрицы, также называемой матрицей замен. Такие матрицы используют в биоинформатическом анализе для идентификации взаимосвязи между последовательностями, одним из их примеров является матрица BLOSUM62, показанная ниже (таблица 1).

Таблица 1: Матрица BLOSUM62, содержащая все возможные показатели замен [Henikoff and Henikoff, 1992].

Представленную матрицу BLOSUM62 используют для получения показателя для каждой пары выровненных аминокислот, находящегося на пересечении соответствующего столбца и ряда. Например, показатель замены остатка глутаминовой кислоты (E) на остаток аспарагиновой кислоты (D) равен 2. По диагонали показаны показатели для аминокислот, которые не изменены. Большинство замен имеют отрицательный показатель. Матрица содержит только целые числа.

Полагают, что определение подходящей оценочной матрицы для осуществления наилучшего выравнивания для данного набора последовательностей входит в объем практических навыков в данной области. Матрицу BLOSUM62 в таблице 1 также используют в качестве матрицы по умолчанию в поиске BLAST, но не ограничиваясь этим.

Другие варианты включают пептиды с модификациями, которые влияют на стабильность пептидов. Такие аналоги могут содержать, например, одну или несколько непептидных связей (которые заменяют пептидные связи) в пептидной последовательности. Также включены аналоги, которые включают остатки, отличные от встречающихся в природе L-аминокислот, например D-аминокислоты или не встречающиеся в природе синтетические аминокислоты, например бета- или гамма-аминокислоты и циклические аналоги.

Конструкции, векторы и их компоненты

Термин "генетическая конструкция" относится к полинуклеотидной молекуле, обычно двухцепочечной ДНК, которая может быть встроена в другую полинуклеотидную молекулу (полинуклеотидная молекула-вставка), такую как, но не ограничиваясь ими, молекула кДНК. Генетическая конструкция может содержать необходимые элементы, которые позволяют транскрипцию полинуклеотидной молекулы-вставки, и, необязательно, трансляцию транскрипта в полипептид. Полинуклеотидная молекула-вставка может происходить из клетки-хозяина или может происходить из отличающейся клетки или организма, и/или она может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид. После попадания внутрь клетки-хозяина генетическая конструкция может встраиваться в хромосомную ДНК хозяина. Генетическая конструкция может быть связана с вектором.

Термин "вектор" относится к полинуклеотидной молекуле, обычно двухцепочечной ДНК, которую используют для транспортировки генетической конструкции в клетку-хозяина. Вектор может быть способен к репликации по меньшей мере в одной дополнительной системе-хозяине, такой как E. coli.

Термин "экспрессирующая конструкция" относится к генетической конструкции, которая включает необходимые элементы, которые позволяют транскрипцию полинуклеотидной молекулы-вставки и необязательно трансляцию транскрипта в полипептид. Экспрессирующая конструкция, как правило, содержит в направлении 5'-3':

a) промотор, функциональный в клетке-хозяине, в которую будет трансформирована конструкция,

b) полинуклеотид, подлежащий экспрессии, и

c) терминатор, функциональный в клетке-хозяине, в которую конструкция будет трансформирована.

Термин "кодирующая область" или "открытая рамка считывания" (ORF) относится к смысловой цепи последовательности геномной ДНК или последовательности кДНК, которая способна продуцировать продукт транскрипции и/или полипептид под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Кодирующую последовательность идентифицируют по наличию 5'-кодона инициации трансляции и 3'-стоп-кодона трансляции. При встраивании в генетическую конструкцию "кодирующая последовательность" способна экспрессироваться, когда она функционально связана с последовательностями промотора и терминатора.

"Функционально связанный" означает, что последовательность, подлежащая экспрессии, помещена под контроль регуляторных элементов, которые включают промоторы, тканеспецифические регуляторные элементы, временные регуляторные элементы, энхансеры, репрессоры и терминаторы.

Термин "некодирующая область" относится к нетранслируемым последовательностям, находящимся выше участка начала трансляции и ниже участка остановки трансляции. Эти последовательности также обозначают, соответственно, как 5'-UTR и 3'-UTR. Эти области включают элементы, требуемые для инициации и терминации транскрипции и для регуляции эффективности трансляции.

Терминаторы представляют собой последовательности, которые терминируют транскрипцию и находятся на 3'-нетранслируемых концах генов ниже транслируемой последовательности. Терминаторы являются важными определяющими факторами стабильности мРНК и обнаружено, что в некоторых случаях они имеют пространственные регуляторные функции.

Термин "промотор" относится к нетранскрибируемым цис-регуляторным элементам выше кодирующей области, которые регулируют транскрипцию гена. Промоторы включают цис-инициирующие элементы, которые определяют участок инициации транскрипции, и консервативные боксы, такие как TATA-бокс, и мотивы, которые связываются факторами транскрипции.

Промотор может быть гомологичным в отношении экспрессируемого полинуклеотида. Это означает, что промотор и полинуклеотид встречаются в природе функционально связанными.

Альтернативно промотор может быть гетерологичным в отношении экспрессируемого полинуклеотида. Это означает, что промотор и полинуклеотид не встречаются в природе функционально связанными.

"Трансген" представляет собой полинуклеотид, который вводят в организм посредством трансформации. Трансген может происходить из того же вида, что и организм, в который вводят трансген, или из отличающегося вида. Трансген также может быть синтетическим и не встречающимся в природе ни в одном виде.

"Трансгенное растение" относится к растению, которое содержит новый генетический материал в результате генетического манипулирования или трансформации. Новый генетический материал может происходить из растения того же вида, что и конечное трансгенное растение, или из отличающегося вида, или он может быть синтетическим.

Предпочтительно "трансгенное растение" отличается от любого растения, встречающегося в природе, вследствие присутствия трансгена.

"Инвертированный повтор" представляет собой последовательность, которая является повторяющейся, где вторая половина повтора находится на комплементарной цепи, например,

(5')GATCTA…….TAGATC(3')

(3')CTAGAT…….ATCTAG(5')

Считывающая транскрипция приведет к транскрипту, который претерпевает комплементарное спаривание оснований с формированием шпилечной структуры при условии, что существует спейсер размером 3-5 п.н. между повторяющимися областями. Спейсер может представлять собой любую полинуклеотидную последовательность, однако, как правило, он имеет длину по меньшей мере 3 пары оснований.

Клетки-хозяева

Клетки-хозяева могут происходить, например, из организмов бактерий, грибов, насекомых, млекопитающих или растений.

Способы выделения или продуцирования полинуклеотидов

Молекулы полинуклеотидов по изобретению можно выделять с использованием различных способов, известных средним специалистам в данной области. В качестве примера, такие полипептиды можно выделять с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) описанной в Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Полипептиды по изобретению можно амплифицировать с использованием праймеров, как определено в настоящем описании, происходящих из полинуклеотидных последовательностей по изобретению.

Кроме того, способы выделения полинуклеотидов по изобретению включают применение целых полипептидов, имеющих последовательность, указанную в настоящем описании, или их частей в качестве зондов для гибридизации. Способ гибридизации меченных полинуклеотидных зондов с полинуклеотидами, иммобилизованными на твердых подложках, таких как нитроцеллюлозные фильтры или нейлоновые мембраны, можно использовать для скрининга геномных библиотек или библиотек кДНК. Иллюстративные условия гибридизации и промывания представляют собой: гибридизацию в течение 20 часов при 65°C в 5,0× SSC, 0,5% додецилсульфате натрия, 1x растворе Денхардта; промывание (три промывания по двадцать минут каждое при 55°C) в 1,0× SSC, 1% (масс./об.) додецилсульфате натрия, и необязательно одно промывание (в течение двадцати минут) в 0,5× SSC, 1% (масс./об.) додецилсульфате натрия, при 60°C. Можно проводить необязательное дополнительное промывание (в течение двадцати минут) в условиях 0,1× SSC, 1% (масс./об.) додецилсульфата натрия при 60°C.

Полинуклеотидные фрагменты по изобретению можно получать способами, хорошо известными в данной области, такими как расщепление эндонуклеазой рестрикции, олигонуклеотидный синтез и амплификация способом ПЦР.

Частичную полинуклеотидную последовательность можно использовать в способах, хорошо известных в данной области, для идентификации соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательности. Такие способы включают способы на основе ПЦР, 5'RACE (Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218: 340-56) и способ на основе гибридизации, компьютерные способы/способы на основе баз данных. Кроме того, в качестве примера, инвертированная ПЦР позволяет получение неизвестных последовательностей, фланкирующих полинуклеотидные последовательности, описанные в настоящем описании, начиная с праймеров, основанных на известной области (Triglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186, включенная в настоящее описание в качестве ссылки). В способе используется несколько ферментов рестрикции для получения подходящего фрагмента в известной области гена. Затем фрагмент замыкают посредством внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР. На основе известной области конструируют расходящиеся праймеры. Для физической сборки полноразмерных клонов можно использовать стандартные подходы молекулярной биологии (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987).

При получении трансгенного растения из конкретного вида может быть полезной трансформация такого растения последовательностью или последовательностями, происходящими из этого вида. Польза может состоять в уменьшении обеспокоенности общества в отношении перекрестно-видовой трансформации при получении трансгенных организмов. Кроме того, когда является желательным подавление гена, может быть необходимым использование последовательности, идентичной (или по меньшей мере в высокой степени сходной) последовательности в растении, для которого является желательной сниженная экспрессия. По этим причинам, среди прочего, является желательной возможность идентифицировать и выделить ортологи конкретного гена в нескольких различных видах растений.

Варианты (включая ортологи) можно идентифицировать описанными способами.

Способы идентификации вариантов

Физические способы

Варианты полипептидов можно идентифицировать с использованием способов на основе ПЦР (Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser). Как правило, полинуклеотидная последовательность праймера, пригодного для амплификации вариантов полинуклеотидных молекул по изобретению способом ПЦР, может быть основана на последовательности, кодирующей консервативную область соответствующей аминокислотной последовательности.

Альтернативно можно использовать способы скрининга библиотек, хорошо известные специалистам в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987). При идентификации вариантов последовательности зонда, жесткость гибридизации и/или промывания, как правило, являются сниженными относительно случая, когда ищут точно совпадающие последовательности.

Полипептидные варианты также можно идентифицировать физическими способами, например, посредством скрининга экспрессирующих библиотек с использованием антител, индуцированных против полипептидов по изобретению (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987), или посредством идентификации полипептидов из природных источников с помощью таких антител.

Компьютерные способы

Варианты последовательностей по изобретению, включая как полинуклеотидные, так и полипептидные, варианты также можно идентифицировать компьютерными способами, хорошо известными специалистам в данной области, с использованием общедоступных алгоритмов выравнивания последовательностей и инструментов поиска сходства последовательностей для поиска в базах данных последовательностей (общедоступные базы данных включают Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR и прочие). См., например, Nucleic Acids Res. 29: 1-10 и 11-16, 2001 для примера Интернет-источников. Поиск сходства извлекает и выравнивает целевые последовательности для сравнения с последовательностью, подлежащей анализу (т.е. последовательностью запроса). Алогоритмы сравнения последовательности используют оценочные матрицы для присвоения итогового показателя каждому из выравниваний.

Иллюстративным семейством программ, пригодных для идентификации вариантов в базах данных последовательностей является пакет программ BLAST (версия 2.2.5 [ноябрь 2002 года]), включая BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN и tBLASTX, который являются общедоступным от (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) или от National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894 USA. Сервер NCBI также обеспечивает возможность использовать программы для скрининга ряда общедоступных баз данных последовательностей. BLASTN сравнивает нуклеотидную последовательность запроса против базы данных нуклеотидных последовательностей. BLASTP сравнивает аминокислотную последовательность запроса против базы данных белковых последовательностей. BLASTX сравнивает нуклеотидную последовательность запроса, транслируемую во всех рамках считывания, против базы данных белковых последовательностей. tBLASTN сравнивает белковую последовательность запроса против базы данных нуклеотидных последовательностей, динамично транслируемых во всех рамках считывания. tBLASTX сравнивает нуклеотидную последовательность запроса в шести рамках считывания против базы данных нуклеотидных последовательностей в шести рамках считывания. Программы BLAST можно использовать с параметрами по умолчанию или параметры можно изменять при необходимости для оптимизации скрининга.

Использование семейства алгоритмов BLAST, включая BLASTN, BLASTP и BLASTX, описано в публикации Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.

"Совпадения" с одной или несколькими последовательностями базы данных с последовательностью запроса, выявленные с помощью BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX или сходного алгоритма, обеспечивают выравнивание и идентификацию сходных частей последовательностей. Совпадения ранжируют в порядке степени сходства и длины перекрывания последовательностей. Совпадения с последовательностью базы данных обычно отражают перекрывание на протяжении только части длины последовательности запроса.

Алгоритмы BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN и tBLASTX также выдают величины "ожидания" для выравниваний. Величина ожидания (E) указывает на количество совпадений, которые можно "ожидать" случайным образом при поиске в базе данных того же размера, содержащей случайные непрерывные последовательности. Величину ожидания используют в качестве порога значимости для определения того, указывает ли совпадение с базой данных на истинное сходство. Например, величину E 0,1, присвоенную полинуклеотидному совпадению, интерпретируют как то, что в базе данных, имеющей размер подвергаемой скринингу базы данных, можно ожидать 0,1 соответствий на протяжении выровненной части последовательности со сходным показателем просто случайно. Для последовательностей, имеющих величину E 0,01 или менее на протяжении выровненных и приведенных в соответствие частей, вероятность нахождения соответствия случайным образом в этой базе данных составляет 1% или менее при использовании алгоритма BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN или tBLASTX.

Множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей можно проводить с помощью CLUSTALW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html) или T-COFFEE (Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: 205-217)) или PILEUP, который использует прогрессирующие попарные выравнивания (Feng and Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, 351).

Доступны паттерн-распознающие программные приложения для поиска мотивов или последовательностей сигнатур. Например, MEME (Multiple Em for Motif Elicitation) находит мотивы и последовательности сигнатур в наборе последовательностей и MAST (Motif Alignment and Search Tool) использует эти мотивы для идентификации сходных или одинаковых мотивов в последовательностях запроса. Результаты MAST предоставляют в качестве серии выравниваний с соответствующими статистическими данными и визуальным обзором найденных мотивов. MEME и MAST были разработаны в University of California, San Diego.

PROSITE (Bairoch and Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, 215) представляет собой способ идентификации функций неохарактеризованных белков, транслированных с геномных последовательностей или последовательностей кДНК. База данных PROSITE (www.expasy.org/prosite) содержит биологически значимые паттерны и профили и организована так, что ее можно использовать с соответствующими вычислительными инструментами для отнесения новой последовательности к известному семейству белков или для определения того, какой известный домен(ы) присутствует в последовательности (Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235). Prosearch представляет собой инструмент, который может осуществлять поиск в базах данных SWISS-PROT и EMBL с использованием данного паттерна или сигнатуры последовательности.

Способы выделения полипептидов

Полипептиды по изобретению или используемые в способах по изобретению, включая варианты полипептидов, можно получать с использованием способов синтеза пептидов, хорошо известных в данной области, таких как прямой синтез пептидов с использованием твердофазных способов (например Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California) или автоматизированного синтеза, например с использованием Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California). Также в процессе такого синтеза можно получать мутантные формы полипептидов.

Полипептиды и варианты полипептидов по изобретению или используемые в способах по изобретению также можно очищать из природных источников с использованием различных способов, которые хорошо известны в данной области (например, Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification).

Альтернативно полипептиды и варианты полипептидов по изобретению или используемые в способах по изобретению можно экспрессировать рекомбинантными способами в подходящих клетках-хозяевах и отделять от клеток, как описано ниже.

Способы получения конструкций и векторов

Генетические конструкции по настоящему изобретению содержит одну или несколько полинуклеотидных последовательностей по изобретению и/или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды по изобретению, и они могут быть пригодными для трансформации, например, организмов бактерий, грибов, насекомых, млекопитающих или растений. Генетические конструкции по изобретению включают экспрессирующие конструкции, как определено в настоящем описании.

Способы получения и применения генетических конструкций и векторов хорошо известны в данной области и описаны, главным образом, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987).

Способы получения клеток-хозяев, содержащих полинуклеотиды, конструкции или векторы

Изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит генетическую конструкцию или вектор по изобретению.

Клетки-хозяева, содержащие генетические конструкции, такие как экспрессирующие конструкции, по изобретению являются пригодными в способах, хорошо известных в данной области (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987) для рекомбинантной продукции полипептидов по изобретению. Такие способы могут вовлекать культивирование клеток-хозяев в подходящей среде в условиях, подходящих для или способствующих экспрессии полипептида по изобретению. Затем экспрессированный рекомбинантный полипептид, который может необязательно секретироваться в культуру, можно отделять от среды, клеток-хозяев или культуральной среды способами, хорошо известными в данной области (например, Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology, Vol 182, Guide to Protein Purification).

Способы получения клеток растений и растений, содержащих конструкции и векторы

Кроме того, изобретение относится к клеткам растений, которые содержат генетическую конструкцию по изобретению, и к клеткам растений, модифицированным для изменения экспрессии полинуклеотида или полипептида по изобретению или используемых в способах по изобретению. Растения, содержащие такие клетки, также являются аспектом изобретения.

Способы трансформации клеток растений, растений и их частей полипептидами описаны в Draper et al., 1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual. Blackwell Sci. Pub. Oxford, p. 365; Potrykus and Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.; и Gelvin et al., 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht. Обзор трансгенных растений, включая способы трансформации, предоставлен в Galun and Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London.

Способы генетического манипулирования растениями

Доступен ряд стратегий трансформации растений (например, Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297, Hellens RP, et al (2000) Plant Mol Biol 42: 819-32, Hellens R et al Plant Meth 1: 13). Например, стратегии можно разрабатывать для увеличения экспрессии полинуклеотида/полипептида в клетке растения, органе и/или на конкретной стадии развития где/когда он обычно экспрессируется, или для эктопической экспрессии полинуклеотида/полипептида в клетке, ткани, органе и/или на конкретной стадии развития, в которых/когда он в норме не экспрессируется. Экспрессируемый полинуклеотид/полипептид может происходить из вида растений, подлежащего трансформации, или он может происходить из отличающегося вида растений.

Генетические конструкции для экспрессии генов в трансгенных растениях обычно включают промоторы для запуска экспрессии одного или нескольких клонированных полинуклеотидов, терминаторы и последовательности селективных маркеров для обнаружения присутствия генетической конструкции в трансформированном растении.

Промоторы, пригодные для применения в генетических конструкциях, могут быть функциональными в клетке, ткани или органе однодольного или двудольного растения, и включают промоторы, специфические для клетки, ткани и органа, промоторы, специфические для клеточного цикла, временные промоторы, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы, которые являются активными в большинстве тканей растений, и рекомбинантные промоторы. Выбор промотора зависит от желаемой временной и пространственной экспрессии клонированного полинуклеотида. Промоторы могут представлять собой промоторы, обычно ассоциированные с представляющим интерес трансгеном, или промоторы, которые происходят из генов других растений, вирусов и патогенных для растений бактерий и грибов. Специалисты в данной области будут способны без излишнего экспериментирования выбрать промоторы, которые являются пригодными для применения для модификации и модулирования признаков растений с использованием генетических конструкций, содержащих полинуклеотидные последовательности по изобретению. Примеры конститутивных промоторов растений включают промотор CaMV 35S, промотор нопалинсинтазы и промотор октопинсинтазы и промотор Ubi 1 из кукурузы. Промоторы растений, которые являются активными в конкретных тканях, отвечают на внутренние сигналы развития или внешние абиотические или биотические стрессовые факторы, описаны в научной литературе. Иллюстративные промоторы описаны, например, в WO 02/00894, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Иллюстративные терминаторы, часто используемые в генетической конструкции для трансформации растений, включают, например, терминатор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, терминаторы нопалинсинтазы или октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, терминатор гена зеина Zea mays, терминатор пирофосфорилазы ADP-глюкозы Oryza sativa терминатор PI-II Solanum tuberosum.

Селективные маркеры, часто используемые для трансформации растений, включают ген неомицинфосфотрансферазы II (NPT II), который сообщает устойчивость к канамицину, ген aadA, который сообщает устойчивость к спектиномицину и стрептомицину, ген фосфинотрицинацетилтрансферазы (ген bar) для устойчивости к Ignite (AgrEvo) и Basta (Hoechst), и ген гигромицинфосфотрансферазы (hpt) для устойчивости к гигромицину.

Также предусматривается применение генетических конструкций, содержащих репортерные гены (кодирующие последовательности, которые проявляют активность, являющуюся чужеродной для хозяина, обычно ферментативную активность и/или видимый сигнал (например, люцифераза, GUS, GFP), которые можно использовать для анализа экспрессии с промотора в растениях и тканях растений. Репортерные гены рассмотрены в Herrera-Estrella et al., 1993, Nature 303, 209, и Schrott, 1995, Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336.

Сайленсинг генов

Стратегии трансформации могут быть предназначены для снижения экспрессии полинуклеотида/полипептида в клетке, ткани, органе растения или на конкретной стадии развития, в которых/когда они обычно экспрессируются. Такие стратегии известны как стратегии сайленсинга генов.

Стратегии сайленсинга генов могут быть сфокусированы на самом гене или на регуляторных элементах, которые обеспечивают экспрессию кодируемого полипептида. "Регуляторные элементы" используют в настоящем описании в наиболее широком возможном значении, и они включают другие гены, которые взаимодействуют с представляющим интерес геном.

Генетические конструкции, сконструированные для снижения или сайленсинга экспрессии полинуклеотида/полипептида по изобретению, могут включать антисмысловую копию полинуклеотида по изобретению. В таких конструкциях полинуклеотид помещают в антисмысловой ориентации в отношении промотора и терминатора.

"Антисмысловой" полинуклеотид получают путем инвертирования полинуклеотида или сегмента полинуклеотида таким образом, чтобы продуцируемый транскрипт был комплементарен мРНК-транскрипту гена, например,

Генетические конструкции, сконструированные для сайленсинга генов, также могут включать инвертированный повтор. "Инвертированный повтор" представляет собой последовательность, которая повторяется, где вторая половина повтора находится на комплементарной цепи, например,

5'-GATCTA………TAGATC-3'

3'-CTAGAT………ATCTAG-5'

Образованный транскрипт может претерпевать образование комплементарных пар оснований с формированием шпилечной структуры. Обычно для возможности образования шпильки требуется спейсер размером по меньшей мере 3-5 п.н. между повторяющимися областями. Конструкции, включающие такие последовательности инвертированных повторов, можно использовать в РНК-интерференции (РНК-i) и, таким образом, они могут упоминаться как конструкции РНК-i.

Другой подход сайленсинга вовлекает применение малой антисмысловой РНК, нацеленной на транскрипт, эквивалентный миРНК (Llave et al., 2002, Science 297, 2053). Применение такой малой антисмысловой РНК, соответствующей полинуклеотиду по изобретению, прямо предусматривается.

Термин "генетическая" конструкция, как используют в рамках изобретения, также включает малые антисмысловые РНК и другие такие полипептиды, обеспечивающие сайленсинг генов.

Трансформация экспрессирующей конструкцией, как определено в настоящем описании, также может приводить к сайленсингу генов посредством процесса, известного как смысловое подавление (например, Napoli et al., 1990, Plant Cell 2, 279; de Carvalho Niebel et al., 1995, Plant Cell, 7, 347). В некоторых случаях смысловое подавление может вовлекать сверхэкспрессию целой или частичной кодирующей последовательности, но также может вовлекать экспрессию некодирующей области гена, такой как интрон или 5'- или 3'-нетранслируемая область (UTR). Химерные частичные смысловые конструкции можно использовать для координационного сайленсинга множества генов (Abbott et al., 2002, Plant Physiol. 128(3): 844-53; Jones et al., 1998, Planta 204: 499-505). Использование таких стратегий смыслового подавления для сайленсинга экспрессии полинуклеотида по изобретению также предусматривается.

Полинуклеотидные вставки в генетических конструкциях, предназначенных для сайленсинга генов, могут соответствовать кодирующей последовательности и/или некодирующей последовательности, такой как промотор, и/или интрон, и/или последовательность 5'- или 3'-UTR, соответствующего гена.

Другие стратегии сайленсинга генов включают доминантно-негативные подходы и использование конструкций рибозимов (McIntyre, 1996, Transgenic Res, 5, 257).

Претранскрипционный сайленсинг может быть достигнут посредством мутации самого гена или его регуляторных элементов. Такие мутации могут включать точковые мутации, сдвиг рамки считывания, инсерции, делеции и замены.

Протоколы трансформации

Ниже представлены репрезентативные публикации, в которых описаны протоколы генетической трансформации, которые можно использовать для генетической трансформации следующих видов растений: рис (Alam et al., 1999, Plant Cell Rep. 18, 572); яблоня (Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412); кукуруза (патенты США с серийными номерами № 5177010 и 5981840); пшеница (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877); томат (патент США с серийным номером № 5159135); картофель (Kumar et al., 1996 Plant J. 9: 821); маниока (Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736); салат-латук (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439); табак (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229); хлопок (патенты США с серийными номерами № 5846797 и 5004863); травы (патенты США № 5187073 и 6020539); мята перечная (Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, 165); цитрусовые растения (Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183); тмин (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39); банан (патент США с серийным номером № 5792935); соя (патенты США № 5416011; 5569834; 5824877; 556304455 и 5968830); ананас (патент США с серийным номером № 5952543); тополь (патент США № 4795855); однодольные растения в целом (патенты США № 5591616 и 6037522); капуста декоративная (патенты США № 5188958; 5463174 и 5750871); зерновые (патент США № 6074877); груша (Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51); слива (Ramesh et al., 2006 Plant Cell Rep. 25(8):821-8; Song and Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006; 25(2): 117-23; Gonzalez Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep.22(1): 38-45); клубника (Oosumi et al., 2006 Planta. 223(6): 1219-30; Folta et al., 2006 Planta Apr 14; PMID: 16614818), роза (Li et al., 2003), рубус (Graham et al., 1995 Methods Mol Biol. 1995; 44: 129-33), томат (Dan et al., 2006, Plant Cell Reports V25: 432-441), яблоня (Yao et al., 1995, Plant Cell Rep. 14, 407-412) и Actinidia eriantha (Wang et al., 2006, Plant Cell Rep. 25.5: 425-31), белая береза (Keinonen-Mettala et al., 1998, Plant Cell Rep. 17: 356-361) и осина (Nilsson O, et al., 1992, Transgenic Research. 1: 209-220). Также изобретение предусматривает трансформацию других видов. Подходящие способы и протоколы доступны в научной литературе.

Для изменения выраженности активности нуклеотида и/или полипептида по изобретению можно использовать несколько других способов, известных в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, Tilling (Till et al., 2003, Methods Mol Biol, 2%, 205), так называемую технологию "Deletagene" (Li et al., 2001, Plant Journal 27(3), 235) и использование искусственных факторов транскрипции, таких как синтетические факторы транскрипции с цинковыми пальцами (например, Jouvenot et al., 2003, Gene Therapy 10, 513). Кроме того, также для модулирования активности этого полипептида в растениях можно экспрессировать антитела или их фрагменты, нацеленные на конкретный полипептид, (Jobling et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21(1), 35). Также можно использовать подходы маркирования транспозонов. Кроме того, пептиды, взаимодействующие с полипептидом по изобретению, можно идентифицировать способами, такими как фаговый дисплей (Dyax Corporation). Такие взаимодействующие пептиды можно экспрессировать в или наносить на растение для достижения активности полипептида по изобретению. Применение каждого из описанных выше подходов для изменения экспрессии нуклеотида и/или полипептида по изобретению прямо предусматривается.

Термины "для изменения экспрессии" и "измененная экспрессия" полинуклеотида или полипептида по изобретению или используемые в способах по изобретению, охватывают ситуацию, где геномная ДНК, соответствующая полинуклеотиду по изобретению, модифицирована таким образом, чтобы обеспечить измененную экспрессию полинуклеотида или полипептида по изобретению. Модификация геномной ДНК может быть осуществлена посредством генетической трансформации или других способов, известных в данной области, для индукции мутаций. "Измененная экспрессия" может относиться к увеличению или снижению количества матричной РНК и/или продуцируемого полипептида, а также может приводить к измененной активности полипептида вследствие изменений последовательности продуцируемого полинуклеотида и полипептида.

Способы селекции растений

Также предусматриваются способы селекции растений с увеличенной биомассой корней. Такие способы вовлекают исследование растений в отношении измененной экспрессии по меньшей мере одного полинуклеотида или полипептида PEAPOD, включая полинуклотиды или полипептиды, как определено или описано в настоящем описании. Такие способы можно использовать в раннем возрасте или на ранней стадии развития, когда характеристики увеличенной биомассы корней не обязательно могут быть легко поддающимися измерению.

Экспрессию полинуклеотида, такого как матричная РНК, часто используют в качестве индикатора экспрессии соответствующего полинуклеотида. Иллюстративные способы измерения экспрессии полинуклеотида включают, но не ограничиваются ими, нозерн-анализ, ОТ-ПЦР и дот-блоттинг (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987). Таким образом, полинуклеотиды или части полинуклеотидов по изобретению являются пригодными в качестве зондов или праймеров, как определено в настоящем описании, в способах идентификации растений с увеличенной биомассой корней. Полинуклеотиды по изобретению или описанные в настоящем описании можно использовать в качестве зондов в экспериментах по гибридизации или в качестве праймеров в экспериментах на основе ПЦР, сконструированных для идентификации таких растений.

Альтернативно антитела можно индуцировать против полипептидов PEAPOD, как описано или раскрыто в настоящем описании. Способы индукции и применения антител являются стандартными в данной области (см., например: Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow A Lane, Eds, Cold Spring Harbour Laboratory, 1998). Такие антитела можно использовать в способах обнаружения измененной экспрессии таких полипептидов. Такие способы могут включать ELISA (Kemeny, 1991, A Practical Guide to ELISA, NY Pergamon Press) и вестерн-анализ (Towbin & Gordon, 1994, J Immunol Methods, 72, 313).

Эти подходы к анализу экспрессии полинуклеотидов или полипептидов и селекции растений с увеличенной биомассой корней являются пригодными в общепринятых программах разведения, предназначенных для получения сортов с такими измененными характеристиками.

Растения

Термин "растение" включает целое растение, любую часть растения, сеянцы и потомство растения.

Термин "сеянец" означает любую часть растения, которую можно использовать для воспроизведения или размножения, либо полового, либо бесполого, включая семена и черенки.

Растения по изобретению можно выращивать и либо подвергать самоопылению, либо скрещивать с другой линией растений, и можно идентифицировать полученные гибриды с желаемыми фенотипическими характеристиками. Можно выращивать два или более поколений, чтобы убедиться, что рассматриваемые фенотипические характеристики стабильно поддерживаются и наследуются. Растения, являющиеся результатом таких стандартных подходов к разведению, также составляют аспект настоящего изобретения.

Контроль роста и развития растений гиббереллинами (GA), брассиностероидами (BR) и другими гормонами растений

Гиббереллины (GA) и брассиностероиды (BR) представляют собой два класса гормонов растений; они вовлечены во многие аспекты морфогенеза и роста растений, включая: прорастание семян, удлинение клеток, развитие сосудов, размер семян, спрямленность листьев, цветение, старение листьев и плодов (Mathew et al 2009, NZJAR 52, 213-225; Hou et al 2010, Developmental Cell 19, 884-894; Jiang and Lin 2013, Plant Signaling and Behaviour 8:10, e25928).

Учитывая их роль в развитии растений, способность манипулировать уровнями либо GA, либо BR, или их нижеследующими мишенями является высокожелательной с точки зрения повышения как выхода, так и качества, во многих видах растений. Действительно существуют некоторые коммерческие примеры, когда экзогенные применения любого из этих гормонов используют для повышения агрономической ценности.

GA можно применять на пастбищах ржи для стимуляции несезонного роста, а также для ускорения цветения (Mathew et al 2009, NZJAR 52, 213-225), также ее можно использовать для противодействия неблагоприятным эффектам более холодных температур на сахарный тростник (тропическая трава C4). GA также используют для увеличения размера плодов бессемянного винограда и вишни, для стимуляции завязывания плода яблони и груши и для замедления старения кожуры конкретных цитрусовых культур (Sun 2011, Current Biology 21, R338-R345). Аналогично, препараты BR рекомендуют для повышения выхода культуры и улучшения качества томата, картофеля, огурца, перца и ячменя, риса, кукурузы, пшеницы, хлопка и табака (Prusakova et al 1999, Agrarian Russia, 41-44; Khripach et al 2000, Annals of Botany 86, 441-447; Anjum et al 2011, J. Agronomy Crop Sci. 197, 177-185; Vardhini 2012, J. Phytology 4, 1-3). Однако невысокое внедрение коммерчески применяемых брассиностероидов может отражать стоимость и тот факт, что растения не абсорбируют стероиды эффективно, когда их применяют экзогенно. Кроме того, необходимость жестко контролировать время и концентрацию экзогенно предоставляемых GA и BR ограничивает их применение.

По большей части биосинтез GA и BR и катаболитческие каскады покрытосеменных растений были охарактеризованы и включают отрицательные регуляторы и нижерасположенные мишени факторов транскрипции. При связывании GA или BR с их соответствующим рецептором возникает комплексный сигнальный каскад и в обоих случаях центральная точка регуляции вовлекает каскад убиквитин-протеасома, изменяющий уровень негативного регулятора DELLA (в случае GA) и регулятора транскрипции BZR1 (в случае BR).

Удаление белков DELLA приводит к устранению репрессии роста и стимуляции отвечающего на GA роста и развития. Напротив, обнаружение BR приводит к накоплению нефосфорилированного белка BZR1 в ядре. Дефосфорилирование BZR1 препятствует его деградации протеасомой и вместо этого позволяет связывание BZR1 с другими ДНК-связывающими факторами транскрипции и взаимодействие с кофакторами транскрипции. Это приводит к регуляции тысяч генов, вовлеченных в рост и другие клеточные процессы, включая ингибирование экспрессии генов биосинтеза BR (He et al 2005, Science 307, 1634-1638; Guo et al 2013, Current Opinion Plant Biol. 16, 545-553).

Существует ряд эндогенных сигналов и внешних стимулов, которые влияют на регуляторный модуль GA-GID1-DELLA, в котором DELLA интегрирует различные сигнальные виды активности посредством прямого белок-белкового взаимодействия с множеством ключевых регуляторных белков из других каскадов. По существу белки DELLA являются ведущими репрессорами роста, которые контролируют рост и развитие растений посредством встраивания внутренних сигналов из каскадов других гормонов (ауксин, абсцизовая кислота, жасмоновая кислота и этилен) и внешних биотических (патоген) и абиотических (условия освещения, холодовые и солевые стрессовые факторы) факторов (Sun 2011, Current Biology 21, R338-R345). Засуха является одним из наиболее важных средовых ограничений роста растений и сельскохозяйственной продуктивности. Неожиданно существует положительная корреляция между увеличенной толерантностью к засухе и более мощной корневой системой, включающей более глубокие корни и более латеральные корни, оба из которых обеспечивают освоение почвы и получение подземных ресурсов (Yu et al 2008, Plant Cell 20, 1134-1151; Werner et al 2010, Plant Cell 22, 3905-3920). Таким образом следует, что обычной сельскохозяйственной целью является оптимизация архитектуры корневой системы, чтобы помочь преодолеть ограничения урожая сельскохозяйственных растений, вызванные нехваткой воды или питательных веществ. Однако из всех абиотических стрессовых факторов, которые уменьшают продуктивность культуры, засуха является наиболее разрушительным и наиболее неподатливым усилиям селекционеров. Классические подходы разведения являются трудными, поскольку этот признак управляется многими генами и его трудно оценить (Werner et al 2010, Plant Cell 22, 3905-3920). В то время как селекция с помощью маркеров (MAS), локусы количественных признаков (QTL) и другие геномные подходы широко используют для облегчения усилий по разведению для получения устойчивых к засухе сортов (Tuberosa and Salvi, 2006, Trends in Plant Science, 11:405-412), система ограничена варьированием, присутствующим в подвергаемой скринингу популяции.

Интересно, что рис имеет только один белок DELLA (SLR1), кукуруза имеет два (d8 и d9) (Lawit et al 2010, Plant Cell Physiol 51, 1854-1868), в то время как арабидопсис имеет пять (GA1, RGA, RGL1, RGL2 и RGL3) (Achard and Genschik 2009, J. Exp. Bot. 60, 1085-1092). Более того, в последнем филогенетическом анализе Chen et al 2013 обнаружили, что пять из шести видов трав, которые они проанализировали, имели только один DELLA, в то время как 14 из 18 двудольных видов имели два или более белков DELLA. Напротив, существует 6 представителей семейства BZR в рисе, 10 в кукурузе (www.Grassius.org) и 6 в арабидопсисе (Wang et al 2002, Developmental Cell 2, 505-513).

Рост и развитие растений основаны на многочисленных связях между каскадами передачи сигнала, которые обеспечивают высокую пластичность при развитии, требуемую вследствие их сидячего образа жизни (Gallego-Bartolome et al 2012, PNAS 109, 13446-13451). Таким образом, вместо существования каждого каскада передачи сигнала гормонами в качестве обособленного модуля, современные данные указывают на то, что существует высокая степень взаимодействия между различными каскадами, и что данный гормон часто модулирует выход, обеспечиваемый остальными. В качестве примера, недавно было показано, что перекрестное взаимодействие между каскадами передачи сигнала GA и BR вовлекает прямое взаимодействие между DELLA и BZR1/BES1, посредством чего белки DELLA не только влияют на стабильность белка, но также ингибируют транскрипционную активность BZR1 (Li and He 2013, Plant Signaling and Behaviour 8:7, e24686 и ссылки в ней). Таким образом стимуляция удлинения клеток посредством GA частично происходит через устранение опосредуемого DELLA ингибирования BZR1.

Недавно было продемонстрировано, что рост и развитие растений можно модифицировать путем прямого манипулирования основными регуляторами роста DELLA (Lawit, Kundu, Rao and Tomes, 2007, ISOLATED POLYNUCLEOTIDE MOLECULES CORRESPONDING TO MUTANT AND WILD-TYPE ALLELES OF THE MAIZE D9 GENE AND METHODS OF USE, WO 2007124312 A2) и BZR1 (Chory and Wang, 2005, GENES INVOLVED IN BRASSINOSTEROID HORMONE ACTION IN PLANTS, US 6921848 B2).

Стероидные гормоны играют ключевую роль в координации широкого диапазона обусловленных развитием и физиологических процессов как в растениях, так и у животных (Thummel and Chory 2002, Genes Dev. 16, 3113-3129). В растениях стероидный гормон брассиностероид (BR) имеет обширные эффекты на рост, развитие и ответы как на биотические, так и на абиотические стрессовые факторы (Zhu et al 2013, Development 140, 1615-1620; Clouse 2011, Plant Cell 23, 1219-1230). В противоположность передаче сигнала стероидными гормонами животных, которые функционируют через ядерные рецепторы, в растениях BR связывается с внеклеточным доменом рецепторной киназы клеточной поверхности BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 (BRI1) и активирует каскад внутриклеточной передачи сигнала, который регулирует экспрессию генов (Clouse 2011, Plant Cell 23, 1219-1230; Kinoshita et al 2005, Nature 433, 167-171). Существует множество стадий, вовлекающих активацию и инактивацию промежуточных соединений, приводящих к фосфорилированию двух факторов транскрипции BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (BZR1) и BZR2 (также известный как BES1). Таким образом факторы транскрипции BZR передачи сигнала являются компонентами-мишенями, конвертирующими передачу сигнала в отвечающую на BR экспрессию генов.

Установлен паттерн в передаче сигнала гормонами растений, где факторы транскрипции-мишени, активируемые гормонами, также негативно регулируются конкретными репрессорными комплексами. Например, в каскадах передачи сигнала жасмоновой кислоты (JA), ауксина, абсцизовой кислоты (ABA) и стриголактона (SL) факторы транскрипции-мишени негативно регулируются репрессорными комплексами, использующими TOPLESS (TPL) в качестве общего корепрессора, привлекаемого специфическим для каскада гормонов репрессором (Pauwels et al 2010, Nature 464, 788-791). В каскаде передачи JA семейство репрессоров транскрипции JASMONATE ZIM DOMAIN (JAZ) как взаимодействует с отвечающим на JA активатором транскрипции MYC2, являющимся мишенью, так и привлекает TPL, либо прямо, либо через адаптерный белок NOVEL INTERACTOR OF JAZ (NINJA) (Pauwels et al 2010 Nature 464, 788-791).

Таким образом, способность регулировать каскады GA и BR для влияния на многие различные представляющие интерес сельскохозяйственные признаки имеет большое значение для коммерческого сельского хозяйства.

Изобретение заявителя

Как рассмотрено выше, настоящее изобретение относится к способу увеличения биомассы корней в растениях посредством эктопической экспрессии PEAPOD.

Без связи с теорией, заявители показали, что PEAPOD (PPD), по-видимому, вовлечен в модулирование каскадов как GA, так и BR, и посредством либо прямого, либо непрямого взаимодействия с основными регуляторами роста DELLA и BZR.

Анализ первичной аминокислотной структуры белков PPD указывает на присутствие высококонсервативного специфического для растений домена, присутствующего только в этих белках. Гомологи PPD существуют в широком диапазоне эвдикот, хвойных и некоторых однодольных растений (пальмы, банан, орхидеи, ряска), но не Poaceae (травы).

Гены PPD в Arabidopsis кодируют белки, которые являются представителями специфического для растений семейства TIFY, названного по мотиву TIF[F/Y]XG, находящемуся в домене, известном как ZIM (Vanholme et al 2007 Trends Plant Sci. 12, 239-244). Два белка PPD арабидопсиса, PPD1 и PPD2, включены в ту же группу класса II TIFY, что и двенадцать хорошо охарактеризованных белков JAZ, которые действуют в качестве репрессоров ответов на жасмонаты. Однако белки PPD и другой не являющийся JAZ белок в группе, по-видимому, не вовлечены в ответы на передачу сигнала гормонов на жасмонаты (Pauwels et al 2010 Nature 464, 788-791).

Вновь, без связи с теорией, заявители полагают, что увеличение биомассы корней согласно изобретению опосредуется новым механизмом регуляции каскадов как GA, так и BR, с использованием гена PPD. Примеры 3 и 4 ниже подтверждают это предположение.

Также можно широко сказать, что настоящее изобретение состоит в частях, элементах и признаках, упоминаемых или указанных в описании заявки, по отдельности или в совокупности, и в любых или всех комбинациях любых двух или более указанных частей, элементов или признаков, и где в настоящем описании упомянуты конкретные целые числа, которые имеют известные эквиваленты в области, к которой относится изобретение, такие эквиваленты считаются в включенными в настоящее описания, как если бы они были индивидуально указаны.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение станет более понятным с помощью прилагаемых чертежей, которые описывают следующее:

На фиг.1 представлены 46 аминокислотных остатков, содержащих область PEAPOD из ряда видов растений, идентичные остатки показаны звездочкой.

На фиг.2 представлены внутренние 27 аминокислотных остатков в области PEAPOD из ряда видов растений, идентичные остатки показаны звездочкой.

На фиг.3 представлены 6 аминокислотных остатков домена TIFY на белках PEAPOD из ряда видов растений, идентичные остатки показаны звездочкой.

На фиг.4 показано схематическое представление белка PPD и приблизительное положение консервативных областей PPD, TIFY и Jas*.

На фиг.5 представлена димеризация PPD и взаимодействие между TPL и NINJA в анализах Y2H.

На фиг.6 представлено взаимодействие между PPD и NINJA и взаимодействие между TPL и BZR1 в анализах Y2H.

На фиг.7 представлено взаимодействие PPD, NINJA, TPL и BZR1 в молодых (A и B) и старых (C) листьях с использованием анализов BiFC.

На фиг.8 показано схематическое представление комплекса PPD-NINJA-TPL-BZR1.

На фиг.9 показано взаимодействие между PPD и BZR1 в анализах Y2H.

На фиг.10 представлен ответ длины гипокотиля растений дикого типа, мутантов Δppd и сверхэкспрессирующих PEAPOD (PPD-OX) растений на экзогенное применение GA и PAC.

На фиг.11 показано увеличение роста корней растений плевела, сверхэкспрессирующих PPD (PPD-OX) из Arabidopsis thaliana или PEAPOD из Abroella trichopoda, по сравнению с диким типом и контролем вектора.

На фиг.12 представлено увеличение длины корней растений люцерны, сверхэкспрессирующих PPD (PPD-OX), по сравнению с контрольными растениями.

На фиг.13 показано, что белки PEAPOD из Arabidopsis thaliana; Picea sitchensis, Amborella trichopoda, Musa acuminate, Trifolium repens и Selaginella moellendorffii являются функционально эквивалентными. Оптимизированную кодирующую последовательность PEAPOD из каждого из них использовали для комплементации мутанта с делецией PEAPOD Δppd Arabidopsis thaliana (экотип Landsberg erecta). Изображения проростков получали на эквивалентных стадиях развития.

ПРИМЕРЫ

Далее изобретение проиллюстрировано с помощью следующих неограничивающих примеров.

Пример 1: Охарактеризация генов PEAPOD в множестве видов растений

Для идентификации ортологов гена PPD в других видах растений консервативную область PPD (46 аминокислот) из гена PPD1 арабидопсиса (SEQ ID NO: 27) использовали для поиска в общедоступных базах данных последовательностей генов растений с использованием программ поиска TBLASTN и BLASTP (Altschul et al 1990). Последовательности PEAPOD были идентифицированы в многообразном диапазоне видов растений, включая мхи, хвойные растения, все отряды исследованных двудольных растений и некоторые из отрядов однодольных растений, включая: пальмы, банан, орхидеи и ряску. Последовательности PEAPOD не обнаруживаются в травах. Репрезентативные последовательности белка и нуклеиновой кислоты PEAPOD представлены в SEQ ID NO: 1-26 и SEQ ID NO: 83-107, соответственно.

Область PEAPOD из 46 аминокислот из PPD1 Arabidopsis thaliana представлена в SEQ ID NO: 27. Эту область из полипептидов SEQ ID NO: 1-26 выравнивали с помощью Vector NTI (VNTI), как показано на фиг.1.

В SEQ ID NO: 28 показана консенсусная последовательность для этой области PPD из 46 аминокислот. В SEQ ID NO: 29 показана та же консенсусная область, однако показано, какие аминокислоты могут присутствовать в каждом из вариабельных положений.

Подпоследовательность из 27 аминокислот из области PEAPOD из 46 аминокислот из PPD1 Arabidopsis thaliana представлена в SEQ ID NO: 30.

Выравнивание этой подпоследовательности из 27 аминокислот для достижения тех же последовательностей, что и на фиг.1, представлено на фиг.2.

В SEQ ID NO: 30 представлена консенсусная последовательность для этой области PPD из 27 аминокислот. В SEQ ID NO: 32 представлена та же консенсусная область, однако показано, какие аминокислоты могут присутствовать в каждом из вариабельных положений.

В каждой из последовательностей пептидов PPD SEQ ID NO: 1-26 также присутствует консервативный мотив TIFY, который располагается после области PPD из 46 аминокислот. Количество аминокислотных остатков, разделяющих C-конец области PPD и N-конец мотива TIFY, зависит от источника PPD; например, количество варьируется от 46 до 140 аминокислот для SEQ ID NO: 1-26.

В SEQ ID NO: 33 показана последовательность PPD1 арабидопсиса на протяжении мотива TIFY. Выравнивание мотива TIFY (как описано Vanholme et al 2007 Trends Plant Sci. 12, 239-244) из SEQ ID NO: 1-26 представлено на фиг.3.

В SEQ ID NO: 34 представлена консенсусная последовательность для этого мотива TIFY из 6 аминокислот. В SEQ ID NO: 35 представлена та же консенсусная область, но показано, какие аминокислоты могут находиться в каждом из вариабельных положений.

Полностью консервативные остатки в доменах PPD и TIFY обозначены звездочками на фиг.1-3.

Заявители утверждают, что эти области и мотивы, описанные выше, обнаруживаются во всех идентифицированных белках PEAPOD и являются диагностическими для таких белков PEAPOD.

Пример 2: Демонстрация функциональности PEAPOD для последовательностей PEAPOD из множества видов растений

Функциональность любой последовательности PEAPOD можно подтверждать посредством комплементации мутантного фенотипа Δppd листьев арабидопсиса. Комплементацию мутантного фенотипа Δppd листьев арабидопсиса сначала использовали для идентификации гена PPD арабидопсиса (White 2006). Ее наблюдали по восстановлению фенотипа уплощенных листьев дикого типа и нормальной форме розетки в противоположность куполообразных листьев и скручиванию розетки в фенотип "пропеллера".

Последовательности PEAPOD, такие как последовательности SEQ IN NO: 1-26 (включая: пальму, хвойные растения, мох, орхидею и другие виды двудольных растений) или любую другую последовательность PEAPOD, подлежащую исследованию, можно трансформировать в мутантный арабидопсис Δppd способами, хорошо известными специалистам в данной области. Пример такого способа описан ниже.

Клонирование и генные конструкции

Получение конструкции CaMV35s::PPD1 Arabidopsis thaliana для сверхэкспрессии PPD1 арабидопсиса в мутантном арабидопсисе Δppd

Экспрессирующую конструкцию синтезировали для обеспечения сверхэкспрессии PPD1 Arabidopsis thaliana под контролем промотора CaMV35s (SEQ ID NO: 129) в мутантном арабидопсисе Δppd. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в арабидопсисе; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, устранение нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и концевой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором CaMV35s и терминатором ocs посредством реакции LR GATEWAY®, которые кодировали SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 111, соответственно.

Получение конструкции CaMV35s::PPD Trifolium repens для сверхэкспрессии PPD1 Trifolium repens в мутантном арабидопсисе Δppd

Экспрессирующую конструкцию синтезировали для обеспечения сверхэкспрессии PPD1 Trifolium repens под контролем промотора CaMV35s (SEQ ID NO: 129) в мутантном арабидопсисе Δppd. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в арабидопсисе; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, устранение нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и концевой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором CaMV35s и терминатором ocs посредством реакции LR GATEWAY®, которые кодировали SEQ ID NO: 106 и SEQ ID NO: 112, соответственно.

Получение конструкции CaMV35s::PPD Amborella trichopoda для сверхэкспрессии PPD Amborella trichopoda в мутантном арабидопсисе Δppd

Экспрессирующую конструкцию синтезировали для обеспечения сверхэкспрессии PPD1 Amborella trichopoda под контролем промотора CaMV35s (SEQ ID NO: 129) в мутантном арабидопсисе Δppd. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в арабидопсисе; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, устранение нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и концевой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором CaMV35s и терминатором ocs посредством реакции LR GATEWAY®, которые кодировали SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 113, соответственно.

Получение конструкции CaMV35s::PPD Musa acuminate для сверхэкспрессии PPD Musa acuminate в мутантном арабидопсисе Δppd

Экспрессирующую конструкцию синтезировали для обеспечения сверхэкспрессии PPD1 Musa acuminate под контролем промотора CaMV35s (SEQ ID NO: 129) в мутантном арабидопсисе Δppd. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в арабидопсисе; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, устранение нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и концевой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором CaMV35s и терминатором ocs посредством реакции LR GATEWAY®, которые кодировали SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение конструкции CaMV35s::PPD1 Picea sitchensis для сверхэкспрессии PPD Picea sitchensis в мутантном арабидопсисе Δppd

Экспрессирующую конструкцию синтезировали для обеспечения сверхэкспрессии PPD1 Picea sitchensis под контролем промотора CaMV35s (SEQ ID NO: 129) в мутантном арабидопсисе Δppd. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в арабидопсисе; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, устранение нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и концевой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором CaMV35s и терминатором ocs посредством реакции LR GATEWAY®, которые кодировали SEQ ID NO: 109 и SEQ ID NO: 115, соответственно.

Получение конструкции CaMV35s::PPD1 Selaginella moellendorffii для сверхэкспрессии PPD Selaginella moellendorffii у мутантном арабидопсисе Δppd

Экспрессирующую конструкцию синтезировали для обеспечения сверхэкспрессии PPD1 Selaginella moellendorffii под контролем промотора CaMV35s (SEQ ID NO: 129) в мутантном арабидопсисе Δppd. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в арабидопсисе; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, устранение нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и концевой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором CaMV35s и терминатором ocs посредством реакции LR GATEWAY®, которые кодировали SEQ ID NO: 110 и SEQ ID NO: 116, соответственно.

Материалы растений и условия роста

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh экотипа Ler можно использовать в качестве растения дикого типа (WT). Делеционный мутант с потерей функции Δppd (с делетированными PPD1 и PPD2) является таким, как описано ранее в White 2006 PNAS 103, 13238-13243.

Растения выращивают в теплице с контролируемой постоянной температурой 21°C или в помещении с контролируемыми условиями при 23°C с циклом 16 ч на свету 8 ч в темноте.

Трансформация Arabidopsis

Описанные выше конструкции можно трансформировать в Arabidopsis способом инфильтрации посредством погружения цветков (Clough and Bent, 1998 Plant J 16, 735-43). Линию Δppd трансформируют для экспрессии полипептидов PPD стандартными способами. Трансгенные растения подтверждают стандартными способами ПЦР-анализа с использованием комбинации специфических для трансгена праймеров и праймеров T-ДНК.

Комплементация линии Δppd с получением фенотипа листьев и фенотипа розеток дикого типа в проростках T1 (потомок растения после инфильтрации) подтверждает функциональность введенного гена PEAPOD, которая может быть показана на фотографиях.

Этот подход можно использовать для подтверждения функциональности любого гена PEAPOD, что по утверждению заявителя демонстрирует его пригодность для применения в рамках настоящего изобретения.

Посредством комплементации мутанта с делецией PEAPOD Δppd Arabidopsis thaliana экотипа Landsberg erecta было показано, что белки PEAPOD из Arabidopsis thaliana; Picea sitchensis, Amborella trichopoda, Musa acuminate и Selaginella moellendorffii являются функционально эквивалентными (фиг.13).

Пример 3: PEAPOD может быть вовлечен в регуляцию каскада передачи сигнала брассиностероидов

Заявители использовали дрожжевой двухгибридный (Y2H) анализ и бимолекулярную флуоресценцию (BiFC) для исследования взаимодействий между PPD, NINJA, TPL и BZR1.

Клонирование и конструкции

Конструкции для анализов Y2H и BiFC получали следующим образом. Последовательности ДНК арабидопсиса, кодирующие открытые рамки считывания для At4g14713 (PPD1) и укороченных и делеционных производных PPD1: PPD1; PPD1Δppd (N-концевое укорочение последовательностей, кодирующих а.к.1-61), PPD1Δtify (внутренняя делеция последовательностей, кодирующих а.к. 154-186), PPD1Δjas* (C-концевое укорочение последовательностей, кодирующих а.к. 229-313) (фиг.4), At4g28910 (NINJA), At1g15750 (TPL), At1g75080 (BZR1), синтетический промотор PUAS-35S и последовательности, кодирующие GAL4DBD и слитые белки c-myc, синтезировали и последовательность подтверждали в GeneArt. Большинство последовательностей было предоставлено в качестве клонов в pENTR221, готовой для клонирования Gateway в экспрессирующие векторы дрожжей и растений. В качестве исключения, промоторная последовательность для анализов активации транскрипции в растениях, включающая участки ферментов рестрикции 5' XhoI и 3' NcoI, была предоставлена клонированной в pMA-RQ. Плазмиды для временного репортерного анализа с LUC: синтетический промотор с 5× участками связывания ДНК UAS GAL4 выше промотора CaMV35S из 105 п.н. клонировали в участки XhoI-NcoI в двойной конструкции люциферазы pNWA62, которая содержит интрон-содержащий ген люциферазы светлячка (LUC) и 35Spro::люциферазу Renilla (REN) в качестве внутреннего стандарта для конструирования pAML7. Для сверхэкспрессии слитых белков GAL4DBD последовательности ДНК, кодирующие ДНК-связывающий домен GAL4 (а.к.1-147 GAL4DBD) и N-концевые слитые конструкции GAL4DBD (с использованием линкера, кодирующего GGGGS) с 2× доменом активатора VP16 (GAL4DBD-VP16) или PPD1 (GAL4DBD-PPD1), клонировали с использованием технологии Gateway в pRSh1 (Winichayakul et al 2008) для конструирования векторов pRSh1-GAL4DBD, pRSh1-GAL4DBD-VP16 и pRSh1-GAL4DBD-PPD1 для экспрессии слитых белков в растениях.

Плазмиды для дрожжевого двухгибридного анализа

Полноразмерные кодирующие последовательности BZR1, NINJA, TPL и PPD1, вместе с укороченными или делеционными производными PPD1 (PPD1Δppd, PPD1Δtify и PPD1Δjas*), подвергали субклонированию Gateway в pDEST32 (N-концевой GAL4DBD) или pDEST22 (N-концевой GAL4AD), для конструирования pDEST32-PPD1, pDEST32-PPD1Δppd, pDEST32-PPD1Δtify, pDEST32-PPD1Δjas*, pDEST32-TPL, в качестве векторов-приманок и pDEST22-PPD1, pDEST22-BZR1 и pDEST22-NINJA в качестве векторов-добычи. При экспрессии эти конструкции продуцировали белки, приведенные в SEQ IN NO: 56-67 и 70-72; включая: ДНК-связывающий домен (DBD), домен активации (AD), PPD1, слитый с DBD (PPD1-DBD), PPD1, слитый с AD (PPD1-AD), PPD1 без домена TIFY, слитого с AD (PPD1-tify-AD), PPD1 без домена jas, слитого с AD (PPD1-jas*-AD), TOPLESS (TPL), TPL, слитого с DBD (TPL-DBD), NINJA, NINJA, слитого с AD (NINJA-AD), BZR1, слитого с AD (BZR1-AD), PPD1 минус домен ppd, слитого с DBD (PPD1-Δppd-DBD), PPD1 минус домен TIFY, слитого с DBD (PPD1-tify-DBD), PPD1 минус домен jas, слитого с DBD (PPD1-jas*-DBD).

Плазмиды для бимолекулярной комплементации флуоресценции

Бинарные векторы BiFC-Gateway YFP: pDEST-VYNE(R)^GW (Venus, а.к.1-173) и pDEST-VYCE(R)^GW(Venus aa 156-239) с N-концевым слиянием использовали для конструирования следующих векторов: pDESTnYFP-BZR1, pDESTnYFP-NINJA, pDESTnYFP-PPD1, pDESTcYFP-BZR1, pDESTcYFP-PPD1, pDESTcYFP-PPD1Δppd, pDESTcYFP-PPD1Δtify и pDESTcYFP-PPD1Δjas*. Для временной экспрессии в растениях белков, взаимодействующих с PPD1 или BZR, NINJA и TPL подвергали субклонированию Gateway® в pRSh1 для конструирования pRSh1-NINJA и pRSh1-TPL. Плазмиды для коиммунопреципитации: синтезированную конструкцию ДНК, кодирующую PPD1, с C-концевым слиянием с 3× c-myc субклонировали в pRSh1 для получения pRSh1-PPD1-3xc-myc, в то время как последовательность кДНК NINJA субклонировали в pB7FWG2.0 (Karimi et al 2002, Trends Plant Sci. 7, 193-195) для конструирования pB7FWG2-NINJA-GFP. При экспрессии эти конструкции продуцировали белки, приведенные в SEQ ID NO: 63, 65, 73-82: включая TOPLESS (TPL), NINJA, Bimolecular Fluorescence (BiFC) nYFP, BiFC cYFP, BiFC nYFP-NINJA, BiFC nYFP-BZR1, BiFC cYFP-PPD1, BiFC cYFP-NINJA, BiFC cYFP-BZR1, BiFC cYFP-PPD1-ppd, BiFC cYFP-PPD1-tify, BiFC cYFP-PPD1-jas*.

Двухгибридную систему ProQuest (Invitrogen) использовали для анализа взаимодействий между PPD1, NINJA, TPL и BZR1. Комбинации конструкций приманок и добычи использовали для совместной трансформации штамма дрожжей MaV203 (Invitrogen) с селекцией на планшетах с агаром с синтетической средой с исключенными компонентами (SD) SD/-Leu/-Trp. Трансформированные штаммы исследовали в отношении взаимодействий с использованием 10-мкл капель в разведениях 1 к 10 и 1 к 100 на планшетах SD/-Leu/-Trp/-His с различными концентрациями 3-аминотриазола (3-AT) (Sigma).

Временные эксперименты BiFC проводили с использованием комбинаций плазмид pDESTnYFP и pDESTcYFP с плазмидами для экспрессии NINJA (pRSh1-NINJA) или TPL (pRSh1-TPL) или без них и инфильтрации агробактериями листьев Nicotiana benthamiana. Для инфильтрации штаммы Agrobacterium tumefaciens GV3101, содержавшие бинарные векторы, ресуспендировали из планшетов и подготавливали для трансформации, как описано для анализа LUC. Все штаммы YFP и экспрессирующие штаммы смешивали в соотношениях 1:1 (об./об.) с добавлением штамма P19 в 1/10 объема. Из каждого подвергнутого инфильтрации листа проводили взятие образцов пяти дисков листьев через 40 ч. За два часа до взятия образцов для микроскопического исследования флуоресценции листья подвергали инфильтрации посредством 1 мкг/мл раствора DAPI для окрашивания ядер. Флуоресценцию YFP и окрашивание DAPI обнаруживали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus Fluoview FV10i. Каждый эксперимент повторяли дважды.

Скрининг Y2H с использованием PPD1 в качестве белка-приманки идентифицировал NINJA как прямо взаимодействующий с PPD1. Результаты анализов BiFC показали, что PPD1 взаимодействовал с NINJA в растениях и что для этого взаимодействия также был необходимым мотив TIFY (фиг.7). Является возможным, что NINJA выполняет функцию мостика между TPL и PPD1. При использовании Y2H не наблюдали прямого взаимодействия между PPD1 и BZR1 (фиг.5). Однако недавние эксперименты по тандемной аффинной очистке (TAP) показали, что TPL может взаимодействовать с BZR1 (Wang et al 2013, Mol. Cell. Proteomics 12, 3653-3665) и здесь результаты Y2H подтвердили, что происходит прямое взаимодействие (фиг.6).

Для определения молекулярной функции белков PPD взаимодействия PPD1, NINJA, TPL и BZR1 исследовали в растениях. Бимолекулярную флуоресценцию (BiFC) использовали, чтобы показать, что в клетках мостовидного эпителия незрелых листьев Nicotiana benthamiana PPD1, по-видимому, взаимодействует с BZR1 в ядре (фиг.7A,B). Связывающий NINJA мотив TIFY в PPD1 был необходим для этого взаимодействия. Более того, взаимодействия не наблюдали, когда nYFP-PPD1 и cYFP-BZR1 коэкспрессировались в полностью расправленных листьях (фиг.7C). Интересно, что взаимодействие между PPD1 и BZR1 восстанавливалось при коэкспрессии NINJA, но не TPL отдельно, что указывает на отсутствие взаимодействия в зрелых листьях вследствие ограничения эндогенного NINJA. Что касается незрелых листьев взаимодействие между PPD1 и BZR1, даже в присутствии коэкспрессии NINJA и TPL, не наблюдали, когда NINJA-связывающий мотив TIFY PPD1 был делетирован (фиг.7C). Эти результаты указывают на то, что PPD1, NINJA, TPL и BZR1 существуют в качестве комплекса в растениях и что NINJA требуется для привлечения PPD1 для взаимодействия через TPL с BZR1.

Оказалось, что PPD1 не взаимодействует прямо с фактором транскрипции-мишенью BZR1. Вместо этого результаты экспериментов по взаимодействию белка PPD1 указывают на модель, в которой белки PPD привлекают корепрессоры транскрипции TPL, с использованием NINJA в качестве адаптера, и этот комплекс PPD-NINJA-TPL взаимодействует с мотивом EAR факторов транскрипции BZR (фиг.8). Таким образом, в этой модели белок PEAPOD1 (PPD1) Arabidopsis thaliana выступает в качестве репрессора каскада передачи сигнала BR и в комбинации с NINJA и TPL подавляет BZR1.

Пример 4: PEAPOD может быть вовлечен в регуляцию каскада передачи сигнала гиббереллина

Известно, что обработка гиббереллиновой кислотой (GA) снижает уровни белков DELLA (включая RGA1), которые являются репрессорами GA; для определения взаимосвязи между PPD, DELLA и каскадом передачи сигнала GA заявители провели дрожжевой двухгибридный (Y2H) анализ между PPD и DELLA (RGA1) и нанесли гормон гиббереллиновую кислоту (GA) и ингибитор биосинтеза GA (паклобутразол, PAC) на растение дикого типа, мутант Δppd и мутант Δppd, сверхэкспрессирующий PPD (PPD-OX).

Двухгибридную систему ProQuest (Invitrogen) использовали для анализа взаимодействий между PPD1 и RGA1. Полноразмерные кодирующие последовательности PPD1 вместе с укороченными или делетированными производными PPD1 (PPD1Δppd, PPD1Δtify и PPD1Δjas*) (фиг.4), подвергали субклонированию Gateway в pDEST32 (N-концевой GAL4DBD) или pDEST22 (N-концевой GAL4AD). При трансляции они давали следующие пептидные последовательности: SEQ ID NO: 58, 68, 69, 70, 71, 72, которые представляют собой PPD1-DBD, RGA1, RGA1-AD, PPD1-ppd-DBD, PPD1-tify-DBD, PP1-jas*-DBD, соответственно.

Комбинацию конструкций приманок и добычи использовали для котрансформации штамма дрожжей MaV203 (Invitrogen), с селекцией на планшетах с агаром с синтетической средой с исключенными компонентами (SD) SD/-Leu/-Trp. Трансформированные штаммы исследовали в отношении взаимодействий с использованием 10-мкл капель в разведениях 1 к 10 и 1 к 100 на планшетах SD/-Leu/-Trp/-His с различными концентрациями 3-аминотриазола (3-AT) (Sigma). Взаимодействие PPD1-RGA1 исследовали с помощью PPD1-DBD, использованного в качестве приманки. Трансформированные дрожжи наносили пятнами в качестве десятикратных разведений на контрольную среду (-2) или селективную среду (-3) с 15 мМ 3AT. Контроли представляли собой пустые векторы, DBD, ДНК-связывающий домен GAL4, AD, домен активации GAL4 (фиг.4). Результаты Y2H указывают на то, что PPD может прямо связываться с DELLA (фиг.9).

Для экзогенного применения GA или PAC семена подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом, 0,01% Triton X-100, в течение 10 мин, а затем 100% этанолом в течение 5 мин, сушили воздухом на стерильной фильтровальной бумаге и переносили на планшеты со средой, содержавшей половинные концентрации солей MS, 1% сахарозу и 0,8% агар. Планшеты инкубировали в течение 5 суток при 4°C в темноте, а затем переносили на 24°C с циклом 14 ч на свету/10 ч в темноте каждые сутки. Свет предоставляли посредством флуоресцентных трубок (Philips TLD 58W/865) с интенсивностью 100 мкм м^-2 с^-1. Проростки дикого типа (Col-0), мутанты по Δppd и трансгенные проростки PPD-OX выращивали в течение пяти суток на среде с различными концентрациями GA (фиг.10A) или PAC (фиг.10B). GA (ACROS organics) и PAC (Sigma-Aldrich) растворяли в этаноле и ацетоне, стерилизовали фильтрацией и добавляли в планшеты со средой. Этанол или ацетон (0,5%) использовали для имитирующих обработок. Проростки выращивали при 24°C при цикле 14 ч на свету/10 ч в темноте в течение 5 суток, а затем анализировали длину гипокотиля (n=35). Каждую обработку повторяли два раза; планки погрешности=стандартная ошибка среднего значения.

Уменьшение уровня DELLA приводит к увеличению транскрипции генов-мишеней DELLA, стимулирующих клеточную экспансию, и его можно количественно определять путем измерения удлинения гипокотиля проростков, растущих на среде, содержащей различные уровни GA. Наиболее низкая концентрация GA (1 мкМ) не стимулировала удлинение гипокотиля дикого типа (WT), в то время как проростки мутанта PPD с потерей функции (Δppd), так и трансгенные сверхэкспрессирующие PPD (PPD-OX) проростки продемонстрировали увеличенное удлинение гипокотиля (фиг.10A). При более высоких концентрациях GA (5-50 мкМ) удлинение гипокотиля WT происходило дозозависимым образом. Для сравнения проростки Δppd и PPD-OX продемонстрировали сверхчувствительное удлинение при вплоть до 5 и 10 мкМ GA, соответственно, где они оба достигли приблизительно одинаковой длины (фиг.10A).

Биосинтез GA ингибируется посредством применения экзогенного паклобутразола (PAC); это приводит к увеличению уровней белков-репрессоров DELLA и соответствующему снижению экспансии клеток. Проростки дикого типа продемонстрировали дозозависимое снижение удлинения гипокотиля от 0 до 10 мкМ PAC (фиг.10B). Вновь, проростки Δppd продемонстрировали сверхчувствительный ответ, который наблюдали в качестве более выраженного снижения удлинения гипокотиля на протяжении того же диапазона применений PAC. Однако проростки PPD-OX были относительно нечувствительными до тех пор, пока концентрацию PAC не увеличивали до уровня выше 0,1 мкМ, после чего они также продемонстрировали уменьшение длины гипокотиля (фиг.10B).

Сверхчувствительный ответ GA проростков Δppd потенциально отражает комбинацию увеличенного нацеливания DELLA на деградацию в отсутствие репрессии фактора транскрипции посредством PPD. Аналогично, добавление PAC на фоне Δppd возможно приводит к более высокому уменьшению удлинения гипокотиля по сравнению с WT, поскольку это происходит в отсутствие одного из природных антагонистов DELLA - PPD, что указывает на то, что PPD и GA конкурируют за связывание с DELLA.

Можно спрогнозировать, что сверхэкспрессия PPD приведет к более высокому уровню антагонизма DELLA, поскольку такое удлинение гипокотиля в этих растениях должно быть сверхчувствительным к GA; действительно, именно это наблюдалось в проростках PPD-OX. В обратной ситуации, когда уровень GA был снижен (вследствие применения PAC), проростки PPD-OX были не отвечающими до тех пор, пока концентрация PAC не превысила 0,1 мкМ. Это, вероятно, отражает точку, в которой происходит достаточное снижение уровней эндогенной GA, чтобы увидеть влияние белка DELLA без антагонизма сверхкспрессируемого PPD.

Пример 5: Увеличение биомассы корней посредством увеличения экспрессии PEAPOD в растениях

Конструкции

Ниже описано несколько конструкций для экспрессии последовательностей PEAPOD из различных видов под контролем различных промоторов для экспрессии в двудольных и однодольных растениях.

Получение конструкции pTobRB7 Δ1.3::PPD для двудольного растения для (предпочтительной для корней) сверхэкспрессии PPD арабидопсиса в двудольных растениях

Синтезировали конструкции, содержащие кодирующую последовательность PPD1, для экспрессии в корнях двудольных растений, последовательности нуклеиновых кислот представлены в SEQ ID NO: 40 и 126. ORF PPD первоначально происходила из кДНК PPD1 Arabidopsis thaliana (номер доступа № NM_202819), и она была модифицирована для включения модифицированной последовательности Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), удаления скрытых участков сплайсинга, в случае SEQ ID NO: 40 включения третьего интрона из DGAT1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 39), добавления удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и хвостовой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавления двойного стоп-кодона. Положение интрона оптимизировали для прогнозирования участка сплайсинга, проводимого с помощью NetGene2 (http://www<dot>cbs<dot>dtu<dot>dk/services/NetGene2/).

Затем конструкцию SEQ ID NO: 40 (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором TobRB7 Δ1.3 (Yamamoto et al 1991, Plant Cell, 3:371-382) и терминатором NOS посредством реакции LR GATEWAY®, с получением SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 44, которые кодировали SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38, соответственно. Сходную стадию субклонирования проводили для конструкции, показанной в SEQ ID NO: 126 (с C-концевой хвостовой частью и без нее), которая кодировала SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение конструкции pTobRB7 Δ0.6::PPD для двудольных растений для (предпочтительной для корней) сверхэкспрессии PPD арабидопсиса в двудольных растениях

Синтезировали конструкции, содержащие кодирующую последовательность PPD1, для экспрессии в корнях двудольных растений, последовательности нуклеиновых кислот представлены в SEQ ID NO: 40 и 126. ORF PPD первоначально происходила из кДНК PPD1 Arabidopsis thaliana (Номер доступа № NM_202819), и она была модифицирована для включения модифицированной последовательности Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), удаления скрытых участков сплайсинга, в случае SEQ ID NO: 40 включения третьего интрона из DGAT1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 39), добавления удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и хвостовой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавления двойного стоп-кодона. Положение интрона оптимизировали для прогнозирования участка сплайсинга, проводимого с помощью NetGene2 (http://www<dot>cbs<dot>dtu<dot>dk/services/NetGene2/).

Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором TobRB7 Δ0.6 (Yamamoto et al 1991, Plant Cell, 3:371-382) и терминатором NOS посредством реакции LR GATEWAY®, с получением SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45, которые кодировали SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38, соответственно. Сходную стадию субклонирования проводили для конструкции, показанной в SEQ ID NO: 126 (с C-концевой хвостовой частью и без нее), которая кодировала SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение конструкции pAtWRKY6::PPD для двудольных растений для (предпочтительной для корней) сверхэкспрессии PPD арабидопсиса в двудольных растениях

Синтезировали конструкции, содержащие кодирующую последовательность PPD1, для экспрессии в корнях двудольных растений, последовательность нуклеиновой кислоты представлена в SEQ ID NO: 41 и 126. ORF PPD первоначально происходила из кДНК PPD1 Arabidopsis thaliana (Номер доступа № NM_202819), и она была модифицирована для включения модифицированной последовательности Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), удаления скрытых участков сплайсинга, в случае SEQ ID NO: 41 включения третьего интрона из DGAT1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 39), добавления удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и хвостовой части в виде His-метки (encoding SEQ ID NO: 37) и добавления двойного стоп-кодона. Положение интрона оптимизировали для прогнозирования участка сплайсинга, проводимого с помощью NetGene2 (http://www<dot>cbs<dot>dtu<dot>dk/services/NetGene2/).

Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором AtWRKY6 табака (Robatzek and Somssich 2001, The Plant Journal, 28: 123-133) и терминатором NOS посредством реакции LR GATEWAY®, с получением SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 47, которые кодировали SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38, соответственно. Сходную стадию субклонирования проводили для конструкции, показанной в SEQ ID NO: 126 (с C-концевой хвостовой частью и без нее), которая кодировала SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение конструкции pTobRB7 Δ1.3::PPD для однодольных растений для (предпочтительной для корней) сверхэкспрессии PPD арабидопсиса в однодольных растениях

Синтезировали конструкцию, содержащую кодирующую последовательность PPD1, для экспрессии в корнях однодольных растений, последовательности нуклеиновых кислот представлены в SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 120. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в однодольных растениях; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, удаления последовательностей нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, в случае SEQ ID NO: 49 включение третьего интрона из DGAT1 Lolium perenne (SEQ ID NO: 48), добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и хвостовой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Положение интрона оптимизировали для прогнозирования участка сплайсинга, проводимого с помощью deepc2 (http://www<dot>cbs<dot>dtu<dot>dk/services/NetGene2/).

Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором pTobRB7 Δ1.3 (Yamamoto et al 1991, Plant Cell, 3:371-382) и терминатором NOS посредством реакции LR GATEWAY®, с получением SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 53, которые кодировали SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38, соответственно. Сходную стадию субклонирования проводили для конструкции, показанной в SEQ ID NO: 120 (с C-концевой хвостовой частью и без нее), которая кодировала SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение конструкции pTobRB7 Δ0.6::PPD для однодольных растений для (предпочтительной для корней) сверхэкспрессии PPD арабидопсиса в двудольных растениях

Синтезировали конструкции, содержащие кодирующую последовательность PPD1, для экспрессии в корнях однодольных растений, последовательности нуклеиновых кислот представлены в SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 120. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в однодольных растениях; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, удаление последовательностей нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, в случае SEQ ID NO: 49 включение третьего интрона из DGAT1 Lolium perenne (SEQ ID NO: 48), добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и хвостовой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Положение интрона оптимизировали для прогнозирования участка сплайсинга, проводимого с помощью deepc2 (http://www<dot>cbs<dot>dtu<dot>dk/services/NetGene2/).

Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором pTobRB7 Δ0.6 (Yamamoto et al 1991, Plant Cell, 3:371-382) и терминатором NOS посредством реакции LR GATEWAY®, с получением SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 54, которые кодировали SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38, соответственно. Сходную стадию субклонирования проводили для конструкции, показанной в SEQ ID NO: 120 (с C-концевой хвостовой частью и без нее), которая кодировала SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение конструкции pAtWRKY6::PPD для однодольных растений для (предпочтительной для корней) сверхэкспрессии PPD арабидопсиса в однодольных растениях

Синтезировали конструкции, содержащие кодирующую последовательность PPD1, для экспрессии в корнях однодольных растений, последовательности нуклеиновых кислот представлены в SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 120. ORF PPD оптимизировали для экспрессии в однодольных растениях; это включало модифицированную последовательность Joshi (Joshi 1997, Nucleic Acid Research 15, 6643-6653), оптимизацию кодонов, удаление последовательностей нестабильности мРНК, удаление сигнальных последовательностей поли-A, удаление скрытых участков сплайсинга, в случае SEQ ID NO: 49 включение третьего интрона из DGAT1 Lolium perenne (SEQ ID NO: 48), добавление удаляемого посредством BamHI C-концевого эпитопа V5 и хвостовой части в виде His-метки (кодирующей SEQ ID NO: 37) и добавление двойного стоп-кодона. Положение интрона оптимизировали для прогнозирования участка сплайсинга, проводимого с помощью deepc2 (http://www<dot>cbs<dot>dtu<dot>dk/services/NetGene2/).

Затем конструкцию (с хвостовой частью и без нее) помещали между промотором pAtWRKY6 (Robatzek and Somssich 2001 The Plant Journal, 28: 123-133) и терминатором NOS посредством реакции LR GATEWAY®, с получением SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 55, которые кодировали SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38, соответственно. Сходную стадию субклонирования проводили для конструкции, показанной в SEQ ID NO: 120 (с C-концевой хвостовой частью и без нее), которая кодировала SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 114, соответственно.

Получение экспрессирующих конструкции, содержащих PPD из других видов растений

Для демонстрации того, что можно использовать PPD из вида, отличного от арабидопсиса, авторы настоящего изобретения синтезировали конструкции, которые, когда их помещают под контроль подходящего промотора, экспрессируют PPD из Arabidopsis thaliana (контроль PPD), бобового растения Trifolium repens, примитивного покрытосеменного растения Amborella trichopoda, однодольного растения Musa acuminate, хвойных растений Picea abies и Picea sitchensis и плауновидного растения Selaginella moellendorffii. Их оптимизировали для экспрессии либо в рисе (включая интрон однодольного растения), либо в арабидопсисе (без интрона). Их модифицировали способами инженерии так, чтобы они содержали поддающуюся удалению хвостовую часть, которая состояла из двух участков BamHI (кодирующих глицин-серин) с каждой стороны последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей V5-His-метку. Пептидные последовательности (с C-концевой хвостовой частью V5-His-метка или без нее) представлены в последовательностях 108-119. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, оптимизированные для экспрессии в рисе, представлены в последовательностях 120-125, и оптимизированные последовательности для экспрессии в арабидопсисе представлены в последовательностях 126-131.

Оптимизированные для арабидопсиса версии помещали ниже соответствующих промоторов в бинарных векторах посредством реакции GATEWAY LR и трансформировали в Δppd Arabidopsis thaliana способом погружения цветков.

Оптимизированные для риса версии помещали ниже соответствующих промоторов посредством реакции GATEWAY LR и трансформировали в плевел биолистическим способом.

Трансформация растений

Трансформация арабидопсиса

Арабидопсис трансформируют, как описано в примере 2.

Трансформация люцерны

Растения люцерны, сверхэкспрессирующие конструкцию Peapod, получали путем опосредуемой агробактериями трансформации с использованием адаптированного способа Samac et al. 2000 (Methods in Molecular Biology 343: 301-311).

Ткань растений

Идентифицировали генотипы Regen-SY (Bingham 1991 Crop Sci. 31, 1098) с высокой способностью к регенерации, которые были способны формировать целые растения из соматических зародышей в условиях in vitro. С использованием этого протокола был выбран один генотип для применения в экспериментах по трансформации растений.

Штаммы агробактерий и векторы

Во всех экспериментах по трансформации использовали бинарные векторы pRSh1::PPD-OP и pRSh1::PPD-OP-V5. Вектор pRSh1 является производным pART27 (Gleave 1992 Plant Mol Biol 20: 1203-1207) и содержит селективный ген bar, экспрессируемый с промотора CaMV, и оптимизированный для трав ген Peapod также под контролем экспрессии промотора CaMV 35S. Плазмиду переносили в штамм A. tumefaciens GV310 и селекцию трансформантов проводили на чашках с YM, содержавших 200 мг л^-1 спектиномицина. Успешное перемещение плазмиды в агробактерии подтверждали рестрикционным картированием после получения плазмидной ДНК из бактериальной культуры.

Культуру бинарных плазмид добавляли к 25 мл бульона Луриа с маннитом и глутаматом (MGL), содержавшего 100 мг/л спектиномицина. Бактериальные культуры выращивали в течение ночи (16 часов) на ротационном шейкере (200 об/мин) при 28°C. Культуры собирали центрифугированием (3000× g), супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в 5 мл раствора 10 мМ MgSO4 при подготовке для трансформации растений.

Трансформация растений

Второй и третий полностью развернутые листья из растения с отвечающим на тканевую культуру генотипом Regen-SY собирали и ополаскивали в течение 30 секунд в 50% растворе этанола, а затем проводили промывание в стерильной дистиллированной воде перед поверхностной стерилизацией в растворе гипохлорита натрия (3% доступный хлор). Затем стерильные листья разрезали на диски листьев, а затем опускали в раствор среды для индукции каллюса SH1.5D. Для трансформации дисков листьев добавляли приблизительно 3 мл бульона с агробактериями к 12 мл SH1.5D и инкубировали в течение 15 минут при нерегулярном перемешивании для тщательного покрытия листьев агробактериями. Затем раствор с бактериями удаляли и фрагменты листьев кратковременно промакивали стерильной фильтровальной бумагой, а затем их помещали адаксиальной стороной вверх на гель SH1.5D с 0,8% фитоагаром. Затем планшеты ингибировали в течение 5 суток в темноте при 25°C.

После инокуляции фрагменты листьев извлекали из чашек и ополаскивали 3-4 раза стерильной жидкой средой SH1.5D, промакивали стерильной фильтровальной бумагой и помещали на чашки SH1.5D, дополненные 5 мг/л глюфосината аммония и 100 мг/л цефотаксима и тиментина для селекции и инкубировали в течение 15 суток в темноте при 25°C. Затем каллюс, развившийся на фрагментах листьев, пассировали в свежую селективную среду SH1.5D на дополнительные 15 суток.

Затем трансформированный каллюс переносили в среду BL0, дополненную глюфосинатом аммония, цефотаксимом и тиментином, для формирования соматических зародышей. После развития зародышей их разрезали и переносили в среду MSN в половинной концентрации для селекции прорастания. Целые укоренившиеся растения переносили и выращивали в теплице.

Анализ способом ПЦР

Анализ способом ПЦР проводили для подтверждения стабильного встраивания T-ДНК в геном растений, восстановившихся после экспериментов по трансформации. Геномную ДНК экстрагировали приблизительно из 50 мг выращенных in vitro листьев с использованием набора Genomic DNA Mini Kit (Geneaid).

Пары праймеров, специфичные к сигналу полиаденилирования ocs3' (ocs3'-1f, 5'-GATATGCGAGACGCCTATGA-3' [SEQ ID NO: 132]; ocs3'-1r, 5'-GAGTTCCCTTCAGTGAACGT-3' [SEQ ID NO: 133]), использовали для получения продукта амплификации размером 439 п.н. Также были включены контрольные реакции, содержавшие плазмидную ДНК-матрицу, нетрансформированную ДНК растений или только воду. Протокол реакций ПЦР состоял из: первоначальной денатурации при 94°C в течение 5 минут, 30 циклов при 95°C 30 с, 55°C 15 с, 72°C 1 мин, и удлинения при 72°C в течение 10 мин. Продукты амплификации разделяли на 1,0% агарозных гелях посредством гель-электрофореза в буфере TAE и визуализировали на системе визуализации Bio-Rad Gel Doc.

Общий состав среды, использованной для трансформации люцерны

A. MGL Маннит 5,0 г/л L-глутаминовая кислота 1,0 г/л KH2PO4 250 мг/л MgSO4 100 мг/л NaCl 100 мг/л Биотин 100 мг/л Бактотриптон 5,0 г/л Дрожжевой экстракт 2,5 г/л pH7,0 (NaOH) B. SH1.5D Макро и микросоли SH (Duchefa) Витамины SH (Duchefa) K2SO4 4,34 г/л Пролин 288 г/л Тиопролин 53 мг/л Сахароза 30 г/л pH 5,8 (KOH) Phytoagar 8,0 г/л Кинетин 0,2 мг/л (добавление после автоклавирования) 2,4D 1,5 мг/л (добавление после автоклавирования) C. BL0 (среда Blaydes) Модифицировнная базальная среда Blaydes (PhytoTechnology Laboratories) L-мио-инозитол 100 мг/л дрожжевой экстракт 2,0 г/л pH 5,8 (KOH) Гель Phyta 2,5 г/л D. Половинная среда MSN Макро и микросоли MS, половинная концентрация (Duchefa) Витамины Nitch & Nitch (Duchefa) Сахароза 15 г/л pH 5,8 (KOH) Фитоагар 8,0 г/л

Трансформация плевела

Растения плевела, сверхэкспрессирующие конструкцию Peapod, получали посредством бомбардировки микрочастицами с использованием адаптированного способа Altpeter et al. 2000 (Molecular Breeding 6: 519-528).

Каллюсы для трансформации индуцировали из незрелых соцветий вплоть до 7 мм. Цветочные побеги собирали, подвергали поверхностной стерилизации в растворе гипохлорита натрия (4% доступный хлор), разрезали, а затем культивировали в темноте при 25°C в течение от четырех до шести недель перед трансформацией на базальной среде Murashige с макронутриентами, микнонутриентами и витаминами Skoog (MS) (1962 Physiol Plant. 15: 473-497), дополненной 30 г/л мальтозы, 5 мг/л 2,4-D, со значением pH, доведенном до 5,8, и отвержденной с помощью 6 г/л агарозы.

Плазмиды получали с использованием набора Invitrogen Pure Link Hi Pure Plasmid Maxiprep Kit с концентрацией, доведенной до 1 мкг/мкл. Плазмиду pAcH1, которая содержит экспрессирующую кассету, содержащую химерный ген гигромицинфосфотрансферазы (HPH) (Bilang et al. 1991 Gene 100: 247-250), экспрессируемый с промотора актина риса с первым интроном и завершающийся 3'-сигналом полиаденилирования nos, использовали для селекции. Плазмиды, содержавшие экспрессирующие кассеты PPD, смешивали в молярном соотношении 1:1 c pAcH1.

Плазмидные ДНК наносили на вольфрамовые частицы M17 (среднее распределение диаметра 1,4 мкМ) с использованием способа Sanford et al. 1993 (Meth. Enzymol. 217: 483-509.) и трансформировали в ткани-мишени с использованием DuPont PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System. Вплоть до 6 часов перед трансформацией каллюс субкультивировали на среде для инициации каллюса, содержавшей 64 г/л маннита. После трансформации (приблизительно 16 часов) трансформированные каллюсы переносили на свободную от маннита базальную среду MS, дополненную 2 мг/л 2,4-D. Через 2 суток каллюсы переносили на ту же среду, содержавшую 200 мг/л гигромицина, и культивировали в темноте в течение 4 недель для селекции трансгенных событий. Регенерация целых растений из соматических зародышей происходила при освещении на базальной среде MS, дополненной 0,2 мг/л кинетина, 30 г/л, сахарозы и 50 мг/л гигромицина, доведенной до pH 5,8 и отвержденной с помощью 8 г/л фитоагара. Трансформированные растения переносили в изолированные условия теплицы для анализа.

Анализ трансформантов способом ПЦР

Анализ способом ПЦР проводили для подтверждения стабильного встраивания трансгенов HPH и PPD в геном для получения растений, восстановленных после экспериментов по трансформации. Геномную ДНК экстрагировали из приблизительно 50 мг листьев, выращенных in vitro, с использованием набора Genomic DNA Mini Kit (Geneaid). Пары праймеров, специфичных к гену HPH (hpt-1, 5'-GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCCG-3' [SEQ ID NO: 134]; hpt-2, 5'-CGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGC-3' [SEQ ID NO: 135]) и сигналу полиаденилирования nos3' (nos3'-1f, 5'-CTGTTGCCGGTCTTGCGATG-3' [SEQ ID NO: 136]; nos3'-1r, 5'-GTCACATAGATGACACCGCG-3' [SEQ ID NO: 137]), использовали для получения продуктов амплификации размером 375 п.н. и 202 п.н., соответственно. Также были включены контрольные реакции, содержавшие плазмидную ДНК-матрицу, нетрансформированную ДНК растений или только воду. Протокол для реакций ПЦР состоял из: первоначальной денатурации при 94°C в течение 5 минут, 30 циклов 95°C 30 с, 55°C 15 с, 72°C 1 мин, и удлинения при 72°C в течение 10 мин. Продукты амплификации разделяли на 1,0% агарозных гелях посредством гель-электрофореза в буфере TAE и визуализировали с помощью системы визуализации Bio-Rad Gel Doc.

Анализ с использованием саузерн-блоттинга трансформантов трав

Гибридизацию с использованием саузерн-блоттинга использовали для оценки количества копий трансгена на линию. Геномную ДНК экстрагировали из материала листьев растений, выращенных в теплице, для гибридизации с использованием саузерн-блоттинга способом Doyle J and Doyle J 1990 (Focus, 12:13-15). ДНК (20 мкг) расщепляли и разделяли на 0,8% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (Roche) с использованием капиллярного переноса посредством 0,4 Н NaOH. Геномную ДНК расщепляли посредством XbaI или HindIII при исследовании в отношении трансгенов HPH и PPD, соответственно. Зонды получали с использованием набора для ПЦР-синтеза DIG. Пары праймеров, специфичные к гену HPH (rgh1, 5'-CTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAG-3' [SEQ ID NO: 138]; rgh5, 5'-GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGG-3' [SEQ ID NO: 139]) и PPD (GrPPD1F, 5'-CACAGGATGGATTCTCCAAGG-3' [SEQ ID NO: 140]; GrPPD1R, 5'-TAAGGTCCACGGAGAGGTTC-3' [SEQ ID NO: 141]) использовали для получения продуктов амплификации размером 906 п.н. и 586 п.н. для зондов, соответственно. Предгибридизацию (1 час) и гибридизацию (12 часов) проводили при 45°C с использованием стандартных буферов (Roche). Обнаружение осуществляли с использованием нерадиоактивного способа в соответствии с протоколом изготовителя с CDP-Star в качестве хемилюминесцентного субстрата. Световые сигналы обнаруживали с использованием системы Bio-Rad ChemiDoc MP System и программного обеспечения.

Получение поликлональных антител против белка PPD1 и иммуноблоттинг

Специально изготовленные поликлональные антитела кролика против PPD1, подвергнутые аффинной очистки, изготавливали в GenScript с использованием полноразмерного белка PPD1 Arabidopsis thaliana. При разведении 1:5000 антитела были способны обнаруживать менее чем 10 нг очищенного белка PPD посредством иммуноблоттинга. Ткань растений замораживали в жидком азоте и растирали в тонкий порошок. Порошок замороженных тканей добавляли в буфер для экстракции, содержавший 50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10% (об./об.) глицерин, 5 мМ DTT, 1% (об./об.) полный коктейль ингибиторов протеаз (Sigma) и 1% (об./об.) Triton X-100 в соотношении 1,0/1,5 (масс./об.), гомогенизировали до размораживания, а затем центрифугировали в течение 12 мин при 16300 g и 4°C. Тотальный растворимый белок в супернатанте количественно определяли с использованием анализа Брэдфорд (Coomassie Plus, Thermo Scientific), доводили до эквивалентных концентраций тотального белка на образец (как правило, 10-40 мкг), денатурировали в 1× буфере для образца NuPAGE LDS (Invitrogen) и разделяли на 4-12% геле Bis-Tris SDS/PAGE (Novex). После блоттинга на мембране из PVDF с использованием устройства iBlot (Invitrogen) проводили обнаружение белка с использованием 1⁰ поликлональных антител против PPD1 в разведении 1:5000, а затем 2⁰антител козы против антител кролика с HRP (Sigma) в разведении 1:5000, наносили реагент Western Bright ECL (Advansta) и получали изображение с использованием устройства ChemiDoc™ (BioRad).

Анализ биомассы корней трансформантов

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания (фиг.11). Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы (таблица 2).

Таблица 2

Масса, плевел Контроль вектора Конститутивный промотор::PPD арабидопсиса, линия 1 Конститутивный промотор::PPD арабидопсиса, линия 2 Конститутивный промотор::PPD арабидопсиса, линия 3 Конститутивный промотор::PPD арабидопсиса, линия 4 Средняя масса корней (г)
(n=12) 0,0733 0,0387 0,4506 0,5657 0,3077 0,3503 SE 0,0138 0,0125 0,0428 0,0625 0,0426 0,0638

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания (фиг.12). Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы (таблица 3 и таблица 4).

Таблица 3

Масса, плевел Контроль вектора pTobRB7Δ0.6::PPD арабидопсиса, линия 1 pTobRB7Δ0.6::PPD арабидопсиса, линия 2 pTobRB7Δ0.6::PPD арабидопсиса, линия 3 Средняя масса корней (г)
(n=12) 0,0733 0,0387 0,2338 0,3686 0,3704 SE 0,0138 0,0125 0,0357 0,0356 0,0611

Таблица 4

Масса, плевел Контроль вектора pTobRB7Δ1.3::PPD арабидопсиса, линия 1 pTobRB7Δ1.3::PPD арабидопсиса, линия 2 pTobRB7Δ1.3::PPD арабидопсиса, линия 3 pTobRB7Δ1.3::PPD арабидопсиса, линия 4 Средняя масса корней (г)
(n=12) 0,0733 0,0387 0,3227 0,2338 0,2720 0,4014 SE 0,0138 0,0125 0,0556 0,0191 0,0581 0,0445

Черенки приблизительно равного размера получали из растений люцерны WT и растений люцерны (сорт USD5), трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора. Черенки сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в помещении для выращивания с длительностью дня x часов; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений люцерны, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой (их фотографировали, фиг.12), затем прикрепленную надземную часть (листья и стебли) удаляли и корни сушили при 65°C в течение 48 ч, а затем взвешивали, таблица 5.

Таблица 5

Линия растений Объединенная сухая масса корней для 10 черенков (мг) Нетрансформированный контроль 43 Трансформированная линия 1 110 Трансформированная линия 2 54 Трансформированная линия 3 160 Трансформированная линия 4 59 Трансформированная линия 5 53 Трансформированная линия 6 85 Трансформированная линия 7 148

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD T. repens под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания (фиг.11). Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD M. acuminate под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD P. sitchensis под контролем конститутивного промотора. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD P. sitchensis под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD P. sitchensis под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD P. sitchensis под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги сеяли в пластмассовые мешки для выращивания, содержавшие горшечную смесь, и подрезали до равной высоты. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в теплице; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений плевела, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно было наблюдать путем изучения роста корней вне мешка для выращивания. Увеличение биомассы корней можно количественно определять путем промывания корней под проточной водой, затем удаления прикрепленной надземной части (листья и стебли) и высушивания корней при 65°C в течение 48 ч, а затем определения сухой массы.

На семена растений арабидопсиса WT и растений арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора наносили насечки, и их высевали в горшечную смесь. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в помещении для роста с длиной дня x часов; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений арабидопсиса, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT, можно было наблюдать путем изучения роста корней вне горшка. Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем прикрепленную надземную часть (листья и стебли) удаляли и корни сушили при 65°C в течение 48 ч, а затем взвешивали.

На семена растений арабидопсиса WT и растений арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора наносили насечки, и их высевали в горшечную смесь. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в помещении для роста с длиной дня x часов; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений арабидопсиса, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT можно наблюдать путем изучения роста корней вне горшка. Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем прикрепленную надземную часть (листья и стебли) удаляли и корни сушили при 65°C в течение 48 ч, а затем взвешивали.

На семена растений арабидопсиса WT и растений арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора наносили насечки, и их высевали в горшечную смесь. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в помещении для роста с длиной дня x часов; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений арабидопсиса, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT, можно было наблюдать путем изучения роста корней вне горшка. Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем прикрепленную надземную часть (листья и стебли) удаляли и корни сушили при 65°C в течение 48 ч, а затем взвешивали.

На семена растений арабидопсиса WT и растений арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD P. abies под контролем конститутивного промотора наносили насечки, и их высевали в горшечную смесь. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в помещении для роста с длиной дня x часов; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений арабидопсиса, трансформированных PPD P. abies под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT, можно было наблюдать путем изучения роста корней вне горшка. Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем прикрепленную надземную часть (листья и стебли) удаляли и корни сушили при 65°C в течение 48 ч, а затем взвешивали.

На семенах растений арабидопсиса WT и растений арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора делали насечки, и их высевали в горшечную смесь. Растения выращивали в течение приблизительно 6 недель в помещении для роста с длиной дня x часов; увеличение биомассы/роста/длины/ветвления корней растений арабидопсиса, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора, по сравнению с растениями WT, можно было наблюдать путем изучения роста корней вне горшка. Увеличение биомассы корней количественно определяли путем промывания корней проточной водой, затем прикрепленную надземную часть (листья и стебли) удаляли и корни сушили при 65°C в течение 48 ч, а затем взвешивали.

Анализ толерантности трансформантов к засухе

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD P. sitchensis под контролем конститутивного промотора. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD T. repens под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD M. acuminate под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD P. sitchensis под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) побегов получали из растений плевела WT и растений плевела, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем одного из трех промоторов корней. Побеги высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) проростков арабидопсиса WT и проростков арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD арабидопсиса под контролем конститутивного промотора, высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) проростков арабидопсиса WT и проростков арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD T. repens под контролем конститутивного промотора, весевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) проростков арабидопсиса WT и проростков арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD M. acuminate под контролем конститутивного промотора, высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) проростков арабидопсиса WT и проростков арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD A. trichopoda под контролем конститутивного промотора, высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) проростков арабидопсиса WT и проростков арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD P. abies под контролем конститутивного промотора, высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

Равное количество (как правило, 4-10) проростков арабидопсиса WT и проростков арабидопсиса Δppd, трансформированных PPD S. moellendorffii под контролем конститутивного промотора, высевали в большие горшки, содержавшие горшечную смесь и почву. Растениям позволяли акклиматизироваться в теплице перед тем, как половину растений каждого типа подвергали водяному стрессу (как правило, гравиметрическое содержание воды 12%, немного выше точки устойчивого завядания), в то время как другую половину оставляли поливаемой (как правило, гравиметрическое содержание воды 22%, приблизительная полевая влагоемкость). Увеличенную толерантность к стрессовому воздействию засухи у растений, сверхэкспрессирующих PPD, можно количественно определять путем сравнения биомассы корней и ростков с растениями WT.

ССЫЛКИ

Achard, P. Genschik P. (2009). Releasing the brakes of plant growth: how Gas shutdown DELLA proteins. J. Exp. Bot., 60:1985-1092.

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

Anjum, SA., Wang, LC., Farooq, M., Hussain, M., Zou, CM. (2011) Brassinolide application improves the drought tolerance in maize through modulation of enzymatic antioxidants and leaf gas exchange. J. Agronomy and Crop Sci. 197:177-185.

Chory and Wang, 2005, Genes involved in brassinosteroid hormone action in plants, US 6,921,848 B2

Clough S.J. and Bent A.F. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743.

Clouse, S.D. Brassinosteroid signal transduction: from receptor kinase activation to transcriptional networks regulating plant development. Plant Cell 23, 1219-1230 (2011).

Clouse, S. D. & Sasse, J. M. BRASSINOSTEROIDS: Essential regulators of plant growth and development. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 16, 427-451 (1998).

Gallego-Bartolome, J., Minguet, EG., Grau-Enguix, F., Abbas, M., Locascio, A., Thomas, SG., Alabadi, D., Blazquez, MA. (2012). Molecular mechanism for the interaction between gibberellin and brassionosteroid signalling pathways in Arabidopsis. PNAS, 109:13446-13451.

Garcia, M.E., Lynch, T., Peeters, J., Snowden, C. & Finkelstein, R. A small plant-specific protein family of ABI five binding proteins (AFPs) regulates stress response in germinating Arabidopsis seeds and seedlings. Plant Mol. Biol. 67, 643-658 (2008).

Guo, H., Li, L., Aluru, M., Sluru, S., Yin, Y. (2013). Mechanisms and networkes for brassinosteroid regulated gene expression. Current Opinion in Plant Biology 16:545-553.

He, J-X., Gendron, JM., Sun, Y., Gampaia, SL., Gendron, N., Sun, CQ., Wang, Z-Y. (2005). BZR1 is a transcriptional repressor with dual roles in brassinosteroid homeostasis and growth responses. Science 307:1634-1638.

Hothorn, M., Belkhadir, Y., Dreux, M., Dabi, T., Noel, J. P., Wilson, I. A. & Chory, J. Structural basis of steroid hormone perception by the receptor kinase BRI1. Nature 474, 467-471 (2011).

Hou, X., Lee LYC, Xia, K., Yan, Y., Yu H. (2010). DELLAs modulate jasmonate signalling via competitive binding to JAZs. Devel. Cell 19:884-894.

Jiang, W-B., Lin, W-H. (2013). Brassinosteroid functions in Arabidopsis seed development. Plant Signaling & Behavior 8:10, e25928; October 2013.

Jiang, L., Liu, X., Xiong, G., Liu, H., Chen, F., Wang, L., Meng, X., Liu, G., Yu, H., Yuan, Y., Yi, W., Zhao, L., Ma, H., He, Y., Wu, Z., Melcher, K., Qian, Q., Xu, H.E., Wang, Y. & Li, J. DWARF 53 acts as a repressor of strigolactone signalling in rice. Nature 504, 401-405 (2013).

Karimi, M., Inzé, D. & Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).

Khripach, V., Zhabinskii, V., Groot, AD. (2000). Twenty years of brassinosteroids: Steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century. Ann. Bot., 86:441-447.

Kinoshita, T., Caňo-Delgado, A., Seto, H., Hiranuma, S., Fujioka, S., Yoshida, S. & Chory, J. Binding of brassinosteroids to the extracellular domain of plant receptor kinase BRI1. Nature 433, 167-171 (2005).

Lawit, Kundu, Rao and Tomes, 2007, Isolated polynucleotide molecules corresponding to mutant and wild-type alleles of the maize D9 gene and methods of use, WO 2007124312 A2

Mathew, C., Hofmann, WA., Osborne, MA. (2009). Pasture response to gibberellins: A review and recommendations. NZ. J. Agric. Res., 52:213-225.

Pauwels, L., Barbero, G.F., Geerink, J., Tilleman, S., Grunewald, W., Pérez, A.C., Chico, J.M., Bossche, R.V., Sewell, J., Gil, E., Garcia-Casado, G., Witters, E., Inzé, D., Long, J.A., Jaeger, G.D., Solano, R. & Goossens, A. NINJA connects the co-repressor TOPLESS to jasmonate signalling. Nature 464, 788-791 (2010).

Pérez, A.C., Durand, A.N., Bossche, R.V., De Clercq, R., Persiau, G., Van Wees, S.C.M., Pieterse, C.M.J., Gevaert, K., De Jaeger, G., Goossens, A. & Pauwels, L. The non-JAZ TIFY protein TIFY8 from Arabidopsis thaliana is a transcriptional repressor. PLos ONE 9, e84891 (2014).

Prusakova, LD., Ezhov, MN., Salnikov, AI. (1999). The use of emistim, epibrassinolide and uniconazole to overcome quality difference of buckwheat grains. Agrarian Russia: 41-44.

Robatzek and Somssich (2001). The Plant Journal, 28: 123-133

She, J., Han, Z., Kim, T. W., Wang, J., Cheng, W., Chang, J., Shi, S., Wang, J., Yang, M., Wang, Z-Y. & Chai, J. Structural insight into brassinosteroid perception by BRI1. Nature 474, 472-476 (2011).

Sun, T-P. (2011). The molecular mechanism and evolution of the GA-GID1-DELLA signalling module in plants. Review. Current Biology, 21:R338-R345.

Szemenyei, H., Hannon, M. & Long, J.A. TOPLESS mediates auxin-dependent transcriptional repression during Arabidopsis embryogenesis. Science 319, 1384-1386 (2008).

Thummel, C. S. & Chory, J. Steroid signalling in plants and insects-common themes, different pathways. Genes Dev. 16, 3113-3129 (2002).

Vanhaeren, H., Gonzalez, N, Coppens, F, De Milde, L, Van Daele, T, Vermeesch, M, Eloy, NB, Storme, V, Inez, D. (2014). Combining growth-promoting genes leads topositive epistasis in Arabidopsis thaliana. eLife 2014;3:e02252. DOI: 10.7554/eLife.02252

Vanholme, B., Grunewald, W., Bateman, A., Kohchi, T., Gheysen, G. (2007). The tify family previously known as ZIM. Trends in Plant Science, 12:239-244.

Vardhini, BV. (2012). Application of brassinolide mitigates saline stress of certain metabolites of sorghum grown in Karaikal. J. Phytology, 4:1-3.

Wang, Z-Y., Nakano T., Gendron, J., He, J., Chen, M., Vafeados, D., Yang, Y., Fujioka, S., Yoshida, S., Asami, T., Chory, J. (2002). Nuclear-localised BZR1 mediates brassinosteroid-induced growth and feedback suppression of brassinosteroid biosynthesis. Developmental Cell 2:505-513.

Wang, C-M., Shang, J-X., Chen, Q-X., Oses-Prieto, J.A., Bai, M-Y, Yang, Y., Yuan, M., Zhang, Y-L., Mu, C-C., Deng, Z., Wei C-Q., Burlingame, A.L., Wang, Z-Y. & Sun, Y. Identification of BZR1-interacting proteins as potential components of the brassinosteroid signalling pathway in Arabidopsis through tandem affinity purification. Mol. Cell. Proteomics 12, 3653-3665 (2013).

Winichayakul, S., Pernthaner, A., Scott, R., Vlaming, R. & Roberts, N. (2008) Head-to-tail fusions of camelid antibodies can be expressed in planta and bind in rumen fluid. Biotech. & Appl. Biochem. 53, 111-122.

White, D. (2006) PEAPOD regulates lamina size and curvature in Arabidopsis. PNAS, 103:13238-13243.

White, D. (2007). Novel plant genes and uses thereof, WO 2007105967A8.

Yamamoto et al (1991). Characterization of cis-acting sequences regulating root-specific gene expression in tobacco. Plant Cell, 3:371-382.

Zhu, J-Y., Sae-Seaw, J. & Wang, Z-Y. Brassinosteroid signalling. Development 140, 1615-1620 (2013).

ОБОБЩЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: Тип последовательности Вид/источник Эталон 1 полипептид Arabidopsis thaliana Белок PEAPOD 1 2 полипептид Arabidopsis thaliana Белок PEAPOD 2 3 полипептид Populus euphratica Белок PEAPOD 4 полипептид Picea abies Белок PEAPOD 5 Полипептид Picea sitchensis Белок PEAPOD 6 полипептид Gossypium raimondii Белок PEAPOD 7 полипептид Aquilegia coerulea Белок PEAPOD 1 8 полипептид Aquilegia coerulea Белок PEAPOD 2 9 полипептид Medicago truncatula Белок PEAPOD 10 полипептид Solanum lycopersicum Белок PEAPOD 11 полипептид Trifolium repens Белок PEAPOD 12 полипептид Amborella A. Trichopoda Белок PEAPOD 13 полипептид Selaginella moellendorffii Белок PEAPOD 1 14 полипептид Selaginella moellendorffii Белок PEAPOD 2 15 полипептид Nicotiana tabacum Белок PEAPOD 16 полипептид Solanum tuberosum Белок PEAPOD 17 полипептид Glycine max Белок PEAPOD 18 полипептид Citrus clementine Белок PEAPOD 19 полипептид Ricinus communus Белок PEAPOD 20 полипептид Vitis vinifera Белок PEAPOD 21 полипептид Morus notabilis Белок PEAPOD 22 полипептид Phoenix dactylifera Белок PEAPOD 23 полипептид Theobroma cacao Белок PEAPOD 24 полипептид Spirodela polyrhiza Белок PEAPOD 25 полипептид Вид Musa Белок PEAPOD 26 полипептид Phalaenopsis aphrodite Белок PEAPOD 27 полипептид Искусственная Внутренняя область PPD1 арабидопсиса из 46 аминокислот 28 полипептид искусственная Внутренний консенсусный мотив 1 из 46 аминокислот, идентичные остатки 29 полипептид искусственная Внутренний консенсусный мотив 2 из 46 аминокислот, вариабельные остатки 30 полипептид искусственная Внутренняя область PPD1 арабидопсиса из 27 аминокислот 31 полипептид искусственная Внутренний консенсусный мотив 1 из 27 аминокислот, идентичные остатки 32 полипептид искусственная Внутренний консенсусный мотив 2 из 27 аминокислот, вариабельные остатки 33 полипептид искусственная Мотив TIFY из 6 аминокислот из PPD1 арабидопсиса 34 полипептид искусственная Консенсусный мотив 1 TIFY из 6 аминокислот, идентичные остатки 35 полипептид искусственная Консенсусный мотив 2 TIFY из 6 аминокислот, вариабельные остатки 36 полипептид искусственная Пептидная последовательность хвостовой части V5-HIS PPD1, экспрессируемая в корнях 37 полипептид искусственная Линкер и пептидная последовательность хвостовой части V5-His 38 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1 (без хвостовой части), экспрессируемая в корнях 39 полинуклеотид Последовательность нуклеиновой кислоты интрона 3 DGAT1 Arabidopsis thaliana 40 полинуклеотид искусственная Синтезированная GenScript оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирующей области PPD1 арабидопсиса (с интроном) для экспрессии в корнях двудольных растений под контролем промотора TobRB7 Δ1.3корней табака; промотора TobRB7 Δ0.6 корней табака 41 полинуклеотид искусственная Синтезированная GenScript оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирующей области PPD1 арабидопсиса (с интроном) для экспрессии в корнях двудольных растений под контролем промотора AtWRKY6 корней арабидопсиса 42 полинуклеотид искусственная Последовательность нуклеиновой кислоты экспрессирующей кассеты промотор TobRB7 Δ1.3::attB1:: оптимизированный PPD арабидопсиса-V5-His(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 43 полинуклеотид искусственная Последовательность нуклеиновой кислоты экспрессирующей кассеты промотор TobRB7 Δ0.6::attB1:: оптимизированный PPD арабидопсиса-V5-His(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 44 полинуклеотид искусственная Последовательность нуклеиновой кислоты экспрессирующей кассеты промотор AtWRKY6::attB1:: оптимизированный PPD арабидопсиса-V5-His(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 45 полинуклеотид искусственная Экспрессирующая кассета промотор TobRB7 Δ1.3 promoter::attB1:: оптимизированный PPD арабидопсиса (ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 46 полинуклеотид искусственная Экспрессирующая кассета промотор TobRB7 Δ0.6::attB1:: оптимизированный PPD арабидопсиса (ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 47 полинуклеотид искусственная Экспрессирующая кассета промотор AtWRKY6::attB1:: оптимизированный PPD арабидопсиса (ИНТРОН)::attB2::терминатор nos. 48 полинуклеотид Последовательность нуклеиновой кислоты интрона 3 DGAT1 Lolium perenne 49 полинуклеотид искусственная Синтезированная GENEART оптимизированная для риса последовательность нуклеиновой кислоты кодирующей области PPD1 (с интроном) для экспрессии в корнях трав с использованием промотора TobRB7 Δ1.3 корней табака; промотора TobRB7 Δ0.6 корней табака; и промотора AtWRKY6 корней арабидопсиса. 50 полинуклеотид искусственная Последовательность нуклеиновой кислоты экспрессирующей кассеты промотор TobRB7 Δ1.3::attB1::оптимизированный для риса PPD-V5-His(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 51 полинуклеотид искусственная Последовательность нуклеиновой кислоты экспрессирующей кассеты промотор TobRB7 Δ0.6::attB1::оптимизированный для риса PPD-V5-His(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 52 полинуклеотид искусственная Последовательность нуклеиновой кислоты экспрессирующей кассеты промотор AtWRKY6::attB1::оптимизированный для риса PPD-V5-His(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 53 полинуклеотид искусственная Экспрессирующая кассета промотор TobRB7 Δ1.3::attB1::оптимизированный для риса PPD(ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 54 полинуклеотид искусственная Экспрессирующая кассета промотор TobRB7 Δ0.6::attB1::оптимизированный для риса PPD (ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 55 полинуклеотид искусственная Промотор AtWRKY6::attB1::оптимизированный для риса PPD (ИНТРОН)::attB2::терминатор nos 56 полипептид искусственная Пептидная последовательность ДНК-связывающего домена (DBD) дрожжевого двухгибрида (Y2H) 57 полипептид искусственная Пептидная последовательность домена активации (AD) Y2H 58 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-DBD Y2H 59 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-AD Y2H 60 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-ppd-AD Y2H 61 полипептид искусственная Пептидная последовательность Y2H PPD1-tify-AD 62 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-jas*-AD Y2H 63 полипептид искусственная Пептидная последовательность TPL 64 полипептид искусственная Пептидная последовательность TPL-DBD Y2H 65 полипептид искусственная Пептидная последовательность NINJA 66 полипептид искусственная Пептидная последовательность NINJA-AD Y2H 67 полипептид искусственная Пептидная последовательность BZR1-AD Y2H 68 полипептид искусственная Пептидная последовательность RGA1 Y2H 69 полипептид искусственная Пептидная последовательность RGA1-AD Y2H 70 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-ppd-DBD Y2H 71 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-tify-DBD Y2H 72 полипептид искусственная Пептидная последовательность PPD1-jas*-DBD Y2H 73 полипептид искусственная Пептидная последовательность nYFP для бимолекулярной флуоресценции (BiFC) 74 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP BiFC 75 полипептид искусственная Пептидная последовательность nYFP-NINJA BiFC 76 полипептид искусственная Пептидная последовательность nYFP-BZR1 BiFC 77 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP-PPD1 BiFC 78 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP-NINJA BiFC 79 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP-BZR1 BiFC 80 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP-PPD1-ppd BiFC 81 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP-PPD1-tify BiFC 82 полипептид искусственная Пептидная последовательность cYFP-PPD1-jas* BiFC 83 полинуклеотид Arabidopsis thaliana Кодирующая последовательность PPD1 Arabidopsis thaliana 84 Полинуклеотид Arabidopsis thaliana Кодирующая последовательность PPD2 Arabidopsis thaliana 85 Полинуклеотид Populus euphratica Кодирующая последовательность PPD Populus trichocarpa 86 Полинуклеотид Picea abies Геномная последовательность PPD Picea abies 87 Полинуклеотид Gossypium raimondii Gossypium raimondii, кодирующая последовательность PPD 88 Полинуклеотид Aquilegia coerulea Aquilegia coerulea, кодирующая последовательность 1 PPD 89 Полинуклеотид Aquilegia coerulea Aquilegia coerulea, кодирующая последовательность 2 PPD 90 Полинуклеотид Medicago truncatula Medicago truncatula, кодирующая последовательность PPD 91 Полинуклеотид Solanum lycopersicum Solanum lycopersicum, кодирующая последовательность PPD 92 Полинуклеотид Trifolium repens Trifolium repens, кодирующая последовательность PPD 93 Полинуклеотид Amborella trichopoda Amborella trichopoda, кодирующая последовательность PPD 94 Полинуклеотид Selaginella moellendorffii Selaginella moellendorffii, кодирующая последовательность 1 PPD 95 Полинуклеотид Selaginella moellendorffii Selaginella moellendorffii, кодирующая последовательность 2 PPD 96 Полинуклеотид Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum, кодирующая последовательность PPD 97 Полинуклеотид Solanum tuberosum Solanum tuberosum, кодирующая последовательность PPD 98 Полинуклеотид Glycine max Glycine max, кодирующая последовательность PPD 99 Полинуклеотид Citrus clementine Citrus clementine, кодирующая последовательность PPD 100 Полинуклеотид Ricinus communus Ricinus communus, кодирующая последовательность PPD 101 Полинуклеотид Vitis vinifera Vitis vinifera, кодирующая последовательность PPD 102 Полинуклеотид Morus notabilis Morus notabilis, кодирующая последовательность PPD 103 Полинуклеотид Phoenix dactylifera Phoenix dactylifera, кодирующая последовательность PPD 104 Полинуклеотид Theobroma cacao Theobroma cacao, кодирующая последовательность PPD 105 Полинуклеотид Spirodela polyrhiza Spirodela Polyrhiza, геномная последовательность PPD 106 Полинуклеотид Вид Musa Вид Musa, кодирующая последовательность PPD 107 Полинуклеотид Phalaenopsis aphrodite Phalaenopsis aphrodite, кодирующая последовательность PPD 108 Полипептид искусственная PPD1 Arabidopsis thaliana+V5-His-метка 109 Полипептид искусственная PPD Trifolium repens+V5-His-метка 110 Полипептид искусственная PPD Amborella trichopoda+V5-His-метка 111 Полипептид искусственная PPD Musa acuminate+V5-His-метка 112 Полипептид искусственная PPD Picea sitchensis+V5-His-метка 113 Полипептид искусственная PPD Selaginella moellendorffii+V5-His-метка 114 Полипептид искусственная PPD Arabidopsis thaliana - без метки 115 Полипептид искусственная PPD Trifolium repens- без метки 116 Полипептид искусственная PPD Amborella trichopoda - без метки 117 Полипептид искусственная PPD Musa acuminate- без метки 118 Полипептид искусственная PPD Picea abies - без метки 119 Полипептид искусственная PPD Selaginella moellendorffii - без метки 120 Полинуклеотид искусственная PPD Arabidopsis thaliana - оптимизированная для однодольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 121 Полинуклеотид искусственная PPD Trifolium repens - оптимизированная для однодольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 122 Полинуклеотид искусственная PPD Amborella trichopoda - оптимизированная для однодольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 123 Полинуклеотид искусственная PPD Musa acuminate - оптимизированная для однодольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 124 Полинуклеотид искусственная PPD Picea sitchensis- оптимизированная для однодольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 125 Полинуклеотид искусственная PPD Selaginella moellendorffii - оптимизированная для однодольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 126 Полинуклеотид искусственная PPD Arabidopsis thaliana - оптимизированная для двудольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 127 Полинуклеотид искусственная PPD Trifolium repens - оптимизированная для двудольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 128 Полинуклеотид искусственная PPD Amborella trichopoda - оптимизированная для двудольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 129 Полинуклеотид искусственная PPD Musa acuminate - оптимизированная для двудольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 130 Полинуклеотид искусственная PPD Picea abies - оптимизированная для двудольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 131 Полинуклеотид искусственная PPD Selaginella moellendorffii - оптимизированная для двудольных растений последовательность нуклеиновой кислоты 132 Полинуклеотид искусственная Праймер, ocs3'-1f 133 Полинуклеотид искусственная Праймер, ocs3'-1r 134 Полинуклеотид искусственная Праймер, hpt-1 135 Полинуклеотид искусственная Праймер, hpt-2 136 Полинуклеотид искусственная Праймер, nos3'-1f 137 Полинуклеотид искусственная Праймер, nos3'-1r 138 Полинуклеотид искусственная Праймер, rgh1 139 Полинуклеотид искусственная Праймер, rgh5 140 Полинуклеотид искусственная Праймер, GrPPD1F 141 Полинуклеотид искусственная Праймер, GrPPD1R

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

<110> AGRESEARCH LIMITED

<120> СПОСОБЫ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ РАСТЕНИЙ

<130> 791261 HCF/mjw

<150> NZ 701643

<151> 2014-11-04

<160> 141

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 313

<212> БЕЛОК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

Met Asp Val Gly Val Ser Pro Ala Lys Ser Ile Leu Ala Lys Pro Leu

1 5 10 15

Lys Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Glu Pro

50 55 60

Gly Asp Asp Ser Gly Ala Gly Ile Phe Arg Lys Ile Leu Val Ser Gln

65 70 75 80

Pro Val Asn Pro Pro Arg Val Thr Thr Thr Leu Ile Glu Pro Ser Asn

85 90 95

Glu Leu Glu Ala Cys Gly Arg Val Ser Tyr Pro Glu Asp Asn Gly Ala

100 105 110

Cys His Arg Met Asp Ser Pro Arg Ser Ala Glu Phe Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Gly His Phe Val Ser Glu Lys Asp Gly His Lys Thr Thr Ile Ser Pro

130 135 140

Arg Ser Pro Ala Glu Thr Ser Glu Leu Val Gly Gln Met Thr Ile Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Ile Pro Pro Glu Lys Ala

165 170 175

Arg Ser Ile Met His Phe Ala Ala Asn Pro Ile Asp Leu Pro Glu Asn

180 185 190

Gly Ile Phe Ala Ser Ser Arg Met Ile Ser Lys Leu Ile Ser Lys Glu

195 200 205

Lys Met Met Glu Leu Pro Gln Lys Gly Leu Glu Lys Ala Asn Ser Ser

210 215 220

Arg Asp Ser Gly Met Glu Gly Gln Ala Asn Arg Lys Val Ser Leu Gln

225 230 235 240

Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asp Arg Lys Phe Ser Lys Ala Lys Lys

245 250 255

Cys Pro Gly Val Ala Ser Ser Ser Leu Glu Met Phe Leu Asn Cys Gln

260 265 270

Pro Arg Met Lys Ala Ala Tyr Ser Gln Asn Leu Gly Cys Thr Gly Ser

275 280 285

Pro Leu His Ser Gln Ser Pro Glu Ser Gln Thr Lys Ser Pro Asn Leu

290 295 300

Ser Val Asp Leu Asn Ser Glu Gly Ile

305 310

<210> 2

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

Met Asp Val Gly Val Thr Thr Ala Lys Ser Ile Leu Glu Lys Pro Leu

1 5 10 15

Lys Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Glu Pro

50 55 60

Gly Asp Asp Ser Gly Ala Gly Ile Leu Arg Lys Ile Leu Val Ser Gln

65 70 75 80

Pro Pro Asn Pro Pro Arg Val Thr Thr Thr Leu Ile Glu Pro Arg Asn

85 90 95

Glu Leu Glu Ala Cys Gly Arg Ile Pro Leu Gln Glu Asp Asp Gly Ala

100 105 110

Cys His Arg Arg Asp Ser Pro Arg Ser Ala Glu Phe Ser Gly Ser Ser

115 120 125

Gly Gln Phe Val Ala Asp Lys Asp Ser His Lys Thr Val Ser Val Ser

130 135 140

Pro Arg Ser Pro Ala Glu Thr Asn Ala Val Val Gly Gln Met Thr Ile

145 150 155 160

Phe Tyr Ser Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Val Pro Pro Glu Lys

165 170 175

Ala Arg Ser Ile Met His Phe Ala Ala Asn Pro Ile Asp Leu Pro Glu

180 185 190

Asn Gly Ile Phe Ala Ser Ser Arg Met Ile Ser Lys Pro Met Ser Lys

195 200 205

Glu Lys Met Val Glu Leu Pro Gln Tyr Gly Leu Glu Lys Ala Pro Ala

210 215 220

Ser Arg Asp Ser Asp Val Glu Gly Gln Ala Asn Arg Lys Val Ser Leu

225 230 235 240

Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Arg Phe Ser Lys Thr Lys

245 250 255

Lys Ala Pro Gly Val Ala Ser Ser Ser Leu Glu Met Phe Leu Asn Arg

260 265 270

Gln Pro Arg Met Asn Ala Ala Tyr Ser Gln Asn Leu Ser Gly Thr Gly

275 280 285

His Cys Glu Ser Pro Glu Asn Gln Thr Lys Ser Pro Asn Ile Ser Val

290 295 300

Asp Leu Asn Ser Asp Leu Asn Ser Glu Asp Asn

305 310 315

<210> 3

<211> 375

<212> БЕЛОК

<213> Populus trichocarpa

<400> 3

Met Gln Pro Gly Glu Thr Val Phe Arg Ser Ala Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

His Gln Leu Thr Glu Asp Asp Ile Ser Gln Val Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ala

50 55 60

Thr Pro Glu Thr Glu Ser Pro Arg Arg Arg Leu Tyr Ile Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Pro His Pro Pro Asp Asn Thr Pro Arg Val Arg Phe Ser Ala Val

85 90 95

Pro Pro Asn Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ala Ser Ala Glu Thr Pro

100 105 110

Ile Ser Val Pro Ala Glu Glu Pro Val Pro Cys Arg Gln His Asp Pro

115 120 125

Pro Asn Pro Asp Asp Pro Ala Asp Pro Leu Pro Pro Val His Ala Ala

130 135 140

Val Thr Glu Asn Ala Ser Val Ser Pro Arg Thr Thr Gly Met Ala Glu

145 150 155 160

Glu Ser Ala Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val

165 170 175

Tyr Asp Asp Val Pro Gly Asp Lys Ala Gln Ala Ile Met His Leu Ala

180 185 190

Ala Ser Pro Phe Ala Pro Pro Gln Asp Ala Ser Ser Asp Val Ile Pro

195 200 205

Thr Leu Arg Pro Leu Gln Cys Gln Leu Asp Thr Pro Gly Val Lys Ala

210 215 220

Ala Pro Asn Ser Ile Val Ala Asn Phe Pro Thr Leu Pro Thr Val Lys

225 230 235 240

Gly Ala Asp Ser Gly Gln Leu Leu Trp Glu Glu Ser Asn Ile Ala Arg

245 250 255

Glu Asp Asn Leu Glu Gly Ser Thr Ser Arg Lys Ala Ser Leu Gln Arg

260 265 270

Tyr Phe Glu Lys Lys Lys Asp Arg Phe Lys Asn Lys Arg Lys Val Ala

275 280 285

Val Pro Ser Ala Ser Leu Asp Val Phe Leu Ser His Leu Val Gly Asp

290 295 300

Gln Ile Ser Asn Asp His Trp Asn Leu Asn Asp Ala Cys Ser Pro Ser

305 310 315 320

Gln Pro Arg Pro Pro Gln Thr Pro Asn Arg Cys Asn Ser Val Asp Asn

325 330 335

Val Ala Lys Asn Gly Ile Leu Lys Ala Asp Leu Asn Asn Lys Gly Asp

340 345 350

Ala Asp Leu Ser Cys Cys Leu Asp Phe Ser Ser Lys Gln Ile Asn Ala

355 360 365

Trp Cys Leu Cys Leu Gly Cys

370 375

<210> 4

<211> 346

<212> БЕЛОК

<213> Picea abies

<400> 4

Met Arg Gly Gly Gly Gly Ala Asp Arg Leu Pro Ala Arg Ala Asn Leu

1 5 10 15

Glu Lys Pro Leu Glu Asp Leu Ser His Glu Asp Ile Met Gln Leu Thr

20 25 30

Arg Glu Asp Cys Arg Arg Tyr Leu Ile Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro

35 40 45

Ser Trp Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Lys

50 55 60

Leu Phe Glu Ser Gly Pro Asn Asp Glu Lys Arg Ser Ala Ala Thr Asn

65 70 75 80

Arg Pro Asn Pro Asp Glu Asn Leu Lys Glu Ala Ala Ser Val Ser Leu

85 90 95

Leu Tyr Gly Ser Gln Pro Glu Ser Pro Ser Val Val Phe Ala Ser Lys

100 105 110

Asp Ser Asp Thr Phe Asn Leu Glu Trp Leu Ala Lys Thr Glu Leu Pro

115 120 125

Val Leu Ala Ser Gln Pro Arg His Ile Ala Gln Gln Asn Val Phe Leu

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Gln Gln Ser Gly Ala Gln Leu Thr Ile Phe Tyr

145 150 155 160

Ser Gly Asn Val Asn Val Tyr Asp Asp Val Pro Ala Glu Lys Ala Gln

165 170 175

Glu Ile Met Leu Leu Ala Gly Ser Gly Asn Tyr Pro Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Cys Gln Ser Thr Arg Asn Thr Gln Gln Asn Ala Val Arg Ala Ala Tyr

195 200 205

Pro Ser Asn Pro Thr Asn Thr Pro Phe Ile His Gly Val Gly Pro Pro

210 215 220

Leu Ala Thr Val Ala Ser Ser Ser Val Met Ser Ser Pro Ile His Lys

225 230 235 240

Glu Ser Pro Ile Thr Arg Lys Ala Ser Leu Gln Arg Phe Leu Glu Lys

245 250 255

Arg Lys Asp Arg Ser Arg Gly Lys Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Lys

260 265 270

Lys Pro Leu Leu Met Gly Met Phe Met His Pro Ser Ile Val His Arg

275 280 285

Gln Tyr Trp Thr Asp Thr Ala Lys Arg Lys Ser Gly Lys Pro Asp Ile

290 295 300

Pro Ala Ser Ile Ser Pro Thr Arg Pro Pro His Thr Pro Arg Arg Thr

305 310 315 320

Ser Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ala Arg His Ala Arg Gly Asp Ile Ser

325 330 335

Ala Gln Gly Gly Ser Leu His Asn Ser Asn

340 345

<210> 5

<211> 222

<212> БЕЛОК

<213> Picea sitchensis

<400> 5

Met Arg Gly Gly Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Pro Ser Leu Asp Lys

1 5 10 15

Pro Leu Glu Glu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Phe Gln Leu Thr Arg Glu

20 25 30

Asp Cys Arg Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp

35 40 45

Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ser Leu Phe

50 55 60

Glu Ser Lys Pro Asn Gln Gln Ser Lys Lys Pro Ser Lys His Lys Pro

65 70 75 80

Ala Thr Leu Gln Phe Glu Thr Ala Arg Asp Ser Thr Phe Ala Gln Ser

85 90 95

Ser Val Ser Gln Glu Gln Ser Leu Gly Phe Ser Trp Ser Lys Glu Val

100 105 110

Leu Asp Lys Gly Thr Ala Glu Arg Gln Arg Leu Cys Ser Asp Ser Gln

115 120 125

Glu Ala His Glu Ile Pro Arg Leu Gly Ser Lys Pro Pro Gln Ser Asn

130 135 140

Thr Glu Gly Lys Arg Cys Ala His Asp Gly His Gly Arg Lys Ser Ala

145 150 155 160

Gln Pro Leu Val Arg Leu Pro Ala Asn Phe Lys Asn Asp Cys Ser Asn

165 170 175

Arg Gln Ser Ser His Thr Ser Glu Ser Gln Pro Asp Thr Leu Leu Arg

180 185 190

Ser Asp Ser Phe Gln Gln Pro Thr Ala Gln Leu Thr Ile Phe Tyr Ala

195 200 205

Gly Met Val Asn Val Tyr Asp Asp Val Pro Leu Asp Lys Ala

210 215 220

<210> 6

<211> 365

<212> БЕЛОК

<213> Gossypium raimondii

<400> 6

Met Glu Ala Gly Val Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ser Phe Ser

1 5 10 15

Ser Ile Leu Asp Lys Pro Leu Ser Gln Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser

20 25 30

Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys Arg Lys Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met

35 40 45

Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser

50 55 60

Phe Lys Ala Leu Leu Glu Ser Asn Glu Asp Ser Gly Ala Gly Ala Arg

65 70 75 80

Arg Lys Ile Leu Val Cys Pro Pro Pro Ser His Phe Pro Pro Gln Asn

85 90 95

Ala Val Ala Ser Asn Ser Gly Glu Ser Val Lys Glu Ala Val Phe Gly

100 105 110

Glu Glu Glu Ser Leu Tyr Gly Gln Lys Asp Leu Ser Leu Lys Ala Ala

115 120 125

Pro Val Val Gln Met Asn Cys Gln Gly Gly Asp Thr Asp Asp Lys Thr

130 135 140

Leu Ser Pro Ser Leu Gly Ser Pro Arg Glu Tyr Ser Lys Leu Pro Gly

145 150 155 160

Arg Ser Gln Cys Glu Thr Asn Glu Leu Gly Gly Gln Met Thr Ile Phe

165 170 175

Tyr Cys Gly Lys Ile Asn Val Tyr Asp Gly Val Pro Leu Ala Lys Ala

180 185 190

Arg Ala Ile Met His Leu Ala Ala Ser Pro Ile Asp Phe Pro Gln Gly

195 200 205

Asn Leu Cys Asn Gln Asn Gly Ala Phe Arg Ser Phe Leu Gly His Val

210 215 220

Gln Glu Ala Glu Asp Lys Asn Asp Leu Thr Ser Ser Ile Ala Leu Asn

225 230 235 240

Leu Asn Ser His Thr Met His Thr Glu Lys Met Thr Glu Tyr Gln Gln

245 250 255

Gln Phe Arg Gly Lys Ala Asn Ile Ser Arg Asp Ser Asp Val Asp Gly

260 265 270

Gln Val Ser Arg Lys Glu Ser Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys

275 280 285

Asp Arg Gly Arg Phe Phe Lys Gly Arg Lys Asn Ala Gly Gln Ala Leu

290 295 300

Ser Ser Ser Glu Met Tyr Leu Asn His Gln Ile Arg Ala His Tyr Leu

305 310 315 320

Asn Gly Gln Thr Asn Gln Ser Arg Thr Ser Ser Pro Pro Gln Ser Gly

325 330 335

Val Pro His Ala Phe Tyr Ser Ser Ala Asp Asn Gln Glu Leu Val Asn

340 345 350

Phe Ser Val Asp Leu Asn Asp Glu Gly Gly Gln Glu His

355 360 365

<210> 7

<211> 357

<212> БЕЛОК

<213> Aquilegia coerulea

<400> 7

Met Lys Pro Asp Glu Thr Val Ser Arg Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Phe Gln Leu Thr Asp Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Phe Leu Arg Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Glu Gln Val Ile Ser Leu Lys Thr Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Arg Thr Glu Ser Asp Thr Asn Ala Thr Gly Ile Arg Gln Lys Leu Leu

65 70 75 80

Val Ser Arg Leu Glu Asn Ser Thr Gln Val Pro Leu Asn Asp Lys Thr

85 90 95

Asn Ala Ser Asn Leu Lys Thr Ser Val Gln Ala Ile Asn Ser Gly Lys

100 105 110

Ala Asp Ile His Gly Asp Arg Pro Cys Arg Val Pro Val Pro Val Pro

115 120 125

Asp Asp Asn Thr Ile Thr Val Pro Val Pro Asp Asn Asn Thr Ile Thr

130 135 140

Val Pro Val Pro Asp Asn Asn Ile Thr Ser Ser Arg Asn Leu Asn Ser

145 150 155 160

Thr Asn Gly Leu Val Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val

165 170 175

Ile Val Tyr Asp Asp Met Pro Ala Glu Lys Ala His Ala Ile Met Lys

180 185 190

Phe Ala Gly Ser His Ile Asn Val Pro Glu Asp Ser Ser Pro Ala Gly

195 200 205

Ala Ala Val Ile Gln Ser Phe Ala Cys Gln Leu Gln Ala Ala Ser Ile

210 215 220

Arg His Gly Leu Ala Phe Pro Ser Ala Val Ser Pro Pro Leu His Asn

225 230 235 240

Val Val Ala Asp Thr Ser Gln His Cys Arg Glu Glu Val Thr Val Ser

245 250 255

Arg Glu Val Glu Pro Glu Gly Pro Val Ser Arg Lys Ala Ser Val Gln

260 265 270

Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg Phe Lys Asn Lys Arg

275 280 285

Lys Ile Glu Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ile Tyr Leu Asn His Gln Leu

290 295 300

Gly Asp Gln Tyr Leu Asn Glu Lys Ser Ser Gln Ser Arg Ala Cys Ser

305 310 315 320

Pro Pro Gln Pro Arg Ala Pro His Thr Pro Thr Arg Cys Ser Ser Val

325 330 335

Glu Asn Gln Val Thr Asn Val Val Phe Ser Ile Asp Leu Asn Asp Asn

340 345 350

Asp Val Arg Glu Gly

355

<210> 8

<211> 347

<212> БЕЛОК

<213> Aquilegia coerulea

<400> 8

Met Lys Pro Asp Glu Thr Val Ser Arg Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Phe Gln Leu Thr Asp Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Phe Leu Arg Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Glu Gln Val Ile Ser Leu Lys Thr Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Arg Thr Glu Ser Asp Thr Asn Ala Thr Gly Ile Arg Gln Lys Leu Leu

65 70 75 80

Val Ser Arg Leu Glu Asn Ser Thr Gln Val Pro Leu Asn Asp Lys Thr

85 90 95

Asn Ala Ser Asn Leu Lys Thr Ser Val Gln Ala Ile Asn Ser Gly Glu

100 105 110

Ala Asp Ile His Gly Asp Arg Pro Cys Arg Val Pro Val Pro Val Pro

115 120 125

Asp Asp Asn Thr Ile Thr Val Pro Val Pro Asp Asn Asn Ile Thr Ser

130 135 140

Ser Arg Asn Leu Asn Ser Thr Asn Gly Leu Val Gly Gln Met Thr Ile

145 150 155 160

Phe Tyr Cys Gly Lys Val Ile Val Tyr Asp Gly Met Pro Ala Glu Lys

165 170 175

Ala His Ala Ile Met Lys Phe Ala Gly Ser His Ile Asn Val Pro Glu

180 185 190

Asp Ser Ser Pro Ala Gly Ala Ala Val Ile Gln Ser Phe Ala Cys Gln

195 200 205

Leu Gln Ala Ala Ser Ile Arg His Gly Leu Ala Phe Pro Ser Ala Val

210 215 220

Ser Pro Pro Leu His Asn Val Val Ala Asp Thr Ser Gln His Cys Arg

225 230 235 240

Glu Glu Val Thr Val Ser Arg Glu Val Glu Pro Glu Gly Pro Val Ser

245 250 255

Arg Lys Ala Ser Val Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly

260 265 270

Arg Phe Lys Asn Lys Arg Lys Ile Glu Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Tyr Leu Asn His Gln Leu Gly Asp Gln Tyr Leu Asn Glu Lys Ser Ser

290 295 300

Gln Ser Arg Ala Cys Ser Pro Pro Gln Pro Arg Ala Pro His Thr Pro

305 310 315 320

Thr Arg Cys Ser Ser Val Glu Asn Gln Val Thr Asn Val Val Phe Ser

325 330 335

Ile Asp Leu Asn Asp Asn Asp Val Arg Glu Gly

340 345

<210> 9

<211> 328

<212> БЕЛОК

<213> Medicago truncatula

<400> 9

Met Asn Gly Gly Ser Thr Val Ser Phe Arg Ser Ile Leu Asp Arg Pro

1 5 10 15

Leu Asn Gln Leu Thr Glu Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp

20 25 30

Cys Arg Arg Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn

35 40 45

Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu

50 55 60

Pro Thr Asp Asp Asp Ile Pro Ala Thr Val Gly Val Gly Val Ser Ser

65 70 75 80

Ala Ile His His His His His His His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Lys

85 90 95

Ala Leu Asp Pro Glu Asp Thr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Ser Thr Ser

100 105 110

Pro Val Ala Glu Arg Pro Thr Glu Thr Asn Asp Ala Asn Val Val Asn

115 120 125

Asn Pro Gly Gly Cys Ala Pro Ser Gly Ser Phe Gly Gln Met Thr Ile

130 135 140

Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Val Ser Pro Asp Lys

145 150 155 160

Ala Arg Ser Ile Met Gln Leu Ala Ala Ala Cys Pro Ser Ser Phe Pro

165 170 175

Gln Asp Asn Pro Ser Asn Lys Asn Ala Ala Val Trp Ala Ser Pro Cys

180 185 190

Asn Leu Pro Ile Asp Lys Glu Val Leu Phe Pro Thr Asp Thr Ala Ile

195 200 205

Leu Gln Val Ala Gln Thr Asp Lys Met Val Glu Tyr Pro Leu Gln Tyr

210 215 220

Arg Glu Lys Gly Ser Thr Ala Arg Asp Ala Glu Gly Gln Ala Ser Arg

225 230 235 240

Lys Val Ser Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg

245 250 255

Ser Lys Gly Lys Lys Leu Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Phe Glu Met

260 265 270

Tyr Leu Asn Leu Pro Val Lys Leu His Ala Ser Asn Gly Asn Ser Ser

275 280 285

Arg Ser Ser Thr Asp Ser Pro Pro Gln Pro Arg Leu Pro Leu Val Ser

290 295 300

Ser Gly Ser Ala Glu Asn Gln Pro Lys Val Thr Leu Pro Ile Asp Leu

305 310 315 320

Asn Asp Lys Asp Val Gln Glu Cys

325

<210> 10

<211> 339

<212> БЕЛОК

<213> Solanum lycopersicum

<400> 10

Met Ser Leu Glu Gln Thr Val Tyr Lys Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Tyr Leu Leu Thr Asp Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Arg Phe Leu Lys Ala Lys Gly Met Arg Lys Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Phe Glu Thr

50 55 60

Thr Pro Glu Ser Asp Thr Gly Gln Arg Lys Lys Arg His Ile Pro Arg

65 70 75 80

Pro Asp Thr Ser Leu Gln Arg Val Gln Lys Glu Thr Ser Ile Asp Ala

85 90 95

Glu Phe Ala Glu Ser Ala Glu Glu Thr Val Pro Tyr Gly Arg Lys Pro

100 105 110

Pro Asn Lys Pro Asp Leu Ser Gly Asp Lys Ala Ala Ser Ala Val Ala

115 120 125

Val Val Asn Asn Leu Ala Pro Ser Arg Thr Thr Asp Ser Gly Asn Ala

130 135 140

Ser Ser Gly Gln Leu Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr

145 150 155 160

Asp Asp Val Pro Ala Glu Lys Ala Glu Ala Ile Met His Leu Ala Ala

165 170 175

Ser Pro Leu Phe Val Pro Ser Glu Thr Pro Leu Asp Ala Asn Arg Ala

180 185 190

Ala Gln His Ser Glu Cys His Leu Gln Ala Ala Asn Val Lys Leu Gly

195 200 205

Gln Asp Ser Pro Met Val Phe Met Pro Thr Met Gln Thr Gly Lys Ile

210 215 220

Thr Glu Val Thr Arg Leu His Leu Glu Glu Ser Asn Thr Ser Tyr Glu

225 230 235 240

Asp Asn Pro Glu Ala Val Asn His Val Ser Arg Lys Ala Leu Leu Glu

245 250 255

Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asp Arg Phe Lys Arg Lys Met Gly Met

260 265 270

Pro Ser Ser Ala Ser Leu Asp Ile Tyr Leu Asn His Arg Thr Ile Asn

275 280 285

His Thr Gln Ser Glu Leu Ser Ser Arg Ser Asn Thr Cys Ser Pro Pro

290 295 300

Ala Ile Arg Leu Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gly Ser Met Asp Asn

305 310 315 320

Ile Leu Gln Met Asp Ala Asn Ala Ser Gly Phe Leu Asp Asp Lys Asp

325 330 335

Gly Lys Glu

<210> 11

<211> 338

<212> БЕЛОК

<213> Trifolium repens

<400> 11

Met Asn Gly Gly Ser Thr Val Ser Phe Arg Ser Ile Leu Asp Lys Pro

1 5 10 15

Leu Asn Gln Leu Thr Glu Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp

20 25 30

Cys Arg Arg Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn

35 40 45

Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu

50 55 60

Pro Thr Asp Asp Asp Leu Pro Ala Pro Val Gly Val Ser Ser Ala Ile

65 70 75 80

His His His His His His His Pro Gln Pro Pro Gln Arg Asn Leu Asn

85 90 95

Glu Ala Pro Val Lys Gly Ser Asp Leu Asp Asp Thr Gly Phe His Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Leu Asn Lys Ser Thr Ser Thr Ala Val Glu Ile Pro Thr

115 120 125

Glu Thr Asn Asp Ala Asn Val Val Lys Ser Ser Gly Gly Cys Val Ala

130 135 140

Ser Gly Ser Phe Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn

145 150 155 160

Val Tyr Asp Gly Val Ser Pro Asp Lys Ala Arg Ser Ile Met Gln Leu

165 170 175

Ala Ala Cys Pro Ser Ser Phe Pro Gln Asp Asn Leu Leu Asn Lys Asn

180 185 190

Ala Ala Val Trp Ala Ser Pro Cys Asn Ile Pro Ile Asp Lys Asp Val

195 200 205

Leu Phe Pro Asn Asp Thr Ala Ile Leu Gln Val Ala Gln Thr Asp Lys

210 215 220

Met Val Glu Tyr Pro Leu Gln Tyr Arg Glu Lys Gly Ser Ile Ala Arg

225 230 235 240

Asp Ala Asp Val Glu Gly Gln Ala Ser Arg Asn Ala Ser Leu Gln Arg

245 250 255

Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg Ser Lys Gly Asn Lys Leu

260 265 270

Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Phe Glu Met Tyr Leu Asn Leu Pro Val

275 280 285

Lys Leu His Ala Ser Asn Gly Asn Ser Ser Arg Ser Ser Thr Asp Ser

290 295 300

Pro Pro Gln Pro Arg Leu Pro Leu Val Ser Gly Gly Ser Ala Glu Asn

305 310 315 320

Gln Pro Lys Val Thr Leu Pro Ile Asp Leu Asn Asp Lys Asp Val Gln

325 330 335

Glu Cys

<210> 12

<211> 311

<212> БЕЛОК

<213> Amborella trichopoda

<400> 12

Met Thr Ala Gly Asp Gly Ser Ile Arg Ser Ile Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Glu Glu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Tyr Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Gly Leu Leu Glu Gly

50 55 60

Lys Pro Cys Asp Asp Asn Ser Asp Val Phe Ser His Arg Ser Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Ile Pro Asn Val Gly Ser Met Arg Glu Lys Glu Lys Ala Val

85 90 95

Asn Ile Ala Asp Pro Glu Ile Ser Gly Ser His Gln Pro Asn Phe Arg

100 105 110

Arg Glu Ile His Glu Thr Thr Arg Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ser Asp

115 120 125

Trp Pro Pro Ser Gln Glu Pro Val Ser Gln Met Thr Ile Phe Tyr Ala

130 135 140

Gly Ala Val Asn Val Tyr Asn Asp Ile Pro Glu Asp Lys Val Gln Ala

145 150 155 160

Ile Ile Tyr Leu Ala Gly Lys Ser Asp Ser Leu Gln Gln Thr Asn Val

165 170 175

Ile Arg Thr Gly Pro Asp Gln Cys Ile Ala Ser Ala Ala Ser Pro Ser

180 185 190

Leu Asn Asp Leu His Ser Arg Arg Ile His Pro Thr Ser Asn Ile Thr

195 200 205

Thr Ser Gln Ser Leu Arg Val Ala Thr Ser Leu Pro Val Gly Pro His

210 215 220

Ser Glu Val Pro Lys Thr Arg Lys Thr Ser Val Gln Arg Phe Leu Glu

225 230 235 240

Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg Leu Lys Gly Thr Leu Ala Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Lys Arg Gly Ser Ser Cys Leu Glu Leu Tyr Ala Thr Ser Arg

260 265 270

Leu Lys Ser Glu Gly Val Ala Thr Thr Thr Thr Gln Ser Asn Met Asn

275 280 285

Asn Val Val Val Ser Pro Ser Asn Pro Arg Met Pro Leu Asn Pro Gly

290 295 300

Ser Cys Ser Trp Val Glu Asn

305 310

<210> 13

<211> 416

<212> БЕЛОК

<213> Selaginella moellendorffii

<400> 13

Met Ala Ala Ser Ile Leu Gly Cys Gly Ser Ser Asn Gly Val Ala Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Glu Val Pro Ala Pro Leu

20 25 30

Arg Pro Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Asp Ile Arg Gln Leu Thr Arg

35 40 45

Glu Asp Cys Arg Arg Tyr Leu Lys Glu Arg Gly Met Arg Arg Pro Ser

50 55 60

Trp Asn Lys Ala Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Leu Cys Pro Ser Asn Pro Val Gly Pro Ser Ser Lys Asn Pro Gly Ser

85 90 95

Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly His Thr Lys

100 105 110

Gln Leu Leu Asp Lys Val Ser Gln Gln Ser Met Pro Asp Ser Cys Pro

115 120 125

Ser Asn Asn Ala Ser Asp Pro Arg Pro Leu Ala Gly Cys Phe Gly Ser

130 135 140

Leu Ala Pro Thr Leu Ser Val Leu Asn Pro Asp Ala Lys Arg Asn Pro

145 150 155 160

Leu Ser Ser Lys Pro Ala Ser Thr Thr Lys Pro His Ser Ala Gln Leu

165 170 175

Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Ile Val Asn Val Tyr Asp Asp Val Pro Leu

180 185 190

Asp Lys Ala Gln Ala Ile Met Leu Leu Ala Ala Ser Lys Thr Phe His

195 200 205

Val Pro Thr Ser Ser Val Pro Gly His Pro Pro Phe Thr Ser Ala Thr

210 215 220

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Glu Leu Asn Gln Gln Thr Glu Ala

225 230 235 240

Thr Gln Lys Tyr Pro Met Gln His Gln Gln Ala Pro Gln Ile Tyr Leu

245 250 255

Ser Ser Gly Ser Ala Leu Pro Asp Glu Ser Cys Thr Glu Pro Gly Leu

260 265 270

Pro Gln Val Arg Ser Ala Ser Leu Gln Arg Phe Leu Ala Lys Arg Arg

275 280 285

Asp Arg Leu Ser Gly Asn Pro Ser Ser Ser Arg Arg Asn Asp Arg Ser

290 295 300

Lys Lys Arg Arg Phe Ser Pro Pro Pro Ser Pro Leu Thr Ser Ala Ser

305 310 315 320

Phe Gln Phe Pro Pro Ser Ala Arg Thr Ser Gln Val Leu Arg Tyr Ser

325 330 335

Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ile Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr

340 345 350

Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Asn Gly Gly His Cys Ser Asn Ser

355 360 365

Asn Gln Ala Ser Glu Asn Ala Gly Ser Asp Thr Ser Gly Gly Ser Ser

370 375 380

Gly Thr Pro Asp Thr Ser Asp Thr Thr Arg Asp Asn Asp Asn Gly Arg

385 390 395 400

Val Ser Asn Glu Asn Gly Arg Val Ser Thr Thr Cys Leu Ala Ala Thr

405 410 415

<210> 14

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Selaginella moellendorffii

<400> 14

Met Ser Ser Met Val Asp Phe Leu Gly Ile Glu Glu Lys Val Ser Thr

1 5 10 15

Ser Val Ser Ala Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Glu Leu Thr Asp Glu

20 25 30

Asp Val Met Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys Arg Arg Tyr Leu Lys Glu

35 40 45

Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys Ala Gln Ala Val Gln Gln

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Lys Ser Leu Cys Asp Pro Ser Pro Ala Ser Ser Gly

65 70 75 80

Ala Ala Lys Arg Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Ala Pro Ala Lys

85 90 95

Lys Pro Met Ala Met Thr Ser Ile Asp Leu Lys Ala Ala Ala Ala Val

100 105 110

Asp Ala Ala Asn Leu Thr Met Phe Tyr Asp Gly Ala Val Ser Val Phe

115 120 125

Asp Asp Val Ser Pro Asp Lys Ala Ser Leu Phe Pro Leu Ala Tyr Ala

130 135 140

Ile Met Leu Leu Ala Gly Asn Val Lys Ser Trp Pro Ser Ile Asn Val

145 150 155 160

Ala Ala Asn Thr Asn Lys Val Val Ile Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Gln

165 170 175

Ala Arg Lys Ala Ser Leu Gln Arg Phe Leu Gln Arg Arg Arg Glu Lys

180 185 190

Thr Ala Lys Glu Ala Ala Ser Lys Gly Asn Ser Asn Lys Ser Pro Cys

195 200 205

His Gly Glu Ser Ser Gly Lys His Ala Ser Asp Ala Thr Asp Pro Ala

210 215 220

Thr Ser Pro Leu Leu Thr Glu Val Ser Ser

225 230

<210> 15

<211> 271

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 15

Met Pro Pro Glu Glu Thr Val Ser Lys Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

His Leu Leu Thr Asp Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu Thr

50 55 60

Thr Pro Asp Ser Asp Thr Gly Pro Arg Arg Lys Leu His Ile Pro Arg

65 70 75 80

Pro Asp Thr Arg Val Gln Gln Val Gln Lys Gly Thr Asp Thr Asp Ala

85 90 95

Glu Phe Ser Lys Ser Ala Glu Gly Met Val Pro Tyr Gly Arg Lys His

100 105 110

Ser Lys Lys Pro Asp Ile Pro Gly Asp Ile Ala Ala Gly Ser Val Ala

115 120 125

Val Ala Ala Gly Asn Asn Leu Ala Pro Ser Arg Thr Thr Asp Leu Gly

130 135 140

Asn Thr Pro Ala Ser Gln Leu Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn

145 150 155 160

Val Tyr Asp Asp Val Pro Ala Glu Lys Ala Gln Ala Ile Met His Leu

165 170 175

Ala Ala Thr Pro Leu Phe Val Pro Ser Glu Thr Pro Leu Gly Ala Thr

180 185 190

Leu Ala Ala Arg His Ser Glu Cys His Leu Gln Ala Ala Ser Val Lys

195 200 205

Gln Gly Pro Asp Ser Ala Met Val Leu Met Pro Thr Met Gln Thr Gly

210 215 220

Lys Met Ser Glu Val Thr Arg Leu Arg Leu Glu Glu Ser Asn Thr Phe

225 230 235 240

Tyr Glu Asp Asn Ser Ala Asn Tyr Ala Glu Ala Val Glu Gly His Pro

245 250 255

Ser Arg Lys Ala Ser Val Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp

260 265 270

<210> 16

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Solanum tuberosum

<400> 16

Met Pro Pro Glu Glu Thr Val Ser Lys Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Asn Gln Leu Thr Asp Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Arg Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Met Arg Lys Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Asp Thr Asp Ala Gly Thr Arg Lys Lys Leu His Ile Pro Arg Ala Asp

65 70 75 80

Thr His Val Gln Ser Gly Lys Asn Thr Tyr Gly Glu Pro Ser Glu Pro

85 90 95

Val Pro Asp Arg Arg Asn Gln Gln Asp Arg Pro Asp Leu Ser Ser His

100 105 110

Ile Thr Ala Leu Pro Val Ala Val Val Asp Asn Ser Ala Pro Ser Arg

115 120 125

Thr Ile Gly Ser Ala Asp Lys Pro Val Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr

130 135 140

Arg Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Asp Val Pro Ala Asp Lys Ala Gln

145 150 155 160

Lys Ile Met Cys Leu Ala Ser Ser Pro Leu Cys Val Pro Ser Glu Thr

165 170 175

Pro Ser Asn Ala Thr Val Ala Ala Arg His Ser Ala Cys Cys Leu Gln

180 185 190

Ala Ala Asn Ser Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Ile Val Pro Thr Ile

195 200 205

Gln Thr Val Lys Met Ser Glu Val Ser Arg Val Pro Ile Glu Glu Ser

210 215 220

Asn Arg Leu Tyr Asn Asp Asn Pro Glu Ala Val Glu Ser Pro Ala Ser

225 230 235 240

Arg Lys Ala Ser Val Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Glu Arg Phe

245 250 255

Lys Trp Lys Arg Lys Val Glu Thr Thr Ser Ser Ala Ser Leu Asp Ile

260 265 270

Tyr Leu Ser Asp Arg Ile Gly Thr Arg Thr Pro Ser Asp Tyr Ala Ser

275 280 285

Gly Ala Asp Leu Cys Phe Thr Pro His Ile Thr Pro Thr Gly Ser Gly

290 295 300

Pro Ile Gln Asp Asn Ile Gln Met Asn Pro Thr Phe Ser Ser Asp Leu

305 310 315 320

Asn Asp Arg Asp Val Arg Glu

325

<210> 17

<211> 348

<212> БЕЛОК

<213> Glycine max

<400> 17

Met Asn Gly Gly Ala Thr Thr Ala Thr Phe Arg Ser Ile Leu Asp Lys

1 5 10 15

Pro Leu Asn Gln Leu Thr Glu Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu

20 25 30

Asp Cys Arg Arg Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp

35 40 45

Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu

50 55 60

Glu Pro Ser Asp Asp Asp Thr Pro Pro Pro Thr Ala Met His His Arg

65 70 75 80

Ser His Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro Gln Ser Gln Val Asn Leu

85 90 95

Thr Glu Pro Pro Pro Pro Pro Lys Ala Pro Pro Pro Glu Glu Ser Ser

100 105 110

Phe His Ala Ala Glu Asp Ile Gln Lys Pro Ala Ser Ser Gly Glu Lys

115 120 125

Pro Ser Glu Thr Asn Asp Thr Asn Thr Asn Val Ala Ser Pro Lys Gly

130 135 140

Cys Ala Thr Ser Gly Ser Phe Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly

145 150 155 160

Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Val Ser Pro Asp Lys Ala Arg Ala Ile

165 170 175

Met Gln Leu Ala Val Ser Pro Val Gln Phe Thr Gln Asp Asp Pro Ser

180 185 190

Asn Gly Asn Ala Ala Val Trp Pro Ser Pro Cys His Leu Pro Met Asp

195 200 205

Lys Asp Val Leu Ile Pro Val Asp Thr Thr Ile Leu Gln Val Ala Gln

210 215 220

Ser Asp Lys Met Met Glu Tyr Pro Leu Gln Tyr Arg Glu Lys Gly Ser

225 230 235 240

Ile Ala Arg Asp Ala Glu Gly Gln Ala Ser Arg Lys Val Ser Leu Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg Leu Lys Gly Lys Lys

260 265 270

Leu Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Phe Glu Met Tyr Leu Asn Leu Pro

275 280 285

Val Lys Val His Ala Ser Asn Gly Asn Ser Ser Arg Ser Ser Thr Ser

290 295 300

Ser Pro Pro Gln Pro Arg Leu Pro Leu Val Ser Ser Gly Ser Ala Asp

305 310 315 320

Asn Gln Leu Lys Val Ala Leu Pro Ile Asp Leu Asn Asp Lys Val Ser

325 330 335

Leu Gln Met Phe Lys Asn Ala Lys Thr Leu Thr Arg

340 345

<210> 18

<211> 338

<212> БЕЛОК

<213> Citrus clementine

<400> 18

Met Asp Val Asp Gly Gly Val Thr Ser Cys Arg Ser Ile Leu Glu Lys

1 5 10 15

Pro Leu Ser Gln Leu Thr Glu Glu Asp Ile Thr Gln Leu Thr Arg Glu

20 25 30

Asp Cys Arg Lys Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp

35 40 45

Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu

50 55 60

Glu Ser Ser Gly Asp Ser Gly Ser Gly Val Leu Arg Arg Val Leu Val

65 70 75 80

Ser Pro Pro Glu Ser Met Pro Pro Arg Val Asn Val Thr Ser Asn Ser

85 90 95

Ala Asp Leu Val Lys Glu Pro Thr Ile Ser Val Ser Gly Asp Gln Asn

100 105 110

Ser Ala Tyr Arg Arg Lys Tyr Pro Arg Asn Cys Ala Val Asp Ala Asp

115 120 125

Asn Lys Thr Ile Ser Asn Arg Asn Pro Cys Glu Ala Asn Gly Ser Ile

130 135 140

Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr Glu Gly

145 150 155 160

Val Pro Thr Asp Lys Ala Gln Glu Ile Met His Leu Ala Ala Thr Pro

165 170 175

Ile Asp Phe Ser Gln Asn Gly Ser Phe Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Arg

180 185 190

Ala Ile Pro Cys His Leu Gln Val Thr Ser Asn Arg His Val Ser Leu

195 200 205

Pro Leu Arg Pro Ala Ala Met Ile Ser Gln Phe Met Gln Thr Gly Lys

210 215 220

Ile Ala Asp Tyr Ser Gln Glu Tyr Arg Glu Lys Ala Ile Ser Thr His

225 230 235 240

Asp Ser Asp Val Asp Gly Gln Val Asn Arg Lys Val Ser Leu Gln Arg

245 250 255

Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg Phe Phe Lys Gly Lys Lys

260 265 270

Asn Thr Gly Pro Thr Pro Ser Leu Glu Met Tyr Leu Asn His Pro Gly

275 280 285

Lys Thr His Ala Ser Asn Gly Gln Gln Ser Gln Ser Asn Thr Ser Ser

290 295 300

Pro Thr Gln Pro Glu Leu Ser Asn Thr Leu Gly Thr Ser Pro Asp Asn

305 310 315 320

Gln Ala Lys Thr Val Met Leu Pro Val Asp Leu Asn Asn Glu Asp Ile

325 330 335

Gln Asp

<210> 19

<211> 335

<212> БЕЛОК

<213> Ricinus communis

<400> 19

Met Asp Ala Gly Val Thr Ser Phe Arg Ser Ile Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Thr Gln Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Asp Ser Gly Ala Gly Ala Leu Arg Arg Ile Leu Val Ser Lys

65 70 75 80

Pro Pro Val Thr Ser Asn Ser Val Asp Ser Ala Lys Glu Pro Ser Asp

85 90 95

Ser Asn Asn Asn Asn Leu Leu Asp Glu Thr Ala Pro His Asp Ser Pro

100 105 110

Lys Ser Pro Pro Pro Ala Pro Ser Leu Asp Cys Pro Leu Glu Glu Ala

115 120 125

Asp Asn Lys Val Ile Ser Ser Arg Ser Pro Gly Ala Thr Asp Gly Leu

130 135 140

Val Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp

145 150 155 160

Gly Val Pro Pro Asp Lys Ala Gln Ala Ile Met His Leu Ala Ala Thr

165 170 175

Pro Ile His Ser Pro Leu Asp Asp Pro Ile Arg Arg Pro Val Phe Ala

180 185 190

Phe Pro Tyr His Leu Gln Thr Pro Ser Asp Lys His Val Phe Val Pro

195 200 205

Ser Asn Ala Ala Ile Ser Pro Thr Thr Pro Thr Glu Lys Val Thr Glu

210 215 220

Tyr Ser Gln Gln Cys Arg Glu Lys Gly Asn Val Thr Tyr Asp His Asp

225 230 235 240

Val Glu Gly Gln Ala Asn Arg Lys Met Ser Leu Gln Arg Tyr Leu Glu

245 250 255

Lys Lys Lys Asp Arg Gly Arg Phe Lys Gly Arg Lys Asn Leu Gly Pro

260 265 270

Asn Ser Ser Ser Leu Asp Ala Tyr Leu Asn His Gln Met Arg Thr His

275 280 285

Ile Ser Asn Glu Gln Ser Thr Arg Ser Ser Thr Ser Ser Pro Thr Gln

290 295 300

Pro Gly Val Pro His Thr Ser Ser Asn Ser Ala Glu Asp Gln Leu Lys

305 310 315 320

Thr Ala Ser Phe Ala Val Asp Leu Asn Glu Asp Val Gln Glu Pro

325 330 335

<210> 20

<211> 393

<212> БЕЛОК

<213> Vitis vinifera

<400> 20

Met Asn Pro Gly Val Thr Thr Leu Arg Ser Ile Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

His Glu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ser Leu Leu Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Arg Lys Ile Thr Asp Ser Pro

65 70 75 80

Pro Ala Glu Asn Leu Pro Pro Val Thr Ser Asn Ser Ala Asp Ser Gly

85 90 95

Lys Glu Leu Ser Ala Asp Ile Gln Ile Ser Val Ser Ala Asp Glu Leu

100 105 110

Val Pro Leu Pro Pro Lys Asp His His Pro Glu Ser Thr Pro Ser Gly

115 120 125

Glu Leu Ala Ser Arg Pro Pro Glu Ala Asp Thr Lys His Thr Cys Pro

130 135 140

Arg Ser Pro Gly Ala Thr Asn Cys Leu Val Gly Gln Met Thr Ile Phe

145 150 155 160

Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Val Pro Asp Asp Lys Ala

165 170 175

Gln Ala Ile Met His Leu Ala Ala Ser Pro Phe His Leu Pro Ser Asp

180 185 190

Asp Pro Phe Ser Gly Ala Ala Met Leu Cys Ser Ser Pro Cys His Leu

195 200 205

His Thr Ala Asn Val Lys His Gly His Ile Pro Pro Arg Ala Met Val

210 215 220

Ser Gln Thr Met Gln Thr Glu Lys Phe Thr Glu Tyr Ser Gln Gln Tyr

225 230 235 240

Arg Glu Glu Val Asn Phe Thr Arg Gly His Gly Ser Glu Ala Leu Ser

245 250 255

Gly Leu Arg Thr Val Gly Ser Pro Thr Ala Arg Pro Thr Glu Asp Met

260 265 270

Glu Gln Thr Thr Cys Leu Thr Ile Trp Gly Thr Phe Arg Tyr Lys Val

275 280 285

Met Pro Phe Glu Ile Tyr Glu Gly Ile Met Asp Val Glu Gly Gln Val

290 295 300

Asp Arg Lys Leu Ser Leu Gln Arg Tyr Phe Glu Lys Arg Lys Asp Arg

305 310 315 320

Phe Lys Ser Arg Lys Lys Ile Gly Leu Pro Ser Gly Ser Leu Glu Met

325 330 335

Tyr Val Asn His Gln Ala Arg Thr Gln Pro Ser Asn Gly Gln Ser Ser

340 345 350

Arg Ser Gly Thr Ser Ser Pro Pro Gln His Gly Leu Ser His Thr Leu

355 360 365

Cys Ser Ser Ala Asp Asn His Thr Lys Asn Phe Thr Pro Phe Val Asp

370 375 380

Leu Asn Ser Lys Asp Ile Gln Glu Ser

385 390

<210> 21

<211> 343

<212> БЕЛОК

<213> Morus notabilis

<400> 21

Met Ser Ala Gly Thr Thr Ala Phe Arg Ser Ile Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Asn Gln Leu Thr Glu Asp Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu Pro

50 55 60

Cys Asp Asp Ser Gly Ala Gly Ala Leu Arg Arg Ile Val Ala Ser Thr

65 70 75 80

Pro Pro Pro Pro Pro Thr Gln Asn Ala Pro Arg Val Ser Thr Phe Ser

85 90 95

Val Thr Ser Asn Ser Ala Asp Ser Gly Lys Glu Ala Ser Val Asp Val

100 105 110

Gln Val Ser Ala Glu Glu Ser Gly Pro Cys Gln Arg Lys Glu Gln Ala

115 120 125

Lys Ser Ala Pro Glu Thr Glu Glu Arg Pro Ala Asp Ala Gly Glu Arg

130 135 140

Ala Ser Pro Arg Ser His Cys Ala Thr Asp Ala Leu Val Gly Gln Met

145 150 155 160

Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr Glu Gly Val Pro Pro

165 170 175

Glu Lys Ala Arg Ala Ile Met His Leu Ala Ala Ser Pro Ile Pro Leu

180 185 190

Ser Arg Glu Asn Ser Phe Gly Val Leu Ala Ala Pro Arg Ser Phe Pro

195 200 205

Trp His Leu His Ala Ala Ser Asp Lys Gly Gly Leu Leu Pro Pro Ser

210 215 220

Ala Thr Ile Ser Gln Pro Met Gln Thr Asp Lys Leu Ala Asp Tyr Ser

225 230 235 240

Gln Gln Cys Trp Glu Lys Glu Asn Asp Gly Gln Ala Ser Arg Lys Leu

245 250 255

Ser Leu Gln Lys Tyr Arg Glu Lys Lys Lys Asp Arg Gly Arg Leu Lys

260 265 270

Thr Lys Arg Ser Thr Gly Phe Asn Ser Ser Ser Met Glu Val Tyr Phe

275 280 285

Asn His Gln Val Lys Thr His Met Ser Asn Gly Asn Ser Ser Arg Ser

290 295 300

Ser Thr Ser Ser Pro Thr Gln Pro Gly Leu Pro Gln Thr Leu Cys Ser

305 310 315 320

Thr Val Asp Asn Gln Pro Lys Ile Pro Cys Leu Pro Val Asp Leu Asn

325 330 335

Glu Lys Leu Thr Ile Glu Met

340

<210> 22

<211> 364

<212> БЕЛОК

<213> Phoenix dactylifera

<400> 22

Met Tyr Trp Val Gly Ser Ala Gln Glu Arg Arg Arg Asp Gly Gly Arg

1 5 10 15

Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu Ser Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ala

20 25 30

Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys Arg Arg Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met

35 40 45

Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser

50 55 60

Leu Lys Ala Leu Leu Glu Gly Arg Pro Glu Ser Gly Glu Leu Pro Val

65 70 75 80

Gly Ala Gly Tyr Arg Gln Lys Pro Pro Pro Arg Arg Pro Ala Ser Leu

85 90 95

Pro Ser Leu Gln Glu Ala Ala Gly Asp Ser Thr Ala Ala Ala Lys Glu

100 105 110

Pro Ser Pro Ser Ser Ser Leu Ser Pro Tyr Arg Arg Arg Asp Pro Ile

115 120 125

Pro Pro Ile Ile Ser Ala Gly Gly Pro Ser Cys Arg Phe Pro Val Ala

130 135 140

Gly Arg Asp Gln Gln Pro Pro Glu Thr Pro Ser Pro Ser Leu Arg Val

145 150 155 160

Thr Ala Glu Val Pro Ala Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Asp Gly Lys

165 170 175

Val Asn Val Tyr Ser Asp Val Thr Val Asp Lys Ala Arg Ala Ile Leu

180 185 190

Leu Leu Ala Gly Arg Arg Asp Cys Tyr Gly Ala Ala Ala Leu Pro Gly

195 200 205

Pro Val His Ser Pro Gln Pro Ala Phe Leu Gly Pro Gly Gln Gly Pro

210 215 220

Val Pro Thr Ala Pro Pro Leu Ala Ala Ala Leu Pro Thr Ser Pro Ala

225 230 235 240

Gly Arg Leu Ala His Arg Phe Glu Gly Pro Ser Gly Val Pro Arg Gly

245 250 255

Lys Ser Ser Leu Val Arg Glu Arg Ser Thr Ser Pro Glu Gly Pro Thr

260 265 270

Ser Arg Lys Ala Ser Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg

275 280 285

Leu Lys Gly Arg Lys Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ser Ser Ser Met Glu

290 295 300

Ile Met Phe Leu Ser Gln Lys Phe Gly Gly Gln Ile Pro Asn Glu Gln

305 310 315 320

Leu Ser Arg Ser Asn Thr Ser Ser Pro Thr Gln Pro Arg Pro Pro Gly

325 330 335

Thr Pro Thr Arg Cys Ser Ser Ile Glu Asn Gln Ala Gln Lys Asn His

340 345 350

Leu Ser Val Asp Leu Asn Asp Asp Gly Cys Gly Asn

355 360

<210> 23

<211> 354

<212> БЕЛОК

<213> Theobroma cacao

<400> 23

Met Glu Ala Gly Val Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Phe Arg

1 5 10 15

Ser Ile Leu Asp Lys Pro Leu Ser Gln Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser

20 25 30

Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys Arg Lys Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met

35 40 45

Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser

50 55 60

Leu Lys Ala Leu Leu Glu Ser Asn Glu Asp Ser Gly Ala Gly Ala Ile

65 70 75 80

Arg Lys Ile Leu Val Ser Pro Pro Ser Pro Ser Val Pro Pro Gln Asn

85 90 95

Ala Ala Ala Arg Val Ala Ser Asn Ser Cys Asp Ser Val Lys Glu Ala

100 105 110

Val Val Gly Glu Glu Gly Ser Pro Tyr Arg Arg Lys Asp Pro Pro Leu

115 120 125

Lys Pro Ser Pro Val Gly Glu Ile Asn Cys Leu Gly Gly Asp Thr Asp

130 135 140

Asn Lys Asn Leu Ser Pro Arg Ser Pro Cys Glu Ser Asn Glu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Cys Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly

165 170 175

Val Pro Leu Asp Lys Ala Arg Ala Ile Met His Leu Ala Ala Thr Pro

180 185 190

Ile Asp Phe Pro Gln Asp Asn Gln Cys Ser Gly Asn Ala Ala Leu Arg

195 200 205

Ser Phe Met Cys His Val Gln Ala Val Gly Asp Lys Asn Gly Leu Val

210 215 220

Ala Ser Thr Ala Leu Asn Ser His Thr Met Gln Thr Glu Lys Leu Thr

225 230 235 240

Glu Tyr Gln His Gln Phe Arg Glu Lys Gly Asn Ile Ala Arg Asp Ala

245 250 255

Asp Val Asp Gly Gln Val Asn Arg Lys Val Ser Leu Gln Arg Tyr Arg

260 265 270

Glu Lys Arg Lys Asp Arg Gly Arg Phe Phe Lys Gly Arg Lys Asn Thr

275 280 285

Gly Gln Ala Ser Ser Ser Leu Glu Met Tyr Leu Asn His Gln Ile Arg

290 295 300

Thr His Asn Ser Asn Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Thr Gly Ser Pro

305 310 315 320

Pro Gln Ser Gly Leu Pro His Ala Phe Cys Ser Ser Ala Asp Asn Gln

325 330 335

Ala Lys Leu Val Asn Leu Ser Val Asp Leu Asn Asp Lys Ser Val Gln

340 345 350

Glu His

<210> 24

<211> 293

<212> БЕЛОК

<213> Spirodela polyrrhiza

<400> 24

Met Ala Gly Ser Glu Ala Ala Ala Pro Glu Glu Ala Gly Arg Ala Gly

1 5 10 15

Glu Glu Glu Val Arg Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro

20 25 30

Leu Glu Lys Pro Leu Ser Glu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ala Gln Val

35 40 45

Thr Arg Glu Asp Cys Arg Arg Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Lys Ser Gln Ala Val Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys

65 70 75 80

Ala Leu Leu Glu Pro Cys His Asp Ala Asp Asp Asp Ala Pro Ser Ala

85 90 95

Gly Ala Val Pro Ser Ile Ser Ser Phe Phe Ser Lys Arg Pro Ser Asp

100 105 110

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Ala Ala Gln Phe Pro Val Ser Ser Pro Met

115 120 125

Arg Gly Glu Pro Ala Gly Gly Ala Pro Gln Ile Val Ser Glu Arg Pro

130 135 140

His Gly Arg Asp Pro Leu Ala Asn Val Phe Thr Cys Ser Asp Ala Leu

145 150 155 160

Gly Arg Phe Pro Ala Thr Gly Asn Gly Ala Leu Pro Pro Asn Ser Ala

165 170 175

Thr Leu Pro Pro Arg Gly Val Ala Ser Ala Glu Thr Leu Glu Gly Gln

180 185 190

Leu Thr Ile Phe Tyr Asp Gly Lys Ile Asn Val Tyr Asp Gly Val Thr

195 200 205

Pro Glu Lys Val Arg Ser Gly Gln Lys Gly Pro Thr Ser Arg Ala Ala

210 215 220

Ser Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Arg Asp Pro Gly

225 230 235 240

Pro Ala Ala Val Ala Thr Leu Tyr Arg Lys Val Phe Leu Ser Ala Thr

245 250 255

Ala Leu Leu Ile Gly Cys Ser Ser Gly Ala Asn Val Val Leu Pro Arg

260 265 270

Ala Glu Gly Pro Thr Ser Arg Ala Ala Ser Leu Gln Arg Tyr Leu Glu

275 280 285

Lys Arg Lys Asp Arg

290

<210> 25

<211> 293

<212> БЕЛОК

<213> Musa acuminata

<400> 25

Met Asn Pro Gly Glu Thr Thr Pro Pro Ser Pro Leu Asp Lys Pro Leu

1 5 10 15

Ala Glu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ala Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Arg Phe Leu Lys Ala Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Leu Glu Gly

50 55 60

Arg Pro Gly Cys Asp Asp Cys Pro Ala Gly Gly Gly Ile Leu Gln Lys

65 70 75 80

Leu Leu Thr Ser Ser Pro Ser Glu Pro Leu Ser Pro Pro Gln Asp Ser

85 90 95

Pro Pro Pro Ala Pro Lys Glu Gly Gly Ser Gly Ser Gln Pro Leu Ala

100 105 110

Lys Glu Pro Ser Pro Tyr Arg Arg Arg Asp Pro Ile Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Ser Ala Gly Asn Pro Thr Cys Gln Thr Pro Ile Ala Gly Ala Asp Leu

130 135 140

Pro His Pro Pro Glu Lys Arg Cys Pro Ser Pro Arg Leu Thr Ala Glu

145 150 155 160

Val Pro Val Gly Gln Met Thr Ile Phe Tyr Asp Gly Met Val Asn Val

165 170 175

Tyr Asp Gly Val Ser Ala Asp Gln Ala Arg Ser Ile Met Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Ser Pro Val Cys Phe Asp Asp Pro Thr Gly Ala Phe Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Pro Pro Ala Phe Arg Phe Pro Pro Gly Leu Pro Arg Pro Ala Pro

210 215 220

Val Pro Thr Ala Pro Ser Phe Val Gly Thr Phe Pro Ile Ser Pro Ala

225 230 235 240

Gly Lys Arg Cys Tyr Ser Tyr Cys Ser Phe Arg Ser Ser Val Ser Leu

245 250 255

Leu Thr Thr Thr Glu Gly Pro Thr Ser Arg Lys Ala Ser Leu Gln Arg

260 265 270

Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Tyr Gly His Leu Pro Thr Glu Ser

275 280 285

Ile Leu Leu Val Ser

290

<210> 26

<211> 171

<212> БЕЛОК

<213> Phalaenopsis aphrodite

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (72)..(87)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<400> 26

Met Asn Ser Asp Ala Ile Thr Met Gly Lys Ser Leu Leu Glu Lys Pro

1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Thr Glu Asp Asp Ile Ala Gln Ile Thr Arg Glu Glu

20 25 30

Cys Arg Arg Phe Leu Lys Asp Arg Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn

35 40 45

Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Ile Ser Leu Lys Ala Leu Phe Glu

50 55 60

Asn Arg Ser Asp Leu Glu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Pro Glu His Ala Asp Leu Ser Ser

85 90 95

Ile Ser Pro Thr Ala Glu Ala Lys Glu Pro Glu Lys Ala Gln Leu Thr

100 105 110

Ile Phe Tyr Gly Gly Lys Val Leu Val Phe Asp Asn Phe Pro Val Asn

115 120 125

Lys Ala Gln Asp Leu Met Gln Ile Ala Gly Lys Glu Gln Asn Gln Asn

130 135 140

Tyr Gly Thr Ala Asn Thr Val Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Asp Leu

145 150 155 160

His Ser Leu Pro Leu Pro Ala Lys Pro Pro Ala

165 170

<210> 27

<211> 46

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 27

Leu Lys Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp

1 5 10 15

Cys Arg Lys Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn

20 25 30

Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ala Leu

35 40 45

<210> 28

<211> 46

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (2)..(3)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (5)..(7)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (9)..(10)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (16)..(16)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (19)..(20)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (22)..(24)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (28)..(28)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (34)..(34)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (37)..(38)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (40)..(41)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (43)..(45)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<400> 28

Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Gln Xaa Thr Arg Glu Xaa

1 5 10 15

Cys Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gly Met Arg Xaa Pro Ser Trp Asn

20 25 30

Lys Xaa Gln Ala Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu

35 40 45

<210> 29

<211> 46

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (2)..(2)

<223> Xaa представляет собой Glu, Phe, His, Tyr, Asn, Trp, Ser, Lys или Thr

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (3)..(3)

<223> Xaa представляет собой Glu, Gln или Leu

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (5)..(5)

<223> Xaa представляет собой Thr или Ser

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (6)..(6)

<223> Xaa представляет собой Glu или Asp

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (7)..(7)

<223> Xaa представляет собой Glu, Leu или Asp

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (9)..(9)

<223> Xaa представляет собой Ile или Val

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (10)..(10)

<223> Xaa представляет собой Ser, Phe, Arg, Met или Thr

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (12)..(12)

<223> Xaa представляет собой Leu или Val

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (16)..(16)

<223> Xaa представляет собой Asp или Glu

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (19)..(19)

<223> Xaa представляет собой Arg или Lys

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (20)..(20)

<223> Xaa представляет собой Tyr или Phe

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (22)..(22)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (23)..(23)

<223> Xaa представляет собой Glu, Asp, Gln или Ala

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (24)..(24)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (28)..(28)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (34)..(34)

<223> Xaa представляет собой Tyr, Ser или Ala

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (37)..(37)

<223> Xaa представляет собой Ile или Val

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (38)..(38)

<223> Xaa представляет собой Gln или Glu

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (40)..(40)

<223> Xaa представляет собой Val или Leu

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (41)..(41)

<223> Xaa представляет собой Leu или Ile

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (43)..(43)

<223> Xaa представляет собой Leu или Phe

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (44)..(44)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (45)..(45)

<223> Xaa представляет собой Gly, Ser, Thr или Ala

<400> 29

Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Gln Xaa Thr Arg Glu Xaa

1 5 10 15

Cys Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gly Met Arg Xaa Pro Ser Trp Asn

20 25 30

Lys Xaa Gln Ala Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu

35 40 45

<210> 30

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 30

Thr Arg Glu Asp Cys Arg Lys Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg

1 5 10 15

Pro Ser Trp Asn Lys Ser Gln Ala Ile Gln Gln

20 25

<210> 31

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (4)..(4)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (7)..(8)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (10)..(12)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (16)..(16)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (22)..(22)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (25)..(26)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<400> 31

Thr Arg Glu Xaa Cys Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gly Met Arg Xaa

1 5 10 15

Pro Ser Trp Asn Lys Xaa Gln Ala Xaa Xaa Gln

20 25

<210> 32

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (4)..(4)

<223> Xaa представляет собой Asp или Glu

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (7)..(7)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (8)..(8)

<223> Xaa представляет собой Phe или Tyr

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (10)..(10)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (11)..(11)

<223> Xaa представляет собой Asp, Ala, Glu или Gln

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (12)..(12)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (16)..(16)

<223> Xaa представляет собой Lys или Arg

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (22)..(22)

<223> Xaa представляет собой Tyr, Ser или Ala

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (25)..(25)

<223> Xaa представляет собой Ile или Val

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (26)..(26)

<223> Xaa представляет собой Gln или Glu

<400> 32

Thr Arg Glu Xaa Cys Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gly Met Arg Xaa

1 5 10 15

Pro Ser Trp Asn Lys Xaa Gln Ala Xaa Xaa Gln

20 25

<210> 33

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 33

Thr Ile Phe Tyr Ser Gly

1 5

<210> 34

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (5)..(5)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<400> 34

Thr Xaa Phe Tyr Xaa Gly

1 5

<210> 35

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (2)..(2)

<223> Xaa представляет собой Ile или Met

<220>

<221> ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ПРИЗНАК

<222> (5)..(5)

<223> Xaa представляет собой Ala, Ser, Asp, Cys, Arg или Gly

<400> 35

Thr Xaa Phe Tyr Xaa Gly

1 5

<210> 36

<211> 355

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 36

Met Asp Val Gly Val Ser Pro Ala Lys Ser Ile Leu Ala Lys Pro Leu

1 5 10 15

Lys Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Glu Pro

50 55 60

Gly Asp Asp Ser Gly Ala Gly Ile Phe Arg Lys Ile Leu Val Ser Gln

65 70 75 80

Pro Val Asn Pro Pro Arg Val Thr Thr Thr Leu Ile Glu Pro Ser Asn

85 90 95

Glu Leu Glu Ala Cys Gly Arg Val Ser Tyr Pro Glu Asp Asn Gly Ala

100 105 110

Cys His Arg Met Asp Ser Pro Arg Ser Ala Glu Phe Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Gly His Phe Val Ser Glu Lys Asp Gly His Lys Thr Thr Ile Ser Pro

130 135 140

Arg Ser Pro Ala Glu Thr Ser Glu Leu Val Gly Gln Met Thr Ile Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Ile Pro Pro Glu Lys Ala

165 170 175

Arg Ser Ile Met His Phe Ala Ala Asn Pro Ile Asp Leu Pro Glu Asn

180 185 190

Gly Ile Phe Ala Ser Ser Arg Met Ile Ser Lys Leu Ile Ser Lys Glu

195 200 205

Lys Met Met Glu Leu Pro Gln Lys Gly Leu Glu Lys Ala Asn Ser Ser

210 215 220

Arg Asp Ser Gly Met Glu Gly Gln Ala Asn Arg Lys Val Ser Leu Gln

225 230 235 240

Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asp Arg Lys Phe Ser Lys Ala Lys Lys

245 250 255

Cys Pro Gly Val Ala Ser Ser Ser Leu Glu Met Phe Leu Asn Cys Gln

260 265 270

Pro Arg Met Lys Ala Ala Tyr Ser Gln Asn Leu Gly Cys Thr Gly Ser

275 280 285

Pro Leu His Ser Gln Ser Pro Glu Ser Gln Thr Lys Ser Pro Asn Leu

290 295 300

Ser Val Asp Leu Asn Ser Glu Gly Ile Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala

305 310 315 320

Lys Gly Glu Leu Arg Gly His Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn

325 330 335

Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His

340 345 350

His Gly Ser

355

<210> 37

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 37

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Lys Gly Glu Leu Arg Gly His Pro Phe

1 5 10 15

Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg

20 25 30

Thr Gly His His His His His His Gly Ser

35 40

<210> 38

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 38

Met Asp Val Gly Val Ser Pro Ala Lys Ser Ile Leu Ala Lys Pro Leu

1 5 10 15

Lys Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

20 25 30

Arg Lys Phe Leu Lys Asp Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

35 40 45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Glu Pro

50 55 60

Gly Asp Asp Ser Gly Ala Gly Ile Phe Arg Lys Ile Leu Val Ser Gln

65 70 75 80

Pro Val Asn Pro Pro Arg Val Thr Thr Thr Leu Ile Glu Pro Ser Asn

85 90 95

Glu Leu Glu Ala Cys Gly Arg Val Ser Tyr Pro Glu Asp Asn Gly Ala

100 105 110

Cys His Arg Met Asp Ser Pro Arg Ser Ala Glu Phe Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Gly His Phe Val Ser Glu Lys Asp Gly His Lys Thr Thr Ile Ser Pro

130 135 140

Arg Ser Pro Ala Glu Thr Ser Glu Leu Val Gly Gln Met Thr Ile Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Ile Pro Pro Glu Lys Ala

165 170 175

Arg Ser Ile Met His Phe Ala Ala Asn Pro Ile Asp Leu Pro Glu Asn

180 185 190

Gly Ile Phe Ala Ser Ser Arg Met Ile Ser Lys Leu Ile Ser Lys Glu

195 200 205

Lys Met Met Glu Leu Pro Gln Lys Gly Leu Glu Lys Ala Asn Ser Ser

210 215 220

Arg Asp Ser Gly Met Glu Gly Gln Ala Asn Arg Lys Val Ser Leu Gln

225 230 235 240

Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asp Arg Lys Phe Ser Lys Ala Lys Lys

245 250 255

Cys Pro Gly Val Ala Ser Ser Ser Leu Glu Met Phe Leu Asn Cys Gln

260 265 270

Pro Arg Met Lys Ala Ala Tyr Ser Gln Asn Leu Gly Cys Thr Gly Ser

275 280 285

Pro Leu His Ser Gln Ser Pro Glu Ser Gln Thr Lys Ser Pro Asn Leu

290 295 300

Ser Val Asp Leu Asn Ser Glu Gly Ile Gly Ser

305 310 315

<210> 39

<211> 86

<212> ДНК

<213> Lolium perenne

<400> 39

gtaatgttca gctctgctat agtgtgtgcc accctgcttg tttaataatg cgttctcttc 60

gtttttatga tatcttattc ttccag 86

<210> 40

<211> 1157

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 40

atggacgtgg gcgtgtcccc ggccaagtct attctcgcca agccggtaat gttcagctct 60

gctatagtgt gtgccaccct gcttgtttaa taatgcgttc tcttcgtttt tatgatatct 120

tattcttcca gctcaagctc ctcaccgagg aggacatctc tcagctcaca agagaggact 180

gccgcaagtt cctgaaggac aaggggatga gaaggccttc ctggaacaag tcccaggcca 240

tccagcaagt gctcagcctc aaggcccttt acgagccagg cgacgactcc ggcgctggca 300

ttttcagaaa gatcctcgtg tcccagccgg tgaacccacc aagggtgacc accacactca 360

tcgagccgtc caatgagctt gaggcttgcg gcagagtgtc ctacccagag gataatggcg 420

cctgccacag gatggattct ccaaggtctg ctgagttctc tggcggctcc ggccatttcg 480

tgtctgagaa ggatggccac aagaccacca tctccccaag atccccagcc gagacatctg 540

agcttgtggg ccagatgacc atcttctact ccggcaaggt gaacgtgtac gacggcatcc 600

caccagagaa ggcccgctcc attatgcact tcgccgccaa cccaatcgac ctcccagaga 660

atggcatctt cgcctccagc cgcatgatct ccaagctcat ctccaaggag aagatgatgg 720

agctgccgca gaagggcctc gagaaggcta attcctctcg cgactccggc atggagggcc 780

aggctaatag aaaggtgtcc ctccaacgct accgcgagaa gaggaaggac cgcaagttct 840

ccaaggccaa gaagtgccca ggcgttgcct cttccagcct cgagatgttc ctcaactgcc 900

agccgagaat gaaggccgcc tactcccaaa atctcggctg cacaggctcc ccactccatt 960

ctcagtcccc agagtctcag accaagtccc cgaacctctc cgtggacctt aactccgagg 1020

gcatcggatc cggcggcggc tctgctaagg gcgagctgag gggccacccg ttcgagggca 1080

agccaattcc aaatccactc ctcggcctcg actctaccag gaccggccac catcaccatc 1140

accacggatc ctaatga 1157

<210> 41

<211> 2921

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 41

gcggccgctc tagaactagt ccccttattg tacttcaatt aattatcatt atatcagcat 60

aaacattata ataagtttct tgcgtgttgg aacgtcattt tagttattct aaagaggaaa 120

tagtttcttt tttgctcatg acatcagaca tctggactac tatactggag tttacctttt 180

cttctcctct ttttcttatt gttcctctaa aaaaaattat cactttttaa atgcattagt 240

taaacttatc tcaacaacgt ttaaaattca tttcttgaat gcccattaca atgtaatagt 300

ataacttaat tagtcgtctc catgaaccat taatacgtac ggagtaatat aaaacaccat 360

tggggagttc aatttgcaat aatttcttgc aaaaatgtaa agtacctttt tgttcttgca 420

aaattttaca aataaaaatt tgcagctctt ttttttctct ctctccaaat actagctcaa 480

aacccacaaa tatttttgaa tttatggcat acttttagaa tgcgtttgat gcaactattt 540

tcctttagga aatattcaca acaatctaag acaatcaaaa agtagaaaat agtttgtaaa 600

aagggatgtg gaggacatct taatcaaata ttttcagttt aaaacttgaa aatgaaaaaa 660

cacccgaaag gaaatgattc gttctttaat atgtcctaca caatgtgaat ttgaattagt 720

ttggtcatac ggtatatcat atgattataa ataaaaaaaa ttagcaaaag aatataattt 780

attaaatatt ttacaccata ccaaacacaa ccgcattata tataatctta attatcatta 840

tcaccagcat caacattata atgattcccc tatgcgttgg aacgtcatta tagttattct 900

aaacaagaaa gaaatttgtt cttgacatca gacatctagt attataactc tagtggagct 960

taccttttct tttccttctt ttttttcttc ttaaaaaaat tatcactttt taaatcttgt 1020

atattagtta agcttatcta aacaaagttt taaattcatt tcttaaacgt ccattacaat 1080

gtaatataac ttagtcgtct caattaaacc attaatgtga aatataaatc aaaaaaagcc 1140

aaagggcggt gggacggcgc caatcatttg tcctagtcca ctcaaataag gcccatggtc 1200

ggcaaaacca aacacaaaat gtgttatttt taattttttc ctcttttatt gttaaagttg 1260

caaaatgtgt tatttttggt aagaccctat ggatatataa agacaggtta tgtgaaactt 1320

ggaaaaccat caagttttaa gcaaaaccct cttaagaact taaattgagc ttcttttggg 1380

gcatttttct agtgagaact aaaaacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta aaaaaaacca 1440

tggacgtggg cgtgtccccg gccaagtcta ttctcgccaa gccggtaatg ttcagctctg 1500

ctatagtgtg tgccaccctg cttgtttaat aatgcgttct cttcgttttt atgatatctt 1560

attcttccag ctcaagctcc tcaccgagga ggacatctct cagctcacaa gagaggactg 1620

ccgcaagttc ctgaaggaca aggggatgag aaggccttcc tggaacaagt cccaggccat 1680

ccagcaagtg ctcagcctca aggcccttta cgagccaggc gacgactccg gcgctggcat 1740

tttcagaaag atcctcgtgt cccagccggt gaacccacca agggtgacca ccacactcat 1800

cgagccgtcc aatgagcttg aggcttgcgg cagagtgtcc tacccagagg ataatggcgc 1860

ctgccacagg atggattctc caaggtctgc tgagttctct ggcggctccg gccatttcgt 1920

gtctgagaag gatggccaca agaccaccat ctccccaaga tccccagccg agacatctga 1980

gcttgtgggc cagatgacca tcttctactc cggcaaggtg aacgtgtacg acggcatccc 2040

accagagaag gcccgctcca ttatgcactt cgccgccaac ccaatcgacc tcccagagaa 2100

tggcatcttc gcctccagcc gcatgatctc caagctcatc tccaaggaga agatgatgga 2160

gctgccgcag aagggcctcg agaaggctaa ttcctctcgc gactccggca tggagggcca 2220

ggctaataga aaggtgtccc tccaacgcta ccgcgagaag aggaaggacc gcaagttctc 2280

caaggccaag aagtgcccag gcgttgcctc ttccagcctc gagatgttcc tcaactgcca 2340

gccgagaatg aaggccgcct actcccaaaa tctcggctgc acaggctccc cactccattc 2400

tcagtcccca gagtctcaga ccaagtcccc gaacctctcc gtggacctta actccgaggg 2460

catcggatcc ggcggcggct ctgctaaggg cgagctgagg ggccacccgt tcgagggcaa 2520

gccaattcca aatccactcc tcggcctcga ctctaccagg accggccacc atcaccatca 2580

ccacggatcc taatgaaccc agctttcttg tacaaagtgg tctagtgggt accgcgaatt 2640

tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc 2700

ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt 2760

aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt 2820

aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt 2880

catctatgtt actagatcga agcggccgct ctagaactag t 2921

<210> 42

<211> 2249

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 42

gcggccgctc tagaactagt gtcctacaca atgtgaattt gaattagttt ggtcatacgg 60

tatatcatat gattataaat aaaaaaaatt agcaaaagaa tataatttat taaatatttt 120

acaccatacc aaacacaacc gcattatata taatcttaat tatcattatc accagcatca 180

acattataat gattccccta tgcgttggaa cgtcattata gttattctaa acaagaaaga 240

aatttgttct tgacatcaga catctagtat tataactcta gtggagctta ccttttcttt 300

tccttctttt ttttcttctt aaaaaaatta tcacttttta aatcttgtat attagttaag 360

cttatctaaa caaagtttta aattcatttc ttaaacgtcc attacaatgt aatataactt 420

agtcgtctca attaaaccat taatgtgaaa tataaatcaa aaaaagccaa agggcggtgg 480

gacggcgcca atcatttgtc ctagtccact caaataaggc ccatggtcgg caaaaccaaa 540

cacaaaatgt gttattttta attttttcct cttttattgt taaagttgca aaatgtgtta 600

tttttggtaa gaccctatgg atatataaag acaggttatg tgaaacttgg aaaaccatca 660

agttttaagc aaaaccctct taagaactta aattgagctt cttttggggc atttttctag 720

tgagaactaa aaacaagttt gtacaaaaaa gcaggctaaa aaaaaccatg gacgtgggcg 780

tgtccccggc caagtctatt ctcgccaagc cggtaatgtt cagctctgct atagtgtgtg 840

ccaccctgct tgtttaataa tgcgttctct tcgtttttat gatatcttat tcttccagct 900

caagctcctc accgaggagg acatctctca gctcacaaga gaggactgcc gcaagttcct 960

gaaggacaag gggatgagaa ggccttcctg gaacaagtcc caggccatcc agcaagtgct 1020

cagcctcaag gccctttacg agccaggcga cgactccggc gctggcattt tcagaaagat 1080

cctcgtgtcc cagccggtga acccaccaag ggtgaccacc acactcatcg agccgtccaa 1140

tgagcttgag gcttgcggca gagtgtccta cccagaggat aatggcgcct gccacaggat 1200

ggattctcca aggtctgctg agttctctgg cggctccggc catttcgtgt ctgagaagga 1260

tggccacaag accaccatct ccccaagatc cccagccgag acatctgagc ttgtgggcca 1320

gatgaccatc ttctactccg gcaaggtgaa cgtgtacgac ggcatcccac cagagaaggc 1380

ccgctccatt atgcacttcg ccgccaaccc aatcgacctc ccagagaatg gcatcttcgc 1440

ctccagccgc atgatctcca agctcatctc caaggagaag atgatggagc tgccgcagaa 1500

gggcctcgag aaggctaatt cctctcgcga ctccggcatg gagggccagg ctaatagaaa 1560

ggtgtccctc caacgctacc gcgagaagag gaaggaccgc aagttctcca aggccaagaa 1620

gtgcccaggc gttgcctctt ccagcctcga gatgttcctc aactgccagc cgagaatgaa 1680

ggccgcctac tcccaaaatc tcggctgcac aggctcccca ctccattctc agtccccaga 1740

gtctcagacc aagtccccga acctctccgt ggaccttaac tccgagggca tcggatccgg 1800

cggcggctct gctaagggcg agctgagggg ccacccgttc gagggcaagc caattccaaa 1860

tccactcctc ggcctcgact ctaccaggac cggccaccat caccatcacc acggatccta 1920

atgaacccag ctttcttgta caaagtggtc tagtgggtac cgcgaatttc cccgatcgtt 1980

caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 2040

tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 2100

tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 2160

aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 2220

tagatcgaag cggccgctct agaactagt 2249

<210> 43

<211> 2852

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 43

gcggccgctc tagaactagt tcacgtggaa cgcgccgcag taaacggagc ggtggatcaa 60

acttttcgtc cgtttgatca aacagaagag aactagtcaa tgctctttct tcatatcaca 120

atttaatagt ctcaagacga ttacgccaca taaccatttt ctcgtgattt cgacatcaaa 180

atttaataaa aggaactgat tgattggtca tcatgttaca agtgtcaaat gagctaatcc 240

gttttacagt ggcatagttt acgatcaatt tacaaatttt tggttttata acatacttgt 300

agttaaaact atttataagc tatttatagt gagttagctt ataaaaccct attcttttat 360

ctaaaattat gttttgactc gtttcatgat aaaattttat ccttttcatc ggaataaaaa 420

actttattat ttatttggca aaataattgg tgtaaaaatt atgtatatgt taataacaaa 480

aaatattaat ctgattcata atcttaaaaa agaaaaattt cttgaaataa actttagaca 540

ttgtaaataa aaaaacatta tttttatata atgggatgtt tatatgtaat tttttataaa 600

aaaataaaag ttgtttacta gtaatccgat tggctttaac tatcgtcgcc aaaagaataa 660

tgtagaactg actttgaggt aaaactaaaa gaaatttgta agataatagt cacattaaat 720

gctaaaatta atacatactg atatatcgta taaaatttat gaaaactaca ccttaacctg 780

aatcatacac tgtaataaaa aaaacaaatt atatataaac cctaaaaact aatcataaat 840

cccaaacggt gtactctcta ttagctttga aaggattgcc caattgtttg ttaaaaattt 900

ctaataatag tacaatgttt tgtttcattt ttccttttcg tcaacctgtt acccaatagc 960

aaatgaagtt tttatgtgtg tgtgtgtgtg tgaatttcca tgaaaatgaa acgggcttag 1020

aatcccggtg tattatgggt cgggtcgtaa ccgggcaatg acgcaggatc tgacgtaaaa 1080

ctcccaagaa tttttttaaa aagtctccgg aaaataaaat caaagttcat taacttaaaa 1140

agaaaaaaca aaatcggtcc acgtcccaaa ccctttttat aggagagtct tatgttctgg 1200

cagaagactt cacagactct ttcttaatct ctctctcttt caaccaaacc cctaaacaaa 1260

aaaaaaatac attttctgat ctctctaaaa atctttctcc ttcgttaatc tcgtgatctc 1320

tttctttttc tatatacaag tttgtacaaa aaagcaggct aaaaaaaacc atggacgtgg 1380

gcgtgtcccc ggccaagtct attctcgcca agccggtaat gttcagctct gctatagtgt 1440

gtgccaccct gcttgtttaa taatgcgttc tcttcgtttt tatgatatct tattcttcca 1500

gctcaagctc ctcaccgagg aggacatctc tcagctcaca agagaggact gccgcaagtt 1560

cctgaaggac aaggggatga gaaggccttc ctggaacaag tcccaggcca tccagcaagt 1620

gctcagcctc aaggcccttt acgagccagg cgacgactcc ggcgctggca ttttcagaaa 1680

gatcctcgtg tcccagccgg tgaacccacc aagggtgacc accacactca tcgagccgtc 1740

caatgagctt gaggcttgcg gcagagtgtc ctacccagag gataatggcg cctgccacag 1800

gatggattct ccaaggtctg ctgagttctc tggcggctcc ggccatttcg tgtctgagaa 1860

ggatggccac aagaccacca tctccccaag atccccagcc gagacatctg agcttgtggg 1920

ccagatgacc atcttctact ccggcaaggt gaacgtgtac gacggcatcc caccagagaa 1980

ggcccgctcc attatgcact tcgccgccaa cccaatcgac ctcccagaga atggcatctt 2040

cgcctccagc cgcatgatct ccaagctcat ctccaaggag aagatgatgg agctgccgca 2100

gaagggcctc gagaaggcta attcctctcg cgactccggc atggagggcc aggctaatag 2160

aaaggtgtcc ctccaacgct accgcgagaa gaggaaggac cgcaagttct ccaaggccaa 2220

gaagtgccca ggcgttgcct cttccagcct cgagatgttc ctcaactgcc agccgagaat 2280

gaaggccgcc tactcccaaa atctcggctg cacaggctcc ccactccatt ctcagtcccc 2340

agagtctcag accaagtccc cgaacctctc cgtggacctt aactccgagg gcatcggatc 2400

cggcggcggc tctgctaagg gcgagctgag gggccacccg ttcgagggca agccaattcc 2460

aaatccactc ctcggcctcg actctaccag gaccggccac catcaccatc accacggatc 2520

ctaatgaacc cagctttctt gtacaaagtg gtctagtggg taccgcgaat ttccccgatc 2580

gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 2640

ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 2700

cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 2760

tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 2820

tactagatcg aagcggccgc tctagaacta gt 2852

<210> 44

<211> 2801

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Консенсусная последовательность

<400> 44