СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ Т-2 ТОКСИКОЗА ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ Т-2 ТОКСИКОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/15 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для лечения Т-2 токсикоза у животных.

Т-2 токсин является одним из наиболее распространенных [1] и токсичных [2] микотоксинов группы трихотеценов.

Т-2 токсин угнетает функциональную активность органов (костный мозг, селезенка, тимус, лимфоидная ткань), подавляя иммунный ответ организма животных и птиц [3]. Так, имеются данные, что Т-2 токсин угнетает центральную нервную систему [4, 5, 6, 7, 8].

Т-2 микотоксикоз проявляется в виде рвоты, геморрагического синдрома, эритроцитопении, лейкопении, тромбоцитопении, анемии. При отравлении Т-2 токсином животные зачастую отказываются от корма, происходит поэтапное разрушение кроветворных и иммунокомпетентных органов [9, 10, 11, 12].

Стратегия предотвращения Т-2 микотоксикоза у животных направлена прежде всего на предотвращение образования микотоксина, исключение из рациона контаминированных кормов, а также на деконтаминацию и детоксикацию кормов.

На практике, несмотря на комплекс превентивных мер, исключить поедание животными пораженных кормов пока не удается, что требует лечения микотоксикозов.

Известны способы лечения при отравлении Т-2 токсином, включающие применение сорбентов, иммуномодуляторов, антиоксидантов, детоксицирующих средств, а также пробиотиков [13, 14].

Так, известно использование ряда антиоксидантов для профилактики и лечения Т-2 токсикоза: препарат IFO-6ET [15], селена и витамина Е [16], витамина С, витамина Е, селена [17, 18].

Недостатком данного способа является то, что детоксикационное действие антиоксидантов основано на устранении инициации свободнорадикального окисления липидов - одного из возможных механизмов действия трихотеценовых микотоксинов, а не на устранении самого токсина.

Одним из эффективных способов лечения микотоксикозов у животных является применение различных адсорбентов: цеолитов [19, 20], бентонитов [11, 21], активированного угля [22], шунгита [23, 24], вермикулита [25], пищевых волокон [26], полисахаридов [27], глюкоманнанов [28, 29], лигнинов [30, 31], белого шлама [32], позволяющих значительно предотвратить всасывание микотоксинов и их метаболитов в пищеварительном тракте и их распространение по организму.

Однако данные способы имеют ряд недостатков, в частности к недостаткам сорбентов на основе алюмосиликатов относят: отсутствие избирательности сорбции к витаминам и питательным веществам, высокая норма ввода в рацион.

Известны способы детоксикации при микотоксикозах с применением пробиотиков на основе различных штаммов бактерий: Bacillus subtilis-93 [33], препарат Сахабактисубтил - содержит штаммы бактерий Bacillus subtilis-ТНП-3 и Bacillus subtilis-THn-5 [34]. Однако эффективность данных препаратов основана на способности микроорганизмов, входящих в их состав, к витаминобразующей, кислотообразующей, антагонистической и иммуностимулирующей активности.

Известны комплексные препараты, в которых могут присутствовать органические и минеральные компоненты, культуры пробиотиков и пребиотиков, ингибиторы, ферменты, биологически активные вещества (витамины, минеральные вещества, иммуностимуляторы): «Фунгистат» [35]; смесь природных цеолитов и ферментных препаратов [36]; смесь сорбционного материала, кислот и др. [37]; кормовая добавка, содержащая пчелиный подмор, бентонит, травяную муку, биомассу и культуральную жидкость чайного гриба М. Gisevii Lindau, бифидумбактерин, антидиарин [38].

Недостатком этих комбинированных препаратов является то, что одновременное присутствие разных по физико-химическим свойствам составляющих, может привести к взаимному компенсированию (поглощению) полезных свойств.

Несмотря на возрастающий перечень фармакологических препаратов для лечения Т-2 токсикоза, выбор эффективных средств защиты от микотоксинов еще крайне незначителен, так как специфической профилактики пока не разработано. Антитоксические сыворотки в медицинской и ветеринарной практике также отсутствуют, это связано в первую очередь с тем, что микотоксины это низкомолекулярные соединения, не обладающие способностью к антителообразованию.

Задачей предлагаемого изобретения является создание антитоксической гипериммунной сыворотки для лечения Т-2 токсикоза животных, обеспечивающей нейтрализацию действия Т-2 токсина, нормализацию показателей гомеостаза, улучшение общего состояния, снижение падежа и повышение массы тела.

Поставленная задача решается тем, что способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки для лечения Т-2 токсикоза животных, предусматривает трехкратную иммунизацию кроликов конъюгатом Т-2 токсина с полилизином в физиологическом растворе, при первой иммунизации - с полным адъювантом Фрейнда, затем с интервалом 3 недели двукратно - с неполным адъювантом Фрейнда. Введение полученных эмульсий проводят с предварительным нагревом до 37°С, в дозе 2 мл однократно внутрикожно, вдоль спины кроликов, у которых через 2 недели после третьей иммунизации берут кровь из вен уха и выдерживают 30 минут при температуре 37°С, затем сгусток отделяют от стенок сосуда и помещают на 18 часов в холодильник при +4°С, через 18 часов отделяют антитоксическую сыворотку, тестируют в непрямом конкурентном варианте ИФА на наличие антител, доводят титр до 1:6400. Полученную таким образом антитоксическую сыворотку вводят больным животным внутримышечно трехкратно с интервалом в 10 дней в дозе 0,3 мл на кг живой массы. Хранят сыворотку в холодильнике при +4°С. А конъюгат Т-2 токсина с полилизином получают на основе гемисукцината Т-2 (ГС-Т-2), к которому добавляют сначала смесь ацетонитрила с водой в соотношении 6:1, а затем ЕДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид), выдерживают смесь в течение 10 минут при температуре 200°С и рН 4,5, затем порционно добавляют раствор полилизина в физиологическом растворе в соотношении 1:3, конъюгируют в течение 2 часов при рН 6,5, затем диализируют в течение 18 часов и используют для получения антитоксической сыворотки. Применение полученной антитоксической гипериммунной сыворотки позволяет обеспечить эффективное лечение больных Т-2 токсикозом животных за счет нейтрализации действия Т-2 токсина, нормализовать показатели гомеостаза, улучшить общее состояние животных и снизить падеж и повысить массу тела животных.

Способ лечения Т-2 токсикоза животных предусматривает трехкратное введение антитоксической гипериммунной сыворотки внутримышечно с интервалом в 10 дней в дозе 0,3 мг на кг живой массы.

Способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки для лечения Т-2 токсикоза животных осуществляли следующим образом.

Для получения сыворотки крови использовали самцов кроликов породы «Серый великан» темного или серого окраса, не старше 2 лет, с массой тела 2,0-2,9 кг. В качестве антигена для гипериммунизации кроликов использовали конъюгат Т-2 токсина с полилизином.

Для получения конъюгата Т-2 токсина с полилизином сначала осуществляли синтез гемисукцината Т-2 (ГС-Т-2). Введение в молекулу гаптена карбоксильной группы проводили согласно общепринятой методике [39]. Эта реакция широко используется в иммунохимии.

Брали 25 мг микотоксина Т-2, растворяли в 5 мл свежеперегнанного над NaOH пиридина и помещали в колбу емкостью 25 мл, снабженную обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой. К раствору добавляли 0,54 г янтарного ангидрида (100-кратный избыток). Реакционную смесь кипятили при 120°С в течение 4 часов. После чего из реакционной массы отбирали 100 мкл раствора в коническую колбу объемом 10 мл для определения степени реакции, затем к пиридиновому раствору добавляли 1 мл хлороформа, промывали дистиллированной водой 4×1 мл и 0,1н HCl 3×1 мл для удаления следов пиридина и янтарного ангидрида, отмытый хлороформ, содержащий продукты реакции, исследовали с помощью аналитической тонкослойной хроматографии на стеклянной пластинке 5×10 см (кизельгель 60 (Mezek)) в системе растворителей ХЛФ : метанол (9:1). Обнаружитель: 1% раствор H₂SO₄ в метаноле, нагревали до 180°С в течение 2 минут Rf (микотоксина Т-2) = 0,72; Rf (гемисукцината Т-2) = 0,35. Реакцию останавливают, когда на пластинке не остается следов исходного Т-2. Пиридин упаривали на роторном испарителе, полученный маслообразный осадок растворяли в 50 мл ХЛФ, затем переносили раствор в делительную воронку и промывали сначала дистиллированной водой (4×150 мл), затем для удаления следов пиридина промывали 0,3H HCl (6×150 мл). Хлороформный слой сушили над активированным углем и хлоридом кальция, фильтровали и упаривали досуха на роторном испарителе. Полученный осадок - стеклообразная желтоватая масса - гемисукцинной - Т-2 (ГС-Т-2). Выход продукта - 24 мг (75%).

Синтез конъюгатов ГС-Т-2 с полилизином (ПЛ) проводили с использованием метода активированных эфиров [40], который широко применяется при создании иммунореагентов [41].

Конъюгат (ГС-Т-2)-ПЛ синтезировали по типичной методике. Брали 2,6 мг ГС-Т-2 и растворяли в смеси ацетонитрил - вода в соотношении 6:1 и добавляли 1,8 мг ЕДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид), выдерживали смесь в течение 10 минут при 200°С и рН 4,5, затем порционно добавляли раствор полилизина в физиологическом растворе (в соотношении 1:3), затем конъюгировали в течение 2 часов при рН 6,5 и диализировали против физиологического раствора в течение 18 часов. Полученный конъюгат Т-2 полилизин использовали для получения антитоксической гипериммунной сыворотки.

Способ получения антитоксической гиперимунной сыворотки осуществляли следующим образом.

За сутки до иммунизации на спине животного выбривали шерсть, протирали 7% раствором этилового спирта. Раствор антигена готовили непосредственно перед иммунизацией: 300 мкг конъюгата Т-2 токсин - полилизин растворяли в 1 мл стерильного физиологического раствора, затем тщательно смешивали с 1 мл полного адъюванта Фрейнда - для первой инъекции. Затем с интервалом 3 недели по 300 мкг конъюгата Т-2 токсин-полилизин растворяли в 1 мл стерильного физиологического раствора и перемешивали с 1 мл неполного адъюванта Фрейнда для 2-ой инъекции и через 3 недели - точно также и для 3-ей инъекции. Полученные эмульсии предварительно нагревали до 37°С и в дозе 2 мл вводили стерильным шприцом однократно внутрикожно вдоль выбритой спины кроликов 10-15 точек, а остатки эмульсии (около 0,2 мл) вводили внутримышечно в бедро. На 7-й, 28 и 49-й день после третьей иммунизации брали пробы крови из вен уха кроликов, исследовали их в непрямом методе ИФА на специфичность антител, максимальное накопление антител наступало через 3 недели. Затем собирали кровь от каждого иммунизированного животного, выдерживали ее 30 минут при 37°С, далее сгусток крови отделяли от стенок, помещали на 18 часов в холодильник при 4°С, а через 18 часов отделяли полученную антитоксическую гиперимунную сыворотку. Тестировали в непрямом конкурентном варианте ИФА на наличие антител, доводили титр до 1:6400 и использовали для лечения больных животных Т-2 токсикозом и хранили в холодильнике при 4°С.

Сыворотку отделяли общепринятым методом [42].

Пример 1. Экспериментальные данные по эффективности специфического лечения Т-2 токсикоза гипериммуной сывороткой были получены в опытах на 72 самцах белых крыс живой массой 160-190 г, разделенных по принципу аналогов на 4 группы. Перед постановкой эксперимента животных в течение двух недель содержали на рационе свободным от микотоксинов. Первая группа животных служила биологическим контролем и в течение 30 суток опыта получала «чистый» автоклавированный комбикорм. Крысам 2 группы задавали «токсичный корм», контаминированный T-2-токсином (в дозе 0,4 мг/кг корма, что превышает предельно-допустимую концентрацию, принятую на территории РФ в 4 раза); третья группа получала «токсичный корм» и лечение в виде инъекций гипериммуной сыворотки в дозе 0,3 мл на кг массы тела в начале опыта и повторно на 10 и 20 сутки эксперимента; крысы четвертой группы получала «токсичный корм» и инъекции интактной сыворотки по той же схеме, что и крысы третьей группы.

Эксперимент длился 30 суток. В течение эксперимента вели учет выживаемости, динамики изменения массы тела. По окончанию эксперимента проводили эвтаназию животных с отбором крови для лабораторных исследований.

Для экспериментальных исследований использовали кристаллический Т-2 токсин, полученный в лаборатории микотоксинов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», с чистотой микотоксина 99,8%. Токсин вводили включением в рацион путем последовательного и ступенчатого тщательного перемешивания. Корм также предварительно проверялся на содержание регламентированных в России микотоксинов методом иммуноферментного анализа [43] и показателям биологической безопасности - корм соответствовал сертификату качества по безопасности.

Гематологические исследования, включающие определение количества эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина проводили общепринятыми методами, содержание общего белка устанавливали - рефрактометрически, количественное соотношение белковых фракций - нефелометрическим методом на КФК-2 при красном светофильтре [44, 45].

Обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту.

У крыс при длительном получении токсического рациона отмечали снижение потребления корма и воды, а также взъерошенность кожного покрова. У животных, получавших специфическое лечение клинические признаки не проявились. Данные и показатели изменения живой массы представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что выживаемость крыс, получавших токсин без лечения, составила 66,7% при 100% сохранности в группах биологического контроля и лечения. Во второй группе выраженные клинические признаки токсикоза проявились уже на 10 сутки эксперимента в виде снижения аппетита, угнетения, анорексии и диареи, в то время как в третьей группе клиническая картина была у 93% животных только в конце эксперимента.

У крыс, получавших токсичный корм без лечения, наблюдали снижение живой массы, так средняя живая масса белых крыс к концу опыта была на 23,1% ниже по сравнению с начальным показателем, а в группе животных, получавших лечение, наблюдали положительный прирост, составивший 0,6%, против 7,41% в группе биологического контроля. В четвертой группе, где крысы получили курс инъекций интактной сыворотки, наблюдали уменьшение живой массы, составивший 26,3%.

Из результатов гематологических исследований крови белых крыс, представленных в таблице 2 видно, что к 30 суткам эксперимента во второй группе отмечалось закономерное выраженное снижение количества эритроцитов на 13,3% (р<0,01), лейкоцитов - на 47,8% (р<0,01), гемоглобина - на 19% (р<0,001), в четвертой группе снижение аналогичных показателей составило 5,88%, 49,6% (р<0,001 и 15,23% (р<0,0001), соответственно. В то время как на фоне специфического лечения данные показатели были на одном уровне с группой контроля.

Прогрессирующие эритроцито-лейкопения и анемия, с одновременным повышением значения СОЭ, являются одним их характерных симптомов микотоксикозов и указывают на серьезные деструктивные изменения в кроветворных и иммунокомпетентных органах, которые, как известно, являются органами-мишенями Т-2 токсина [46, 47].

Скорость оседания эритроцитов увеличивалась во второй и четвертой группах крыс на 30 сутки опыта на 146,1% (р<0,01) и 138,26% (р<0,001) соответственно, в то время как в группе с лечением - на 26,1% (р<0,05).

Согласно данным, представленным в таблице 2 видно, что наиболее выраженное нарушение белкового обмена происходило у крыс, получавших токсичный корм без лечения, так во второй и четвертых группах содержание общего белка в сыворотке крови по сравнению с контрольными данными снизилось на 30 сутку на 26,0% (р<0,01) и 27,6% (р<0,001) соответственно. Введение специфической сыворотки предотвращало белковый дисбаланс, так в третьей группе происходило снижение общего белка на 30 сутки на 12,6% (р<0,05).

Таким образом, проведенными исследованиями установлено, что при Т-2 - токсикозе белых крыс применение специфического лечения снижало отрицательное влияние экотоксиканта, способствовало повышению сохранности животных и нормализации гемато-биохимических показателей.

Пример 2. Известно, что пушные звери более чувствительны к микотоксинам, чем лабораторные и сельскохозяйственные животные [48, 49]. Поэтому для подтверждения данных об эффективности специфического лечения Т-2 токсикоза гипериммуной сывороткой на белых крысах, был поставлен аналогичный эксперимент на кроликах породы «Серый великан». Для этой цели было сформировано 4 группы кроликов по 3 животных, разделенных по принципу аналогов. Первая группа - служила биологическим контролем, получала обычный корм без токсинов; вторая - с рационом Т-2 токсин в дозе 300 мкг/кг корма; третья - с рационом Т-2 токсин в дозе 300 мкг/кг корма и лечение в виде инъекций гипериммуной сыворотки в дозе 0,3 мл на кг массы тела в начале опыта и повторно на 10 и 20 сутки эксперимента. Четвертая группы получала с рационом Т-2 токсин в дозе 300 мкг/кг корма «токсичный корм» и инъекции интактной сыворотки по той же схеме, что и животные третьей группы.

Перед постановкой эксперимента животных в течение двух недель содержали на рационе свободным от микотоксинов. Опыт длился в течение 30 дней, каждые 10 дней проводили гематологические и биохимические исследования крови.

Для экспериментальных исследований использовали кристаллический Т-2 токсин, полученный в лаборатории микотоксинов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», с чистотой микотоксина 99,8%. Токсин вводили в корма путем последовательного и ступенчатого тщательного перемешивания. Корм также предварительно проверялся на содержание регламентированных в России микотоксинов методом иммуноферментного анализа [43] и показателям биологической безопасности - корм соответствовал сертификату качества по безопасности.

В качестве параметров эффективности применения антитоксической сыворотки при Т-2 токсикозе служили клинические признаки, динамика массы тела, гематологические и биохимические показатели.

Количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина в периферической крови определяли по общепринятым методикам, общий белок - рефрактометрически [50, 45]. Биохимические показатели сыворотки крови (глюкоза, мочевина, мочевая кислота, ACT, АЛТ, общий кальций, неорганический фосфор) определяли на анализаторе Express Plus.

Обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту.

Клинические признаки интоксикации регистрировали только у животных, получавших токсичный корм, что проявлялось апатией, снижением аппетита и реакции на внешние раздражители, кратковременным расстройством желудочно-кишечного тракта на 25 сутки эксперимента.

Динамика живой массы тела кроликов при Т-2 токсикозе на фоне применения антитоксической сыворотки представлены в таблице 3, из которой видно, что практически во всех подопытных группах, за исключением группы биологического контроля, происходило снижение живой массы.

Как видно из таблицы, во второй и четвертой группах к 20 суткам масса тела уменьшилась на 10,8 и 10,4%, к 30 суткам - на 15,5 и 15,0%, соответственно. В первой и третьей группах, относительно исходных данных отмечали повышение массы тела на 7,97% и 7,68%, соответственно.

Результаты исследования крови кроликов при Т-2 токсикозе на фоне специфического лечения, представлены в таблице 4, из которой видно, что снижение гематологических показателей в группе крыс, получавших «токсичный корм» без применения антитоксической сыворотки, за все время исследования, было ниже исходных показателей.

По данным таблицы 4 видно, что во второй группе кроликов, содержание эритроцитов в крови по сравнению с исходными данными уменьшилось на 10 сутки эксперимента на 5,81%, на 20 сутки - на 17,1%, на 30 сутки - на 21,15%. В третьей группе на 10 сутки увеличилось количество эритроцитов на 2,8%, потом количество эритроцитов снизилось относительно исходных данных на 20, 30 сутки исследования на 2,3 и 6,85% соответственно. В четвертой группе снижение эритроцитов в аналогичные сроки составило в те же сроки 6,37%; 14,35 и 21,1%, соответственно.

Содержание гемоглобина в крови кроликов второй группы по сравнению с исходными данными уменьшилось на 10 сутки эксперимента на 5,73%, на 20 сут - на 10,40%, на 30 сут - на 16,06%. В третьей группе на 10 сутки увеличилось содержание гемоглобина на 3,01%, потом содержание гемоглобина снизилось относительно исходных данных на 20, 30 сутки исследования на 1,97 и 6,45% соответственно. Содержание гемоглобина в крови четвертой группы кроликов по сравнению с исходными данными на 10, 20 и 30 сутки эксперимента снизилось на 4,2%, 12,68% и 15,51% соответственно.

СОЭ в крови второй группы кроликов по сравнению с исходными данными увеличилось на 10 сутки эксперимента на 20,71%, на 20 сутки - на 63,31%, на 30 сутки - на 100%. В третьей группе на 10 сутки СОЭ снизилось на 4,32%, потом увеличилось относительно исходных данных на 20 и 30 сутки исследования на 7,56 и 16,75% соответственно. СОЭ в крови кроликов четвертой группы увеличилось на 10, 20 и 30 сутки эксперимента на 19,28%, 66,27 и 95,18% соответственно.

Как видно из таблицы №4 во второй группе кроликов, содержание лейкоцитов в крови по сравнению с исходными данными увеличилось на 10 сутки эксперимента на 13,7%, на 20 и 30 сутки отмечалось снижение количества лейкоцитов на 18,55 и 33,1% соответственно. В третьей группе на 10 сутки количество лейкоцитов увеличилось на 3,45%, в последующем на 20, 30 сутки исследования количество лейкоцитов снизилось относительно исходных данных на 1,93 и 6,83% соответственно. Содержание лейкоцитов в крови кроликов четвертой опытной группы снизилось на 20 и 30 сутки эксперимента на 17,95 и 30,91% соответственно.

Содержание общего белка во второй группе кроликов по сравнению с исходными данными к 10 суткам эксперимента снизилось на 6,06%, к 20 суткам - на 12,12%, к 30 суткам - на 24,24%. В третьей группе животных к 10 суткам эксперимента содержание общего белка было выше исходных данных на 2,8%, к 20 суткам этот показатель снизился на 6,7%, к 30 суткам - на 9,3%. В четвертой группе на 10, 20 и 30 сутки эксперимента снижение общего белка составило 6,1; 12,6 и 23,5% соответственно.

В ходе эксперимента провели исследования некоторых биохимических показателей крови кроликов при Т-2 токсикозе на фоне специфического лечения. Данные представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 вытекает, что во второй группе содержание глюкозы на 10, 20 и 30 сутки снизилось на 4,45; 17,3 и 27% соответственно. В третьей группе кроликов содержание глюкозы на 10 и 20 сутки исследования, относительно исходных данных, увеличилось на 5,7 и 1,8% соответственно. При исследовании крови кроликов на 30 сутки отмечалось снижение концентрации глюкозы на 7,7%. В четвертой группе содержание глюкозы в крови кроликов на 10, 20 и 30 сутки, относительно исходных данных, снизилось на 1,83; 18,3 и 28,3% соответственно.

Во второй и третьей группах содержание фосфора неорганического на 10, 20 и 30 сутки, относительно исходных данных, увеличилось на 6,9; 24,5; 40,1% и 2,4; 0,9; 6,7% соответственно. В четвертой группе напротив наблюдали снижение данного показателя в эти же сроки на 7,3; 25,8 и 39,1% соответственно.

Во второй группе содержание кальция общего на 10, 20 и 30 сутки снижалось на 4,5; 25,8 и 39,1% соответственно. Аналогичная тенденция к снижению данного показателя на 4,8; 26,8 и 40,2% соответственно, прослеживалась и в четвертой группе. В третьей группе этот уровень на 10 и 20 сутки увеличивался на 6,4 и 4,8% соответственно; на 30 сутки уменьшался на 5,2%.

Во второй группе активность ACT на 10, 20 и 30 сутки увеличилась, относительно исходных данных, на 24,2; 86,8 и 150% соответственно, в четвертой группе увеличение данного показателя в те же сроки составило 23,8; 87,6 и 145%, соответственно. В третьей группе данный показатель на 10 сутки уменьшался на 13,1%; на 20 и 30 сутки увеличивался на 4,6 и 38,8% соответственно.

Активность АЛТ на 10, 20 и 30 сутки увеличилась во второй группе относительно исходных данных на 35,5; 107 и 146,9% соответственно, в четвертой группе увеличение данного показателя в те же сроки составило 36,7; 108 и 155%, соответственно. В третьей группе данный показатель к 10 суткам исследований уменьшался на 3,7%; на 20 и 30 сутки - увеличился на 26,7 и 78,6% соответственно. В третьей группе кроликов активность АЛТ на 10 сутки уменьшилась на 11,5%; на 20 и 30 сутки - увеличилась на 12,6 и 59,7% соответственно.

Во второй, третьей и четвертой группах активность щелочной фосфатазы на 10, 20 и 30 сутки увеличилась на 49,1; 79,0; 125,2%; на 9,5; 22,5; 43,6% и на 48,5; 78,0 и 120,0%, соответственно.

Таким образом, предложенный способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки для лечения Т-2 токсикоза животных позволяет преодолеть токсический эффект, вызванный присутствием в их рационах Т-2 токсина, нормализовать показатели гомеостаза, улучшить общее состояние и снизить падеж животных и повысить массу их тела.

Таким образом, использование специфического способа лечения Т-2 токсикоза позволит предотвратить у животных токсический эффект, вызванный присутствием в их рационах Т-2 токсина. При пассивной иммунизации специфической антитоксической гипериммунной кроличьей сывороткой, полученной многократной иммунизацией кроликов коньюгатом Т-2 полилизина, происходит нейтрализация негативного действия Т-2 токсина, нормализация показателей гомеостаза, улучшение общего состояния, снижение падежа и повышение массы тела животных.

Использованная литература:

1. Тремасов, М.Я. Профилактика микотоксикозов животных в России //Ветеринария. - 2002. - №. 9. - С. 3-8.

2. Рухляда, В.В. Действие фузариотоксина Т-2 на организм поросят //Ветеринария. - 1985. - №. 8. - 11-14.

3. Бекесова, Т. Как защитить корма от плесени //Т. Бекесова. - 2003. - С. 11-12.

4. Уразаев, А.Н., Сметов П.К. Трихотеценовый токсикоз животных //Матер. республиканской научно-производ. конф. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - 1996.

5. Ображей, А.Ф. Т-2 токсикоз кур //Ветеринария. - 1997. - №. 12. - С. 47-50.

6. Семенов, Э.И., Иванов А.В. Актуальные проблемы ветеринарной микотоксикологии //Иммунология, аллергология, инфектология. - 2009. - №. 2. - С. 28-29.

7. Тремасов, М.Я. и др. Проблема микотоксикозов животных //Ветеринарный врач. - 2010. - №. 5. - С. 16-19.

8. Иванов, А.В. и др. Диагностика, профилактика и лечение сочетанных отравлений животных вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Fusarium: Методическое пособие (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН) //Казань: Издательство ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ. - 2012. - 14 л.

9. Кузнецов, А.Ф. Ветеринарная микология. - СПб.: Лань, 2001.

10. Иванов, А.В. и др. Микотоксикозы животных (этиология, диагностика, лечение, профилактика) //М.: Колос. - 2008. - Т. 177. - С. 6-7.

11. Кадиков, И.Р. Показатели естественной резистентности кроликов при отравлении Т-2 токсином и применении лекарственных средств / И.Р. Кадиков, В.А. Новиков, М.Я. Тремасов // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: Матер междунар. научно-практ. конф., Воронеж, 17-19 сентября 2008. - Воронеж, 2008. - С. 162-165.

12. Тремасов, М.Я. Актуальные проблемы ветеринарной микотоксикологии/М.Я. Тремасов, Э.И. Семенов, А.В. Иванов //Иммунология, аллергология, инфектология. - 2009. - №. 2. - С. 28-29.

13. Иванов, А.В. Микотоксины: проблемы, пути решения / А.В. Иванов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов и др. // Нива Татарстана. - 2013. - Т. 1. - С. 20-23.

14. Huyghebaert G., Ducatelle R., Van Immerseel F. An update on alternatives to antimicrobial growth promoters for broilers //The Veterinary Journal. - 2011. - T. 187. - №. 2. - C. 182-188.

15. Способ профилактики микотоксикозов у сельскохозяйственной птицы // Патент России №2337672, 10.11.2008 / С.Ю. Гулюшкин, Т.Н. Ленкова, Е.В. Елизарова [и др.].

16. Atroshi F. et al. Significance of apoptosis and its relationship to antioxidants after ochratoxin A administration in mice //J. Pharm. Pharm. Sci. - 2000. - T. 3. - №. 3. - C. 281-291.

17. Masood K. et al. Differential ethanol sensitivity of recombinant N-methyl-D-aspartate receptor subunits //Molecular pharmacology. - 1994. - T. 45. - №. 2. - C. 324-329.

18. Rizzo A.F. et al. Protective effect of antioxidants against free radical-mediated lipid peroxidation induced by DON or T-2 toxin //Journal of Veterinary Medicine Series A. - 1994. - T. 41. - №. 1-10. - C. 81-90.

19. Шадрин, A.M. Применение природных цеолитов для детоксикации микотоксинов в кормах //Гигиена, ветеринарная санитария и экология животноводства: Матер, всеросс. науч.-практич. конф. Чебоксары. - 1994. - С. 529.

20. Рыжов, В.А. и др. Древесноугольные сорбенты для профилактики микотоксинов //Современные тенденции в сельском хозяйстве. - 2014. - С. 108-111.

21. Семенов, Э.И. Поиск средств профилактики смешанных микотоксикозов животных. - 2006.

22. Фисинин, В.И. Ресурсосберегающие технологии и конкурентоспособность отрасли //Птицеводство. - 2002. - №. 1. - С. 2-5.

23. Способ регулирования продуктивности жвачных животных // Патент России 2569632, 27.11.2015 / Н.В. Боголюбова, В.Н. Романов, Ю.К. Калинин [и др.].

24. Полифункциональный энтеросорбент // Патент России 2430731, 10.10.2011 / А.П. Савельчев, М.Ф. Ильязов, Э.Н. Шарипов.

25. Способ повышения молочной продуктивности крупного рогатого скота // Патент России №2551159, 20.02.2014 / В.П. Короткий, В.А. Рыжов, Ю.Н. Прытков, [и др.].

26. Тутельян, В.А. и др. Влияние пищевых волокон на токсичность и метаболизм трихотеценовых микотоксинов //Токсикологический вестник. - 1994. - №. 1. - С. 16-20.

27. Мишина, Н.Н. Профилактическая эффективность лигнин- и полисахаридсодержащих энтеросорбентов при сочетанном Т-2 и афлатоксикозе / Дисс. канд. биол. наук, 16.00.04. - 148 с.

28. Dawson K.J., Belkhir K.A Bayesian approach to the identification of panmictic populations and the assignment of individuals //Genetics Research. - 2001. - T. 78. - №. 1. - C. 59-77.

29. Ахмадышин, P.A. и др. Роль клеточной стенки в адсорбции Т-2 токсина дрожжами Saccharomyces cerevisiae //Ветеринарный врач. - 2008. -№. 1. - С. 11-12.

30. Композиционный энтеросорбент и способ его приготовления // Патент России №2234931. 29.07.2002 / Решетников И.В.

31. Способ получения энтеросорбента // Патент России №2084236. 20.02.1996 / А.П. Гришина.

32. Способ профилактики микотоксикозов при выращивании бройлеров // Патент России №2555354 С2. 10.07.2015 / М.Э. Бураев, Л.П. Луцкая, Е.В. Шацких [и др.].

33. Способ профилактики микотоксикозов и желудочно-кишечных заболеваний животных // Патент России №2491942 С1. 10.09.2013 / М.Я. Тремасов, Л.Е. Матросова, А.В. Иванов [и др.]

34. Способ профилактики микотоксикозов животных // Патент России №2297842. 27.04.2007 / М.П. Неустроев, Н.П. Тарабукина, А.А. Былгаева [и др.].

35. Способ получения биопрепарата для устранения микотоксинов из кормового сырья и биопрепарат, полученный этим способом // Патент России №2420565. 10.06.2011 / М.А. Малков, Т.В. Данькова.

36. Способ получения многоцелевого препарата с фунгистатической и сорбционной активностью для снижения токсичности кормов, зерна, шрота и торфогрунтов // Патент России №2278158 С2. 20.06.2006 / Малков М.А., Данькова Т.В., Попова Ж.П. [и др.].

37. Кормовой продукт для продуктивных сельскохозяйственных животных и птиц // Патент России №2425587 C1. 10.08.2011 / С.И. Першин, А.В. Стружинский, B.C. Васильев [и др.].

38. Кормовая добавка для сельскохозяйственных животных и птицы // Патент России №2579219 С. 2016.04.10 / А.В. Иванов, Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов [и др.].

39. Wyllie Т.D., Morehouse L.G. Mycotoxic fungi, mycotoxins, mycotoxicoses. - M. Dekker, 1977

40. Means G.E., Feeney R.E. Chemical modification of proteins. – 1971.

41. Кононенко, Г.П. и др. Охратоксин А: исследование контаминации зерна //Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36. - №. 2. - С. 209-213.

42. Бургасов, П.Н. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М //Медицина. - 1978. - С. 103-157.

43. ГОСТ 31653-2012. Корма. Метод иммуноферментного определения микотоксинов.

44. Антонов, Б.И. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические //М.: Агропромиздат. - 1991. - С. 16.

45. Кондрахин, И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики. - КолосС, 2004.

46. Красников, Г.А. и др. Гистологические и биохимические изменения при микотоксикозах птицы //Ветеринария. - 1992. - №. 4. - С. 32.

47. McDonald Е.A., Rosenbluth R., Brenneman R. Expandable microporous prosthesis: пат. 5728150 США. - 1998.

48. Бочарова, A.M., Семикрасова A.H., Петрова И.В. Микотоксины и методы борьбы с ними //Кролиководство и звероводство. - 2017. - №. 3. - С. 9-10.

49. Ерин, А.Т., Плотников В.Г., Рыминская Е.И. Приусадебное кролиководство и нутриеводство //Мн.: Ураджай. - 1994.

50. Миняева, О.А., Ботова Д.И., Нелюбина Е.С. Концентрационные зависимости вязкости белковых систем и рефрактометрический анализ растворов белков //Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №. 6. - С. 1797-1797.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и представляет собой способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки для лечения Т-2 токсикоза животных, предусматривающий трехкратную иммунизацию кроликов конъюгатом Т-2 токсина с полилизином в физиологическом растворе, при первой иммунизации - с полным адъювантом Фрейнда, затем с интервалом 3 недели двукратно - с неполным адъювантом Фрейнда, введение полученных эмульсий проводят с предварительным нагревом их до температуры 37°С в дозе 2 мл однократно внутрикожно вдоль спины кроликов, у которых через 2 недели после третьей иммунизации берут кровь из вен уха, получают сыворотку крови от каждого иммунизированного животного, собирают кровь и выдерживают 30 минут при температуре 37°С, затем сгусток крови отделяют от стенок сосуда и помещают на 18 часов в холодильник при температуре 4°С, через 18 часов отделают антитоксическую сыворотку, тестируют в непрямом конкурентном варианте ИФА на наличие антител, доводят титр до 1:6400 и способ лечения Т-2 токсикоза животных, предусматривающий введение в организм антитоксической гипериммунной сыворотки, полученной заявленным способом, которую вводят трехкратно внутримышечно с интервалом 10 дней в дозе 0,3 мг на кг живой массы. Заявленная группа изобретений позволяет получить гипериммунную сыворотку для лечения Т-2 токсикоза животных, использование которой в заявленном способе лечения обеспечивает нейтрализацию действия Т-2 токсина, нормализацию показателей гомеостаза, улучшение общего состояния, снижение падежа и повышение массы тела. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

1. Способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки для лечения Т-2 токсикоза животных, предусматривающий трехкратную иммунизацию кроликов конъюгатом Т-2 токсина с полилизином в физиологическом растворе, при первой иммунизации - с полным адъювантом Фрейнда, затем с интервалом 3 недели двукратно - с неполным адъювантом Фрейнда, введение полученных эмульсий проводят с предварительным нагревом их до температуры 37°С в дозе 2 мл однократно внутрикожно вдоль спины кроликов, у которых через 2 недели после третьей иммунизации берут кровь из вен уха, получают сыворотку крови от каждого иммунизированного животного, собирают кровь и выдерживают 30 минут при температуре 37°С, затем сгусток крови отделяют от стенок сосуда и помещают на 18 часов в холодильник при температуре 4°С, через 18 часов отделают антитоксическую сыворотку, тестируют в непрямом конкурентном варианте ИФА на наличие антител, доводят титр до 1:6400, полученную антитоксическую сыворотку вводят больным животным внутримышечно трехкратно с интервалом в 10 дней в дозе 0,3 мл на кг живой массы, хранят сыворотку в холодильнике при 4°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат Т-2 токсина с полилизином получают на основе гемисукцината Т-2 (ГС-Т-2), к которому добавляют сначала смесь ацетонитрила с водой в соотношении 6:1, а затем ЕДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид), выдерживают смесь в течение 10 минут при температуре +200°С и рН 4,5, затем порционно добавляют раствор полилизина в физиологическом растворе в соотношении 1:3, конъюгируют в течение 2 часов при рН 6,5, а затем диализируют в течение 18 часов и используют для получения сыворотки.

3. Способ лечения Т-2 токсикоза животных, предусматривающий введение в организм специфического антитоксического препарата, отличающийся тем, что в качестве специфического антитоксического препарата используют антитоксическую гипериммунную сыворотку, полученную согласно способу по п. 1, которую вводят трехкратно внутримышечно с интервалом 10 дней в дозе 0,3 мг на кг живой массы.