ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к биспецифическим антителам к человеческому бета-амилоиду и человеческому рецептору трансферрина, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела и их применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Приблизительно 70% всех случаев деменции являются следствием болезни Альцгеймера, связанной с избирательным повреждением участков мозга и нейронных цепей, играющих ключевую роль в когнитивном процессе. Болезнь Альцгеймера характеризуется появлением нейрофибриллярных клубков, в частности, в пирамидальных нейронах гиппокампа, а также многочисленных амилоидных бляшек, имеющих плотное ядро, состоящее из отложений амилоида, окруженное бледным ореолом.

Внеклеточные сенильные бляшки содержат большое количество преимущественно фибриллярного пептида, обозначаемого «амилоид β», «бета-амилоид», «Aβ4», «β-A4» или «Aβ»; см. Selkoe, Ann. Rev. Cell Biol. 10 (1994) 373-403; Koo PNAS 96 (1999) 9989-9990; US 4,666,829; Glenner BBRC 12 (1984) 1131). Данный амилоид образуется из «белка-предшественника бета-амилоида» APP (от англ. Alzheimer precursor protein или β-amyloid precursor protein). АРР представляют собой интегральные мембранные гликопротеины (см. Sisodia PNAS 89 (1992) 6075) и подвергаются эндопротеолитическому расщеплению внутри последовательности AP α-секретазой, протеазой, связанной с плазматической мембраной (см. Sisodia (1992), Joe. cit.). Кроме того, благодаря активности других секретаз, в частности, β-секретазы и γ-секретазы, происходит внеклеточное высвобождение амилоида-β (Aβ), содержащего 39 аминокислот (Aβ39), 40 аминокислот (Aβ 40), 42 аминокислоты (Aβ 42) или 43 аминокислоты (Aβ 43) (см. Sinha PNAS 96 (1999) 11094-1053; Price, Science 282 (1998) 1078-1083; WO 00/72880 или Hardy, TINS 20 (1997) 154).

Следует отметить, что бета-амилоид имеет несколько форм естественного происхождения, при этом человеческие формы обозначаются, как указано выше: Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 и Aβ43. Наиболее распространенная форма, Aβ42, имеет аминокислотную последовательность (начиная с N-конца): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 05). У Aβ41, Aβ40, Aβ39 отсутствуют C-концевые аминокислоты A, IA и VIA, соответственно. У формы Aβ43 на C-конце приведенной выше последовательности находится дополнительный остаток треонина.

Показано, что время, необходимое для образования ядра из фибрилл Aβ40 существенно больше, чем для образования ядра из фибрилл Aβ42 (см., например, Lansbury, Jr., P. T. and Harper, J. D., Ann. Rev. Biochem. 66 (1997) 385-407). Как указано в обзоре Wagner (J. Clin. Invest. 104 (1999) 1239-1332), Aβ42 чаще всего обнаруживается ассоциированным с сенильными бляшками и имеет большую склонность к образованию фибрилл in vitro. Кроме того, предполагают, что Aβ42 служит «затравкой» при полимеризации упорядоченных некристаллических пептидов Aβ, связанной с образованием ядра (см., например, Jarrett, Cell 93 (1993) 1055-1058). Процессинг модифицированного АРР и/или образование внеклеточных бляшек, содержащих белковые отложения, известны не только при болезни Альцгеймера, но также и у субъектов, страдающих другими неврологическими и/или нейродегенеративными расстройствами. Такие расстройства включают в том числе синдром Дауна, наследственную церебральную геморрагию с амилоидозом голландского типа, болезнь Паркинсона, БАС (боковой амиотрофический склероз), болезнь Крейцфельда-Якоба, ВИЧ-ассоциированную деменцию и моторную нейропатию.

На данный момент известно лишь ограниченное число схем лечения заболеваний, связанных с отложением амилоида. Например, обсуждалось, что ингибиторы холинэстераз, такие как галантамин, ривастигмин или донезепил оказывали благотворное действие только на пациентов с болезнью Альцгеймера легкой и умеренной степени тяжести. При этом также были зарегистрированы нежелательные явления, связанные с холинэргическим действием указанных препаратов. Поскольку указанные холинергические препараты приносят лишь некоторое симптоматическое облегчение, ответ на терапию у большинства пациентов является неудовлетворительным. Согласно оценкам, существенное когнитивное улучшение наблюдается только у 5% пациентов, получавших терапию, и существует мало доказательств, что терапия существенным образом влияет на течение данного прогрессирующего заболевания.

Следовательно, по-прежнему существует огромная потребность в более эффективных препаратах и, в частности, в таких, которые могут останавливать или замедлять прогрессирование заболевания. Недавно начали также применять антагонисты рецепторов NMDA, такие как мемантин.

Однако, были зарегистрированы нежелательные явления, связанные с их фармакологической активностью. Кроме того, такое лечение указанными антагонистами рецепторов NMDA можно считать всего лишь симптоматическим, но не меняющим течение заболевания.

Также были предложены иммуномодулирующие методы лечения расстройств, связанных с отложением амилоида. WO 99/27944 описывает конъюгаты, содержащие части бета-амилоида и молекулы-носители, где указанная молекула-носитель должна усиливать иммунный ответ. Другой подход с активной иммунизацией упоминается в WO 00/72880, где фрагменты бета-амилоида применяют для индукции иммунного ответа.

В WO 99/27944 или WO 01/62801 предложены способы пассивной иммунизации антителами к целому бета-амилоиду, а в WO 02/46237, WO 02/088306 и WO 02/08830 описаны специфические гуманизированные антитела, направленные против частей бета-амилоида. WO 00/77178 описывает антитела, связывающие β-амилоид в переходном состоянии, которое он принимает в процессе гидролиза. WO 03/070760 описывает молекулы антител, распознающие две прерывистые аминокислотные последовательности бета-амилоида.

WO 2014/033074 относится к челнокам, проходящим через гематоэнцефалический барьер, которые связываются с рецепторами гематоэнцефалического барьера, и способам их применения. Доставка лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер при помощи белков, слитых с доменом IgG, представляющего собой моноклональное антитело к рецептору трансферрина, описана Pardridge, W. (Exp. Opin. Drug Deliv. 12 (2015) 207-222). Yu, Y.J. et al. (Sci. Translat. Med. 6 (2014) 261ra154-261ra154) описывает терапевтические биспецифические антитела, пересекающие гематоэнцефалический барьер у приматов, не являющихся человеком. Дезагрегация амилоидной бляшки в головном мозге трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера при ежедневном подкожном введении четырехвалентного биспецифического антитела, направленного против рецептора трансферрина и бета-амилоидного пептида, описано Sumbria, R.K., et al. (Mol. Pharm. 10 (2013) 3507-3513). Niewoehner, J., et al. (Neuron 81 (2014) 49-609 описывает улучшенное проникновение в мозг и эффективность терапевтического антитела, работающего по принципу одновалентного молекулярного челнока.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предложено биспецифическое антитело, содержащее:

а) одно (полноразмерное) антитело, содержащее по две пары легких (полноразмерных) цепей антитела и тяжелых (полноразмерных) цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой тяжелая (полноразмерная) цепь антитела и легкая (полноразмерная) цепь антитела специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей (полноразмерного) антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из (полноразмерных) легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из (полноразмерных) тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

В одном воплощении дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом тяжелой цепи посредством пептидного линкера.

В одном воплощении N-конец вариабельного домена тяжелой цепи Fab фрагмента слит с C-концом полноразмерной тяжелой цепи или с C-концом пептидного линкера.

В одном воплощении

а) полноразмерная тяжелая цепь, которая слита с дополнительными Fab-фрагментами имеет в качестве C-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи трипептид LSP, пролин которого непосредственно слит с первым аминокислотным остатком дополнительного Fab-фрагмента или пептидного линкера посредством пептидной связи, и

б) полноразмерная тяжелая цепь, которая не слита с дополнительными Fab-фрагментами, имеет в качестве C-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи трипептид LSP или SPG или PGK.

В одном воплощении (полноразмерное) антитело представляет собой

а) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1,

б) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4,

в) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно,

е) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно,

ж) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, H310A и H435A в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно, или

з) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и T256E в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно.

В одном воплощении (полноразмерное) антитело представляет собой

а) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1,

б) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4,

в) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,

е) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,

ж) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, H310A и H435A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,

з) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и T256E в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно, или

и) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, H310A, H433A и Y436A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно.

В одном воплощении дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутацию T366W, или с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V.

В одном воплощении

полноразмерное антитело относится к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно, и

дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутацию T366W, или с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V.

В одном воплощении всех аспектов сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 18, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 20, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 21, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.

В одном воплощении биспецифическое антитело содержит

i) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 01 на 70% или более,

ii) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 02 на 70% или более,

iii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 03 на 70% или более,

iv) Fab фрагмент тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 04 на 70% или более,

где

SEQ ID NO: 01 имеет аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,

SEQ ID NO: 02 имеет аминокислотную последовательность QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,

SEQ ID NO: 03 имеет аминокислотную последовательность AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYASSNVDNTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC и

SEQ ID NO: 04 имеет аминокислотную последовательность QSMQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSSYAMSWIRQHPGKGLEWIGYIWSGGSTDYASWAKSRVTISKTSTTVSLKLSSVTAADTAVYYCARRYGTSYPDYGDASGFDPWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело, содержащее (полноразмерную) легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (полноразмерную) тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02, (полноразмерную) легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, и Fab фрагмент антитела, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04.

В одном воплощении биспецифическое антитело является моноклональным.

Одним аспектом по данному описанию является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело по данному описанию.

Одним аспектом по данному описанию является клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по данному описанию, кодирующую биспецифическое антитело по данному описанию.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ получения биспецифического антитела по данному описанию, включающий следующие стадии:

а) культивирование клетки-хозяина по данному описанию с продуцированием биспецифического антитела и

б) выделение биспецифического антитела из клетки или среды культивирования и, таким образом, получение биспецифического антитела по данному описанию.

Одним аспектом по данному описанию является иммуноконъюгат, содержащий биспецифическое антитело по данному описанию и цитотоксический агент.

Одним аспектом по данному описанию является фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по данному описанию и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним аспектом по данному описанию является антитело по данному описанию для применения в качестве лекарственного средства.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в лечении болезни Альцгеймера.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в ингибировании/замедлении образования бляшек в головном мозге.

Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в дезинтеграции β-амилоидных бляшек.

Одним аспектом по данному описанию является применение биспецифического антитела по данному описанию для изготовления лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения амилоидозов.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для предупреждения и/или лечения заболевания, ассоциированного с амилоидогенезом и/или образованием амилоидых бляшек. В одном воплощении заболевание выбрано из группы, состоящей из деменции, болезни Альцгеймера, моторной нейропатии, синдрома Дауна, болезни Крейтцфельдта-Якоба, наследственной церебральной гемморагии с амилоидозом голландского типа, болезни Паркинсона, ВИЧ-ассоциированной деменции, БАС или нейрональных расстройств, связанных со старением. В одном предпочтительном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения болезни Альцгеймера.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для ингибирования/замедления образования бляшек в головном мозге. В одном воплощении лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для дезинтеграции β-амилоидных бляшек.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием, ассоциированным с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, страдающего болезнью Альцгеймера, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ дезинтеграции β-амилоидных бляшек в головном мозге индивидуума, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для дезинтеграции β-амилоидных бляшек в головном мозге.

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ ингибирования/замедления образования бляшек в головном мозге индивидуума, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для ингибирования/замедления образования бляшек в головном мозге.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Димеризуемые модули выступы-в-впадины и их применение в инженерии антител описано Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73. Образование дополнительных дисульфидных мостиков в CH3 домене описано Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681.

Общая информация, относящаяся к нуклеотидным последовательностям легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, приведена Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

В данном описании положения аминокислот всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепей пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat, описанной Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), которая обозначается в данном описании «системой нумерации Kabat». В частности, систему нумерации Kabat (см. стр. 647-660) Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) используют для константного домена легкой цепи CL изотипов каппа и лямбда, а систему нумерации EU-индекс, предложенную Kabat (см. стр. 661-723), которая в целях ясности обозначается в данном описании «системой нумерации EU-индекс, предложенной Kabat», используют для константных доменов тяжелой цепи (CH1, шарнирный участок, CH2 и CH3).

I. ТЕРМИНОЛОГИЯ

«Гематоэнцефалический барьер», или ГЭБ относится к физиологическому барьеру между периферической системой кровообращения и головным и спинным мозгом, образованному плотными контактами в плазматической мембране эндотелия капилляров мозга, создающими плотный барьер, ограничивающий транспортировку в мозг молекул, даже таких небольших, как мочевина (60 Дальтон). ГЭБ в головном мозге, гематоспинальный барьер в спинном мозге и гематоретинальный барьер в роговице представляют собой непрерывный барьер между капиллярной кровью и ЦНС и в данном описании вместе обозначаются гематоэнцефалическим барьером, или ГЭБ. ГЭБ также охватывает гематоликворный барьер (хороидные сплетения), где барьер скорее состоит из эпендимоцитов, чем из эндотелиальных клеток капилляров.

Термины «антитело к человеческому бета-амилоиду» и «антитело, специфически связывающееся с человеческим бета-амилоидом» относится к антителу, которое споосбно связываться с человеческим пептидом бета-амилоидом с достаточной аффинностью, так что антитело может применяться в качестве диагностического и/или терапевтического агента, мишенью которого является пептид бета-амилоид.

Следует отметить, что человеческий бета-амилоид существует в виде нескольких встречающихся в естественном состоянии форм, при этом встречающиеся в организме человека формы обозначают Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 и Aβ43. Наиболее распространенная форма, Aβ42, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05. У Aβ41, Aβ40, Aβ39 отсутствуют C-концевые аминокислоты A, IA и VIA, соответственно. У формы Aβ43 имеется дополнительный остаток треонина на C-конце последовательности SEQ ID NO: 05. В одном воплощении человеческий белок бета-амилоид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05.

Таким образом, термин также охватывает антитела, которые связываются с укороченным фрагментом человеческого полипептида бета-амилоида.

«Центральная нервная система» или «ЦНС» относится к комплексу нервных тканей, контролирующих функции организма, и охватывает головной мозг и спинной мозг.

«Рецептор гематоэнцефалического барьера» (сокращённо «РГЭБ») представляет собой внеклеточный мембрано-связанный белок-рецептор, экспресируемый эндотелиальными клетками головного мозга, способный переносить молекулы через ГЭБ или использоваться для переноса введенных экзогенных молекул. Примеры РГЭБ в данном описании включают: рецептор трансферрина (TfR), рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-R), рецепторы липопротеинов низкой плотности, включая, без ограничения, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок 1 (LRP1) и родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок 8 (LRP8), а также гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF). Одним из предпочтительных РГЭБ является рецептор трансферрина (TfR).

«Рецептор трансферрина» (TfR) представляет собой трансмембранный гликопротеин (с молекулярной массой приблизительно 180 000 Да), состоящий из двух субъединиц, связанных дисульфидными связями (каждая имеет кажущуюся молекулярную массу приблизительно 90 000 Да), задействованный в поглощении железа у позвоночных. В одном воплощении указанный TfR представляет собой человеческий TfR, содержащий аминокислотную последовательность, указанную, например, Schneider et al (Nature 311 (1984) 675-678). В одном воплощении человеческий рецептор трансферрина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

«Мультиспецифическое антитело» обозначает антитело, специфически связывающееся по меньшей мере с двумя различными эпитопами одного и того жа антигена или двух различных антигенов. Примеры мультиспецифических антител могут связываться как РГЭБ, так и с антигеном головного мозга. Мультиспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab')₂ ) или их комбинаций (например, полноразмерное антитело плюс дополнительные scFv или Fab фрагменты). Также описаны модифицированные антитела с двумя, тремя или более (например, четырьмя) функциональными антигенсвязывающими сайтами (см., например, US 2002/0004587 A1).

«Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения» в целях данного описания представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасных участков вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящие из каркасной последовательности иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной последовательности человеческого происхождения, согласно описанию, приведенному ниже. Акцепторные каркасные участки «происходящие из» каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человеческого происхождения могут содержать такую же аминокислотную последовательность или могут иметь замены аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях последовательность акцепторной каркасной последовательности VL человеческого происхождения идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.

«Аффинность» относится к прочности суммы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в данном описании «аффинность связывания» обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно в целом охарактеризовать константой диссоциации (k_d). Аффинность можно определить стандартными способами, известными в области техники, включая описанные в данном документе.

Антитело «зрелой аффинности» относится к антителу с одной или несколькими модификациями в одной или более чем одной гипервариабельной области (HVR, от англ. hypervariable regions), по сравнению с родительским антителом, которое не имеет таких модификаций, указанные модификации приводят к улучшению аффинности антитела или антигена.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязыващую активность, но не ограничивается ими.

Термин «антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» (ADCC, от англ. antibody-dependent cellular cytotoxicity) обозначает функцию, опосредуемую связыванием Fc-рецептора, и относится к лизису клеток-мишеней, вызываемому антителом по данному описанию в присутствии эффекторных клеток. В одном воплощении ADCC определяют при воздействии на препарат экспрессирующих CD19 клеток эритроидного ряда (например, клеток К562, экспрессирующих рекомбинантный человеческий CD19) антитела по данному описанию в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) или эффекторные клетки, выделенные из лейкоконцентрата, такие как моноциты или естественные киллерные (NK, от англ. natural killer) клетки. Клетки-мишени метят ⁵¹Cr и затем инкубируют с антителом. Меченные клетки инкубируют с эффекторными клетками и анализируют высвобождение ⁵¹Cr в надосадочную жидкость. Контроли включают инкубацию эндотелиальных клеток-мишеней с эффекторными клетками, но в отсутствие антитела. Способность антитела запускать начальные стадии, опосредующие ADCC, исследуют, определяя их связывание с клетками, экспрессирующими рецепторы Fcγ, такими как клетки с рекомбинантной экспрессией FcγRI и/или FcγRIIA или NK клетки (экспрессирующими в основном FcγRIIIA). В одном предпочтительном воплощении определяют связывание с FcγR на NK клетках.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, содержащей часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, c которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител, но не ограничиваются ими.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или биологического вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или биологического вида.

«Класс» антитела обозначает тип константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них далее подразделяются на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин «цитотоксический агент», используемый в данном описании, относится к веществу, которое ингибирует или препятствует клеточной функции и/или вызывает клеточную гибель или деструкцию. Цитотоксические агенты включают, без ограничения, радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, подавляющие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.

Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность» (CDC, от англ. complement-dependent cytotoxicity) относится к лизису клеток, вызванному антителом по данному описанию в присутствии комплемента. В одном воплощении CDC определяют при воздействии антитела по данному описанию на экспрессирующие CD19 эндотелиальные человеческие клетки в присутствии комплемента. В одном воплощении клетки помечены кальцеином. О наличии CDC свидетельствует лизис 20% или более клеток-мишеней при концентрации 30 мкг/мл. Связывание с компонентом комплемента C1q можно определить посредством ИФА (иммуноферментного анализа). В таком исследовании на поверхности планшета для ИФА иммобилизуют антитело в диапазоне концентраций и добавляют очищенный человеческий C1q или человеческую сыворотку. Связывание C1q определяют при помощи антитела, направленного против C1q, с последующим добавлением меченного пероксидазой конъюгата. Связывание (максимальное связывание Bmax) определяют, как оптическую плотность при 405 нм (OD405) для субстрата пероксидазы ABTS® (2,2'-азино-ди-[3-этилбензтиазолин-6-сульфонат (6)]).

«Эффекторные функции» относятся к такой биологической активности, присущей Fc области антитела, которая варьируется в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: Связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание Fc-рецепторов, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточных рецепторов) и активацию B клеток.

Эффекторные функции, зависящие от связывания Fc-рецепторов, могут быть опосредованы взаимодействием Fc-области антитела с Fc-рецепторами (FcR), которые представляют собой специализированные рецепторы клеточной поверхности гемопоэтических клеток. Fc-рецепторы относятся к суперсемейству иммуноглобулинов, и показано, что они опосредуют как элиминацию покрытых антителом патогенов вследствие фагоцитоза иммунных комплексов, так и лизис эритроцитов и многих других клеток-мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, благодаря антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см., например, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR классифицируют по их специфичности в отношении изотипов иммуноглобулинов: Fc рецепторы к антителам IgG обозначают FcγR. Связывание Fc рецепторов описано, например, Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.

Перекрестное связывание рецепторов с Fc-областями IgG антител (FcγR) запускает огромное разнообразие эффекторных функций, включая фагоцитоз, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение воспалительных медиаторов, а также удаление иммунных комплексов и регуляцию выработки антител. У человека описано три класса FcγR, а именно:

- FcγRI (CD64) связывает мономерный IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах. Модификации Fc-области IgG по меньшей мере по одному аминокислотному остатку из E233-G236, P238, D265, N297, A327 и P329 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat) уменьшают связывание с FcγRI. Остатки в положениях 233–236 IgG2, встроенные в IgG1 и IgG4, уменьшали связывание с FcγRI в 10³ раз и устраняли ответ моноцитов человека на сенсибилизированные антителом красные кровяные клетки (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613–2624). - FcγRII (CD32) связывает комплексы IgG с афинностью от умеренной до средней и широко экспрессируется. Данный рецептор можно подразделить на два подтипа, FcγRIIA и FcγRIIB. FcγRIIA обнаруживается на многих клетках, задействованных в киллинге (например, макрофагах, моноцитах, нейтрофилах) и по-видимому, способен активировать процесс килинга. FcγRIIB по-видимому играет роль в процессе ингибирования и обнаруживается на B-клетках, макрофагах, а также на тучных клетках и эозинофилах. На B-клетках его функция, по-видимому, заключается в подавлении дальнейшего образования иммуноглобулинов и переключении изотипов, например, на класс IgE. FcγRIIB, находящийся на макрофагах, ингибирует фагоцитоз, опосредуемый FcγRIIA. B-форма, находящаяся на эозинофилах и тучных клетках, может способствовать подавлению активации указанных клеток, опосредованной связыванием IgE с его отдельным рецептором. Сниженное связывание с FcγRIIA обнаруживается, например, у антител, содержащих Fc-область IgG с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 и K414 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat). - FcγRIII (CD16) связывает IgG с афинностью от умеренной до средней и существует в двух формах. FcγRIIIA обнаруживается на NK клетках, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах и T клетках и опосредует ADCC. FcγRIIIB экспрессируется на высоком уровне на нейтрофилах. Сниженное связывание с FcγRIIIA обнаруживается, например, у антител, содержащих Fc-область IgG с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 и D376 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).

Картирование сайтов связывания IgG1 человека с Fc-рецепторами, указанные выше сайты мутаций и способы определения связывания с FcγRI и FcγRIIA описаны Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

«Эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, обозначает количество, эффективное для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата при необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени.

Термин «Fc рецептор», используемый в данном описании, относится к активирующим рецепторам, отличающимся наличием цитоплазматическогй последовательности ITAM, ассоциированной с рецептором (см., например, Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). Такими рецепторами являются FcγRI, FcγRIIA и FcγRIIIA. Термин «отсутствие связывания с FcγR» означает, что при концентрации антитела 10 мкг/мл связывание антитела, описанного в данном документе, с NK клетками составляет 10% или менее от связывания, зарегистрированного для анти-OX40L антитела LC.001, согласно описанию в WO 2006/029879.

Тогда как IgG4 демонстрирует сниженное связывание с FcR, антитела других подклассов IgG демонстрируют выраженное связывание. Однако, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (потеря углевода Fc), Pro329 и 234, 235, 236 и 237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435 представляют собой остатки, модификация которых также снижает связывание с FcR (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; и EP 0 307 434). В одном воплощении антитело по данному описанию относится к подклассу IgG1 или IgG2 и содержит мутацию PVA236, GLPSS331 и/или L234A/L235A. В одном воплощении антитело по данному описанию относится к подклассу IgG4 и содержит мутацию L235E. В одном воплощении антитело дополнительно содержит мутацию S228P.

Термин «Fc область» в данном документе обозначает C-концевой участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере часть константной области. Термин охватывает последовательности нативных Fc областей и вариантов Fc областей. В одном воплощении Fc область тяжелой цепи IgG человека располагается между Cys226 или Pro230 и карбокси-концом тяжелой цепи. При этом С-концевой лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или отстуствовать. Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков Fc области или константной области соответствует системе нумерации EU, также обозначаемой EU-индекс, описанной Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Антитела по данному описанию содержат Fc-область, в одном воплощении Fc-область имеет человеческое происхождение. В одном воплощении Fc-область содержит все части константной области человеческого происхождения. Fc-область антитела непосредственно вовлечена в активацию комплемента, связывание C1q, активацию C3 и связывание Fc-рецепторов. При том, что влияние антитела на систему комплемента зависит от некоторых условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-области. Такие сайты связывания известны в области техники и описаны, например, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; and EP 0 307 434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 и P329 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat; если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также обозначаемой EU-индекс, описанной Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 обычно демонстрируют способность активировать комплемент, связывать C1q и активировать C3, тогда как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывает C1q и не активирует C3. Термин «Fc-область антитела» хорошо известен специалистам в области техники и основывается на расщеплении антител папаином. В одном воплощении Fc-область представляет собой Fc-область человеческого происхождения. В одном воплощении Fc-область относится к подклассу IgG4, содержит мутации S228P и/или L235E (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat). В одном воплощении Fc-область относится к подклассу IgG1, содержит мутации L234A и/или L235A (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).

«Каркасные участки» или «FR» (от англ. framework regions) обозначают остатки в составе вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR, от англ. hypervariable region). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термин «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» в данном описании используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу аналогичную структуре нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc область, описанную в данном документе. «Полноразмерное антитело» представляет собой антитело, содержащее вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи (VL, VH), а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены с нативной последовательностью человеческого происхождения) или варианты аминокислотной последовательности. Более конкретно, полноразмерное антитело содержит две легких цепи антитела (каждая содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи) и две тяжелых цепи антитела (каждая содержит вариабельный домен тяжелой цепи, шарнирный участок и константные домены тяжелой цепи CH1, CH2 и CH3). С-концевые аминокислотные остатки K или GK в двух тяжелых цепях полноразмерного антитела могут присутствовать или отсутствовать, независимо друг от друга. Кроме того, полноразмерное антитело может иметь в составе доменов вставки, мутации и делеции аминокислот, но не делеции целого домена.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомков этих клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей. Потомство может не быть абсолютно идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может иметь мутации. Термины также охватывают потомков с мутациями, обладающих такой же функцией или биологической активностью, как и исходно трансформированные клетки, прошедшие скрининг или отбор.

«Консенсусная каркасная область человеческого происхождения» обозначает каркасную область, представляющую собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выборке каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулина человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, как в описании Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении, применительно к VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как в описании Kabat et al., см. выше. В одном воплощении, применительно к VH, подгруппа представляет собой подгруппу III, как в описании Kabat et al., см. выше.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки HVR, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки FR человеческого происхождения. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR) соответствуют таковым из иммуноглобулинов, не являющихся человеческими, и все или по существу все FR соответствуют таковым человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящую из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое прошло гуманизацию.

Термин «гипервариабельный участок», или «HVR» (от англ. hypervariable region) в данном документе обозначает каждый из участков вариабельных доменов антитела, содержащих гипервариабельные аминокислотные остатки («участки, определяющие комплементарность», или CDR (от англ. сomplementarity determining regions)) и/или формирующих петли определенной структуры («гипервариабельные петли») и/или содержащих остатки, контактирующие с антигеном («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в составе VH (H1, H2, H3) и три в составе VL (L1, L2, L3).

HVR включают:

(а) гипервариабельные петли, образованные аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(б) CDR, образованные аминокислотными остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);

(в) контакты с антигеном, образованные аминокислотными остатками 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) и 94-102 (H3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в составе вариабельного домена (например, остатки FR) пронумерованы согласно Kabat et al., см. выше.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более чем одной гетерологичной молекулой, включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.

«Индивидуум» или «субъект» в данном описании является млекопитающим. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и не являщихся человеком приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.

«Выделенное» антитело обозначает антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99% по данным, например, электрофоретического (например, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ), изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографического определения (например, с помощью ионообменной или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)). Обзор способов оценки чистоты антител представлен, например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

«Выделенная» нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, как правило содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от ее естественного положения на хромосоме.

«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина» относится к одной или более чем одной молекуле, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такие молекулы нуклеиновых кислот в составе одного вектора или в отдельных векторах, и такие молекулы нуклеиновых кислот присутствуют в клете-хозяине в одном или более чем одном местоположении.

Термин «моноклональное антитело» (mAb) в данном документе обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих естественные мутации или образующиеся в ходе получения препарата моноклональных антител, указанные варианты обычно присутствуют в незначительном количестве. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Так, прилагательное «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть получены множеством способов, включая гибридомную технологию, способы ДНК-рекомбинации, способы фагового дисплея и способы, в которых применяют трансгенных животных, содержащих все или часть иммуноглобулиновых локусов человека, но не ограничиваясь ими, такие способы и другие приведенные в качестве примера способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

«Голое антитело» относится к антителу, не конъюгированному с гетерологичной группировкой (например, цитотоксической группировкой) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.

«Нативные антитела» относятся к молекулам иммуноглобулинов естественного происхождения, имеющим различные структуры. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины размером приблизительно 150 000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными связями. В направлении от N-конца к C-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также обозначаемую вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следуют три константных домена (CH1, CH2 и CH3), при этом между первым и вторым константными доменами расположен шарнирный участок. Аналогично, в направлении от N-конца к C-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также обозначаемую вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен (CL). В зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ).

Термин «листовка-вкладыш» используется для обозначения инструкций по применению, обычно вкладываемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях к применению, применении, дозировках, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения этих терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно референтной полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, и без принятия каких-либо консервативных замен за часть идентичной последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может выполняться различными способами, известными в данной области техники, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить надлежащие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижеия максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей настоящего описания, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получены при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана в компании Genentech, Inc., исходный код был представлен вместе с пользовательской документацией в бюро по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, где было зарегистрировано авторское право под номером TXU510087. Доступ к программе ALIGN-2 можно получить в компании Genentech, Inc., Южный Сан Франциско, Калифорния, или код программы может быть скомпилирован на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для работы на платформе UNIX, включая платформу digital UNIX V4.0D. Все параметры для сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и остаются неизменными.

В случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, процент идентичности заданной аминокислотной последовательности A с последовательностью В, относительно последовательности В или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью B (что можно также сформулировать как заданная аминокислотная последователность A, имеющая или содержащая определенный процент идентичной аминокислотной последовательности с последовательностью В, относительно последовательности В или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью B) рассчитывают по формуле:

X/Y x 100,

где X это число аминокислотных остатков, которые были расценены программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 как абсолютные совпадения при выравнивании A и B в рамках этой программы, и где Y это общее число аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что когда длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, процент идентичности аминокислотной последовательности A с последовательностью B не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности B с последовательностью A. Если не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, приведенные здесь, получены согласно описанию в предыдущем параграфе о применении компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективное проявление биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будут вводить композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Используемый в данном документе термин «лечение» (и его грамматические производные, такие как «лечить» или «проводить лечение») обозначает клиническое вмешательство в попытке изменить естественный ход заболевания у индивидуума, получающего лечение, и может осуществляться как для профилактики, так и при наличии патологического состояния. Желательные эффекты лечения включают предупреждение возникновения или повторного проявления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению применяют, чтобы отсрочить развитие заболевания или чтобы замедлить прогрессирование заболевания.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» обозначает домен тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют схожую структуру, каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три гипервариабельных области (HVR). (См., например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Для обеспечения антигенсвязывающей специфичности может быть достаточно одного домена VH или VL. Кроме того, антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH или VL домен антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL или VH доменов, соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин «вектор», используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной передавать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин охватывает вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе обозначают «экспрессирующими векторами».

II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

В одном аспекте изобретение основано на том, что, с одной стороны биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина по данному описанию обладает улучшенными свойствами. В некоторых воплощениях предложены биспецифические антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина. Предложенные в данном изобретении антитела могут найти применение, например, в диагностике или лечении болезни Альцгеймера.

А. Примеры биспецифических антител к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина

В одном аспекте изобретения предложены выделенные биспецифические антитела, которые связываются с человеческим бета-амилоидом и человеческим рецептором трансферрина. Антитела представляют собой биспецифические антитела, состоящие из полноразмерного основного антитела и слитого Fab-фрагмента с перекрестной заменой некоторых доменов. Таким образом, полученное биспецифическое антитело является асимметричным. Таким образом, биспецифическое антитело получают при помощи технологии гетеродимеризации, называемой выступы-во-впадины, используя первую тяжелую цепь с так называемыми мутациями типа «выступ» (HCknob) и вторую тяжелую цепь с так называемыми мутациями типа «впадина» (HChole).

Антитело 0012, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06 - 09.

Антитело 0012 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домен легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Антитело 0015, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01 - 03 и последовательность SEQ ID NO: 10.

Антитело 0015 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домен легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Антитело 0020, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из трех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 - 13.

Антитело 0020 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab-фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Антитело 0024, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 - 17.

Антитело 0024 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Для рекомбинантного получения биспецифических антител применяли различные расположения/комбинации соответствующих полипептидов в различных экспрессирующих плазмидах и различные соотношения полученных плазмид. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

антитело соотношение плазмид относительная площадь пика [%]
(КЭ-ДСН; невосстанавливающие условия) LC ½ mAb впадина димер с цепями впадина-впадина мономер антитела 0012 1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 12 9 78 0012 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 1 9 9 79 0012 1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross) 6 9 9 75 0015 1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 7 23 62 0015 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 4 17 75 0015 1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross) 4 20 66 0020 1(HChole+LC):4(HCknob+LCcross) 16 11 72

Биспецифические антитела получали в небольшом количестве и анализировали спектр побочных продуктов после первой стадии очистки посредством аффинной хроматографии с белком А и после второй стадии очистки посредством эксклюзионной хроматографии. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

антитело соотношение плазмид выход мономерного продукта при культивировании в 3 л после препаративной очистки с белком А
(КЭ-ДСН невосстан./
выход) спектр побочных продуктов
(КЭ-ДСН невосстан.) LC ½ mAb впадина димер с цепями впадина-впадина + ³/₄ mAb 0012 1:1:3 65 %
13,3 мг 3 % 28 % 3,5 % 0024 1:1:3 70 %
14,8 мг 6 % 15 % 7 % 0015 1:1:3 85 %
15,8 мг 4 % 5 % 5 % 0020 1:4 29 %
6 мг 11 % 44 % 8 %

антитело соотношение плазмид выход мономерного продукта при культивировании в 3 л после препаративной очистки с белком А и препаративной ЭХ
(КЭ-ДСН невосстан./
выход) спектр побочных продуктов
(КЭ-ДСН невосстан.) LC ½ mAb впадина димер впадина-впадина + ³/₄ mAb 0012 1:1:3 >90 %
2,8 мг 5 % 3 % 2,5 % 0024 1:1:3 78 %
4 мг 11 % 5 % 6 % 0015 1:1:3 >95 %
5,8 мг 1 % 0,5 % 1 % 0020 1:4 68 %
0,8 мг 13 % 10 % 8,6 %

антитело соотношение плазмид выход мономера из 3 л после препаративной очистки с белком A
по данным ЭХ побочные продукты по данным ЭХ [%] конечный продукт по данным ЭХ побочные продукты по данным ЭХ [%] ВМ НМ ВМ НМ 0012 1:1:3 78 % 0 22 97,5 % 0 2,5 0024 1:1:3 80 % 0 20 96 % 0 4 0015 1:1:3 87 % 0 13 97 % 0 3 0020 1:4 53 % 7 40 97 % 0 3

Сайт связывания бета-амилоида содержит дополнительный сайт гликозилирования. Поэтому исследовали гликозилирование. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

антитело соотношение плазмид HChole HCknob
КЭ-ДСН; восстан.;
отн. площ. пика [%] неглик. глик. неглик. глик. 0012 1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 10 14 8 18 0012 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 9 13 8 21 0012 1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross) 10 13 7 18 0015 1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 7 16 5 25 0015 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 6 16 5 29 0015 1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross) 7 15 6 26 0020 1(HChole+LC):4(HCknob+LCcross) 9 18 7 21

Процентная доля негликозилированного Fab при культивировании в объеме 3 л после очистки с применением белка А

антитело соотношение плазмид HChole HCknob КЭ-ДСН; восстанавл. неглик. глик. неглик. глик. 0012 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 23 77 10 90 0015 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 16 84 8 92 0024 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 16 84 7,5 92,5

Процентная доля негликозилированного Fab при культивировании в объеме 3 л после очистки с применением белка А и эксклюзионной хроматографии

антитело соотношение плазмид HChole HCknob КЭ-ДСН; восстанавл. неглик. глик. неглик. глик. 0012 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 8 92 6 94 0015 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 10 90 4,5 95,5 0024 1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross) 8 92 4,5 95,5

Стабильность биспецифических антител исследовали при инкубации в течение 14 суток в буферном растворе с определенными значениями pH. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

параметр антитело 0012 антитело 0015 антитело 0024 относительное связывание с бета-амилоидом (1-40) по данным BIAcore 14 суток, pH 6,0, 40 °C, His/NaCl буфер 87 % 96 % 97 % 14 суток, pH 7,4, 37 °C, PBS буфер 82 % 86 % 101 % относительное связывание с человеческим рецептором трансферрина по данным BIAcore 14 суток, pH 6,0, 40 °C, His/NaCl буфер 101 % 91 % 93 % 14 суток, pH 7,4, 37 °C, PBS буфер 78 % 85 % 90 %

Температура агрегации антител 0015 и 0024 составляла приблизительно 53-55°C, а для антитела 0012 приблизительно 54-56°C.

Скорость диссоциации (k_d в [1/мс]) при связывании человеческого рецептора трансферрина по результатам определения на биоанализаторе BIAcore была сопоставимой для антител 0015 и 0024, а также для родительского антитела к человеческому рецептору трансферрина при 25 °C, 37 °C и 40 °C: от 1,86E-02 до 1,97E-02, от 1,98E-2 до 2,03E-2 и 1,44E-02, соответственно.

Бета-амилоид-специфическая эффекторная функция всех антител была сопоставима с родительским моноспецифическим антителом к бета-амилоиду при исследовании с использованием клеток U937. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

антитело IL-8 [нг/мл] IP-10 [нг/мл] родительское антитело к бета-амилоиду 5 4,3 антитело-0012 7 5,3 антитело-0015 - 5 антитело-0020 7 4,5 антитело-0024 8 5,2

Ни одно из биспецифических антител не демонстрировало активации нейтрофилов in vitro.

Таким образом, антитело 0015 демонстрировало подходящие свойства и, следовательно, является предпочтительным аспектом изобретения. Кроме того, данное антитело обладает улучшенными свойствами, которые, среди прочих, включают улучшенный профиль побочных продуктов.

В одном аспекте данного изобретения предложено биспецифическое антитело, содержащее:

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо аминокислотного остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.

Другим аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее

а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и

б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,

где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),

где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо аминокислотного остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),

где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и

где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,

где сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 18, и последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 19 и

где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 20, и последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 21.

В некоторых воплощениях последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но при этом сайт связывания, содержащий указанную последовательность, сохраняет способность связываться со своим антигеном. В некоторых воплощениях осуществлена замена, вставка и/или делеция всего от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 18 или 20. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции возникают в участках за пределами HVR (т.е. в FR).

В некоторых воплощениях последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но при этом сайт связывания, содержащий указанную последовательность, сохраняет способность связываться со своим антигеном. В некоторых воплощениях осуществлена замена, вставка и/или делеция всего от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 19 или 21. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции возникают в участках за пределами HVR (т.е. в FR).

В одном воплощении сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 18, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.

В одном воплощении сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 20, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 21, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.

В одном воплощении биспецифическое антитело содержит

i) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 01 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,

ii) тяжелую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 02 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,

iii) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 03 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более, и

iv) Fab фрагмент тяжелой цепи, последовательность которого идентична последовательности SEQ ID NO: 04 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,