СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/00 G01N33/53 A61P33/08 

Изобретение относится к медицине и касается способов получения пневмоцист (Pneumocystis carinii) для диагностических тест-систем.

Известен способ получения Pneumocystis carinii с использованием иммунодепрессанта - ацетат кортизона (В.И.Васильева, Н.В.Каражас и др. - а.с. №1685991; Н.В.Каражас и Т.Н.Рыбалкина - патент №2186390).

Однако для подавления иммунитета животных разовая доза ацетат-кортизона составляет 75-100 мл на 1 кг веса, а для интраназального инфицирования используется большая концентрация пневмоцист (10⁶ в 1 мл), и выход целевого продукта был недостаточно большим (30 цист в поле зрения).

Цель изобретения - усиление подавления иммунитета животного, уменьшение разовой дозы иммунодепрессанта, уменьшение концентрации пневмоцист при интраназальном инфицировании и увеличение выхода целевого продукта.

Сущность изобретения заключается в том, что для подавления иммунитета животных используют циклофосфан в разовой дозе 20 мг на 1 кг веса, а для интраназального инфицирования животных - суспензию пневмоцист в концентрации 10⁴ в 1 мл, что позволяет увеличить выход пневмоцист, используемых для приготовления диагностических тест-систем.

Пример 1.

В качестве испытуемых животных используют мини-свиней в возрасте от 1 до 1,5 месяцев весом 1,5-2 кг. Животных делят на две группы: опыт и контроль. Мини-свиньям в опытной группе за две недели перед инфицированием Pneumocystis carinii подавляют иммунитет введением циклофосфана 20 мг на кг веса дважды в неделю, затем одноразово интраназально заражают животных суспензией пневмоцист в концентрации 10⁴ в 1 мл в количестве 2,0 мл.

Контрольная группа получает по той же схеме вместо циклофосфана 0,85% хлористого натрия. Животных содержат на низкобелковой монотонной диете (овсяная каша на воде). Для предупреждения бактериальной инфекции в пищу добавляют доксициллин гидрохлорид 15,6 мг на 1 кг массы животного.

У погибших животных иссекают легкие и готовят из них мазки-отпечатки. Препараты окрашивают по Романовскому-Гимза, исследуют в световом микроскопе при увеличении ×700 и выявляют все формы развития пневмоцист (трофозоиты, прецисты и цисты).

У животных опытной группы на 5-6 неделе отмечают пассивность поведения, ухудшение аппетита, остановку в прибавке в весе, кожные покровы, хоть и чистые, но животные страдают от кожного зуда. На 7 неделе эксперимента у животных заметна потеря в весе; с трудом встают на ноги, копытца холодные, появляется слабая синюшность пятачков, взъерошенность волосяного покрова. На 8 неделе появляется хриплое дыхание, усиливается насморк, полный отказ от пищи, пятачки выраженного синюшного оттенка.

Контрольная группа животных набирает в весе, активна, волосяной покров в норме, пятачки розовые.

Легкие, выделенные от погибших мини-свиней, увеличены в объеме, тяжелые, характерного мраморного цвета с серым оттенком, узловатые; на разрезе выделяется пенистое содержимое альвеол, в котором и находятся пневмоцисты.

Максимальное содержание пневмоцист в поле зрения при увеличении ×700 достигает 60-100 клеток, что более чем в два раза больше, чем при использовании ацетат кортизона.

Выделенные из легких погибших мини-свиней пневмоцисты концентрируют и очищают в градиенте плотности перколла и используют для приготовления специфического антигена, необходимого для создания диагностических тест-систем.

Пример 2.

Для определения IgM (ранних) и IgG антител против Pneumocystis carinii в динамике используют иммуноферментную тест-систему (ИФА), что позволяет оценивать течение инфекционного процесса.

Антиген получают разрушением пневмоцист ультразвуком и объединением внутренних и поверхностных белков в один пул, который адсорбируют в определенной концентрации на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов. Выявление антител к антигенам пневмоцист основано на иммуноферментном анализе на твердой фазе с использованием пероксидазы хрена в качестве маркерного фермента.

Исследуемую сыворотку крови добавляют в лунку планшета с адсорбированным на ее поверхности антигеном пневмоцист. Если в сыворотке содержатся антитела, они образуют комплекс антиген-антитело.

Сыворотку удаляют отмыванием и в лунку добавляют конъюгат моноклональных антител против IgM или IgG человека, меченных пероксидазой, которые взаимодействуют с антителами, присоединившимися на первом этапе к антигену пневмоцист.

Лунки промывают и добавляют хромоген (ТМБ). В результате взаимодействия ТМБ с пероксидазой, соединенной с антителами, раствор приобретает желтую окраску. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна содержанию антител к антигенам пневмоцист в сыворотке.

Контрольные положительные сыворотки разводят в 160 мкл ФСБ, а отрицательную - в 320 мкл. Анализируемые сыворотки разводят в соотношении 1:200, 1:2000 и 1:20000 (при выявлении антител класса IgM) и 1:100, 1:1000 и 1:10000 (при выявлении антител класса IgG).

При проведении исследований в этих разведениях не наблюдалось ложноположительных реакций ни с одной из 200 сывороток доноров.

Реакция останавливается добавлением в лунки планшета стоп-реагента (2М серной кислоты).

Результаты ИФА регистрируют с помощью мультискана.

Для диагностики заболевания (особенно острой формы) одного исследования недостаточно. Диагноз может быть установлен на основании изучения двух образцов сыворотки одного и того же пациента, полученных в динамике с интервалом 2-3 недели на IgM и IgG антитела.

Пример 3.

Для выявления антител IgM и IgG к антигену Pneumocystis carinii при непрямом иммунофлюоресцентном методе (НРИФ) в качестве антигена берут целые, инактивированные формалином клетки Pneumocystis carinii, высоко специфические положительные и отрицательные контроли сывороток (К+ и К-) и анти-человеческие сыворотки, меченные ФИТЦ.

Исследуемые пробы сывороток, помещают во все лунки предметного стекла, кроме контрольных. В контрольные лунки с антигеном вносят контрольные сыворотки (К+) и (К-). Антиген, находящийся в (К+) и в исследуемом материале, соединяется со специфическими антителами к Pneumocystis carinii.

Сыворотку удаляют отмывкой и в лунки вносят смесь иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против иммуноглобулинов человека и альбумина, меченного родамином, которые взаимодействуют с антителами. Лунки отмывают, подсушивают и исследуют под люминисцентным микроскопом ЛЮМАМ РПО-11 ув. ×400, водная иммерсия.

В исследуемых сыворотках, содержащих антитела к Pneumocystis carinii и в (К+), наблюдается желто-зеленое свечение на 3-4 креста, в (К-) - свечение отсутствует или не более чем на один крест. Сыворотки должны исследоваться в динамике с интервалом 2-3 недели.

Пример 4.

Для выявления антигена Pneumocystis carinii в биологических материалах больных с подозрением на пневмоцистоз и у лиц с иммунодефицитными состояниями в непрямом иммунофлюоресцентном методе (НРИФ) используют целые и инактивированные формалином клетки Pneumocystis carinii, высокоспецифические иммунные сыворотки и иммуноглобулины диагностические, флюоресцирующие против иммуноглобулинов человека.

Исследуемый биологический материал человека помещают в пустые лунки (по 1 или 2 на пробу) 18-ти луночного предметного стекла. Препарат фиксируют холодным ацетоном после высыхания образца. Во все лунки с исследуемым материалом, а также в 2 лунки с антигеном вносят положительную сыворотку по 5 мкл, кроме 5 и 6 лунок третьего ряда - в них вносят отрицательную сыворотку (К-).

Сыворотку удаляют отмывкой и в лунку вносят смесь иммуноглобулинов диагностических, флюоресцирующих против иммуноглобулинов человека и альбумина бычьего, меченного родамином, которые взаимодействуют с антителами. Лунки отмывают, подсушивают и исследуют под люминисцентным микроскопом.

В исследуемых материалах, содержащих антиген Pneumocystis carinii, наблюдается желто-зеленое свечение на +++ или ++++.

При этом не наблюдается ложноположительных реакций ни в одном из материалов, полученных от больных с клинически выраженной пневмонией. Из 150 обследованных у 30% была диагностирована пневмоцистная пневмония, что было подтверждено комплексом лабораторных методов и клинической картиной.

Таким образом, использование циклофосфана как иммунодепрессанта позволяет получить усиление подавления иммунитета животного, уменьшение разовой дозы иммунодепрессанта, уменьшение концентрации пневмоцист при интраназальном инфицировании и увеличение выхода целевого продукта, который используется для приготовления тест-систем ИФА и НРИФ (для определения антител IgM и IgG) и НРИФ (для выявления антигенов Pneumocystis carinii).

Способ получения антигена пневмоцист Pneumocystis carinii для диагностических тест-систем для прижизненной диагностики пневмоцистоза. Интраназально инфицируют животных пневмоцистами с использованием иммунодепрессанта для подавления иммунитета. В качестве иммунодепрессанта вводят циклофосфан в разовой дозе 20 мг на 1 кг веса. Для интраназального инфицирования используют суспензию пневмоцист в концентрации 10⁴ в 1 мл. Способ позволяет увеличить выход пневмоцист и соответственно антигена, а тест-системы, разработанные на основе антигена пневмоцист, выявляют специфические ранние IgM, диагностические IgG антитела, а также антигены, наличие или отсутствие которых в полной мере отражает течение заболевания.

Способ получения антигена Pneumocystis carinii для диагностических тест-систем, включающий использование иммунодепрессанта для подавления иммунитета, интраназальное инфицирование животных пневмоцистами, отличающийся тем, что в качестве иммунодепрессанта используют циклофосфан в разовой дозе 20 мг на 1 кг веса, а для интраназального инфицирования животных используют суспензию пневмоцист в концентрации 10⁴ в 1 мл.