Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Известен способ одновременного определения синдрома недостаточнй адгезии лейкоцитов (BLAD) и комплексного порока позвоночника (CVM) у крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (патент RU 2601151). Недостатком данного способа является то, что для детекции результатов ПЦР и проведения генотипирования используют анализ кинетических кривых ПЦР с определением порогового (threshold) цикла. Надежность анализа зависит в данном случае от нескольких параметров: качества очистки образца ДНК, эффективности фермента Taq-полимеразы, оптических характеристик амплификатора. Варьирование этих параметров повышает вероятность ошибки и ограничивает возможность автоматизированного определения генотипа.

В предлагаемом способе используются аллель-специфичные FAM- и VIC-зонды и один общий для обоих аллелей зонд, несущий BHQ-гаситель. Гибридизация зондов происходит после завершения основного этапа амплификации с последующим плавлением. Это позволяет различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Установление температуры плавления аллель-специфичных зондов, характерной для каждого из аллелей, позволяет провести генотипирование образца в одной пробирке. Помимо температуры плавления при анализе генотипа может также учитываться форма кривой плавления, что повышает надежность анализа и позволяет автоматизировать и формализовать процедуру интерпретации полученных данных, снизив, при этом, вероятность ошибки оператора. Использование гибридизационных зондов значительно снижает требования к степени очистки препарата ДНК и иным варьирующим параметрам биохимической и аппаратной природы, делая предлагаемую тест-систему более универсальной и удобной в использовании.

Цель настоящего изобретения (тест-системы) - выявление носителей синдрома недостаточной адгезии лимфоцитов у крупного рогатого скота (BLAD) в популяциях скота черно-пестрого корня (голштинская, черно-пестрая, ярославская и другие родственные породы).

Тест-система предназначена для проведения исследований по идентификации однонуклеотидной замены (A → G) в позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у крупного рогатого скота (BLAD). Эта мутация нарушает нормальную функцию нейтрофилов, дефектные нейтрофилы теряют способность мигрировать через эпителий капилляров и субэпителиальные мембраны. Клинические симптомы проявления BLAD-синдрома в гомозиготном состоянии выражаются в предрасположенности к респираторным инфекциям, диарее и низкой естественной резистентности организма к бактериальным инфекциям. Гомозиготные телята заболевают в первые месяцы жизни. Для них характерен замедленный рост, взъерошенная и тусклая шерсть, шаткость зубов, язвы в ротовой полости, массовые кровоизлияния по всему желудочно-кишечному тракту, поносы. Больные животные не поддаются лечению и погибают в течение первого года жизни.

Разработка и реализация национальных программ против распространения BLAD-синдрома привели к тому, что частота аллели рецессивной аллели гена CD18 в последнее время значительно снизилась. Однако без систематического мониторинга популяций черно-пестрого скота и других пород с прилитием крови крупного рогатого скота голштинской породы частота встречаемости данной мутации может возрасти. Поэтому разработка новых, более совершенных, тест-систем для проведения ПЦР для выявления носителей BLAD по-прежнему актуальна.

Принцип действия: определение генотипа основано на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, общими для «дикого» и «мутантного» вариантов нуклеотидной последовательности.

BLAD-d 5'-TGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTT-3'

BLAD-r 5'-CGACTCGGTGATGCCATTGAGG-3'

После завершения температурной программы ПЦР флуоресцентные зонды гибридизуются на полненную матрицу путем понижения температуры реакционной смеси. Для определения варианта последовательности используется два типа олигонуклеотидов, гибридизующихся на матрицу рядом.

BLAD-pf 5'-CCCCATCGACCTGTACT-(FAM)

BLAD-pv 5'-CCCCATCGGCCTGTACT-(VIC)

BLAD-pq (BHQ)-ACCTGATGGACCTCTCCTACTC-(P)

Первый тип олигонуклеотидов мечен флуорофором, второй - гасителем флуоресценции.

Для генотипирования используется один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции (зонд BLAD-pq) и два сиквенс-специфичных олигонуклеотида несущих различные флуорофоры: BLAD-pf и BLAD-pv (FAM маркирует предковый аллель, VIC-мутантный аллель). Определение генотипа проводится путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Результаты регистрируются в режиме реального времени. Если анализируемый образец содержит только один вариант нуклеотидной последовательности гена, т.е. гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для зонда, образующего совершенный (полностью комплементарный) дуплекс существенно выше, нежели для зонда, образующего несовершенный (частично некомплементарный) дуплекс. При анализе гетерозиготного образца, содержащего оба варианта нуклеотидной последовательности, оба варианта зондов образуют совершенный дуплекс, поэтому температуры их плавления практически одинаковы.

Источники информации:

1. Марзанов Н.С., Марзанова С.Н., Девришов Д.А., Алексеев Я.И., Коновалова Н.В. Способ одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих cvm и blad у крупного рогатого скота, и тест-система для его осуществления [Текст] // Патент России RU 2601151 - 2017 г. - Бюлл. №34.

2. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР «в реальном времени» [Текст] // БИНОМ. Лаборатория знаний Москва - 2009 г. - 224 с. ISBN 978-5-9963-0086-0.

3. Справочная информация. Красители и тушители для ПЦР в «реальном времени» [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.oligos.ru/spravka-krasiteli-tushiteli.html. свободный - (31.10.2019).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложенная тест-система является комплексом, в который входит специфический набор реагентов, порядок действий при приготовлении реакционной смеси и специально разработанная программа для амплификации гена CD18 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени». Для проведения ПЦР используют специфические олигонуклеотидные праймеры. Изобретение позволяет выявить носителей синдрома недостаточной адгезии лимфоцитов у крупного рогатого скота (BLAD) в популяциях скота черно-пестрого корня (голштинская, черно-пестрая, ярославская и другие родственные породы).

Тест-система для выявления SNP-мутации в 383 позиции гена CD 18 включает набор реактивов: термостабильный фермент - Taq-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, два синтетических олигонуклеотидных праймера, специфичных к данному участку ДНК:

BLAD-d 5'-TGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTT-3'

BLAD-r 5'-CGACTCGGTGATGCCATTGAGG-3'

и два вида зондов:

аллель-специфичные флюоресцирующие

BLAD-pf 5'-CCCCATCGACCTGTACT-(FAM)

BLAD-pv 5'-CCCCATCGGCCTGTACT-(VIC)

и общий для обоих аллелей гасящий

BLAD-pq (BHQ)-ACCTGATGGACCTCTCCTACTC-(P),

а также минеральное масло, защищающее реакционную смесь от испарения в ходе ПЦР.