СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs3423414874 В ГЕНЕ CACNA1S, АССОЦИИРОВАННОГО С СИНДРОМОМ МЫШЕЧНОЙ СЛАБОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Несмотря на все достоинства искусственного осеменения, эта технология способствует тому, что быки, носители генетических аномалий в скрытом состоянии, могут передавать их тысячам или даже десяткам тысяч дочерей и сыновей, что способствует накоплению различного рода мутаций в популяциях крупного рогатого скота [Cooper Т.А., Wiggans G.R., Null D.J., Hutchison J.L., Cole J.B. Genomic evaluation, breed identification, and discovery of a haplotype affecting fertility for Ayrshire dairy cattle // J Dairy Sci. 2014;97(6):3878-82. doi: 10.3168/jds.2013-7427. Epub 2014 Mar 27; Paiva D.S. et al. Incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency, complex vertebral malformation, and deficiency of uridine-5 -monophosphate synthase carriers in Brazilian Girolando cattle // Genetics and Molecular Research 12 (3). 2013. R 3186-3192].

Наиболее полную информацию обо всех генетических дефектах КРС содержит база данных OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) Университета Сиднея ([Электронный ресурс] http://omia.angis.org.au/home/). Согласно информации, которая была доступна на 21.06.2024 года, обнаружено 686 аномалий, для 208 из которых установлена локализация в геноме (то есть, возможно выявление животных носителей с использованием ДНК-анализа).

Исследования показали, что из генетических аномалий голштинского скота, тестируемых в настоящее время на территории РФ: НН0 (BY), НН1, НН2, НН3, НН4, НН5, НН6, ННВ (BLAD), ННС (CVM) и HHD (DUMPS), HCD (дефицит холестерина), ВС (цитруллинемия), FXID (дефицит фактора XI свертывания крови), ННМ (MF) в субпопуляции голштинов Краснодарского края чаще всего встречался гаплотип HCD (у 3% животных), реже всего - аномалии CVM и MF (по 0,2% соответственно) [Ковалюк Н.В., Якушева Л.И., Волченко А.Е., Шахназарова Ю.Ю. Распространение генетических аномалий крупного рогатого скота голштинской породы юга России // Молочное и мясное скотоводство. - 2022. - №3. - С. 21-25 DOI 10.33943/MMS.2022.71.96.004]. Аномалии DUMPS, ВС и FIXD в представленной выборке обнаружены не были.

В 2022 году впервые появилась информация о новой аномалии голштинского скота, в 2024 году стало понятно с каким участком ДНК она ассоциирована (https://wvvw.omia.org/home/). Телята, гомозиготные носители аномалии, не могут встать на ноги после рождения или теряют способность стоять несколько позже. Установлено, что 52% телят, гомозиготных носителей мутации, гибнут в возрасте до 18 месяцев.

Бык ROYLANE SOCRA ROBUST-ET HOUSAM 64966739 (2008 года рождения) - носитель варианта гена, ассоциированного с синдромом мышечной слабости крупного рогатого скота (HMW), отец многих известных производителей, внес, как полагают, самый существенный вклад в распространение аномалии (таблица 1).

Рецессивный гаплотип, приводящий к повышенной смертности телят, локализован на хромосоме 16, в гене CACNA1S (calcium voltage-gated channel subunit alphal S).

Последовательность экзонов, по-видимому, очень консервативна в гене CACNA1S и в гомологичных генах у других видов млекопитающих. Мутации у людей и мышей в таких генах вызывают явления временного или постоянного паралича, аналогичные тем, которые возникают у телят, страдающих мышечной слабостью (HMW). Мутация rs3423414874 в гене CACNA1S представляет собой миссенс-мутацию, кодируемую отрицательной цепью, которая, как предполагается изменяет кодон с GGC на AGC, что приводит к замене аминокислоты глицина на серии в разных местах 9 возможных транскриптов гена.

Согласно базе данных OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) Университета Сиднея ([Электронный ресурс] http://omia.angis.org.au/home/) гаплотип локализован на ВТА 16, ген CACNA1S. Частота встречаемости миссенс мутации С>Т в позиции rs3423414874 CACNA1S достигает 17% в голштинской популяции 2024 года. [Al-Khudhair, A., VanRaden, P.M., Null, D.J., Neupane, M., McClure, M.C., Dechow, CD. New mutation within a common haplotype is associated with calf muscle weakness in Holsteins.- J Dairy Sci: S0022-0302(24)00025-0- 2024. Pubmed reference: 38246543. DOI: 10.3168/jds.2023-24121; Dechow, CD., Frye, E., Maunsell, F.P. Identification of a putative haplotype associated with recumbency in Holstein calves.-JDS Commun3- P.:412-415, 2022. Pubmed reference: 36465504. DOI: 10.3168/jdsc.2022-0224].

Достаточно необычным является неполная пенетрантность (проявление клинических симптомов не у всех особей-носителей) в рецессивном гомозиготном состоянии гена CACNA1S. Распространению аномалии способствовало ее скрытое носительство топовыми мировыми быками-производителями.

Голштинская ассоциация официально признала синдром мышечной слабости нежелательным генетическим заболеванием. С 1 февраля 2024 года информация о носительстве племенными голштинскими животными данного гаплотипа доступна (в частности, на https://www.cdn.ca).

По информации, указанной на сайте https://www.cdn.ca, проведена оценка HMW- статусов быков-производителей двух американских и российской компаний - поставщиков спермы. Суммарная выборка быков -производителей составила 200 голов. Установлено, что быки-производители, принадлежавшие как зарубежным, так и отечественным племенным предприятиям, оказались носителями HMW примерно с одинаковой вероятностью (частота встречаемости от 15 до 17%).

Анализ научно-технической и патентной информации показал, что единственным применяемым сегодня способом диагностики полиморфизма в CACNA1S, ассоциированным с HMW, используемым в качестве аналога, является использование биочипов, используемых для полногеномного генотипирования. Однако проведение ДНК-диагностики данным способом требует наличия дорогостоящего оборудования и, кроме того, связано с высокой стоимостью чипов.

В качестве прототипа заявленного способа, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату, можно считать секвенирование фрагмента гена CACNA1S (Sequence data (30х, Illumina HiSeq pair-ended)), в результате которого была выявлена мутация, ассоциированная с HMW [Al-Khudhair, A., VanRaden, P.M., Null, D.J., Neupane, M., McClure, M.C., Dechow, CD. New mutation within a common haplotype is associated with calf muscle weakness in Holsteins. - J Dairy Sci: S0022-0302(24)00025-0- 2024. Pubmed reference: 38246543. DOI: 10.3168/jds.2023-24121].

Основной недостаток прототипа заключается в необходимости использования дорогостоящего оборудования и высокой стоимости исследований.

Задача изобретения – расширение арсенала средств определения полиморфизма rs3423414874 в гене CACNA1S, ассоциированного с синдромом мышечной слабости.

Технический результат изобретения достигается тем, что для определения полиморфизма С→Т в позиции rs3423414874 гена CACNA1S, ассоциированного с синдромом мышечной слабости используется метод аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) [Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503-16] в двух пробирках, позволяющий проводить идентификацию результатов с помощью метода электрофореза в агарозном геле.

Способ основан на использовании одного общего праймера (MW1 5' ACCACCTCCTCCTCTAGGGCTGT 3') и двух аллель-специфичных праймеров (MW2 5' CTTCTTCATCTACGCGGTCATCG 3' или MW3 5' CTTCTTCATCTACGCGGTCATCA 3'), последний нуклеотид которых на 3'-конце приходится на выявляемую нуклеотидную замену. При этом реакция ставится в двух пробирках, а по ее результативности (в первой или второй, или в обеих пробирках) делается вывод о генотипе животного:

- если реакция является результативной в пробирке с праймером MW1, комплементарным области, не затронутой мутацией и праймером MW2 содержащим на 3' - конце нуклеотид, комплементарный нормальному аллелю (С), а в другой пробирке реакция не проходит - животное несет 2 нормальных аллеля;

- если реакция является результативной в пробирке с праймером MW1, комплементарным области, не затронутой мутацией и праймером MW3 содержащим на 3' - конце нуклеотид, комплементарный мутантному аллелю (Т), а в другой пробирке не проходит - животное несет 2 мутантных аллеля;

- если реакция является результативной и в пробирке с праймерами MW1 + MW2 и в пробирке с праймерами MW1 + MW3 - животное является гетерозиготным.

Способ отличается тем, что расширяет арсенал средств выявления мутантного аллеля Т, ассоциированного с синдромом мышечной слабости (HMW), в позиции rs3423414874 гена CACNA1S.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами (n=10), были использованы образцы спермы быков голштинской породы с заведомо известными генотипами ([Электронный ресурс https://www.cdn.ca]).

ДНК выделяли с использованием наборов реагентов Diatom™ DNA Prep 100, для постановки ПЦР-реакции использовали наборы реагентов Gene Рак PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва). Мастермиксы содержат все необходимые для проведения отдельной реакции компоненты, включая ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК полимеразу, смесь высокоочищенных 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

Перечень быков-производителей с известными генотипами, образцы спермы которых использовались в качестве референтных образцов представлен в таблице 2.

Определение полиморфизма гена CACNA1S. ассоциированного с синдромом мышечной слабости:

После выделения, один и тот же образец ДНК вносили в две пробирки с реагентами Gene Рак PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва).

В одну из них добавляли праймер MW1, комплементарный области, не затронутой мутацией и праймер MW2 содержащий на 3' - конце нуклеотид комплементарный нормальному аллелю С.

Последовательность праймеров MW1 и MW2, сконструированных при использовании программы подбора праймеров Primer Premier:

MW1 5' ACCACCTCCTCCTCTAGGGCTGT 3';

MW2 5' CTTCTTCATCTACGCGGTCATCG 3'.

В другую - праймер MW1 и праймер MW3, содержащим на 3' - конце нуклеотид, комплементарный мутантному аллелю Т.

Последовательность праймеров MW1 и MW3:

MW1 5' ACCACCTCCTCCTCTAGGGCTGT 3';

MW3 5' CTTCTTCATCTACGCGGTCATCA 3'.

Выполняли 28 циклов ПЦР в 20 мкл реакционной смеси (согласно инструкции, к набору реагентов Gene Рак PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва). В пробирки с реакционной смесью добавляли по 10 пмол каждого из праймеров и по 2 мкл ДНК. Реакцию проводили при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 94°С - 3 мин, 28 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 70°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 3 мин. Параметры реакции подобраны эмпирически.

Определение аллелей С и Т гена CACNA1S осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 10 мкл амплификата в лунки 2% агарозного геля, электрофоретически разделяли в 1х ТВЕ буфере 30 мин при 100 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ), при этом:

- если реакция результативна в пробирке 1 (визуализируется полоса 148 пар оснований (п.о.) на дорожке с содержимым пробирки (1) с праймером MW1 и праймером MW2, содержащим на 3' - конце нуклеотид комплементарный нормальному аллелю С, а в другой пробирке (2) реакция не проходит -животное несет 2 нормальных аллеля;

- если реакция результативна в пробирке 2 (визуализируется полоса 148 пар оснований (п.о.) на дорожке с содержимым пробирки (2) с праймером MW1 и праймером MW3 содержащим на 3' - конце нуклеотид комплементарный мутантному аллелю Т, а в другой пробирке не проходит - животное несет 2 мутантных аллеля;

- если реакция результативна и в пробирке с праймерами MW1 + MW2 и в пробирке с праймерами MW1 + MW3 - животное является гетерозиготным (визуализируются полосы 148 пар оснований (п.о.) на дорожках с содержимым пробирок 1 и 2).

Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины (50 п. о.), (ООО «Лаборатория Изоген», Россия). Как видно из электрофореграммы (фиг.1) серии образцов с известными генотипами (табл.2) во втором ряду оказались результативны реакции от носителей HMW (дорожки 2, 4, 6, 8, 9), реакции от животных, свободных от носительства оказались не результативны (2 ряд дорожки 1, 3, 5, 7, 10). Таким образом, способ для определения нуклеотидной замены С→Т в позиции rs3423414874 гена CACNA1S, ассоциированного с синдромом «мышечной слабости» (HMW) показал свою состоятельность.

Пример осуществления способа:

Из крови 4 коров (№1,2,3,4) (АО «Родина», Каневского район Краснодарского края) набором реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва) выделены 4 образца ДНК.

Каждый из образцов ДНК (по 2 мкл) внесен в 2 пробирки из набора Gene Рак PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва) вместе с парой праймеров в соответствии с таблицей 3.

Пробирки 9 и 10 использованы для отрицательного контроля реакции (H₂O вместо ДНК).

Все 10 пробирок инкубированы при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 94°С - 3 мин, 28 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 70°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 3 мин.

На завершающем этапе методом гель-электрофореза содержимое пробирок разделили в 2% агарозном геле, в 1х ТВЕ буфере, 30 мин при 100 В и детектировали под ультрафиолетовым светом. Электрофореграмма анализа представлена на фиг.2.

Разработанный способ был апробирован на образцах крови (n=75) коров из трех хозяйств Краснодарского края. В среднем частота встречаемости носителей HMW составила 17%.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2025-02-21"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Способ

определения полиморфизма rs3423414874 в гене CACNA 1S,

ассоциированного с синдромом мышечной слабости крупного рогатого

скота.xml" dtdVersion="V1_3" originalFreeTextLanguageCode="ru">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024119036/10(042371)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-07-04</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024119036/10(042371)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-07-04</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью научно-производственное обьединение

"Юг-Плем"</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Yug-Plem</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Ковалюк Наталья

Викторовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kovalyuk Natalia</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ определения полиморфизма

rs3423414874 в гене CACNA 1S, ассоциированного с синдромом мышечной

слабости крупного рогатого скота</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Bos taurus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctcctcctctagggctgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Bos taurus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttcttcatctacgcggtcatcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Bos taurus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttcttcatctacgcggtcatca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ определения полиморфизма rs3423414874 в гене CACNA1S, ассоциированного с синдромом мышечной слабости крупного рогатого скота, заключающийся в применении двухпробирочного метода аллель-специфичной полимеразной цепной реакции, согласно изобретению используют один общий праймер и два аллель-специфичных праймера. Технический результат заключается в расширении арсенала средств определения полиморфизма rs3423414874 в гене CACNA1S. 2 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ определения полиморфизма rs3423414874 в гене CACNA1S, ассоциированного с синдромом мышечной слабости крупного рогатого скота, заключающийся в применении двухпробирочного метода аллель-специфичной полимеразной цепной реакции, отличающийся использованием одного общего праймера MW1 5' ACCACCTCCTCCTCTAGGGCTGT 3' и двух аллель-специфичных праймеров MW2 5' CTTCTTCATCTACGCGGTCATCG 3' и MW3 5' CTTCTTCATCTACGCGGTCATCA 3', последний нуклеотид которых на 3'-конце приходится на выявляемую нуклеотидную замену:

- если реакция является результативной в пробирке с праймером MW1, комплементарным области, не затронутой мутацией и праймером MW2, содержащим на 3'-конце нуклеотид, комплементарный нормальному аллелю С, а в другой пробирке реакция не проходит - животное несет 2 нормальных аллеля;

- если реакция является результативной в пробирке с праймером MW1, комплементарным области, не затронутой мутацией и праймером MW3, содержащим на 3'-конце нуклеотид, комплементарный мутантному аллелю Т, а в другой пробирке не проходит - животное несет 2 мутантных аллеля;

- если реакция является результативной и в пробирке с праймерами MW1 + MW2, и в пробирке с праймерами MW1 + MW3 - животное является гетерозиготным.