Рекомбинантная плазмидная ДНК pFUSE/scFv47Fc, предназначенная для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, инактивирующего пестицид параоксон Российский патент 2020 года по МПК C12N15/11 C12N15/63 C07K16/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к технологии получения рекомбинантных антител человека (рчАт) и может быть использовано в медицине в терапии отравлений фосфорорганическими токсинами.

Объектом изобретения является одноцепочечное антитело, слитое с константным доменом антитела человека, с высокой эффективностью взаимодействующее с фосфорорганическим пестицидом параоксон.

Параоксон - является метаболитом широко применяемого инсектицида паратиона, применяющегося для защиты сельскохозяйственных растений от насекомых-вредителей. Потенциал активности параоксона как ингибитора ацетилхолинэстеразы составляет 70% от потенциала известного боевого отравляющего соединения «Зарин». Паратион и параоксон применяются в качестве пестицидов и приводят к отравлениям и смерти местного населения [Konradsen, F. Dan Med Bull. 2007]. Параоксон, паратион и диизопропилфторофосфат также применяются в гражданских лабораториях в качестве модельных фосфорорганических токсинов (ФОТ) для изучения влияния на организм боевых отравляющих веществ (БОВ). В основе токсичности большинства ФОТ и БОВ лежит необратимое ингибирование фермента ацетилхолинэстеразы (АцХЭ, КФ 3.1.1.7) путем фосфорилирования или фосфонирилования гидроксила аминокислотного остатка серина в активном центре фермента. Ацетилхолин является медиатором передачи сигналов в ЦНС, вегетативной нервной системе, а также между двигательными нейронами и скелетной мускулатурой. Ингибирование ацетилхолинэстеразы приводит к длительному присутствию ацетилхолина в синаптической щели и его действию на постсинаптические рецепторы, что вызывает ряд негативных изменений в нервной системе, нарушение нервно-мускульной передачи сигнала и паралич дыхательной мускулатуры [Bajgar, J. Acta Medica. 2005].

Устранение негативных эффектов, связанных с повышенным уровнем ацетилхолина в постсинаптической щели, осуществляется за счет применения низкомолекулярных ингибиторов холинэргических рецепторов. Примерами таких ингибиторов являются: атропин, скополамин, бенацтизин - ингибиторы М-холинорецепторов, и карамифен - ингибитор N-холинорецепторов [Raveh, L. et al. Toxicology. 2014]. Профилактика отравления ФОТ включает в себя также применение слабых и обратимых ингибиторов ацетилхолинэстеразы, которые конкурируют с фосфорорганическими соединениями за связывание с активным центром фермента, тем самым осуществляя протекторное действие. Примером таких ингибиторов являются пиридостигмин и физостигмин. Снижение уровня ацетилхолина при отравлении достигается путем восстановления активности ацетилхолинэстеразы при введении оксимов, которые способны вызвать гидролиз фосфорорганического ингибитора и серина активного центра ацетилхолинэстеразы. Примерами оксимов, используемых в терапии, являются обидоксим, пралидоксим (2-РАМ), метоксим, HI-6 и HLo-7 [Worek, F. Thiermann, H. Pharmacol. Ther. 2013]. В настоящий момент, наиболее стандартным методом лечения отравлений фосфорорганическими веществами является применение атропина как обратимого антагониста мускариновых рецепторов в комбинации с одним или несколькими оксимами для реактивации ацетилхолинэстеразы. Однако у такого подхода имеется несколько недостатков. Во-первых, данная терапия приводит к серьезным побочным эффектам в случае применения в отсутствие ингибиторов холинэстеразы. Во-вторых, терапия должна быть начата в течение минут после заражения для избежания серьезных последствий отравления. В-третьих, данная терапия предотвращает смертельный исход, но не ряд необратимых нарушений нервной системы [Lenz, D. et al. Toxicology. 2007].

В качестве альтернативы рассматривается использование биологических антидотов [Obare, S.O. et al. Sensors. 2010], такими препаратами могут быть антитела и ферменты, которые инактивируют токсины до того, как те достигнут своей биологической мишени [Edwards, F.L. Tchounwou, Р.В. Int J Environ Res Public Health. 2005]. Человеческую бутирилхолинэстеразу (БуХЭ, EC 3.1.1.8), которая является естественным аналогом АцХЭ по механизму действия, можно рассматривать в качестве классического стехиометрического антидота, что означает, что один эквивалент фермента необратимо взаимодействует с одним эквивалентом отравляющего вещества. В опытах на мышах и нечеловекообразных обезьянах показано, что нейтрализация ФОТ в системе кровообращения предварительно введенной экзогенной БуХЭ обеспечивает повышение выживаемости и предотвращение побочных эффектов от отравления, нарушающих дееспособность экспериментальных животных [Doctor, В.Р. et al. Neurosci. Biobehav. Rev. 1991, Jentry, M.K. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992]. Из всех антидотов против ФОТ только бутирилхолинэстераза плазмы крови человека получила статус «New development drug» от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) в 2006 г. Несмотря на очевидные преимущества применение БуХЭ из плазмы крови крайне ограничено из-за высокой стоимости препарата и экстремально быстрого выведения мономерных и димерных форм БуХЭ из кровотока [Raveh, L. et al. Toxicology. 2014]. Следует отметить, что недостатком получения БуХЭ из плазмы крови человека является не только высокая цена исходного материала, но и риск заражения получаемого образца опасными вирусами.

Применение рекомбинантных антител в качестве терапевтических средств является одним из наиболее привлекательных направлений биофармацевтики. Антитела являются одним из основных компонентов адаптивного иммунитета, в результате распознавания антигенов запускается целый ряд иммунологических каскадов, которые приводят к удалению опасных молекул, способных вызвать патологические процессы в организме человека. Благодаря достижениям генетической инженерии и биотехнологии целый ряд препаратов на основе антител уже вошел в широкую клиническую практику по борьбе с социально значимыми заболеваниями.

В качестве прототипа заявленного изобретения использовалось полноразмерное антитело А17, способное гидролизовать пестицид параоксон с невысоким уровнем каталитической активности [Smirnov, I.V. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011]. Ближайшим аналогом заявленного изобретения является мутантный вариант S35R с аминокислотной заменой на остаток аргинина в 35 положении вариабельного домена легкой цепи, полученный в виде Fab-фрагмента антитела, для которого эффективности взаимодействия с параоксоном была улучшена в 170 раз по сравнению с исходным антителом [Smirnov, I.V. et al. Sci Adv. 2016]. Однако настоящее изобретение отличается от ближайшего аналога тем, что в результате использования заявленной генетической конструкции, получаемый вариант антитела имеет аминокислотную замену на остаток лизина в 47 положении вариабельного домена легкой цепи и демонстрирует увеличение эффективности в 300 раз по сравнению с антителом А17 дикого типа и превосходит полученный ранее мутантный вариант S35R. Также, в отличие от ближайшего аналога, представленного в виде Fab-фрагмента, изобретение решает задачу получения рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, слитого с константным доменом антитела человека, и, инактивирующего фосфорорганический пестицид параоксон.

Поставленная задача решается за счет создания рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE/scFv47Fc, кодирующей ген рекомбинантного антитела, и состоящей из плазмиды pFUSE, которая содержит:

высокоэффективный синтетический промотор hEF/HTLV,

нуклеотидную последовательность гена вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела

нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Ser-Gly3)3,

нуклеотидную последовательность гена константного фрагмента иммуноглобулина человека Fc, содержащую в своем составе СН2 и СН3 константные домены тяжелой цепи IgG1 (Fc2-3) и находящуюся в единой рамке считывания с геном вариабельных доменов антитела.

Техническим результатом использования рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE/scFv47Fc является получение одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека, где вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, обеспечивающие специфичность и эффективность взаимодействия с параоксоном, находятся в единой рамке считывания (scFv) и объединены в один ген с Fc-фрагментом, который, в свою очередь, обеспечивает эффекторные функции, связанные с активацией комплемента, сохраняя природные свойства полноразмерного антител. Генетическая конструкция, кодирующая одноцепочечное антитело человека, слитое с константным доменом антитела человека (scFvFc) предпочтительна в настоящем изобретении, т.к. уменьшение размера получаемой молекулы позволяет добиваться увеличения эффективной молярной концентрации и обеспечивает физиологические и терапевтические преимущества по сравнению с полноразмерным вариантом антитела.

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:

Рис. 1. Схема генетической конструкции - рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE/scFv47Fc.

Рис. 2. Электрофоретический анализ экспрессии рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, слитого с константным доменом антитела человека, полученного после трансфекции клеток линии НЕК-293.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Создание генетической конструкции pFUSE/scFv47Fc.

Последовательность гена рекомбинантного антитела получают из генетической конструкции scFv_pHEN2 Reshetnyak et al., JACS 2007 с использованием ПЦР с перекрывающихся праймеров и набора олигонуклеотидов gaagagccatggcccaggtgcagctgcag, ccccaaaaagctcatttatgacaataataagcgaccctcagg, cataaatgagctttttgggggctgttcctggg, ttacttcctaggacggtcagcttggtc и последующим клонированием в вектор pFUSE с использованием эндонуклеаз рестрикции NcoI и AvrII, с получением генетической конструкции pFUSE/scFv47Fc (Рис. 1).

ПРИМЕР 2

Экспрессия генетической конструкции pFUSE/scFv47Fc и выделение рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, слитого с константным доменом антитела человека scFv47Fc.

Полученную генетическую конструкцию pFUSE/scFv47Fc используют для временной трансфекций клеток линии HEK-293 с использованием среды FreeStyle 293 и полиэтиленимина (PEI) [N. Portolano et al. J. Vis. Exp. 2014]. Рекомбинантное одноцепочечное антитело человека, слитое с константным доменом антитела человека (scFv47Fc) очищают с использованием аффинной колонки HiTrap Protein G HP (GE Healthcare, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Очищенный рекомбинантный белок диализуют против фосфатно-солевого буфера с рН 7.4. Чистоту полученного препарата scFv47Fc анализируют электрофоретически (Рис. 2).

ПРИМЕР 3

Анализ кинетических параметров.

Реакционную способность очищенного препарата scFv47Fc по отношению к параоксону в сравнении с антителом дикого типа и его мутантным вариантом S35R проводят по следующей схеме: раствор антител в концентрации 10 мкМ вносят в раствор с субстратом в концентрации 50-1000 мкМ в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7.4). Кинетические измерения проводят с использованием шишечного спектрофотометрофлуориметра Varioscan (Thermo Scientific, США). Накопление продукта реакции - n-нитрофенола - регистрируют по изменению оптической плотности при длине волны 400 нм в течение 1,5 ч. Количественную оценку кинетических параметров проводят с использованием кинетической схемы Китца-Уилсона с помощью программы DynaFit («BioKin»), результаты представлены в Таблице 1 (в графической части).

--->

Перечень последовательностей

<110> IBCh RAS

Mokrushina Yu.A., Pipiya S.O. Golovin A.V., Smirnov I.V., Gabibov A.G.

<120> РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFUSE/scFv47Fc ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА, СЛИТОГО С КОНСТАНТНЫМ ФРАГМЕНТОМ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ИНАКТИВИРУЮЩЕГО ПЕСТИЦИД ПАРАОКСОН

<140> 2019128650/20(056394)

<141> 2019-09-12

<160> 1

<170> PatentIn 3.5.1

<210> 1

<211> 4962

<212> DNA
<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant plasmid pFUSE/scFv47Fc

<400> 1

ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300

gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360

cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420

cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480

tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540

ctacctgaga tcaccggcga aggagggcca ccatgtacag gatgcaactc ctgtcttgca 600

ttgcactaag tcttgcactt gtcacgaatt cggcggccca gccggccatg gcccaggtgc 660

agctgcagga gtcgggccca ggactggtga agccttcgga gaccctgtcc ctcacctgcg 720

ctgtctctgg ttactccatc agcagtggtt actactgggg ctggatccgg cagcccccag 780

ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct atcatagtgg gagcacctac tacaacccgt 840

ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc 900

tgagctctgt gaccgccgca gacacggccg tgtattactg tgcaggactt acgcagtctt 960

cgcataatga tgcgaattgg ggccaaggta ccctggtcac cgtctcgagt ggtggaggcg 1020

gttcaggcgg aggtggctct ggcggtagtg cacttcagtc tgtgctgacg cagccgccct 1080

cagtgtctgc ggccccagga cagaaggtca ccatctcctg ctctggaagc agctccaaca 1140

ttgggaataa ttatgtatcc tggtaccagc agctcccagg aacagccccc aaaaagctca 1200

tttatgacaa taataagcga ccctcaggga ttcctgaccg attctctggc tccaagtctg 1260

gcacgtcagc caccctgggc atcaccggac tccagactgg ggacgaggcc gattattact 1320

gcggaacatg ggatagcagc ctgaatccgg tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc 1380

taggtggcct cgggggcctg gctagcgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc 1440

caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 1500

ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 1560

gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 1620

ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1680

ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1740

ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 1800

aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 1860

gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 1920

cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1980

acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 2040

tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 2100

aatgatatct agctggccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 2160

tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 2220

aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 2280

ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat 2340

ggaattaatt ctaaaataca gcatagcaaa actttaacct ccaaatcaag cctctacttg 2400

aatccttttc tgagggatga ataaggcata ggcatcaggg gctgttgcca atgtgcatta 2460

gctgtttgca gcctcacctt ctttcatgga gtttaagata tagtgtattt tcccaaggtt 2520

tgaactagct cttcatttct ttatgtttta aatgcactga cctcccacat tcccttttta 2580

gtaaaatatt cagaaataat ttaaatacat cattgcaatg aaaataaatg ttttttatta 2640

ggcagaatcc agatgctcaa ggcccttcat aatatccccc agtttagtag ttggacttag 2700

ggaacaaagg aacctttaat agaaattgga cagcaagaaa gcgagcttct agcttatcct 2760

cagtcctgct cctctgccac aaagtgcacg cagttgccgg ccgggtcgcg cagggcgaac 2820

tcccgccccc acggctgctc gccgatctcg gtcatggccg gcccggaggc gtcccggaag 2880

ttcgtggaca cgacctccga ccactcggcg tacagctcgt ccaggccgcg cacccacacc 2940

caggccaggg tgttgtccgg caccacctgg tcctggaccg cgctgatgaa cagggtcacg 3000

tcgtcccgga ccacaccggc gaagtcgtcc tccacgaagt cccgggagaa cccgagccgg 3060

tcggtccaga actcgaccgc tccggcgacg tcgcgcgcgg tgagcaccgg aacggcactg 3120

gtcaacttgg ccatgatggc tcctcctgtc aggagaggaa agagaagaag gttagtacaa 3180

ttgctatagt gagttgtatt atactatgca gatatactat gccaatgatt aattgtcaaa 3240

ctagggctgc agggttcata gtgccacttt tcctgcactg ccccatctcc tgcccaccct 3300

ttcccaggca tagacagtca gtgacttacc aaactcacag gagggagaag gcagaagctt 3360

gagacagacc cgcgggaccg ccgaactgcg aggggacgtg gctagggcgg cttcttttat 3420

ggtgcgccgg ccctcggagg cagggcgctc ggggaggcct agcggccaat ctgcggtggc 3480

aggaggcggg gccgaaggcc gtgcctgacc aatccggagc acataggagt ctcagccccc 3540

cgccccaaag caaggggaag tcacgcgcct gtagcgccag cgtgttgtga aatgggggct 3600

tgggggggtt ggggccctga ctagtcaaaa caaactccca ttgacgtcaa tggggtggag 3660

acttggaaat ccccgtgagt caaaccgcta tccacgccca ttgatgtact gccaaaaccg 3720

catcatcatg gtaatagcga tgactaatac gtagatgtac tgccaagtag gaaagtccca 3780

taaggtcatg tactgggcat aatgccaggc gggccattta ccgtcattga cgtcaatagg 3840

gggcgtactt ggcatatgat acacttgatg tactgccaag tgggcagttt accgtaaata 3900

ctccacccat tgacgtcaat ggaaagtccc tattggcgtt actatgggaa catacgtcat 3960

tattgacgtc aatgggcggg ggtcgttggg cggtcagcca ggcgggccat ttaccgtaag 4020

ttatgtaacg cctgcaggtt aattaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 4080

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 4140

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 4200

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 4260

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 4320

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 4380

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 4440

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 4500

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 4560

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 4620

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 4680

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 4740

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atggctagtt aattaacatt taaatcagcg 4800

gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcgt 4860

aactaacata cgctctccat caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg 4920

tccccagtgc aagtgcaggt gccagaacat ttctctatcg aa 4962

Нуклеотдная последовательность рекомбинантной плазмидной ДНКpFUSE/scFv47Fc:

GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACCTGAGATCACCGGcGAAGGAGGGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGaattcggcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctctggttactccatcagcagtggttactactggggctggatccggcagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctatcatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcagacacggccgtgtattactgtgcaggacttacgcagtcttcgcataatgatgcgaattggggccaaggtaccctggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtagtgcacttcagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggaacagcccccaaaaagctcatttatgacaataataagcgaccctcagggattcctgaccgattctctggctccaagtctggcacgtcagccaccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcggaacatgggatagcagcctgaatccggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtggcctcgggggcctggctagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctcTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATATCTAGCTGGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGAATTAATTCTAAAATACAGCATAGCAAAACTTTAACCTCCAAATCAAGCCTCTACTTGAATCCTTTTCTGAGGGATGAATAAGGCATAGGCATCAGGGGCTGTTGCCAATGTGCATTAGCTGTTTGCAGCCTCACCTTCTTTCATGGAGTTTAAGATATAGTGTATTTTCCCAAGGTTTGAACTAGCTCTTCATTTCTTTATGTTTTAAATGCACTGACCTCCCACATTCCCTTTTTAGTAAAATATTCAGAAATAATTTAAATACATCATTGCAATGAAAATAAATGTTTTTTATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAGGCCCTTCATAATATCCCCCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACAGCAAGAAAGCGAGCTTCTAGCTTATCCTCAGTCCTGCTCCTCTGCCACAAAGTGCACGCAGTTGCCGGCCGGGTCGCGCAGGGCGAACTCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCATGGCCGGCCCGGAGGCGTCCCGGAAGTTCGTGGACACGACCTCCGACCACTCGGCGTACAGCTCGTCCAGGCCGCGCACCCACACCCAGGCCAGGGTGTTGTCCGGCACCACCTGGTCCTGGACCGCGCTGATGAACAGGGTCACGTCGTCCCGGACCACACCGGCGAAGTCGTCCTCCACGAAGTCCCGGGAGAACCCGAGCCGGTCGGTCCAGAACTCGACCGCTCCGGCGACGTCGCGCGCGGTGAGCACCGGAACGGCACTGGTCAACTTGGCCATGATGGCTCCTCctgtcaggagaggaaagagaagaaggttagtacaattgCTATAGTGAGTTGTATTATACTATGCAGATATACTATGCCAATGATTAATTGTCAAACTAGGGCTGCAgggttcatagtgccacttttcctgcactgccccatctcctgcccaccctttcccaggcatagacagtcagtgacttacCAAACTCACAGGAGGGAGAAGGCAGAAGCTTGAGACAGACCCGCGGGACCGCCGAACTGCGAGGGGACGTGGCTAGGGCGGCTTCTTTTATGGTGCGCCGGCCCTCGGAGGCAGGGCGCTCGGGGAGGCCTAGCGGCCAATCTGCGGTGGCAGGAGGCGGGGCCGAAGGCCGTGCCTGACCAATCCGGAGCACATAGGAGTCTCAGCCCCCCGCCCCAAAGCAAGGGGAAGTCACGCGCCTGTAGCGCCAGCGTGTTGTGAAATGGGGGCTTGGGGGGGTTGGGGCCCTGACTAGTCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCCAAAACCGCATCATCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCCTGCAGGTTAATTAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGGCTAGTTAATTAACATTTAAATCAGCGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGTAACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTATCGAA

<---

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и инактивирующего фосфорорганический пестицид параоксон. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в получении одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и инактивирующего фосфорорганический пестицид параоксон. 1 табл., 3 пр., 2 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pFUSE/scFv47Fc для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и инактивирующего фосфорорганический пестицид параоксон, состоящая из нуклеотидной последовательности с SEQ ID NO: 1.