СИСТЕМА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ FAB-ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIAPASTORIS, НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A И Ab-LCh-LAMBDA/pPICZα_A, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ ТЯЖЕЛОЙ И ЛЕГКОЙ ЦЕПЕЙ АНТИТЕЛ, СООТВЕТСТВЕННО Российский патент 2019 года по МПК C12N15/81 C12N15/13 

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к: рекомбинантным плазмидным ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A, позволяющим клонировать любые вариабельные домены тяжелых и легких цепей, соответветственно, системе экспрессии Fab-фрагментов антител с лямбда изотипом легкой цепи при котрансформации обеих генетических конструкций с предварительно встроенными интересующими вариабельными доменами тяжелых и легких цепей антитела в клетки метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, получению Fab-фрагментов антител с лямбда изотипом легкой цепи из культультуральной среды без протеолитической деградации конечного препарата. Изобретение может быть использовано в научных исследованиях и биотехнологии для получения рекомбинантных Fab-фрагментов антител, требующих высокой степени чистоты, гомогенности и воспроизводимости опытных партий образцов.

Объектом изобретения является система из двух модифицированных рекомбинантных плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZα_A, предназначенных для клонирования вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител, соответственно, с последующей котрансформацией смеси обеих генетических конструкций в эквимолярном соотношении в клетки метилотрофных дрожжей Pichia pastoris и получением стабильных рекомбинантных Fab-фрагментов антител с лямбда изотипом легкой цепи.

Известен способ получения одноцепочечных антител в клетках линии P. pastoris в составе слитного белка с константным доменом иммуноглобулина мыши (Wang DD, Su MM, Sun Y, Huang SL, Wang J, Yan WQ. Protein Expr Purif. 2012 Nov; 86(1):75-81). В данной работе использовалась одноцистронная система векторов. Авторам удалось получить выход продукта 60 мг/л при использовании 80 литрового ферментера. Недостатком этой системы является получение антитела в виде одноцепочечного фрагмента, так как существуют данные о различии в уровнях специфической активности между Fab-фрагментами и одноцепочечными антителами в пользу первых (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др.//Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95).

Известна система получения Fab-фрагмента антитела в составе моноцистронного вектора содержащего сайт гидролиза протеазой KEX2 (Burtet RT1, Santos-Silva MA, Buss GA, Moraes LM, Maranhao AQ, Brigido MM. J Biochem. 2007 Dec; 142(6):665-9). В результате, авторам удалось получить функционально активный Fab-фрагмент, однако уровень экспрессии не превышал 10 мг/л культуральной среды.

Описана система получения Fab-фрагмента антитела, состоящая из двух моноцистронных векторов, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител, соответственно (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др.//Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95). Система позволяла получать до 15 мг/л активного Fab-фрагмента, однако впоследствии была обнаружена невысокая стабильность получаемых препаратов белка, предположительно по причине совыделения и расщепления Fab-фрагментов протеиназами хозяйской клетки. Легкие цепи могут принадлежать к каппа или лямбда изотипу и соответствуют одному константному домену. Показано, что изотип легкой цепи может оказывать значительное влияние на структуру рекомбинантного Fab-фрагмента антитела, при этом вариант с лямбда изотипом легкой цепи обладает большей конформационной жесткостью и термической стабильностью (Ponomarenko N, Chatziefthimiou SD, Kurkova I, Mokrushina Y, et al. Role of κ→λ light-chain constant-domain switch in the structure and functionality of A17 reactibody. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2014;70:708-19).

Задачей настоящего изобретения является создание системы для экспрессии Fab-фрагментов антител с высокой стабильностью конечных препаратов белка. Поставленная задача решается за счет создания двух модифицированных рекомбинантных плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A, у которых в отличии от описанных ближайших аналогов (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др.//Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95 и Ponomarenko N.A., Chatziefthimiou S.D., Kurkova I.N. et al. //Acta Crystallogr. Section D. 2014. Vol.70, N3. P. 708-719) удалены маркерные последовальности 3xFLAG эпитопа в случае тяжелой цепи и с-myc эпитопа в случае легкой цепи, с целью минимизации протеолитической деградации конечного рекомбинантного продукта - Fab-фрагмента антитела - в процессе его наработки в дрожжевой системе и хроматографической очистки. Сайты деградации Fab-фрагментов соответствуют двум типам эндогенных протеаз дрожжей P. pastoris - протеазе А (ЕС 3.4.23.8) и карбоксипептидазе Y (ЕС 3.4.16.5). Такие сайты деградации как His-X, Asn-X, Asp-X, Gln-X, Glu-X в избытке представлены в ближайших аналогах в последовательностях 3xFLAG и с-myc эпитопов, расположенных на С-концах тяжелой и легкой цепей, соответственно. Также в полилинкерные области рекомбинантных плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A в сравнении с ближайшими аналогами были внесены изменения, а именно сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции BsmBI сохранен, но сдвинут в обоих случаях на 12 нуклеотидов для расщепления последовательностей непосредственно в области, кодирующей лидерный пептид, в рекомбинантную плазмидную ДНК Ab-LCh-LAMBDA/pPICZα_A были добавлены уникальные рестриктные сайты между последовательностями, кодирующими лидерный пептид и константный домен легкой цепи. Таким образом, рекомбинантные плазмидные ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A (Фиг. 1) содержат уникальные сайты рестрикции BsmBI и XhoI, Ace65I для клонирования любых вариабельных доменов тяжелой цепи и BsmBI и KpnI, AvrII, HindIII для клонирования любых вариабельных доменов легкой цепи антител между последовательностями, кодирующими лидерный пептид и константный домен тяжелой или легкой цепи и предназначены для последующей котрансформации в метилотрофные дрожжи Pichia pastoris и получения стабильных рекомбинантных Fab-фрагментов антител с лямбда изотипом легкой цепи. При наличии указанных вариантов рестриктных сайтов в последовательности интересующего вариабельного домена тяжелой или легкой цепи для его амплификации методом ПЦР с помощью праймеров могут быть введены сайты для эндонуклеаз рестрикции II типа (BspMI, BsaI и др.), образующие далее при клонировании в рекомбинантные векторы совместимые липкие концы.

Обозначение «pPICZ_α_A» в рекомбинантных плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A (Фиг. 1) отражает содержание структурных элементов генетической конструкции pPICZαA ("Invitrogen", США) на основе которой были получены ближайшие аналоги (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др.//Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95 и Ponomarenko N.A., Chatziefthimiou S.D., Kurkova I.N. et al. //Acta Crystallogr. Section D. 2014. Vol. 70, N3. P. 708-719), а именно индуцибельного промотора гена алкогольоксидазы АОХ1 дрожжей P. pastoris дикого типа, нативного терминатора и сигнала полиаденилирования АОХ1 гена, последовательности гена Sh ble, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к антибиотику зеоцин, нуклеотидной последовательности сигнального пептида альфа-фактора из S. cerevisiae, необходимую для секреции экспрессируемых продуктов в культуральную среду. Последовательность, кодирующая сигнальный пептид альфа-фактора была изменена, а именно, были удалены 12 нуклеотидов, кодирующих два ЕА повтора. Удаление ЕАЕА последовательности при процессинге рекомбинантного продукта дипептидил-аминопептидазой дрожжевой клетки STE13 часто проходит неэффективно, поэтому в настоящем изобретении С-конец альфа-факторного пептида оканчивается сайтом узнавания Kex2 протеазы, при этом для клонирования вариабельных доменов тяжелых и легких цепей антител в стык с Kex2 сайтом присутствует сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции II типа BsmBI, что в результате обеспечивает сохранение нативной последовательности N-конца тяжелых и легких цепей Fab-фрагментов антител.

Рекомбинантная плазмида Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A (Фиг. 1А) содержит нуклеотидную последовательность первого константного домена γ1 цепи иммуноглобулина человека (СН1), часть участка шарнирной области, последовательность шести-гистидинового кластера для очистки белкового препарата с использованием металл-аффинной хроматографии. Указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «Ab-HCh-HIS».

Рекомбинантная плазмида Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A (Фиг. 1Б) содержит нуклеотидную последовательность, 12-фрагмента, а также константного лямбда-2 домена легкой цепи, оканчивающуюся стоп-кодоном. Указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «Ab-LCh-LAMBDA».

В рекомбинантной плазмидной ДНК Ab HCh-His/pPicZαA (Фиг. 1А) для экспрессии фрагментов тяжелой цепи антител С-конец гена константного домена слит с 6xHis последовательностью, которая используется для очистки белка на первой стадии с помощью металл-хелатной хроматографии. В рекомбинантной плазмидной ДНК Ab-LCh_lambda/pPICZαA (Фиг. 1Б) для экспрессии фрагментов легкой цепи антител на С-конец гена константного домена перед 6xHis последовательностью введен стоп-кодон. Синтез полноразмерной легкой цепи заканчивается перед 6xHis кластером и, таким образом, она экспрессируется в нативной форме и очищается только в комплексе с тяжелой цепью в виде Fab-фрагмента.

Техническим результатом котрансформации плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A с предварительно встроенными интересующими вариабельными доменами тяжелых и легких цепей антитела в клетки дрожжей P. pastoris является получение Fab-фрагментов антител с последующей хроматографической очисткой с выходом до 30%, чистотой более 95% и стабильностью не менее 60 дней при хранении при +4°С.

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами: Фиг. 1. Схематическое изображение модифицированных генетических конструкций для экспрессии Fab-фрагментов антител в дрожжевой системе P. pastoris. (А) - рекомбинантная плазмидная ДНК Ab HCh-His/pPicZ_α_A. (Б) - рекомбинантная плазмидная ДНК Ab-LCh_lambda/pPICZ_α_A.

Фиг. 2. Электрофоретический анализ чистоты (А) препаратов Fab-фрагмента антитела А5 lambda на разных стадиях хроматографического выделения (Б) очищенного препаратов Fab-фрагмента антитела А17, с наблюдаемой деградацией по С-концевым эпитопам. На рисунке А: 1 - элюат после металл-хелатной хроматографической очистки, 2 - основная фракция после разделения образца на катионообменной хроматографии, 3 - фракция после проведения гель-фильтрации, 4 - проскок, не связывающийся с гидрофобным сорбентом, 5 - элюат Fab-фрагмента с гидрофобного сорбента, М - маркер молекулярной массы. На рисунке Б: 1 - препарат Fab-фрагмента антитела, содержащего на С-концах цепей с-myc и 3xFLAG эпитопы сразу после процедуры очистки, 2 - после хранения образца на +4°С в течение недели, 3 - после хранения образца на +4°С в течение двух недель. Таблица. Характеристика методики выделения препаратов рекомбинантных Fab-фрагментов антител.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1

Создание системы генетических конструкций Ab-LCh_kappa/pPICZ_α_A и Ab-LCh_lambda/pPICZ_α_A.

Оптимизацию генетических конструкций осуществляют на основе полученных ранее векторов pPICZαA/Hch и pPICZαA/Lch (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др.//Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95) и pPICZαA/Jλ2 (Ponomarenko N.A., Chatziefthimiou S.D., Kurkova I.N. et al. //Acta Crystallogr. Section D. 2014. Vol. 70, N3. P. 708-719). Для получения оптимизированного вектора Ab HCh-His/pPicZαA для экспрессии фрагментов тяжелой цепи антител первый константный домен γ1 цепи иммуноглобулина человека (СН1) и часть участка шарнирной области амплифицируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с конструкции pPICZαA/Hch с использованием специфических праймеров. Полученный ПЦР продукт клонируют в исходный вектор pPICZαA/Hch по сайтам рестрикции Acc65I и SalI с элиминацией 3xFLAG эпитопа. Аналогичным образом для получения конструкций Ab-LCh_kappa/pPICZαA и Ab-LCh_lambda/pPICZαA J-фрагменты и константные домены легких цепей амплифицируют с использованием специфических праймеров методом ПЦР и затем лигируют в вектор pPICZαA/Lch по сайтам рестрикции XhoI-SalI и Acc65I-SalI соответственно. При этом на С-конце элиминируют с-myc эпитоп и с помощью праймеров вводят стоп-код он. На основе созданных векторов получают конструкции для экспрессии антитела А5 - A5_lambda/pPICZαA, A5_kappa/pPICZαA и A5-HCh-His/pPicZαA. Амплификацию вариабельных доменов осуществляют с помощью специфических праймеров с ранее полученной конструкции, кодирующей одноцепочечное антитело, A5ScFvFLAG/pHEN2 (Reshetnyak A.V., Armentano M.F., Ponomarenko N.A. et al. //J. Am. Chem. Soc. 2007. Vol. 129, N51. P. 16175-16182) (Фиг. 1).

При конструировании вектора Ab HCh-His/pPicZαA (Фиг. 1А) для экспрессии фрагментов тяжелой цепи антител удаляют последовательность 3xFLAG эпитопа, а С-конец гена константного домена объединяют с 6xHis последовательностью, которая будет использоваться для очистки белка на первой стадии с помощью металл-хелатной хроматографии. При клонировании сохраняют универсальные сайты рестрикции BsmBI и XhoI, а также Acc65I для встраивания любых вариабельных доменов тяжелой цепи. В векторе Ab-LCh_lambda/pPICZαA (Фиг. 1Б) помимо удаления с-myc эпитопа перед 6xHis последовательностью вводят стоп-кодон. Синтез полноразмерной легкой цепи будет заканчиваться перед 6xHis маркером и, таким образом, она будет экспрессироваться в нативной форме и очищаться только в комплексе с тяжелой цепью в виде Fab-фрагмента. Для клонирования вариабельных доменов легкой цепи в Jl2 участок в процессе ПЦР вводят универсальные сайты рестрикции KpnI, AvrII и HindIII и сохраняют сайт узнавания для BsmBI.

ПРИМЕР 2

Получение штамма-продуцента рекомбинантного Fab-фрагмента в дрожжах Р. pastoris.

Клетки P. pastoris штамма GS115 котрансформируют методом электропорации предварительно линеаризованными по сайту рестрикции Pmel конструкциями A5-HCh-His/pPicZα в паре с A5_lambda/pPICZαA или A5_kappa/pPICZαA. Селекцию трансформантов проводят на антибиотике зеоцин, клон-продуцент с максимальным уровнем продукции отбирают, анализируя суммарные белки культуральной среды в 12% ДСН-ПААГ.

Препаративную наработку Fab-фрагмента антитела А5 проводят в 3-9 л питательной среды BMMY с использованием качалочных колб на 750 мл по рекомендациям фирмы изготовителя ("Invitrogen") с некоторыми модификациями: стартовая плотность культуры для индукции метанолом составляет А600=5.0, метанол добавляют до концентрации 0,5% каждые 24 часа, в это же время также вносят сорбитол до 0,15%, экспрессию проводят на протяжении трех суток.

Полученную после экспрессии Fab-фрагмента антитела А5 культуральную среду центрифугируют для удаления клеток. Далее проводят ультрафильтрацию с использованием фильтрационных модулей 0,45 мм и 0,22 мм и концентрирование среды с помощью ультрафильтрационного модуля Pelicon2 10 кДа. Концентрированный раствор Fab-фрагмента подвергают металл-хелатной хроматографии с использованием сорбента Ni-NTA Superflow (QIAGEN) по протоколу фирмы производителя. Полученный элюат диализуют против 20 мМ CH3COONa рН 6.0. Вторую стадию очистки осуществляют с помощью катионообменной хроматографии с использованием колонки MonoS 5/50 GL (GE Healthcare) согласно инструкции производителя. Для нанесения используют буфер, содержащий 20 мМ CH3COONa рН 6.0, элюцию проводят солевым градиентом NaCl от 0 до 0,35 М в 20 мМ CH3COONa рН 6.0 в 20 объемах колонки при скорости потока 1 мл/мин. Далее фракции, содержащие Fab-фрагмент, очищают гель-фильтрацией на колонке HiLoad 26/600 Superdex75 pg (GE Healthcare) в буфере, содержащем 20 mM NaxH3-xPO4, рН7.4, 300 mM NaCl. Для дальнейшей очистки проводят гидрофобную хроматографию с использованием HiTrepPhenyl HP 5ml (GE Healthcare) в буфере - 1 M (NH4)2S04, 20 mM NaxH3-xPO4, pH7.4. Изократическую элюцию проводят раствором 20 mM NaxH3-xPO4, pH7.4. После каждой стадии очистки проводят электрофорез в ПААГ в не восстанавливающих условиях по стандартной методике Леммли с последующей оценкой чистоты препарата с помощью денситометрического анализа. Результаты очистки представлены в Таблице.

На Фиг. 2А представлен электрофоретический анализ проведения хроматографического фракционирования Fab-фрагмента антитела A51ambda. Полученный конечный образец (Фиг. 2А, дорожка 5) не изменяет свойств электрофоретической подвижности и остается стабильным не менее 60 дней при хранении на +4°С. На Фиг. 2Б представлена сравнительная электрофореграмма очищенного образца Fab-фрагмента, содержащего на С-концах цепей маркерные эпитопы 3xFLAG и с-myc и претерпевающего постепенную деградацию при тех же условиях хранения. Таким образом, разработанная нами система позволяет получать высоко очищенные, гомогенные и стабильные препараты рекомбинантных Fab-фрагментов антител, имеющих терапевтическое значение.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена система для экспрессии Fab-фрагментов антител, состоящая из рекомбинантных плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZα_A. Трансформация дрожжей Р. Pastoris указанными плазмидными ДНК позволяет получать очищенные Fab-фрагменты антител с выходом до 30% с чистотой более 95% и стабильностью не менее 60 дней при хранении при +4°С. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Система для экспрессии Fab-фрагментов антител в метилотрофных дрожжах Р. pastoris, состоящая из рекомбинантнх плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A, показанных на фиг. 1 и содержащих в своем составе плазмиду pPICZαA со следующими элементами в порядке их расположения: индуцибельный промотор гена алкогольоксидазы АОХ1 дрожжей P. pastoris дикого типа, нуклеотидная последовательность сигнального пептида альфа-фактора из S. cerevisiae, оканчивающаяся сайтом узнавания для Кех2 протеазы и необходимая для секреции экспрессируемых продуктов в культуральную среду, уникальные сайты рестрикции BsmBI и XhoI, Acc65I для клонирования вариабельных доменов тяжелой цепи антител в плазмидной ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A или BsmBI и KpnI, AvrII, HindIII для клонирования вариабельных доменов легкой цепи антител в плазмидной ДНК Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A, нуклеотидная последовательность, кодирующая часть участка шарнирной области и первый константный домен γ1 тяжелой цепи (СН1) иммуноглобулина человека, а также последовательность шестигистидинового кластера (6xHis), непосредственно оканчивающаяся стоп-кодоном и необходимая для очистки конечного белкового препарата с использованием металл-аффинной хроматографии, в плазмидной ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A или нуклеотидная последовательность, кодирующая часть участка J2 области и константный домен легкой цепи лямбда-2 изотипа (32X2) иммуноглобулина человека, оканчивающаяся стоп-кодоном в плазмидной ДНК Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A, нативный терминатор и сигнал полиаденилирования гена алкогольоксидазы АОХ1, последовательность гена Sh ble, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к антибиотику зеоцину, ориджин репликации pUC.

2. Система для экспрессии Fab-фрагментов антител в метилотрофных дрожжах Р. pastoris по п. 1, где любые клонированные вариабельные домены антител образуют открытую рамку считывания - последовательность сигнального пептида альфа-фактора из S. cerevisiae, оканчивающаяся сайтом узнавания для Kex2 протеазы, последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, последовательность первого константного домена γ1 тяжелой цепи (СН1) иммуноглобулина человека, последовательность шестигистидинового кластера (6xHis) или последовательность сигнального пептида альфа-фактора из S. cerevisiae, оканчивающаяся сайтом узнавания для Kex2 протеазы, последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, последовательность константного домена легкой цепи лямбда-2 изотипа иммуноглобулина человека.

3. Система для экспрессии Fab-фрагментов антител в метилотрофных дрожжах Р. pastoris по п. 2, где рекомбинантные плазмидные ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZ_α_A с предварительно встроенными интересующими вариабельными доменами тяжелых и легких цепей антитела контрансформируются в клетки метилотрофных дрожжей Pichia pastoris.