Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae, обладающий способностью к биопленкообразованию Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 C12R1/22 

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, микробиологии и может быть использовано в ветеринарии и биотехнологии при производстве биологических препаратов.

В ветеринарной микробиологии применяют ряд штаммов антигенов для производства вакцин против клебсиеллеза сельскохозяйственных животных.

В настоящее время особое внимание уделяют диагностике клебсиеллезных инфекций. Клебсиеллы обнаруживаются при пневмонии, инфекциях мочеполовой системы, острых желудочно-кишечных заболеваниях, различных гнойно-септических осложнениях, а также при глазных и других инфекциях сельскохозяйственных животных.

Клебсиеллы вызывают интерес у специалистов ветеринарной службы, ботаников и гигиенистов, так как их обнаруживают и при заболеваниях животных (пневмонии, маститы, септицемии), выделяют из пищевых продуктов, с поверхности овощей и семян, цветов, из воды различных водоемов. Такое повсеместное распространение клебсиелл свидетельствует о значении этой проблемы не только для медицины, но и для народного хозяйства (1).

Изучение этиологической роли грамотрицательной микрофлоры при хронических инфекциях, их биопленкообразующей способности и антибиотикочувствительности к используемым в лечении инфекции препаратам имеет большое практическое значение для оценки эффективности проводимой антибиотикотерапии, поиска новых путей диагностики и подавления способности микроорганизмов образовывать биопленки.

За прототип взят штамм Klebsiella pneumoniae №24, выделенный из органов новорожденного поросенка и обладающий следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, не образует спор, образует капсулу, не имеет жгутиков, неподвижен.

На МПБ через 5-6 часов помутнение среды с последующим образованием тонкой поверхностной пленки, на МПА-полупрозрачные с ровным краем слизистой консистенции, на среде Эндо бледно-розовые колонии с красноватым центром.

Патогенен для белых мышей, LD₅₀ составляет 3,1×10⁸ клеток при внутрибрюшинном заражении.

Недостатком является то, что данный штамм выделен из органов новорожденного поросенка, менее вирулентный, со слабо выраженным мукоидным фенотипом.

Техническим результатом являлось получение штамма Klebsiella pneumoniae с гипермукоидным фенотипом для изучения биопленкоспособности, пригодного для получения иммунных препаратов для профилактики и лечения клебсиеллеза сельскохозяйственных животных, разработка средств борьбы с биопленками.

Предложенный штамм Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288M, выделен из маститного молока коров.

Предложенный штамм Klebsiella pneumoniae депонирован 27 апреля 2018 г., регистрационный номер - "штамм Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М", во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГБУ ВГНКИ). Предложенный производственный штамм Klebsiella pneumoniae ВКШМ-Б-288М обладает следующими свойствами.

Заявленный штамм бактерий Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М, штамм антиген выделен в животноводческом комплексе Российской Федерации, поэтому является специфичным для крупного рогатого скота в пределах Северо-Западного региона Российской Федерации, его включение в вакцину против клебсиеллеза позволит усилить ее специфичность и повысить эффективность профилактики клебсиеллеза, а также изучить биопленкоспособность и разработать меры борьбы.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М обладает гипермукоидным фенотипом, проявляет множественную резистентность к антимикробным препаратам, продуцирует β-лактамазу расширенного спектра класса СТХ M1, вирулентен для мышей.

Морфологические признаки: грамотрицательные палочки, не образующие спор, с выраженной капсулой.

Культуральные свойства на плотных средах: колонии круглые с ровным краем, слизистые и могут сливаться, образуя матрикс.

На жидких средах (МПБ) - диффузное интенсивное помутнение среды с образованием толстой слизистой пленки на поверхности, при на клоне пробирки пленка сдерживала жидкость.

Биохимические тесты изучали с применением бактериологического анализатора VITEK2.

Устойчивость к антибактериальным препаратам определялась диск-диффузионным методом согласно Клиническим рекомендациям 2015 года с использованием дисков производства Oxoid: штамм устойчив к ампициллину, цефтазидиму, цефтриаксону, цефепиму, тетрациклину, стрептомицину, гентамицину, тобрамицину, амикацину, сульфаниламиду, ко-тримоксазолу; чувствителен к хлорамфениколу, налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину, меропенему, нитрофурантоину.

Наряду с традиционной культуральной диагностикой использовали протеомный анализ, основанный на использовании физических технологий, к числу которых относится матрично-активированная лазерная дезорбционная/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия - MALDI-TOF-MS.

Пример 1. Изучение биопленкообразования Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М с гипермукоидным фенотипом.

Исследовали способность выделенных штаммов формировать биопленки на поверхности 96-луночных полистероловых планшетов проводили по методу GO, Toole и R.Kolter. По уровню адсорбции красителя этанолом, измеренному в единицах оптической плотности (OD 630) на фотометре ELx808 (BioTek, США) при длине волн 630 нм оценивали активность формирования биопленки. Для интерпретации полученных данных определяли способность штаммов формировать биопленки в соответствии с критериями, разработанными Stepanovic S.et al.: при значениях OD 630 ниже 0,090 - считали, что штаммы не обладали способностью к образованию биопленки; при 0,090<OD630≤0,180 - штаммы обладали слабой; при 0,180<OD630≤0,360 - средней; при OD630>0,360 - высокой способностью к образованию биопленки.

Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae обладает высокой способностью к образованию биопленки и активно формирует биопленки на поверхности полистироловых планшетов через 24 ч. Уже через 24 ч исследования уровень биопленкообразования штаммов K. Pneumoniae был в 3,2 раза выше контрольных значений культуры Staphylococcus aureus.

При росте на МПА образуются слизистые колонии, которые сливаются между собой, образуя матрикс, при этом капельки слизи отрываясь, прикрепляются к крышке чашки Петри.

Пример 2. Приготовление модифицированной среды Эндо для культивирования Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М.

Штамм Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М культивировали на среде Эндо, с добавлением молока, что стимулирует образование биопленки следующего состава, г:

Дистиллированная вода 1000,0 Питательный агар, сухой 26,5 ЭКДА 1,22 Фуксин основной 0,23 Сахар молочный 10,7 Динатрий фосфат 0,48 Сульфит натрия безводный 0,83 Натрий углекислый 0,03

Молоко цельное обезжиривали центрифугированием, разводили водой 1:1, устанавливали рН 7,0-7.3 с помощью пищевой соды. Молоко стерилизовали в автоклаве 0,5 атм 110°С - 20 мин, добавляли 5% молока при разливе среды Эндо в чашки Петри.

Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М с выраженным гипермукоидным фенотипом, выделенная из маститного молока коров активнее продуцировала слизистые колонии, которые сливаясь, образовывали матрикс.

Оптимальная температура инкубирования 370°С, срок инкубирования 18-20 ч, рН 7,2±0,2.

Источники информации

1. Патент RU2224019 МПК⁷ CIN 1/20, А61K 39/108.2004 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae с выраженным гипермукоидным фенонтипом, обладающий способностью к биопленкообразованию, депонирован в ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером ВКШМ-Б-288М. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для диагностики и подавления способности микроорганизмов образовывать биопленки. 2 пр.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae ВКШМ-Б-288М с выраженным гипермукоидным фенонтипом, обладающий способностью к биопленкообразованию.