СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЗИДА МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/15 G01N27/48 

Изобретение относится к области фармацевтической и аналитической химии, в частности к вольтамперометрическому способу определения нового биологически активного нитросоединения - триазида (5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-α] пиримидинида l-аргининия моногидрата, фиг.1 - химическая структура), предназначенного для лечения и профилактики вирусных заболеваний человека и животных. Соединение относится к новому классу нитроазолопиримидинов, содержащих мостиковый атом азота и рассматриваемых в качестве структурных аналогов природных нуклеозидов пуринового ряда. Благодаря этой особенности они могут выступать в роли антиметаболитов, проявляя противовирусное действие [Savateev. K.V., Ulomsky E.N., Rusinov V.L., Isenov M.L., Chupakhin O.N. Structural analogs of adenosine receptor inhibitors in the series of 1,2,4-triazolo[1,5-a] pyrimidines // Russian Chemical Bulletin. 2015. 64: 1378−1384],

[Savateev K.V., Ulomsky E.N., Borisov S.S., Voinkov E.K., Fedotov V.V., Rusinov V.L. 8-Alkyl[1,2,4]triazolo[5,1-b]purines // Chem. Heterocycl. Compd. 2014. 50: 880–887].

Триазид обладает высокой противовирусной активностью в отношении штаммов вируса гриппа A(H3N2), B/Lee/40 и умеренной - в отношении штаммов A(H1N1), A(H9N2) в системах in vitro и in vivo. Соединение можно отнести к VI классу относительно безвредных веществ по классификации Hodge и Sterner [Чупахин О.Н., Чарушин В.Н., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Котовская С.К., Киселев О.И., Деева Э.Г., Саватеев К.В., Борисов С.С. // Патент РФ № 2529487. Дата публикации 27.09.2014].

В настоящее время фармацевтическая субстанция «триазид» успешно проходит клинические испытания [Саватеев К.В. Дис. Синтез, строение, свойства и биологическая активность нитроазолопиримидинов. канд. хим. наук. Екатеринбург: Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина, 2016. 182 с].

В настоящее время из патентной и научно-технической литературы неизвестны сведения о способах количественного определения триазида.

Задача разработки чувствительного и экспрессного способа количественного определения триазида в субстанции и лекарственной форме является актуальной и важной для обеспечения контроля качества лекарственного средства на предмет возможных фальсификаций и деструкции в процессе хранения.

Способ может быть использован для количественного определения триазида в порошке и его лекарственных формах.

Известны способы количественного определения органических лекарственных веществ, заключающиеся в применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектрофотометрии. Эти методы имеют ряд недостатков: ВЭЖХ отличает длительность и трудоемкость анализа, необходимость использования большого количества реактивов, включая токсичные органические растворители, высокая стоимость оборудования, расходных материалов и обслуживающего персонала, а спектрофотометрия в некоторых случаях не обладает необходимой селективностью и чувствительностью.

Известны способы определения биологически активных нитросоединений вольтамперометрическими методами [Сагликоглу Г., Йилмаз С. Высокочувствительное вольтамперометрическое определение метронидазола на стеклоуглеродном электроде, модифицированном поли(р-аминобензолсульфокислотой) // Электрохимия. 2015. 51: 977-981], [Шайдарова Л.Г., Гедмина А.В., Жалдак Э.Р., Челнокова А.И., Будников Г.К. Вольтамперометрическое определение Ацикловира в лекарственных средствах на электроде, модифицированном пленкой из гексахлороплатината или гексацианокобальтата рутения // Химико-фармацевтический журнал. 2014. 48: 37-43]. Область применения данных способов ограничена ввиду их специфичности.

Также известен способ определения противовирусного лекарственного соединения с похожей структурой Триазавирина [(натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло-[5,1-c][1,2,4]триазин-7-она, дигидрата] из класса азолоазинов (фиг.2 - химическая структура), к которому относится и триазид, методом вольтамперометрии. Сущность его заключается в электровосстановлении триазавирина на толстопленочном углеродсодержащем электроде (ТУЭ). на фоне 0,1 моль/л азотной кислоты в диапазоне потенциалов от 0,10 до (-0,40) В при скорости квадратно-волновой развертки потенциала 0,16 В/с [Малахова Н.А., Козицина А.Н, Иванова А.В., Цмокалюк А.Н., Сараева С.Ю., Матерн А.И. Способ количественного определения триазавирина методом вольтамперометрии (Варианты) // Патент РФ на изобретение № 2614022, опубликован 22.03.2017]. Наличие в молекуле триазида L-аргининия в качестве заместителя может существенно влиять на электрохимическую активность соединения [Chua C.K., Pumera M. Influence of Methyl Substituent Position on Redox Properties of Nitroaromatics Related to 2,4,6-Trinitrotoluene // Electroanalysis. 2011. 23: 2350 – 2356], в связи с чем использование перечисленных выше условий в способе определения триазавирина делает невозможным его применение для определения триазида ввиду отсутствия тока восстановления соединения в указанном диапазоне потенциалов. На фоне 0,1 моль/л азотной кислоты катодный ток триазида регистрируется в более широком диапазоне потенциалов от 0,20 до (-1,0) В в области волны восстановления растворенного кислорода (фиг. 2), что не позволяет получать корректную аналитическую информацию из-за наложения двух параллельно протекающих электрохимических процессов. На фиг. 3 представлены катодные квадратно-волновые (КвВ) вольтамперограммы, зарегистрированные на тонкопленочных углеродосодержащих электродах (ТУЭ) без удаления кислорода в растворе 0,1 моль/л азотной кислоты со скоростью развертки 0,15 В/с без добавления (сплошная кривая) и после добавления 80 мг/л триазида (точечная кривая).

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание чувствительного и экспрессного способа количественного вольтамперометрического определения триазида в фармацевтической субстанции для обеспечения контроля качества лекарственного средства.

Поставленная задача достигается тем, что способ количественного определения триазида (5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-α]пиримидинида l-аргининия моногидрата] в субстанции, заключается в переводе триазида из пробы в водный раствор и внесении аликвоты подготовленного раствора анализируемой пробы в электрохимическую ячейку с фоновым электролитом буфером Бриттона-Робинсона при рН 7 в присутствии 0,01 М сульфита натрия, после чего осуществляют регистрацию катодных вольтамперных кривых в квадратно-волновом режиме на поверхности толстопленочного углеродсодержащего электрода в интервале от (-0,40) до (-1,4) В при скорости развертки потенциала 150 мВ/с, амплитуде импульса 50 мВ, а концентрацию триазида определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от (-0,60) до (-1,0) В относительно хлоридсеребряного электрода из выражения:

, где

Х – содержание триазида в субстанции, %;

Н₁ - среднее значение высоты пика триазида для пробы, мкА;

Н₂ - среднее значение высоты пика триазида для пробы с добавленным стандартным раствором триазида, мкА;

С_д – концентрация стандартного раствора триазида, из которого делают добавку в пробу, г/л.

V_д – объем стандартного раствора триазида, добавленный в электролизер, мл.

V_ал - аликвотная часть испытуемого раствора пробы, помещенная в электролизер, мл;

V₀ - объем испытуемого раствора триазида, приготовленного из точной навески, мл;

m - масса навески субстанции триазида, г.

Новым в способе является то, что идентификацию триазида проводят в присутствии сульфита натрия для химического связывания мешающего определению триазида растворенного кислорода по известной реакции O₂ + 2Na₂SO₃ → 2Na₂SO₄ [Некрасов Б.В. Основы общей химии. М.: Химия, 1973. 656 с.] в нейтральном растворе ББР для увеличения скорости химической реакции (скорость реакции возрастает с повышением pH раствора до значения 7 – 8 [Терни Т. Механизмы реакций окисления-восстановления. М.: Мир, 1968. 211 с.]) по высоте пика его восстановления на поверхности ТУЭ в диапазоне потенциалов от (-0,60) до (-1,0) В относительно хлоридсеребряного электрода.

Концентрация кислорода в растворах, находящихся в соприкосновении с воздухом, близка к 0,5 мМ. Для удаления кислорода из анализируемого раствора достаточно 0,04 М концентрации сульфита натрия, что достигается добавлением 0,2 см³ насыщенного (≈ 2,1 М) раствора сульфита натрия на 10 см³ анализируемого раствора [Хустенко Л.А., Толмачева Т.П. Электрохимический способ определения мышьяка // Патент РФ на изобретение № 2354961 опубликован 10.05.2009].

Экспериментально установлено, что для практически полного связывания растворенного кислорода сульфитом натрия в перемешиваемом нейтральном растворе ББР достаточно 30 с. На фиг. 4 представлены катодные квадратно-волновые вольтамперограммы, зарегистрированные на ТУЭ в растворе ББР при рН 7,0 со скоростью развертки 0,15 В/с без добавления (синяя) и после добавления в перемешиваемый раствор объемом 20 см³ 0,4 см³ 2,1 М насыщенного раствора сульфита натрия через 0,5 (зеленая), 2 (желтая) и 60 минут (голубая) кривые. Как видно из рисунка, надежное связывание растворенного кислорода после добавления указанного количества сульфита наблюдается в течение часа.

Отличительные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства: высокая, менее одной минуты, скорость процедуры удаления, мешающего определению триазида, растворенного кислорода из раствора при выбранных условиях протекания химической окислительно-восстановительной реакции для обеспечения простоты и экспрессности анализа в отсутствие необходимости продувки раствора инертным газом продолжительностью не менее 20 мин. К недостаткам продувки следует отнести также сложность выполнения самой процедуры, необходимость использования дорогостоящего инертного газа высокой степени чистоты и дополнительного оборудования.

Данное изобретение может быть использовано как в лабораториях фармацевтического контроля для определения триазида в порошке и его лекарственных формах, так и в фармацевтической промышленности для контроля технологических процессов и качества фармпрепаратов, сточных вод и воздушной зоны химико-фармацевтических предприятий.

Все условия определения триазида подобраны экспериментально. В процессе поиска оптимальных условий вольтамперометрического определения триазида было изучено влияние ряда факторов: кислотность фонового электролита, частота импульса, амплитуда импульса и скорость квадратно-волновой (КвВ) развертки потенциала на высоту пика триазида.

Влияние кислотности растворов ББР на ток восстановления триазида изучали в присутствии сульфита натрия в области рН 7 – 12. Максимальный ток восстановления триазида фиксируется при рН 7. Затем с увеличением рН происходит резкое уменьшение тока восстановления триазида с последующей стабилизацией при рН 10 – 12. Полученные результаты свидетельствуют об участии ионов водорода в процессе электровосстановления соединения. Исходя из полученных результатов в качестве фонового электролита был выбран раствор ББР с рН 7, так как на его фоне наблюдалась четкая волна восстановления триазида максимальной величины, кроме того, данный раствор обеспечивал хорошую электропроводность, широкую рабочую область и необходимую площадь для обработки сигнала.

Ток пика в квадратно-волновом режиме существенно зависит от амплитуды импульса и скорости развертки потенциала.

Оптимальная амплитуда импульса составила 50 мВ. При значениях амплитуды импульса менее 50 мВ высота пика не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения триазида. При дальнейшем увеличении значения амплитуды импульса рост пика триазида существенно замедляется. При этом базовая линия остаточного тока возрастает в 4 раза, что уменьшает соотношение полезный сигнал/остаточный ток и ухудшает воспроизводимость результатов измерения (табл.1 на фиг. 5). Кроме того, регистрация пика триазида затрудняется вследствие асимметричности сигнала и увеличения его ширины.

Важным для определения триазида методом КвВ ВА является выбор скорости развертки потенциала. Экспериментально установлено, что оптимальной является скорость развертки 150 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону уменьшения увеличивает время анализа и понижает высоту пика триазида. При увеличении скорости развертки рост пика триазида существенно замедляется, базовая линия остаточного тока возрастает в 3 раза, что уменьшает соотношение полезный сигнал/остаточный ток и ухудшает воспроизводимость результатов измерения (табл.2 на фиг. 6). Кроме того регистрация пика триазида затрудняется вследствие асимметричности сигнала и увеличения его ширины.

Предложенный способ количественного определения триазида отличается простотой и экспрессностью. Время единичного анализа не превышает 2 мин. Способ не требует больших трудозатрат, исключает использование большого количества реактивов, включая токсичные органические растворители, дорогостоящих электродов и инертных газов и может быть применен в любой химической лаборатории, имеющей вольтамперометрический анализатор как отечественного, так и зарубежного производства.

Метрологические характеристики данного способа: предел обнаружения составляет 4,9⋅10^-6 моль/дм³. Область определяемых содержаний ТЗ: от 2,6⋅10^-5 до 1,3⋅10^-3 моль/дм³. Относительная ошибка определения не превышает 1 %. Способ позволяет измерять в выбранных условиях пик восстановления триазида с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение (RSD) измеряемого тока восстановления триазида не превышает 0,7 % при последовательной регистрации 5 катодных сигналов для концентрации триазида на уровне его определяемых содержаний.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Определение триазида в субстанции методом КвВ вольтамперометрии.

В электролитическую ячейку вольтамперометрического анализатора вносят В электролизер помещают 20 см³ буферного раствора Бриттона-Робинсона (рН 7 ± 0,2), добавляют 0,1 см³ насыщенного раствора сульфита натрия и перемешивают раствор в течение 30 с. Опускают в раствор электроды: индикаторный – ТУЭ, вспомогательный стеклоуглеродный и электрод сравнения – насыщенный хлоридсеребряный (нас. х.с.э.).

Затем опускают в электролизер индикаторный электрод, электрод сравнения, вспомогательный электрод, выключают перемешивание и регистрируют 2 – 3 вольтамперограммы фонового раствора со скоростью 150 мВ/с в интервале от (-0,4) до (-1,4) В для контроля полноты связывания растворенного кислорода сульфитом натрия. Отсутствие пиков на вольтамперограмме свидетельствует о полноте связывания растворенного кислорода. Затем в ячейку с фоновым раствором вносят аликвоту 1,0 мл подготовленного водного раствора анализируемой пробы, перемешивают раствор 5 с и вновь регистрируют вольтамперограмму в тех же условиях. Пик для указанной концентрации вещества регистрируют в диапазоне потенциалов от (-0,60) до (-1,0) В (отн. нас. х.с.э.). Содержание триазида в субстанции (Х, %) оценивают методом добавки стандартного раствора триазида, измеряя высоту катодных пиков, по следующей формуле:

, где

Н₁ - среднее значение высоты пика триазида для пробы, мкА;

Н₂ - среднее значение высоты пика триазида для пробы с добавленным стандартным раствором триазида, мкА;

С_д – концентрация стандартного раствора триазида, из которого делают добавку в пробу, г/л.

V_д – объем стандартного раствора триазида, добавленный в электролизер, мл.

V_ал - аликвотная часть испытуемого раствора пробы, помещенная в электролизер, мл;

V₀ - объем испытуемого раствора триазида, приготовленного из точной навески, мл;

m - масса навески субстанции триазида, г.

Предлагаемым способом были проанализированы три разные партии субстанции триазида.

n=3, Р=0.95

№ партии субстанции ТРИАЗИД Навеска субстанции ТРИАЗИД, г Найденное содержание триазида, % RSD,% 1 0,0102 100,3 ± 1,1 1,03 2 0,0100 99,7 ± 0,9 0,61 3 0,0101 100,3 ± 0,9 0,59

Согласно фармакопейной статьи предприятия «ТРИАЗИД субстанция» содержание триазида (количественное определение методом ВЭЖХ) должно быть не менее 98,0 % и не более 102,0 % в пересчете на сухое вещество. Результаты анализов трех разных партий субстанции удовлетворяют заявленным требованиям.

Изобретение относится к области фармацевтической и аналитической химии и может быть использовано в фармацевтической промышленности для контроля технологических процессов и качества фармпрепаратов, а также - сточных вод и воздушной зоны химико-фармацевтических предприятий. Сущность способа основана на способности триазида восстанавливаться на различных типах графитовых электродов и заключается в переводе триазида из пробы в водный раствор и в прямом (без предварительного накопления на электроде) вольтамперометрическом определении в ней триазида на фоне буферной смеси Бриттона-Робинсона рН=7 в присутствии 0,01 М сульфита натрия регистрацией катодных пиков в квадратно-волновом режиме съемки вольтамперограмм в интервале от (-0,4) до (-1,4) В при скорости развертки потенциала 150 мВ/с, амплитуде импульса 50 мВ. Концентрацию триазида определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от (-0,60) до (-1,0) В относительно хлоридсеребряного электрода методом добавки стандартного раствора триазида. Достигается чувствительность и экспрессность анализа. 1 табл., 6 ил.

Способ количественного определения триазида (5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-α]пиримидинида l-аргининия моногидрата] в субстанции, заключающийся в переводе триазида из пробы в водный раствор и внесении аликвоты подготовленного раствора анализируемой пробы в электрохимическую ячейку с фоновым электролитом буфером Бриттона-Робинсона при рН 7 в присутствии 0,01 М сульфита натрия, после чего осуществляют регистрацию катодных вольтамперных кривых в квадратно-волновом режиме на поверхности толстопленочного углеродсодержащего электрода в интервале от (-0,40) до (-1,4) В при скорости развертки потенциала 150 мВ/с, амплитуде импульса 50 мВ, а концентрацию триазида определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от (-0,60) до (-1,0) В относительно хлоридсеребряного электрода из выражения:

,

где

Х – содержание триазида в субстанции, %;

Н₁ - среднее значение высоты пика триазида для пробы, мкА;

Н₂ - среднее значение высоты пика триазида для пробы с добавленным стандартным раствором триазида, мкА;

С_д – концентрация стандартного раствора триазида, из которого делают добавку в пробу, г/л;

V_д – объем стандартного раствора триазида, добавленный в электролизер, мл;

V_ал - аликвотная часть испытуемого раствора пробы, помещенная в электролизер, мл;

V₀ - объем испытуемого раствора триазида, приготовленного из точной навески, мл;

m - масса навески субстанции триазида, г.