ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas oryzihabitans - СТИМУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ В ЗАСУШЛИВЫХ АГРОЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/38 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к бактериальным препаратам для стимулирования роста растений в неблагоприятных агроэкологических условиях.

В условиях сложных агроэкологических условий России важное значение приобретает повышение адаптивных свойств сельскохозяйственных культур. При этом важным фактором повышения урожайности (продуктивности) растений может быть ускоренная энергия прорастания семян, увеличение их всхожести, ускоренное развитие корневой системы, обеспечивающей улучшение их питания и, как следствие, возрастание массы растения.

Для решения данной задачи постоянно ведется поиск эффективных и экологически безопасных биологически активных средств, стабильно влияющих на рост и развитие растений. Для интенсификации производства без использования химических средств современное растениеводство заинтересовано в поиске препаратов биологического и, в частности, микробиологического происхождения для создания на их основе препаратов, повышающих адаптивные способности растений к стрессовым факторам.

В настоящее время известно использование большого числа бактериальных препаратов для стимулирующего воздействия на растения в условиях засухи, наличия в почве нефтепродуктов, солей металлов и других негативных факторов. В частности, показано (CN109266580), что Bacillus mojavensis AER314-4 может увеличить скорость прорастания семян Sophora japonica на 54% при стрессе, вызванном засухой за счет разложения крахмала до растворимого сахара путем активации амилазы в семенах, что уменьшило осмотическое давление и способствовало увеличению водопоглощения.

Применение штамма Bacillus toyonensis SB 19 стимулировало устойчивость листовых овощей к высоким температурам и засухе (KR101922428). Показано (CN108865951) применение Pantoea Alhagi XK-11 для повышения засухоустойчивости сельскохозяйственных культур, улучшается всасывание растений питательных элементов, улучшает метаболическую систему растений и сохраняет водный потенциал растений, что способствует росту и развитию растений и повышению урожайности.

Сотрудниками Пекинского лесного университета (UNIV BEIJING FORE-STRY, Китай) показано, что использование свободно живущей азотфиксирующей бактерии может стимулировать рост растений в экологических системах с засухой, большими перепадами температур, солевыми и щелочными катастрофами и сильным ультрафиолетовым излучением. В качестве микроорганизма предлагается применять штаммы Klebsiella sp.is LTGPAF-6F (CN105754901), Massilia albidiflava MBC10 (CN105385626), Massilia dura MBC2 (CN105385625), Rhizobium galegae MBC8 (CN105385624), Pseudomonas cannabina MBC1 (CN105349464), Citrobacter freundii MBC7 (CN105255797) и ряд других.

Однако все указанные препараты находятся на стадии полевых испытаний и не имеют разрешения на применении на территории России.

Одним из перспективных микроорганизмов для бактериальных удобрений являются штаммы Pseudomonas. В частности, известны штамм микроорганизмов Pseudomonas species, предназначенный для получения бактериального удобрения (RU 2051586,1996) и штамм Pseudomonas putida, депонированный в ЦМПМ ВНИИГенетики №ВКПМВ-4308 (RU 2130264,1999).

Недостатком данных штаммов является относительно малый эффект в повышении урожайности как зерновых и овощных, так и кормовых культур.

Наиболее близким к заявляемому объекту является Недостатком данного штамма бактерий, который по совокупности морфологических и физиолого-биохимических признаков, а также по достигаемому техническому эффекту является наиболее близким к заявляемому объекту и выбран в качестве прототипа, также является относительно малый эффект в повышении урожайности как зерновых и овощных, так и кормовых культур.

Наиболее близким к заявляемому составу является штамм Pseudomonas brassi-cacearum 26W(b) (RU 2453596, 2012), депонированный ВКПМ под номером В-10388. ХЪ В результате использования данного штамма в качестве удобрения удается в среднем на 15-20% повысить урожайность ряда зерновых, овощных и кормовых культур, в частности пшеницы, ржи, проса, огурцов, томатов, кукурузы, амаранта и рапса. Однако применение данного удобрения в условиях засушливых районов оказалось недостаточно эффективным.

Задачей, решаемой авторами, являлось расширение спектра используемых бактериальных препаратов.

Технический результат достигается созданием бактериального препарата на основе нового штамма бактерий Pseudomonas oryzihabitans B3S, депонированного в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 15.12.2012 под №RCAM 04752. (Справка о депонировании прилагается).

Штамм характеризуется следующими показателями. Родовое, видовое название, номер. Pseudomonas oryzihabitans B3S

Происхождение. Штамм выделен из дерно-подзолистой почвы ризосферы гороха, Ленинградская обл.

По какому определителю, руководству идентифицирован. Определитель бактерий Берджи. т. 1. Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. Девятое издание. В двух томах. Москва «Мир», 1997.

Свойства, практическая ценность культуры. Штамм представляет практическую ценность. Продуцент фитогормонов, обладает высокой активностью АЦК дезаминазы, стимулятор роста растений в стрессовых условиях.

Культурально-морфологические. физико-биохимические особенности культуры:

Форма колоний - круглые, беловато-серые, матовые, средне-выпуклые, слабо-слизистые

Хорошо гомогенизируются в жидких средах.

Край ровный

Диаметр 3-4 мм

Спорообразование - спор не образует

Утилизирует основные компоненты корневых экссудатов гороха посевного

Способы и условия хранения: Выращивание на средах: мясо-пептонный агар, среде BPF. Выращивание при температуре 28°С. Срок хранения при периодическом пересеве -2 месяца.

Рекомендуемые условия и способы хранения: криоконсервация. Продолжительность выращивании на питательной среде Зсуток; состав защитной среды(г/л):пептон-5, гидролизат казеина-5, K₂HPO₄-1, МО₄-0,5, глицерин-150. Титр клеточной суспензии 10⁹ кл/мл; скорость замораживания (град/мин)-1; температура хранения -80°С. Срок хранения -7 лет.

Ранее бактерии Pseudomonas oryzihabitans использовали в составе препарата для предотвращения и лечения гнили клубничного корня (CN108633914), Pseudomonas cepacia (KFCC-11118) для утилизации пищевого мусора (KR20020042298), Pseudomonas aurantiaca IB5-10 предназначен для стимулирования роста растений береговой дюны и повышения скорости прорастания (KR20110132930). Заявляемый штамм характеризуется следующими свойствами, которые имеют значение для положительных взаимодействий бактерий с растениями, указанными в таблице 1.

Одновременно в этих условиях клетки выделяют метаболиты различной природы, в том числе и аутометаболиты, что обеспечивает как ускоренное развитие самих клеток при севе в почву, так и более высокую сохранность их при хранении, что обеспечивает возможность сорбции как клеток, так и продукции их метаболизма и, в конечном итоге возможность получения гранулированной формы удобрения, как более удобной при применении удобрения. Практическая применимость штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Результаты культивирования штаммов бактерий при культивировании на агаризованной среде.

Бактерии культивировали на жидкой питательной среде, в которую входили: сахароза, сорбат калия, глицерин, карбоксиметилцеллюлоза, пептон, дрожжевой экстракт, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, рН=6,4. Начальная концентрация внесенных в среду бактерий составляла 1×10Е5 клеток в 1 мл. Культивирование проводили при температуре 22°С в течении 28 суток. Через каждые 7 суток определяли титр бактериальных культур методом посева разведений бактериальных суспензий на агаризованную питательную среду.

Пример 2. Результаты испытания эффективности штамма Pseudomonas oryzihabitans B3S в вегетационных опытах.

Растения выращивали в сосудах, содержащих 5 кг дерново-подзолистой почвы: гумус - 1,5-1,9%; азот общий - 0,16-0,22%; подвижный фосфор - 50-68 мг Р₂О₅/100 г; подвижный калий - 43-69 мг K₂O/100 г; рН 5,9-6,2. Удобрения в почву вносили в количестве (мг/кг): NH₄NO₃ - 200; KCl - 200; MgSO₄ - 60; Н_{3 В}О₃ - 3; MnSO₄ - 3; ZnSO₄ - 3; Na₂MoO₄ - 1,5. Семена ячменя стерилизовали смесью перекиси водорода и этилового спирта (1:1) в течение 3 мин, сеяли в почву и одновременно инокулировали водными суспензиями бактерий (10⁷ клеток/мл) в количестве 1 мл на семя. Для приготовления суспензий использовали биомассу бактерий, выращенных на агаризованной питательной среде. Вегетационные опыты проводили в летний период в теплице с естественным световым и температурным режимами. В фазу появления всходов в каждом сосуде оставляли по 6 одинаково развитых растений. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% (оптимальное увлажнение почвы) и 30% (недостаточное увлажнение почвы - имитация засухи) от полной полевой влагоемкости регулярным поливом сосудов по весу. При определении урожая растений повторность во всех опытах была 4-кратной.

Установлено, что в условиях оптимального увлажнения почвы штамм достоверно повысил надземную массу гороха и масса клубней картофеля (Таблица 3). Инокуляция ячменя была более эффективной штаммом Pseudomonas oryzihabitans B3S по сравнению с контролем и аналогом. В условиях недостаточного увлажнения почвы штамм оказывали положительное действие на рост и урожай испытуемых растений.

Важно подчеркнуть, что положительный эффект от инокуляции, выраженный в процентах к контролю, был выражен существенно сильнее в условиях недостаточного увлажнения почвы. Это свидетельствовало об антистрессовом действии изучаемых штаммов, которое может проявляться в условиях засухи. Комплементарность полезных свойств у изучаемых штаммов будет способствовать усилению антистрессового эффекта и повышению стабильности положительного действия штаммов на рост инокулированных растений.

Звездочками указаны достоверные отличия от контроля. В скобках указаны прибавки относительно контроля в %.

Полученные результаты показали, что заявляемый штамм способствует стимулированию роста растений, особенно в условиях недостатки влаги.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas oryzihabitans, депонированный в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером RCAM 04752, обладающий способностью стимулировать рост растений в условиях недостатка влаги. Изобретение обеспечивает повышение урожайности растений в засушливых агроэкологических условиях. 3 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Pseudomonas oryzihabitans, депонированный в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером RCAM 04752, в качестве стимулятора роста растений в неблагоприятных агроэкологических условиях.