ШТАММ БАКТЕРИЙ Variovorax paradoxus AV10 - СТИМУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ В ЗАСУШЛИВЫХ АГРОЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к штаммам микроорганизмов для получения средства для повышения урожайности растений при сельскохозяйственном использовании при неблагоприятных природных условиях (засуха, наличие вредных веществ и т.п.).

В условиях сложных агроэкологических условий России важное значение приобретает повышение адаптивных свойств сельскохозяйственных культур. При этом важным фактором повышения урожайности (продуктивности) растений может быть ускоренная энергия прорастания семян, увеличение их всхожести, ускоренное развитие корневой системы, обеспечивающей улучшение их питания и, как следствие, возрастание массы растения.

Для решения данной задачи постоянно ведется поиск эффективных и экологически безопасных биологически активных средств, стабильно влияющих на рост и развитие растений. Для интенсификации производства без использования химических средств современное растениеводство заинтересовано в поиске препаратов биологического и, в частности, микробиологического происхождения для создания на их основе препаратов, повышающих адаптивные способности растений к стрессовым факторам.

В настоящее время известно использование большого числа бактериальных препаратов для стимулирующего воздействия на растения в условиях засухи, наличия в почве нефтепродуктов, солей металлов и других негативных факторов. В частности, показано (CN 109266580), что Bacillus mojavensis AER314-4 может увеличить скорость прорастания семян Sophora japonica на 54% при стрессе, вызванном засухой за счет разложения крахмала до растворимого сахара путем активации амилазы в семенах, что уменьшило осмотическое давление и способствовало увеличению водопоглощения.

Применение штамма Bacillus toyonensis SB 19 стимулировало устойчивость листовых овощей к высоким температурам и засухе (KR 101922428). Показано (CN 108865951) применение Pantoea Alhagi XK-11 для повышения засухоустойчивости сельскохозяйственных культур, улучшается всасывание растений питательных элементов, улучшает метаболическую систему растений и сохраняет водный потенциал растений, что способствует росту и развитию растений и повышению урожайности.

Сотрудниками Пекинского лесного университета (UNIV BEIJING FORE-STRY, Китай) показано, что использование свободно живущей азотфиксирующей бактерии может стимулировать рост растений в экологических системах с засухой, большими перепадами температур, солевыми и щелочными катастрофами и сильным ультрафиолетовым излучением. В качестве микроорганизма предлагается применять штаммы Klebsiella sp.is LTGPAF-6F (CN 105754901), Massilia albidiflava MBC10 (CN 105385626), Massilia dura MBC2 (CN 105385625), Rhizobium galegae MBC8 (CN 105385624), Pseudomonas cannabina MBC1 (CN 105349464), Citrobacter freundii MBC7 (CN 105255797) и ряд других.

Однако все указанные препараты находятся на стадии полевых испытаний и не имеют разрешения на применении на территории России.

Одним из перспективных микроорганизмов для бактериальных удобрений являются штаммы Pseudomonas. В частности, известны штамм микроорганизмов Pseudomonas species, предназначенный для получения бактериального удобрения (RU 2051586,1996) и штамм Pseudomonas putida, депонированный в ЦМПМ ВНИИГенетики № ВКПМВ-4308 (RU 2130264,1999). Недостатком данных штаммов является относительно малый эффект в повышении урожайности как зерновых и овощных, так и кормовых культур.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по достигаемому эффекту является штамм Pseudomonas brassicacearum 26W (RU 2453596, 2012), депонированный ВКПМ под номером В-10388. ХЪ В результате использования данного штамма в качестве удобрения удается в среднем на 15-20% повысить урожайность ряда зерновых, овощных и кормовых культур, в частности пшеницы, ржи, проса, огурцов, томатов, кукурузы, амаранта и рапса. Однако применение данного удобрения в условиях засушливых районов оказалось недостаточно эффективным.

Задачей, решаемой авторами, являлось расширение спектра используемых бактериальных препаратов.

Технический результат достигается созданием штамма бактерий Variovorax paradoxus AV-10, депонированного в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 15.12.2012 под № RCAM 04753. (Справка о депонировании прилагается).

Штамм характеризуется следующими показателями.

Родовое, видовое название, номер. Variovorax paradoxus AV-10/

Происхождение. Штамм выделен из чернозема ризосферы сои, Краснодарский край.

По какому определителю, руководству идентифицирован. Определитель бактерий Берджи. т. 1. Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. Девятое издание. В двух томах. Москва «Мир», 1997.

Свойства, практическая ценность культуры. Штамм представляет практическую ценность. Продуцент ауксинов, обладает высокой активностью АЦК дезаминазы, деструктор кворум-сенсинг молекул (гомосеринлактонов), модулятор гормонального статуса растений, стимулятор роста растений в стрессовых условиях.

Культурально-морфологические. физико-биохимические особенности культуры:

• Форма колоний -круглые, желтоватые, блестящие, слабо-прозрачные, слабо-выпуклые, слизистые или слабо-слизистые

• Хорошо гомогенизируются в жидких средах.

• Край ровный

• Часто образуют - формы диаметром 3-4 и 0,5-1,0 соответственно

• Спорообразование - спор не образует

• Устойчив к антибиотикам стрептомицину, канамицину и рифампицину

• Утилизирует основные комоненты корневых экссудатов томатов, картофеля и гороха посевного

Способы и условия хранения: Выращивание на средах: мясо-пептонный агар, дрожжевом экстракте, среде BPF. Выращивание при температуре 28°С. Срок хранения при периодическом пересеве - 3 месяца.

Рекомендуемые условия и способы хранения; криоконсервация. Продолжительность выращивании на питательной среде 3-4 суток; состав защитной среды(г/л): пептон-5, гидролизат казеина-5, K₂HPO₄-1, М О₄-0,5, глицерин-150. Титр клеточной суспензии 10⁹ кл/мл; скорость замораживания (град/мин)-1; температура хранения -80°С. Срок хранения - 8 лет.

В настоящее время известно использование штаммов Variovorax paradoxus для удаления из почвы солей кадмия (RU 2515691, 2014). редкоземельных элементов JPH0870851 углеводородных загрязнений GB2425759, получения амидазы (JP2003225094) стереоспецифического синтеза и энантиомерного обогащения бета-аминокислот (МХРА06000367). Кроме того штамм Variovorax paradoxus KB5, обладает контролирующей активностью по отношению к патогену растений, вызывающему заболевания растений (KR20170009409).

Штамм Variovorax paradoxus AV10 и его применение в литературе не описано.

Свойства штамма, которые имеют значение для положительных взаимодействий бактерий с растениями, указаны в таблице 1.

2. Оценка совместимости штаммов бактерий при совместном культивировании.

Бактерии культивировали на жидкой питательной среде, в которую входили: сахароза, сорбат калия, глицерин, карбоксиметилцеллюлоза, пептон, дрожжевой экстракт, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, рН=6,4. Начальная концентрация внесенных в среду бактерий составляла 1х10Е5 клеток в 1 мл. Культивирование проводили при температуре 22°С в течении 28 суток. Через каждые 7 суток определяли титр бактериальных культур методом посева разведений бактериальных суспензий на агаризованную питательную среду.

3. Результаты испытания эффективности штамма Variovorax paradoxus AV10 в вегетационных опытах.

Растения выращивали в сосудах, содержащих 5 кг дерново-подзолистой почвы: гумус - 1,5-1,9%; азот общий - 0,16-0,22%; подвижный фосфор - 50-68 мг Р₂О₅/100 г; подвижный калий - 43-69 мг K₂O/100 г; рН 5,9-6,2. Удобрения в почву вносили в количестве (мг/кг): NH₄NO₃ - 200; KCl - 200; MgSO₄ - 60; H₃BO₃ - 3; MnSO₄ - 3; ZnSO₄ - 3; Na₂MoO₄ - 1,5. Семена ячменя стерилизовали смесью перекиси водорода и этилового спирта (1:1) в течение 3 мин, сеяли в почву и одновременно инокулировали водными суспензиями бактерий (10⁷ клеток/мл) в количестве 1 мл на семя. Для приготовления суспензий использовали биомассу бактерий, выращенных на агаризованной питательной среде. Вегетационные опыты проводили в летний период в теплице с естественным световым и температурным режимами. В фазу появления всходов в каждом сосуде оставляли по 6 одинаково развитых растений. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% (оптимальное увлажнение почвы) и 30% (недостаточное увлажнение почвы -имитация засухи) от полной полевой влагоемкости регулярным поливом сосудов по весу. При определении урожая растений повторность во всех опытах была 4-кратной.

Установлено, что в условиях оптимального увлажнения почвы штамм достоверно повысил надземную массу гороха и масса клубней картофеля (Таблица 3). Инокуляция томатов была более эффективной штаммом Variovorax paradoxus AV10. В условиях недостаточного увлажнения почвы штамм оказывали положительное действие на рост и урожай испытуемых растений.

Важно подчеркнуть, что положительный эффект от инокуляции, выраженный в процентах к контролю, был выражен существенно сильнее в условиях недостаточного увлажнения почвы. Это свидетельствовало об антистрессовом действии изучаемых штаммов, которое может проявляться в условиях засухи. Комплементарность полезных свойств у изучаемых штаммов будет способствовать усилению антистрессового эффекта и повышению стабильности положительного действия штаммов на рост инокулированных растений.

Полученные результаты показали, что заявляемый штамм способствует стимулированию роста растений, особенно в условиях недостатки влаги.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к бактериальным препаратам для стимулирования роста растений в неблагоприятных агроэкологических условиях. Предлагается штамм бактерий Variovorax paradoxus AV10, депонированный в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под № RCAM 04753, в качестве стимулятора роста растений в неблагоприятных агроэкологических условиях. Штамм способствует стимулированию роста растений, особенно в условиях недостатка влаги. 3 табл., 1 пр.

Штамм бактерий Vahovorax paradoxus AV10, депонированный в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под № RCAM 04753, в качестве стимулятора роста растений в неблагоприятных агроэкологических условиях.