ШТАММ BACILLUS PUMILUS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АНТИБИОТИК ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ АМИКУМАЦИН Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12P7/40 C12R1/07 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму, продуцирующему антибиотик широкого действия амикумацин А с высоким выходом. Изобретение позволяет расширить ассортимент штаммов для продукции антибиотиков и может быть использовано для последующего производства амикумацина А.

Рост числа случаев инфицирования резистентными штаммами микроорганизмов носит в настоящее время лавинообразный характер, бросающий вызов устойчивому развитию человечества и создающий опасность возвращения тех времен, когда основной причиной смертности являлись инфекционные заболевания. Для решения проблемы антибиотикорезистентности принципиально важен поиск новых антибиотиков, штаммов-продуцентов антибиотиков и поиск новых мишеней для ранее открытых антибиотиков. В 1982 году из Bacillus pumilus AI-77 было выделено вещество AI-77-B, которое показывало хорошую гастропротекторную активность и не обладало антихолинергическими (холинолитическими) или антигистаминными свойствами. Антибиотик амикумацин А (выделенное вещество AI-77-B) относится к гетероциклическим соединениям класса оксикумаринов (Фиг. 1). Ранее было показано, что взаимосвязь терапии язвы желудка с антибиотическим действием амикумацина А в отношении Helicobacter pilory – агента, вызывающего язву желудка (Pinchuk I.V. и др., 2001). Позднее было показано, что амикумацин А эффективен в отношении штаммов MRSA (Lama А., 2012). Установлено, что амикумацин А обладает противоопухолевой активностью (US 5925671, WO 1996027594), противовирусной активностью (US 20080161324, US 200100009970). Механизм действия амикумацина А основан на специфическом ингибировании рибосомы (Y.S. Polikanov и др., 2014), позднее было показано, что антибиотик действует как на прокариотическую, так и на эукариотическую рибосому. Применение этого вещества в качестве терапевтического средства ограничено из-за его плохой оральной абсорбции (Maddimsetti, Venkateswara, Rao и др. 2014). Этот факт требует получение стабильных аналогов амикумацина А. Химический синтез чрезвычайно затруднен вследствие наличия пяти стерео-центров (Фиг. 1). В то же врем модификация природного амикумацина представляется более реализуемой задачей. Это делает перспективным поиск штаммов-продуцентов для его последующей эффективной наработки и очистки. Амикумацин А и его близкие аналоги образуются бациллами, выделенными из различных источников, в основном B. pumilus (Itoh J. и др., 1981, 1982; Berrue F. и др., 2009, Terekhov и др. 2018) и В. subtilis (Li Y. и др, 2012; Azumi М., 2008), а также неидентифицированными до вида представителями рода Bacillus (СА2214776). Наиболее подробное описание продуцента амикумацина А дано в работе Itoh J. и др., 1981 и патенте RU 2627187, которые выбраны нами в качестве прототипа. В указанной статье штамм В. pumilus, образует смесь антибиотиков, из которых основным компонентом является амикумацин А. В патенте RU 2627187 содержание амикумацина А в культуральной жидкости, образованного в результате биосинтеза, составляет 80-110 мкг/мл.

Таким образом, техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в выявлении бактериального штамма, способного синтезировать антибиотик амикумацин А с повышенной эффективностью.

Для решения поставленной технической проблемы предлагается новый штамм-продуцент амикумацина А, выделенный из образца микробиоты ротовой полости сибирского медведя Ursus arctos collaris, с использованием технологии высокопроизводительного скрининга. Идентификация штамма произведена на основании генетической, биотехнологической, культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик. Заявляемый штамм В. pumilus AmiA_125 депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов, коллекционный номер ВКМ: В-3464D.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в высокой продуктивности штамма B. pumilus AmiA_125, ВКМ: В-3464D, способного синтезировать амикумацин А на уровне 145-170 мкг/мл в культуральной среде, что позволяет расширить ассортимент штаммов для продукции антибиотиков.

Описание настоящего изобретения

Родовое и видовое название штамма. Штамм-продуцент антибиотика амикумацин А был отнесен к Bacillus pumilus и депонирован 25 ноября 2019 года во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, находящийся по адресу: 142290, Россия, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, д.3 (ИБФМ РАН – обособленное подразделение Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований РАН (ФИЦ ПНЦБИ РАН)), с присвоенным при депонировании обозначением AmiA_125 и номером ВКМ: В-3464D.

Происхождение штамма (источник выделения, родословная). Исходный штамм выделен из образца микробиоты ротовой полости сибирского медведя Ursus arctos collaris, с использованием технологии высокопроизводительного скрининга (Terekhov и др. 2017, 2018, патент RU2656216) по поиску активности, подавляющей рост патогенного микроорганизма Staphylococcus aureus. В результате отбора был получен штамм AmiA_125, стабильно сохраняющий продукцию антибиотика после более чем 30 пересевов. При глубинном культивировании на питательной среде, следующего состава: 50 г/л глюкозы, 10 г/л бакто-триптон, 10 г/л дрожжевой экстракт, 2 г/л хлорид натрия, 3 г/л YNB, 1 г/л аммония гидроксид, 1 г/л карбоната кальция и 8.2 г/л фосфата натрия pH 7.5, штамм B. pumilus AmiA_125, ВКМ: В-3464D образует 145-170 мкг/мл амикумацина А, что превышает уровень биосинтеза штамма-прототипа, заявленного в патенте RU 2627187.

Гено- и физиолого-биохимические характеристики. Видовую генотаксономическую идентификацию проводили по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Целевой ген амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенировали и сопоставляли полученную последовательность с аналогичными последовательностями типовых штаммов рода Bacillus, хранящихся в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Совпадение последовательности гена 16S рРНК штамма ВКМ: В-3464D с аналогичными генными последовательностями типовых штаммов вида Bacillus pumilus составляет более 98% (Таблица 1), что подтверждает принадлежность заявляемого штамма к виду B. pumilus. Последовательность гена 16S рРНК штамма ВКМ: В-3464D депонирована в GenBank под номером MN650262.1. Штамм ВКМ: В-3464D является факультативный анаэробом ауксотрофом, культивируется на минимальной синтетической среде и не требует для роста внесения аминокислот или биотина в отличие от некоторых других бацилл. Утилизирует сахарозу, глюкозу, фруктозу, практически не гидролизует крахмал.

Культурально-морфологические характеристики. Грамположительные, эндоспорообразующие, подвижные, прямые палочки, 1.2 × 4.6 мкм. На агаризованной среде Лурье-Бертрана, содержащей 10 г/л бакто-триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 10 г/л хлорид натрия, 1% агар-агара при температуре 30°C штамм ВКМ: В-3464D образуют бежевые крупные матовые колонии с неровным краем, экзопигмент отсутствует. На вторые сутки культивирования на агаризованной среде начинается формирование эндоспор, характерных для бактерий рода Bacillus. Штамм ВКМ: В-3464D хорошо растет в диапазоне температур 22-37°C, формируя крупные колонии; при температуре 60°C роста нет.

Биотехнологическая характеристика (условия культивирования; название и свойства полезного вещества, продуцируемого штаммом; уровень активности (продуктивности)). Штамм ВКМ: В-3464D образует антибиотик амикумацин А (Фиг. 1) при культивации в среде 50 г/л глюкозы, 10 г/л бакто-триптон, 10 г/л дрожжевой экстракт, 2 г/л хлорид натрия, 3 г/л YNB, 1 г/л аммония гидроксид, 1 г/л карбоната кальция и 8.2 г/л фосфата натрия, pH 7.5. Колбы объемом 750 мл со 50 мл среды засевали суспензией клеток в количестве 10⁶ клеток/колбу. Культивацию проводили в условиях аэрирования на роторной качалке со скоростью вращения 220 об/мин при 30°C в течение 24 часов. Продуктивность штамма означает содержание амикумацина А в единице объема культуральной жидкости, образовавшегося в результате биосинтеза при культивировании штамма В. pumilus AmiA_125, ВКМ: В-3464D и составляет 145-170 мкг/мл амикумацина А, что превышает уровень биосинтеза штамма-прототипа.

Определение антимикробного спектра и минимальной ингибирующей концентрации (MIC) амикумацина А. В качестве стандарта использовали очищенный с помощью ВЭЖХ до чистоты более 99% амикумацин А. Из Фиг. 2 следует, что амикумацин эффективен в отношении грамположительных бактерий, а именно штаммов S. aureus, независимо от наличия или отсутствия метициллинрезистентности, Macrococcus caseolyticus, Weissella confusa, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Aerococcus viridans, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus casseliflavus, а также грамотрицательных бактероидов Bacteroides vulgatus. Во всех перечисленных случаях MIC составлял меньше 10 мкг/мл.

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:

Фиг. 1. Химическая структура амикумацина А.

Фиг. 2. Определение антимикробного спектра и минимальной ингибирующей концентрации амикумацина А.

Таблица 1. Сравнение последовательности гена 16S рРНК (GenBank: MN650262.1) штамма ВКМ: В-3464D с аналогичными генными последовательностями типовых штаммов Bacillus pumilus.

Таблица 1

Описание последовательности Номер Идентичность, % Bacillus pumilus 16S ribosomal RNA gene, partial sequence DQ105967.1 99.793 Bacillus pumilus strain ATCC 7061 16S ribosomal RNA gene, partial sequence AY876289.1 99.721 Bacillus pumilus strain 001T 16S ribosomal RNA gene, partial sequence FJ477095.1 98.295

Далее настоящее изобретение поясняется примерами, которые служат его иллюстрацией и не ограничивают области охвата настоящего изобретения, изложенной в формуле изобретения.

ПРИМЕР 1

В 12 колб Эрленмейера объемом 750 мл вносят по 50 мл среды следующего состава: 50 г/л глюкозы, 10 г/л бакто-триптон, 10 г/л дрожжевой экстракт, 2 г/л хлорид натрия, 3 г/л YNB, 1 г/л аммония гидроксид, 1 г/л карбоната кальция и 8.2 г/л фосфата натрия pH 7.5 и стерилизуют 45 мин в автоклаве. Из суспензии клеток ночной культуры со штаммом ВКМ: В-3464D вносят 10⁶ клеток в каждую колбу. Колбы помещают на роторную качалку со скоростью вращения 220 об/мин при температуре 30°C.

Через 24 ч культуральную жидкость из 12 колб объединяют, общий объем культуральной жидкости составляет 0,56 л. Клетки из культуральной жидкости осаждают центрифугированием на центрифуге Beckman Avanti JСE (фирма Beckman Coulter, США). Надосадочную жидкость фильтруют и добавляют этилацетат в соотношении 1:1= об.:об.. Экстракт упаривают досуха и растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученный препарат наносят на ВЭЖХ Zorbax C8 (Agilent) и фракционируют с использованием смеси буфера 1 (20 мМ NH₄OAc pH 5.0, 5% AсCN), буфер 2 (20 мМ NH₄OAc pH 5.0, 80% AсCN) при скорости потока 5 мл/мин. Окончательную очистку проводят с использованием ВЭЖХ колонки Symmetry C18 (Waters) смесью буферов 1 и 2 при скорости 1 мл/мин, и использовании линейного градиента 0–3 мин (100% буфер 1, 0% буфер 2), 3–4 мин (0–30% буфер 2), 4–11 мин (30–37% буфер 2), 11–12 мин (37–100% буфер 2). Детекцию ведут при длине волны 315 нм. Элюат упаривают, лиофилизируют и растворяют в метаноле. Количественное определение очищенного амикумацина А проводят спектрофотометрически с использованием коэффициента экстинкции, ε _{315nm, MeOH} = 4380 М^-1см^-1. Продуктивность штамма рассчитывают по формуле

П (мг/л) = A_AmiA×V_AmiA×423.47×1000/(4380×0.56), где

A_AmiA× - значение оптической плотности при спектрофотометрическом определении концентрации при длине волны 315 нм

V_AmiA× - объем пробы после очистки,

423.47 - молекулярный вес амикумацина А, г/моль,

0.56 - объем культуральной жидкости после продукции, л,

4380 - коэффициент экстинкции при длине волны 315 нм, М^-1см^-1.

В результате трех последовательных наработок средняя продуктивность штамма B. pumilus AmiA_125, ВКМ: В-3464D в условиях культивирования в колбах Эрленмейера составляет 158 мг/л.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus pumilus ВКМ В-3464D, полученный методом скрининга микробиоты ротовой полости сибирского бурого медведя Ursus arctos collaris, обладает способностью синтезировать антибиотик амикумацин А широкого спектра действия. Изобретение обеспечивает расширение арсенала штаммов, продуцирующих антибиотики. 1 табл., 1 пр., 2 ил.

Штамм Bacillus pumilus AmiA_125, ВКМ В-3464D, полученный методом скрининга микробиоты ротовой полости сибирского бурого медведя Ursus arctos collaris, способный синтезировать антибиотик широкого спектра действия амикумацин А.