Штамм бактерий Bacillus licheniformis - продуцент кератиназы Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для переработки кератинсодержащего сырья, преимущественно кератина пера, полученного от птицеперерабатывающей промышленности.

Кератин представляет собой волокнистый и нерастворимый структурный белок, сильно сшитый дисульфидными, водородными и гидрофобными связями, что обеспечивает механическую стабильность и устойчивость к действию распространенных протеолитических ферментов, таких как пепсин, трипсин и папаин. Кератинолитические ферменты имеют важное применение в биотехнологических процессах для разработки экологически чистых процессов и для обработки кератинсодержащих отходов птицеводческой и кожевенной промышленности. После гидролиза перья можно использовать в качестве удобрения, кормовой добавки, обогащенной такими аминокислотами, как серии, цистеин и пролин. Процесс обработки кератиназой заменяет использование сульфида натрия в процессе удаления волос в кожевенной промышленности [Radha, S., & Gunasekaran, P. (2007). Cloning and expression of keratinase gene in Bacillus megateriumand optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain. Journal of Applied Microbiology, 103(4), 1301-1310. doi: 10.1111/j.1365-2672.2007.03372.x].

Известен способ получения кератинового монопродукта, предназначенного для использования в ветеринарии, медицине, косметологии, биотехнологии, пищевой промышленности, а также в качестве белковой кормовой добавки к основному рациону животных и птиц, заключающийся в том, что исходный кератинсодержащий материал обрабатывают раствором соляной кислоты и пероксида водорода (см. RU 2679884 С1, опубл. 14.02.2019, Бюл. №5, МПК С08Н 1/06, A23K 10/26).

Однако представленный образец разрушает кератин пера в экстремальных условиях химического гидролиза, которые могут привести к потере незаменимых аминокислот, таких как лизин, метионин и триптофан; между тем, эти условия могут вызывать образование непитательных аминокислот, таких как лизиноаланин, лантионин и др. Указанный недостаток решается благодаря обработки пера ферментами, а также микроорганизмами, включая бактерии, актиномицеты, грибы.

Благодаря широкому спектру активности кератиназы считаются эффективной альтернативой химическим и термическим способам обработки вторичных отходов различных промышленных производств, богатых белком [Akram, F., ul Haq, I., & Jabbar, Z. Production and characterization of a novel thermo-and detergent stable keratinase from Bacillus sp. NKSP-7 with perceptible applications in leather processing and laundry industries. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 164: 371-383. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.07.146]. Микробные кератинолитические ферменты позволяют расщеплять кератин в мягких условиях, в результате чего образуются гидролизаты кератина, содержащие неповрежденные аминокислоты и пептиды [Holkar, С.R., Jain, S.S., Jadhav, A.J., & Pinjari, D.V. Valorization of keratin-based waste. Process Safety and Environmental Protection, 2018, 115: 85-98. doi: 10.1016/j.psep.2017.08.045].

Bacillus licheniformis BBE 11-1 и Stenotrophomonas maltophilia BBE 11-1 были использованы для разложения 50 г/л отходов куриного пера. Скорость разложения составила 35,4% и 22,8% за 96 ч, соответственно. Скорость деградации при совместном использовании культур достигла 55,2% из-за более высокой активности кератиназы и протеазы. При совместном культивировании в ферментере объемом 3 л при контроле растворенного кислорода и температуры скорость деградации была значительно увеличена до 81,8%, а коэффициент конверсии составил 70,0% за 48 ч. Гидролизаты проявляли антиоксидантную активность и содержали большое количество аминокислот (895,89 мг/дл3) и растворимых пептидов [Peng, Z., Мао, X., Zhang, J., Du, G., & Chen, J. Effective biodegradation of chicken feather waste by co-cultivation of keratinase producing strains. Microbial cell factories, 2019, 18(1), 84. doi: 10.1186/s12934-019-1134-9].

Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis-60 BKM B-2366 Д - продуцент щелочной протеазы (см. RU 2303066 С1, опубл. 20.07.2007, Бюл. №20, МПК C12N 9/56, C12N 1/20, C12R 1/66). Однако штамм Bacillus licheniformis-60 обладает высокой продуктивностью преимущественно в отношении комплекса щелочных протеаз, необходимых для гидролиза растительных белков, и гораздо в меньшей степени в отношении фермента кератиназы, специфично гидролизующего кератиноподобные белки которые отличаются устойчивостью к деградации обычными протеолитическими ферментами.

Известен штамм Bacillus licheniformis BKM В-2220Д - продуцент кератиназы (сериновой протеазы), раскрытый в патенте RU 2177994 С2, опубл. 10.01.2002, Бюл. №1, МПК C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/10, который может быть использован в микробиологической промышленности для производства ферментных препаратов, применяемых в легкой промышленности и в сельском хозяйстве, где требуется гидролиз нативного кератина. Штамм Bacillus licheniformis BKM В-222ОД обладает повышенной способностью к биосинтезу кератиназы и продуцирует не менее шести внеклеточных ферментов, в том числе щелочную протеазу и а-амилазу, которые усиливают гидролизующий эффект кератиназного препарата. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 40°С в течение 48-72 ч, рН среды 7,5-7,8.

Однако для штамма Bacillus licheniformis BKM В-2220Д нет информации о возможности его роста на питательной среде с единственным источником углерода в виде пера птицы.

Были выделены четыре микроорганизма Bacillus licheniformis В-740, Bacillus pumilus В-508, Bacillus subtilis АТСС 6051 и Streptomyces albidoflavus АТСС 25422, обладающие максимально выраженными производственными признаками: концентрация биомассы при культивировании данных штаммов равнялась 335,0 1×10^-3 КОЕ/г, уровень кератинолитической активности продуцируемых штаммами ферментов - в среднем 30 Е/мг белка, показатель накопления белка в биомассе от 65,2 до 76,5% и степень гидролиза белка от 78,4 до 79,4% [Дмитриева А.И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. №4 С. 602-615].

Однако для данных штаммов Bacillus licheniformis В-740, Bacillus pumilus В-508, Bacillus subtilis АТСС 6051 и Streptomyces albidoflavus АТСС 25422 не предоставлена информации о возможности их культивировать на питательной среде с единственным источником углерода в виде пера птицы.

Известны штаммы Bacillus licheniformis O.W.U. 138В и 88В, а также другие штаммы, способные разлагать перо диких птиц. Например, штаммы и кератиназы, продуцируемые этими штаммами, полезны для деградации отходов пера, полученных при промышленной переработке домашней птицы; производства кормов для животных, удобрений или природного газа из отходов птицеводства; и чистки некоторых тканей (см. US 5877000 А, опубл. 02.03.1999, МПК C12N 9/56, US 6214576 В1, опубл. 10.04.2001, МПК C12N 9/56).

Однако представленные образцы штаммов Bacillus licheniformis О. W.U. 138В и 88В не могут расти на питательной среде с единственным источником углерода в виде пера птицы.

Наиболее близким аналогом к заявляемому штамму по совокупности существенных признаков и достигаемому техническому результату является штамм Bacillus licheniformis БАЛ-1, депонированный в Биоресурсный Центр Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКГТМ) НИЦ Курчатовский институт под номером В-14243, дата депонирования 30 мая 2022 года.

При выращивании на питательной среде с внесением единственного источника углерода в виде пера птицы конечная концентрация клеток достигает 1×10⁶ КОЕ/мл. При ферментации пера в течение 72 ч при 28°С и постоянном перемешивании имеет кератиназную активность 16,2 KU/мл.

Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-1 не обладает достаточной кератиназной активностью и спектром выделяемых кератиназ для разрушения свободных кератинов в культуральной жидкости, имеет большое количество фенотипов, появляющихся в процессе ферментации.

Задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении нового штамма Bacillus licheniformis, продуцирующего кератиназу, способную перерабатывать перо сельскохозяйственной птицы.

Согласно ГОСТ 18473-88 Птицеводство. Термины и определения: к сельскохозяйственной птице относится птица, разводимая с целью получения от нее яиц, мяса, пера, пуха. Так, к сельскохозяйственной птице относятся: куры, индейки, цесарки, утки, гуси, перепела и голуби.

Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении нового штамма Bacillus licheniformis - продуцента кератиназы, способного ферментировать перо до аминокислот и пептидов в среде с единственным источником углерода в виде пера сельскохозяйственной птицы.

Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ Курчатовский институт под номером В-14244, дата депонирования 30 мая 2022 года. Штамм способен храниться в лиофильном виде при температуре 4-6°С.

Условия хранения штамма.

Полученный из коллекции штамм высевают в условиях асептики на триптиказеино-соевый агар (г/л): триптон - 17; соевый пептон - 3; хлорид натрия - 5; фосфат калия двузамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; вода очищенная - до 1000 мл; агар - 12. Среду автоклавируют при 121°С 15 мин.

На данной питательной среде штамм способен храниться в течении одного месяца при температуре 2-8°С.

Характеристика штамма.

Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 является природным изолятом, выделен из естественных условий - воды Балтийского залива.

Факультативный анаэроб. Температурный диапазон роста - 10-55°С, колонии на триптиказеино-соевом агаре слабовыпуклые, сухие, непрозрачные, белесые, полиморфные, диаметром 5-7 мм, врастающие в питательную среду.

Клетки представляют собой грамположительные одиночные подвижные палочки размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мкм, спорообразующие. Оптимальная температура роста 28°С. В логарифмической фазе роста образуются цепочки из 2-3-х клеток более вытянутой формы. В стационарной фазе роста цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму. Штамм гидролизует казеин и крахмал, разжижает желатин.

Идентификация штамма Bacillus licheniformis БАЛ-2 была проведена на основании морфологических и физиолого-биохимических характеристик. Также была определенна нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК. Гомология с нуклеотидной последовательностью гена 16S рРНК штамма Bacillus licheniformis QT445 составила 97,06%.

Вид Bacillus licheniformis одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) как GRAS (Generally Recognized As Safe), что означает, что штаммы этого вида, как и продуцируемые ими протеазы, могут безопасно и без ограничений применяться для пищевых биотехнологий [URL: https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=GRASNotices&sort=GRN_No&order=DESC&startrow=1&type=basic&search=Bacillus%201icheniformis (дата обращения 01.08.2023)].

Штамм способен расти на среде с единственным источником углерода в виде пера сельскохозяйственной птицы. В колбу, содержащую 100 мл минерально-питательной среды (состав среды в г/л: фосфат калия однозамещенный - 2, сульфат аммония - 2, сульфат магния семиводный - 0,125, хлорид натрия - 0,5, сульфат железа (II) семиводный - 0,002, вода очищенная - до 100 мл, рН среды 7,5) вносили 5 г измельченного пера сельскохозяйственной птицы, а также штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2. Инокулят штамма Bacillus licheniformis вносился до конечной концентрации 1×10⁶ КОЕ/мл. Ферментация пера проводилась в течение 72 ч при температуре 28°С при постоянном перемешивании. По окончании процесса ферментации визуально наблюдалось изменение оптической плотности (помутнение среды), что свидетельствовало об увеличении количества микроорганизмов в культуральной среде. Кроме того, было замечено изменение консистенции перьевого сырья в сторону повышения пластичности (размягчения), что представлено на фиг. 1.

Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 не заменяется фенотипами, появляющимися во время ферментации, является продуцентом кератиназ. Кератиназная активность штамма составляет 18,3 KU/мл.

Кератиназную активность штамма определяли следующим образом: раствор кератина готовили по Grywnowicz et al., 1989. Образец перьев сельскохозяйственной птицы весом 10 г нагревали в обратном холодильнике при температуре 100°С в течение 2 ч с 500 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Кератин, экстрагированный ДМСО, содержал 1-2% белка. Солюбилизированный кератин осаждали добавлением двух объемов холодного ацетона с температурой - 90°С на объем раствора кератина. Эту смесь оставляли в холодильнике на 2 ч, чтобы обеспечить максимальное осаждение кератина. По истечении этого времени смесь центрифугировали при 6000 g, а затем осадок промывали четырьмя объемами воды на объем осадка. Затем осадок суспендировали в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0 или рН 8,0.

Протеолитическую активность субстрата из кератина перьев (KS) измеряли с использованием суспензии кератина, содержащей 2% белка в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, с 0,01 М MgCl₂. Порцию 1 мл раствора фермента добавляли к 1 мл суспензии KS в реакционном буфере. После 1 ч инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 2 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, после чего раствор фильтровали. Одна единица протеолитической активности определялась как количество фермента, которое вызывало увеличение поглощения на 0,01 между образцом и контролем при 280 нм. Контроль: 1 мл суспензии KS в реакционном буфере после 1 ч инкубации с добавлением 2 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора фермента.

Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 способен разлагать кератин пера до незаменимых аминокислот, что подтверждается данными тонкослойной бумажной хроматографии (фиг. 2). Было выявлено присутствие следующих аминокислот в культуральной жидкости ферментированного сырья: лизин, метионин, треонин, валин, фенилаланин. Наблюдалась большая цветовая насыщенность пятен аминокислот в культуральной жидкости штамма Bacillus licheniformis БАЛ-2, указывающая на большую степень деградации кератина до аминокислот.

Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 способен переводить неусвояемый кератин в перевариваемые пептиды, что подтверждено методом двумерного электрофореза с масс-спектрометрией ферментированного пера (фиг. 3).

Преимущество нового ферментного концентрата заключается в эффективном воздействия на перо сельскохозяйственной птицы с целью деградации пера до перевариваемых белков и незаменимых аминокислот.

Применение нового ферментного концентрата существенно повысит степень рентабельности производства за счет снижения себестоимости кормового сырья, полученного от деградации измельченного пера сельскохозяйственной птицы, и обогащения незаменимых аминокислотами, появившимися в процессе деградации.

Пример 1.

В колбу, содержащую 100 мл минерально-питательной среды (состав среды в г/л: фосфат калия однозамещенный - 2, сульфат аммония - 2, сульфат магния семиводный - 0,125, хлорид натрия - 0,5, сульфат железа (II) семиводный - 0,002, рН 7,5) вносили 5 г измельченного пера сельскохозяйственной птицы, а также штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2. Посевной материал штамма Bacillus licheniformis вносился до конечной концентрации 1×10⁶ КОЕ/мл. Ферментация пера проводилась в течение 72 ч при 28°С.

Последующий пересев в колбы на 750 мл со средой, состоящей из следующих компонентов сухих веществ (г/л): измельченное перо - 50; фосфат калия однозамещенный - 2,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния семиводный - 0,125; хлорид натрия - 0,5; сульфат железа (2) семиводный - 0,002; вода очищенная - до 250 мл.

Пересев осуществляют при рН, равном 7,5; температуре 26-28°С; при скорости вращения мешалки - 160-180 об/мин. Кератиназная активность через 72 ч культивирования составила 23,6 KU/мл.

Пример 2.

Культивирование осуществляется в промышленном ферментере. Перо сельскохозяйственной птицы измельчается в промышленной мясорубке до фракции 1-2 мм.

Перед внесением инокулята происходит мойка и стерилизации ферментера - пустой ферментер наполняют горячей водой 90-95°С, мойка проходит в течение 30 минут. Затем в течение 30 минут аппараты промывают 3-5% раствором кальцинированной соды, после их ополаскивают горячей водой с температурой 70-85°С.

Состав среды для накопления инокулята (г/л): измельченное перо сельскохозяйственной птицы - 50; фосфат калия однозамещенный - 2,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния семиводный - 0,125; хлорид натрия - 0,5; сульфат железа (2) семиводный - 0,002. Посевной материал получают как описано в примере 1. Посевной материал вносят до конечной концентрации 1×10⁶ КОЕ/мл; время выращивания посевного материала - 36,5 ч; при рН 7,5; температуре 28°С; скорость работы мешалки 39,5 об/ч. Кератиназная активность определялась через 36,5 ч культивирования и составила 32,4 KU/мл.

Пример 3.

Культивирование осуществляется в промышленном ферментере. Получали посевной материал как описано в примере 2, расход посевного материала для ферментера рассчитывается к полезному объему ферментера и составляет 5%, время ферментации 72 ч при скорости мешалки 80 об/ч, при избыточном давлении 40 кПа, непрерывной аэрации среды стерильным воздухом (расход воздуха 60 м³/л среды в час). Посевная линия и штуцер отбора проб в течение всего периода ферментации должен находится под паром. При нормальных условиях роста конечное значение рН среды должно быть 6,9-7,2 при температуре 28°С.

Питательная среда для ферментера компонуется в реактор-смеситель, подается через нагревательную колонку и выдерживатель. Состав среды сухих веществ (г/л): пера сельскохозяйственной птицы - 50; фосфат калия однозамещенный - 2,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния семиводный - 0,125; хлорид натрия - 0,5; сульфат железа (2) семиводный - 0,002. Куриное перо измельчалось аналогично примеру 2.

Количество вносимого измельченного сырья рассчитывается как содержание абсолютно сухого вещества (измельченного сырья), умноженного на фактическую влажность и внесенного в ферментер в двойном количестве, - при влажности сырья в 65,7% и содержании абсолютно сухих веществ 50 г/л будет вноситься: 171,6 г/л.

Кератиназная активность определялась через 72 ч культивирования и составила 48,6 KU/мл.

Пример 4.

Полученную культуральную среду, как описано в примере 3, очищают от компонентов среды и бактериальной биомассы методом фильтр-пресса для последующего концентрирования в вакуум-выпарных установках при температуре 50-55°С до 1/4 объема содержания сухих веществ. Полученный данным способом концентрат обладает кератиназной активность 291,6 KU/мл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для переработки кератинсодержащего сырья, преимущественно кератина пера, полученного от птицеперерабатывающей промышленности. Предложен штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 ВКПМ В-14244 - продуцент кератиназы. Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 является природным изолятом, выделен из естественных условий - воды Балтийского залива. Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении нового штамма Bacillus licheniformis - продуцента кератиназы, способного ферментировать перо до аминокислот и пептидов в среде с единственным источником углерода в виде пера сельскохозяйственной птицы. 3 ил.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis БАЛ-2 ВКПМ В-14244 - продуцент кератиназы.