СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS Российский патент 2020 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, биологии и биотехнологии, а именно к выделению вирулентных бактериофагов.

Применение вирулентных бактериофагов является альтернативой или дополнением использования антибиотиков и других антибактериальных средств. Однако в связи с возможностью развития фагоустойчивости бактерий необходим постоянный поиск новых природных, натуральных вирулентных бактериофагов.

В контексте настоящего описания природное происхождение вирулентных (или, иначе, литических бактериофагов) обозначается с учетом общепринятых синонимичных терминов: бактериофаг дикого типа, натуральный бактериофаг, природный бактериофаг, немодифицированный бактериофаг, немодифицированная форма бактериофага.

Природные вирулентные бактериофаги имеют более широкие возможности применения, чем генетически модифицированные (Моуе Z.D., Woolston J., Sulakvelidze A. Bacteriophage applications for food production and processing // Viruses. - 2018. - Vol. 10, №4. - Article 205. - DOI: 10.3390/v10040205; Verbeken G., Pirnay J.-P., Lavigne R., Jennes S., De Vos D., Casteels M., Huys I. Call for a dedicated European legal framework for bacteriophage therapy // Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. -2014. - Vol. 62(2). - P. 117-129. - DOI: 10.1007/s00005-014-0269-y). Кроме того, природные, немодифицированные вирулентные фаги являются не только первоначальной основой для фагосодержащей продукции, но и носителями генетической информации, позволяющей разрабатывать генетически-модифицированные фаги.

Уровень техники

Важным направлением поиска природных вирулентных бактериофагов является выделение бактериофагов, эффективных в отношении бактерий, образующих биопленки, так как в биопленках проявляется феномен повышенной, не обусловленной генетически антибиотикотолерантности бактерий, а также может снижаться эффективность применения бактериофагов (Галимзянов Х.М., Башкина О.А., Досмуханова Э.Г., Абдрахманова P.O., Демина Ю.З., Даудова А.Д., Алешкин А.В., Несвижский Ю.В., Рыбкин B.C., Афанасьев С.С., Чикобава М.Г., Аршба И.М., Рубальский М.О., Рубальский Е.О. Клиническое значение биопленкообразования у бактерий // Астраханский медицинский журнал. - 2018. - Т. 13, №4. - С. 32-42; Abedon S.T. Bacteriophage exploitation of bacterial biofilms: phage preference for less mature targets? // FEMS microbiology letters. - 2016. - Vol. 363, N 3. - PII fnv246. - DOI: 10.1093/femsle/fnv246; Levin-Reisman I., Ronin I., Gefen O., Braniss I., Shoresh N., Balaban N.Q. Antibiotic tolerance facilitates the evolution of resistance // Science (New York, N.Y.). - 2017. - Vol. 355, №6327. - P. 826-830; Stewart P.S. Antimicrobial tolerance in biofilms // Microbiology spectrum. - 2015. - Vol. 3, №3. - URL: http://www.asmscience.org/content/journal/ microbiolspec/10.1128/microbiolspec.MB-0010-2014).

Одними из наиболее распространенных биопленкообразующих возбудителей бактериальных инфекций являются золотистые стафилококки - Staphylococcus aureus (Manandhar S., Singh A., Varma A., Pandey S., Shrivastava N. Biofilm producing clinical Staphylococcus aureus isolates augmented prevalence of antibiotic resistant cases in tertiary care hospitals of Nepal // Frontiers in microbiology. - 2018. - Vol. 27, №9. - Article 2749. - DOI: 10.3389/fmicb.2018.02749$ Kwiecinski J.M, Jacobsson G., Horswill A.R., Josefsson E., Jin T. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates correlates with the infection type // Infectious diseases (London, England). - 2019. - Vol. 51, №6. - P. 446-451. - DOI: 10.1080/23744235.2019.1593499).

Известен вирулентный бактериофаг Staphylococcus aureus SA18, относящийся к семейству Myoviridae, выделенный из клинического материала (RU 2503716 С1, 10.01.2014).

Основным недостатком известного аналога является отсутствие эффективного действия на бипленкообразующие изоляты Staphylococcus aureus.

Из уровня техники известен способ выделения штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA20, способного разрушать биопленки, сформированные различными штаммами Staphylococcus aureus. Согласно описанию изобретения, данный способ заключается в выделении бактериофага из мазков зева и миндалин добровольцев (RU 2565824 С1, 20.10.2015).

Основным недостатком известного способа является единичное получение штамма бактериофага, эффективного против биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения -прототипом - является известный способ получения бактериофага (RU 2613423 С1, 16.03.2017), при использовании которого на полученный газон культуры штамма-хозяина Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, вместо маточного бактериофага засевали биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом.

Недостатком данного аналога является недостаточная эффективность выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок.

Решаемой технической проблемой в настоящем изобретении является разработка способа, направленного на повышение эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок.

Раскрытие сущности изобретения

Достигаемым техническим результатом является увеличение эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок, при использовании в качестве источника бактериофагов клинически значимых для хронического инфекционного процесса биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, высеянных из доступного, распространенного клинического материала.

Достижение указанного технического результата обусловлено следующей совокупностью существенных признаков:

биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом, засевают на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубируют посев при 36-37°С в течение 20-24 часов,

отбирают выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендируют их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубируют полученную суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов,

добавляют к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1-10 мкг, после чего дополнительно инкубируют суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов при периодическом встряхивании,

добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл,

последовательно инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут,

отбирают супернатант в стерильную пробирку, инкубируют его при комнатной температуре в течение 1-2 часов, затем сеют по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10^-2-10^-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, последовательно инкубируют посев при 36-37°С в течение 18-24 часов, отбирают изолированные бляшки, суспендируют их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл,

инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, затем центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.

Из литературы и практики использования реакций амплификации нуклеиновых кислот неизвестно о способе выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, который был бы идентичен разработанному нами.

Разработанный способ выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus апробирован в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России).

Было проведено сравнительное исследование характеристик, полученных при использовании разработанного нами способа выделения вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus и способа, согласно ближайшему аналогу. Результаты представлены в таблице 1.

Как следует из приведенной таблицы 1, эффективность выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus согласно разработанному способу выше, чем у способа-прототипа.

Кроме того, были проведены исследования в сравнении с выделением природных вирулентных бактериофагов без применения митомицина С из одинаковых биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, выделенных из удаленных миндалин больных хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом. Результаты данной апробации приведены в таблице 2.

Как следует из приведенной таблицы 2, при использовании разработанного способа были выделены немодифицированные, природные вирулентные бактериофаги Staphylococcus aureus из 5 биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, из которых при предварительных попытках выделения бактериофагов без митомицина С бактериофаги выделены не были.

Таким образом, указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - увеличения эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок, при использовании в качестве источника бактериофагов клинически значимых для хронического инфекционного процесса биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, высеянных из доступного, распространенного клинического материала.

Осуществление изобретения

Сущность изобретения поясняется на ряде примеров, наглядно демонстрирующих увеличение эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок, при использовании в качестве источника бактериофагов клинически значимых для хронического инфекционного процесса биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, высеянных из доступного, распространенного клинического материала. При этом приведенные примеры способа выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Для выделения природного вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus, активного в отношении стафилококковых биопленок, использован биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus 7зев14, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, являющихся доступным, распространенным клиническим материалом. Предварительная попытка выделения бактериофагов из используемого биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus без применения митомицина С не была эффективной, то есть бактериофаги выделены не были.

Для повышения эффективности выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus используемый биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, засевали на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубировали посев при 36°С в течение 24 часов, отбирали выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендировали их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубировали полученную суспензию при 36°С в течение 2,5 часов, затем добавляли к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 10 мкг, после чего дополнительно инкубировали суспензию при 36°С в течение 2,5 часов при периодическом встряхивании, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,6 мл, после чего последовательно инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут, центрифугировали инкубированную суспензию при 4000 об./мин в течение 30 минут, отбирали супернатант в стерильную пробирку, инкубировали его при комнатной температуре в течение 2 часов, затем сеяли по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10^-2-10^-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus АТСС 19685, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубировали посев при 36°С в течение 24 часов, отбирали изолированные бляшки, суспендировали их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,6 мл, после этого инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут, затем центрифугировали инкубированную суспензию при 4000 об./мин в течение 30 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.

Выделенный штамм стафилококкового бактериофага был активен в отношении стафилококковых биопленок. Проведенный биоинформатический анализ полногеномной нуклеотидной последовательности выделенного штамма бактериофага доказал его вирулентность. В результате сравнительного биоинформатического анализа, показавшего идентичность генома вирулентного бактериофага, находящегося в культуре использованного биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus, не подвергавшегося воздействию митомицина С, и генома выделенного вирулентного стафилококкового бактериофага, установлено отсутствие мутаций в геноме выделенного вирулентного бактериофага в результате воздействия митомицина С, что подтверждает выделение немодифицированной формы вирулентного стафилококкового бактериофага согласно предлагаемому способу.

Пример 2. Для выделения природного вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus, активного в отношении стафилококковых биопленок, использован биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus 9зев14, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, являющихся доступным, распространенным клиническим материалом. Предварительная попытка выделения бактериофагов из используемого биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus без применения митомицина С не была эффективной, то есть бактериофаги выделены не были.

Для повышения эффективности выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus используемый биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, засевали на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубировали посев при 36,5°С в течение 22 часов, отбирали выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендировали их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубировали полученную суспензию при 36,5°С в течение 2,3 часов, затем добавляли к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 5 мкг, после чего дополнительно инкубировали суспензию при 36,5°С в течение 2,3 часов при периодическом встряхивании, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,55 мл, после чего последовательно инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 25 минут, центрифугировали инкубированную суспензию при 4500 об./мин в течение 25 минут, отбирали супернатант в стерильную пробирку, инкубировали его при комнатной температуре в течение 1,5 часов, затем сеяли по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10^-2-10^-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus 2072, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубировали посев при 36,5°С в течение 22 часов, отбирали изолированные бляшки, суспендировали их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,55 мл, после этого инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 25 минут, затем центрифугировали инкубированную суспензию при 4500 об./мин в течение 25 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.

Выделенный штамм стафилококкового бактериофага был активен в отношении стафилококковых биопленок. Проведенный биоинформатический анализ полногеномной нуклеотидной последовательности выделенного штамма бактериофага доказал его вирулентность. В результате сравнительного биоинформатического анализа, показавшего идентичность генома вирулентного бактериофага, находящегося в культуре использованного биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus, не подвергавшегося воздействию митомицина С, и генома выделенного вирулентного стафилококкового бактериофага, установлено отсутствие мутаций в геноме выделенного вирулентного бактериофага в результате воздействия митомицина С, что подтверждает выделение немодифицированной формы вирулентного стафилококкового бактериофага согласно разработанному способу.

Пример 3. Для выделения природного вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus, активного в отношении стафилококковых биопленок, использован биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus 2аден, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом, являющихся доступным, распространенным клиническим материалом. Предварительная попытка выделения бактериофагов из используемого биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus без применения митомицина С не была эффективной, то есть бактериофаги выделены не были.

Для повышения эффективности выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus используемый биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом, засевали на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубировали посев при 37°С в течение 20 часов, отбирали выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендировали их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубировали полученную суспензию при 37°С в течение 2 часов, затем добавляли к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1 мкг, после чего дополнительно инкубировали суспензию при 37°С в течение 2 часов при периодическом встряхивании, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5 мл, после чего последовательно инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 30 минут, центрифугировали инкубированную суспензию при 5000 об./мин в течение 20 минут, отбирали супернатант в стерильную пробирку, инкубировали его при комнатной температуре в течение 1 часа, затем сеяли по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10^-2-10^-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus АТСС 12600, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубировали посев при 37°С в течение 20 часов, отбирали изолированные бляшки, суспендировали их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5 мл, после этого инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугировали инкубированную суспензию при 5000 об./мин в течение 20 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.

Выделенный штамм стафилококкового бактериофага был активен в отношении стафилококковых биопленок. Проведенный биоинформатический анализ полногеномной нуклеотидной последовательности выделенного штамма бактериофага доказал его вирулентность. В результате сравнительного биоинформатического анализа, показавшего идентичность генома вирулентного бактериофага, находящегося в культуре использованного биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus, не подвергавшегося воздействию митомицина С, и генома выделенного вирулентного стафилококкового бактериофага, установлено отсутствие мутаций в геноме выделенного вирулентного бактериофага в результате воздействия митомицина С, что подтверждает выделение немодифицированной формы вирулентного стафилококкового бактериофага согласно разработанному способу.

Изобретение относится к медицине, биологии и биотехнологии. Способ выделения вирулентных бактериофагов включает следующие стадии: биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом засевают на поверхность стерильного LB-агара, инкубируют при 36-37°С в течение 20-24 часов, отбирают выросшие колонии, суспендируют их в стерильном LB-бульона, инкубируют суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов, затем добавляют к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1-10 мкг, после чего дополнительно инкубируют при периодическом встряхивании, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, после чего последовательно инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут, отбирают супернатант в стерильную пробирку, инкубируют его при комнатной температуре в течение 1-2 часов, затем сеют по Грациа в разведениях 10^-2-10^-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, последовательно инкубируют посев при 36-37°С в течение 18-24 часов, отбирают изолированные бляшки, суспендируют их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, снова инкубируют полученную суспензию, центрифугируют и отбирают супернатант. Способ позволяет увеличить эффективность выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок. 2 табл., 3 пр.

Способ выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, отличающийся тем, что биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом, засевают на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубируют посев при 36-37°С в течение 20-24 часов, отбирают выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендируют их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубируют полученную суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов, затем добавляют к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1-10 мкг, после чего дополнительно инкубируют суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов при периодическом встряхивании, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, после чего последовательно инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут, отбирают супернатант в стерильную пробирку, инкубируют его при комнатной температуре в течение 1-2 часов, затем сеют по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10^-2-10^-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубируют посев при 36-37°С в течение 18-24 часов, отбирают изолированные бляшки, суспендируют их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, после этого инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, затем центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.