Способ скрининга регуляторов роста растений и комплект скрининга, основанный на заявленном способе Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/04 C12N3/00 C12N5/02 A01P21/00 A01N43/88 

Изобретение относится к области разработки новых ростовых веществ, активных в отношении растений, с целью применения их в сельском хозяйстве, а также для высокопроизводительного тестирования (скрининга) широкого спектра низкомолекулярных соединений с целью установления их биологической активности.

Клеточные модельные системы являются необходимыми инструментами тестирования новых биологически активных соединений, разрабатываемых для их применения в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Культуры клеток растений были использованы для идентификации ряда новых регуляторных пептидов растений, включая целые семейства регуляторных пептидов с высоким прикладным потенциалом, таких как фитосульфокины (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623; Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine-α , a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high- and lowaffinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357–13362. doi:10.1073/pnas.94.24.13357; Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia. Plant Physiol. 120, 1043–1048. doi:10.1104/pp.120.4.1043; Bahyrycz, A., Matsubayashi, Y., Ogawa, M., Sakagami, Y., and Konopińska, D. (2005). Further analogues of plant peptide hormone phytosulfokine-α (PSK-α) and their biological evaluation. J. Pept. Sci. 11, 589–592. doi:10.1002/psc.653; Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (2006). PEPTIDE HORMONES IN PLANTS. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 649–674. doi:10.1146/annurev.arplant.56.032604.144204; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2) и пептиды семейства CLE (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845–8. doi:10.1126/science.1128439; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12- 385095-9.00014-2).

Семейство коротких регуляторных пептидов, которые были объединены названием фитосульфокины (Phytosulphokines, PSKs), было открыто при проведении поиска ростовых веществ в жидкой питательной среде, кондиционированной при суспензионном культивировании изолированных клеток мезофилла спаржи Asparagus officinalis L. Важно отметить, что клетки спаржи в данных работах были использованы и как источник пептидов и как клеточная модельная тест-система (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623).

Исследование кондиционирующих факторов, которые подавляют дифференциацию культивируемых клеток бархатцев в трахеальные клетки проводящей системы в ксилогенетических культурах клеток, привело к открытию пептидов-регуляторов проводящей системы семенных растений (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436). Данные пептиды-регуляторы дифференцировки сосудов оказались членами большого семейства пептидных фитогормонов CLE, в котором они заняли особое место как пептиды, связанные с процессами дифференциации, а не ростовыми процессами, в отношении которых компетентно большинство из 26 пептидов семейства CLE у растений арабидопсис (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845–8. doi:10.1126/science.1128439; Kondo, Y., Hirakawa, Y., Kieber, J. J., and Fukuda, H. (2011). CLE Peptides can Negatively Regulate Protoxylem Vessel Formation via Cytokinin Signaling. Plant Cell Physiol. 52, 37–48. doi:10.1093/pcp/pcq129; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2). Модельные системы in vitro, основанные на культурах проростков Arabidopsis thaliana L., выращиваемых в вертикально ориентированных чашках Петри (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845–8. doi:10.1126/science.1128439), также сыграли важную роль при открытии семейств регуляторных пептидов CLE и дополнили экспериментальные работы по открытию CLE-пептидов, основанные на анализе процессов дифференциации в культурах клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436). Две цитируемые работы двух независимых групп авторов вышли подряд в одном выпуске Science за 2006 г., дополняют друг друга по смыслу и составляют единое целое как значительный этап в развитии функциональной пептидомики растений. Важно подчеркнуть, что растительные клеточные модельные тест-системы, использованные для анализа биологической активности пептидов в данных работах, сыграли ключевую роль в открытии новых пептидных регуляторов роста растений.

Универсальность клеточных модельных культур как тест-систем была продемонстрирована применительно к новым ростовым веществам в работах с клетками спаржи. После открытия фитосульфокинов в культивируемых клетках спаржи (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623) авторы использовали тест на пролиферацию клеток спаржи не только для тестирования биологической активности растительных пептидов, включая фитосульфокины, и не только пептидов, продуцируемых клетками спаржи, но и для открытия семейства пептидных фитогормонов PSY в растениях арабидопсис (Amano, Y., Tsubouchi, H., Shinohara, H., Ogawa, M., and Matsubayashi, Y. (2007). Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18333–8. doi:10.1073/pnas.0706403104). Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что культивируемые клетки спаржи Asparagus officinalis L. были апробированы как универсальные клеточные модельные системы для тестирования биологической активности новых пептидов из высших растений, принадлежащих к различным систематическим группам. Результаты применения модельных клеток спаржи для тестирования пептидов PSY из Arabidopsis thaliana L. были подтверждены в тестах на культурах клеток самого растения арабидопсис, который был источником исследуемых пептидов, и привели к открытию нового семейства растительных регуляторных пептидов PSY (Amano, Y., Tsubouchi, H., Shinohara, H., Ogawa, M., and Matsubayashi, Y. (2007). Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18333–8. doi:10.1073/pnas.0706403104). Еще одним примером универсальности клеток растений как тест-систем на биологическую активность низкомолекулярных биорегуляторов являются работы, в которых исследовалось действие фитосульфокинов, открытых в клетках спаржи Asparagus officinalis L., на процессы дифференциации сосудистых элементов в ксилогенных культурах клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia. Plant Physiol. 120, 1043–1048. doi:10.1104/pp.120.4.1043; Motose, H., Iwamoto, K., Endo, S., Demura, T., Sakagami, Y., Matsubayashi, Y., et al. (2009). Involvement of phytosulfokine in the attenuation of stress response during the transdifferentiation of Zinnia mesophyll cells into tracheary elements. Plant Physiol. doi:10.1104/pp.109.135954). Фитосульфокины из спаржи оказались активными в отношении клеток бархатцев, чувствительных к пептидным факторам клеточной дифференцировки CLE. Таким образом, анализ митотической активности и процессов дифференцировки в культивируемых ксилогенных клетках бархатцев позволил выявить новые функциональные свойства фитосульфокинов. Культура клеток бархатцев была апробирована в экспериментах по исследованию биологической активности фитосульфокинов в широком диапазоне концентраций, включая наномолярный (Motose, H., Iwamoto, K., Endo, S., Demura, T., Sakagami, Y., Matsubayashi, Y., et al. (2009). Involvement of phytosulfokine in the attenuation of stress response during the transdifferentiation of Zinnia mesophyll cells into tracheary elements. Plant Physiol. doi:10.1104/pp.109.135954).

В качестве клеточных тест-систем известны культуры протопластов риса в агарозных блоках, которые были использованы для тестирования биологической активности фитосульфокинов. Биотесты на основе протопластов риса представляют собой агарозные блоки с протопластами, заключенными в толще агаровой среды, инкубация которых происходит в жидкой среде с добавлением или без добавления исследуемого соединения. Критерием фитогормональной активности исследуемого вещества является интенсивность процесса деления протопластов и образования каллусных структур в толще агара, которая оценивается путем подсчета их числа в агарозных блоках (Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine-α, a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific highand low-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357–13362. doi:10.1073/pnas.94.24.13357).

Культуры клеток спаржи Asparagus officinalis L. (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623; Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine- , a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high- and low-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357–13362. doi:10.1073/pnas.94.24.13357) и ксилогенные культуры клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia. Plant Physiol. 120, 1043–1048. doi:10.1104/pp.120.4.1043) являются ближайшими аналогами клеточных тест-систем для установления и изучения биологической активности коротких пептидов и других низкомолекулярных соединений применительно к культурам спор зеленых мхов, разработанных в данном изобретении. В процессе прорастания спор зеленых мхов, использованных в данном изобретении, происходит запуск процессов развития организма из одной клетки, основанных на клеточной дифференцировке.

Известно применение мхов в качестве культивируемых объектов в модельных тест-системах (Vujicic М.М. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica Serbica, 41, 2017, стр. 11-15). При этом для культивирования мхов используются чашки Петри, а в качестве эксплантируемого и культивируемого материала используются побеги зеленых мхов или талломы печеночников (Vujicic М.М. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica Serbica, 41, 2017, стр. 11-15). Следует отметить, что побеги зеленых мхов и талломы печеночников являются сложными многоклеточными органами растений, их эксплантация и культивирование на искусственных средах дает некоторые результаты по тестированию ростовых веществ. Интерпретация этих результатов ограничена анализом воздействия тестируемых веществ на многоклеточные органы и целые растения и не дает возможности проследить в эксперименте эффект вещества на отдельные клетки. В отличие от подобных многоклеточных модельных систем, культуры клеток и одноклеточных систем, таких как споры, могут быть использованы для исследования воздействия различных химических агентов на отдельные клетки и клеточные процессы.

Прототипом культуры спор мхов, используемой в качестве клеточной системы для тестирования биологической активности пептидов и других низкомолекулярных биорегуляторов являются ксилогенные культуры клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12- 385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.).

Техническая проблема, возникающая при работе с культурами клеток спаржи, бархатцев и другими клетками семенных растений как тест-системами для анализа биологической активности низкомолекулярных соединений, заключается в целом ряде их недостатков:

1. Высокая гетерогенность клеток. Культивируемые клетки семенных растений, используемые в тестах, в частности, ксилогенные клетки бархатцев, являющиеся прототипом клеточной системы данного изобретения, отличаются высоким разнообразием размеров и формы клеток, а также высокой гетерогенностью по клеточной морфологии (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.).

2. Сложность микроскопического анализа клеток, в котором необходимо тщательно анализировать элементы текстуры клеточной стенки бледных, слабоокрашенных клеток. В частности такими клетками являются культивируемые клетки бархатцев Zinnia elegans (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.). При этом анализ можно проводить только в медленном режиме «от клетки к клетке», необходимо тщательно анализировать особенности внутренней структуры каждой клетки по формированию трахеальных элементов, связанной с изменением структуры клеточной оболочки.

3. Полиплоидность и гетерозиготность, которые свойственны культурам клеток семенных растений. В популяции культивируемых клеток семенных растений возможно варьирование не только плоидности, но и числа хромосом.

4. Необходимость проводить сложный, многостадийный процесс выделения клеток из растительных тканей, в частности, применительно к прототипу данного изобретения, клеткам бархатцев Zinnia elegans, необходимо проводить разрушение листовой ткани и выделять клетки мезофилла, которые на следующих стадиях надо проводить через несколько подготовительных стадий культивирования на специальных средах для получения адекватных для тестовых экспериментов клеток (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.).

Технический результат, который позволяет получать настоящее изобретение, заключается достижении высокой чувствительности и специфичности гомогенной клеточной тест-системы при низких концентрациях тестируемых веществ, высокой стандартизируемости процесса тестирования и высокой воспроизводимости результатов теста.

Для решения технической проблемы, связанной с использованием культур клеток спаржи, бархатцев и других семенных растений в качестве тест-систем для анализа биологической активности низкомолекулярных веществ, и достижения заявленного технического результата предлагается способ высокопроизводительного скрининга регуляторов роста растений, в котором в качестве клеточной тест-системы используют споры зеленых мхов, включающий стадию подготовки, которая заключается в выделении спор зеленого мха из гаметофоров зеленых мхов путем механического разрушения спорофитов с одновременным переводом спор в водную суспензию в стерильной воде, а также центрифугирование для очистки; стадию культивирования клеточной тест-системы, к которой добавлены кандидаты регуляторов роста растений; и стадию анализа роста клеточной тест-системы, на которой пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида, добавленного в лунки культуральных планшетов, и с помощью видеокамеры, которой оборудован микроскоп, получают изображения спор в лунках, при этом в качестве показателя клеточной активности исследуемого вещества регулятора роста растений используют долю проросших спор зеленых мхов от их общего числа в опытном и контрольном образцах.

Клеточная тест-система может быть выбрана из растений, принадлежащих к видам Atrichum tenellum, Atrichum undulatum, Barbula unguiculata, Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrella patens, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum, Polytrichum commune, Polytrichum juniperinum, Pottia truncata, Pottia intermedia, Weissia brachycarpa.

На стадии подготовки клеточной системы споры выделяют из гаметофоров зеленых мхов. Споры выделяют путем механического разрушения спорофитов, осуществляют перевод спор в водную суспензию в стерильной воде и центрифугируют. Выделенные споры депонируют в стерильной воде при температуре от 4 до 10°С на срок от 3 до 90 суток.

На стадии культивирования споры зеленых мхов культивируют в стандартных культуральных планшетах в жидкой питательной среде. Культивирование спор зеленого мха осуществляют при температуре от 16 до 28°С в условиях фотопериода длиной от 8 до 20 ч.

Анализ роста клеточной тест-системы осуществляют после завершения культивирования спор на жидкой питательной среде в течение периода от 24 до 72 суток. Пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида.

Анализ роста клеточной тест-системы осуществляют на стандартном инвертированном микроскопе, оборудованном видеокамерой для микроскопии в светлом поле, с помощью программных пакетов ImageJ.

В качестве показателя клеточной активности исследуемого вещества как регулятора роста растений используют долю проросших спор зеленых мхов от их общего числа в опытном и контрольном образцах. Проросшие споры зеленого мха определяют по формированию протонематического выроста.

Кандидаты в качестве регуляторов роста растений выбирают из группы низкомолекулярных соединений, состоящей из синтетических соединений, природных соединений, компонентов растительных экстрактов.

Предлагается комплект скрининга регуляторов роста растений, для осуществления заявленного способа, включающий клеточную тест-систему в виде спор зеленых мхов, культуральный планшет и микроскоп.

При этом микроскоп оборудован видеокамерой для микроскопии в светлом поле, а культуральный планшет содержит от 6 до 96 до лунок.

Предлагается применение спор зеленых мхов для скрининга регуляторов роста растений заявленным способом.

В настоящем изобретении споры зеленых мхов впервые используются как высокосинхронные, гомогенные одноклеточные модельные системы, основанные на культивировании фототрофных растительных клеток. Данная тест-система позволяет анализировать различные соединения в широких диапазонах концентраций. На основе предложенной системы скрининга проводится анализ биологической активности ростовых веществ при выводе одиночных клеток из состояния покоя, на стартовом этапе развития организма из одной клетки. Несмотря на значительный научный интерес и экспериментальный потенциал, споры зеленых мхов до последнего времени остаются невостребованными (и незапатентованными) как высокоэффективная и перспективная клеточная модель, которая может быть успешно реализована в тестах на биологическую активность химических агентов.

Заявленный способ скрининга позволяет решить техническую проблему, связанную с высокой гетерогенностью клеток, используемых в аналогичных системах.

В отличие от культур клеток семенных растений культура спор мхов, использованная в данном изобретении, является высокогомогенной клеточной тест-системой по таким параметрам, как плоидность, стабильность генетического материала, размер и форма клеток, а также по особенностям клеточной морфологии.

В отличие от прототипа, которым являются клетки бархатцев (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.), в предлагаемом изобретении упрощается и ускоряется процесс этап микроскопии клеток, связанный с проведением анализа клеточной структуры. В настоящем изобретении анализ биологической активности веществ проводится на основе регистрации изменений в клеточной морфологии, а именно формы клетки, которая изменяется в процессе образования клеточного выроста. Данный анализ позволяет быстро проводить регистрацию десятков и сотен клеток при небольших увеличениях светового микроскопа в светлом поле, при этом также возможна автоматизация процесса обработки изображений с помощью программных пакетов.

В заявленном изобретении отсутствует необходимость в проведении многостадийного процесса выделения клеток из растительных тканей, как это делается при получении культуры клеток бархатцев. В отличие от большинства модельных культивируемых клеток семенных растений и, в частности от модельной культуры клеток бархатцев Zinnia elegans, которая является прототипом тестовой клеточной системы данного изобретения, для получения спор зеленых мхов не требуется проводить специальных подготовительных этапов клеточной работы по обработке и культивированию растительного материала. Споры зеленых мхов образуются естественным путем в коробочках гаметофоров в количествах, достаточных для использования их в клеточных тест-системах. В настоящем изобретении разработан простой и эффективный способ получения водной клеточной суспензии на основе спор мхов, пригодной для проведения клеточных тестов на биологическую активность низкомолекулярных соединений.

Заявленное изобретение решает техническую проблему, связанную с полиплоидностью, гетерозиготностью и соматической вариативностью, которые свойственны культурам клеток семенных растений. В отличие от культивируемых клеток семенных растений, биологическая особенность спор зеленых мхов, используемых в данном изобретении, заключается в том, что они являются строго гаплоидными клетками.

Заявленные изобретения иллюстрируются следующими рисунками.

На Фиг. 1 представлены изображения спор Physcomitrella patens.

На Фиг. 2 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия абсцизовой кислоты на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens.

На Фиг. 3 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens.

На Фиг. 4 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида GFLVARPN, SEQ ID №2 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens.

На Фиг. 5 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens.

На Фиг. 6 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4 на процесс прорастания спор мха Polytrichum commune.

На Фиг. 7 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида IAEIPTQKPAADVQFGSL, SEQ ID №5 на процесс прорастания спор мха Atrichum undulatum.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Клеточная тест-система представляет собой культуру спор мхов, которые культивируют в стандартных культуральных планшетах с числом лунок от 6 до 96 в специально подобранной жидкой питательной среде, разработанной путем модификации стандартной среды для культивирования зеленых мхов (Cove, D. J., Perroud, P.-F., Charron, A. J., McDaniel, S. F., Khandelwal, A., and Quatrano, R. S. (2009). Culturing the Moss Physcomitrella patens. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, pdb.prot5136-pdb.prot5136. doi:10.1101/pdb.prot5136).

1) Культуру спор выделяют в лабораторных условиях из коробочек гаметофоров зеленых мхов (Physcomitrella patens, Atrichum undulatum, Polytrichum commune) которые собирают в естественной среде обитания или выращивают в контролируемых условиях на стандартных средах (Cove, D. J., Perroud, P.-F., Charron, A. J., McDaniel, S. F., Khandelwal, A., and Quatrano, R. S. (2009). Culturing the Moss Physcomitrella patens. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, pdb.prot5136-pdb.prot5136. doi:10.1101/pdb.prot5136). Споры выделяют из гаметофоров по методике, основанной на механическом разрушении зрелых коробочек (спорофитов) с одновременным переводом спор в водную суспензию в стерильной воде с последующий их очисткой путем центрифугирования. Выделенные споры депонируют в стерильной воде при температуре от 4 до 10°С на срок от 3 до 90 суток и используют для проведения опытов по тестированию низкомолекулярных соединений.

2) Культивирование спор проводят в стандартных планшетах, содержащих от 6 до 96 лунок, в которые вносят жидкую культуральную среду в объеме от 50 мкл до 4 мл которая содержит тестируемое соединение, добавленное в виде водной аликвоты в объеме от 2 до 100 мкл. В качестве контроля используют водную аликвоту без добавления тестируемого соединения.

3) Культивирование спор проводят при температуре от 16 до 28°С в условиях фотопериода длиной от 8 до 20 ч.

4) После завершения культивирования спор в течение периода от 24 до 72 ч проводят анализ проб на стандартном инвертированном микроскопе, оборудованном видеокамерой для микроскопии в светлом поле. Для анализа пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида, который добавляют в лунки культуральных планшетов виде 8% раствора в объеме от 50 мкл до 4 мл.

5) С помощью видеокамеры, которой оборудован микроскоп, получают изображения спор в лунках. Для анализа одной пробы ведется учет 800 спор. Анализ заключается в учете непроросших спор (с интактной оболочкой) и проросших спор. Прорастание спор идентифицируют по формированию протонематического выроста на месте разрыва оболочки споры (Cove, D. J., Perroud, P. F., Charron, A. J., McDaniel, S. F., Khandelwal, A., and Quatrano, R. S. (2009b). The moss Physcomitrella patens: A novel model system for plant development and genomic studies. Cold Spring Harb. Protoc. doi:10.1101/pdb.emo115; Cove, D., Bezanilla, M., Harries, P., and Quatrano, R. (2006). Mosses as model systems for the study of metabolism and development. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 497–520. doi:10.1146/annurev.arplant.57.032905.105338).

Так, на Фиг. 1 представлены изображения спор Physcomitrella patens. Различение проросших спор от непроросших спор ведется по наличию протонематического выроста. На Фиг. 1 проросшая спора обозначена цифрой 1. Непроросшие споры характеризуются наличием интактной (целостной, без разрывов) оболочки и эллипсоидной, близкой к сферической, формы. Проросшие споры отличаются по форме от непроросших спор по наличию протонематического выроста, который придает им грушевидную форму.

6) Анализ процесса прорастания спор проводят с помощью программных пакетов ImageJ. В опытных образцах и в контрольных образцах ведут учет доли проросших и непроросших спор. Вывод о наличии ростовой активности делают на основе оценки достоверности разницы между опытными и контрольными образцами по доле проросших и непроросших спор при использовании стандартного математико-статистического аппарата и критериев значимости. Если в опытном образце доля проросших спор выше, чем в контрольном образце, то делают вывод о наличии у исследуемого вещества рост-активирующей активности. Если опытный образец показывает достоверно меньшую долю проросших спор по сравнению с контролем, то можно делать вывод об ингибирующем действии исследуемого вещества на рост и клеточную пролиферацию. При анализе ростовой активности веществ в различных концентрациях (несколько вариантов тестов с разными концентрациями исследуемого вещества) возможно применение аппарата дисперсионного анализа.

Техническая сущность изобретений поясняется следующими примерами.

Пример 1. В примере в качестве регулятора роста растений использовали абсцизовою кислоту.

Абсцизовая кислота является сигнальным и стрессовым фитогормоном, который является ингибитором многих процессов, которые происходят при развитии растений, например при прорастании семян. На Фиг. 2 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия абсцизовой кислоты на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности. Символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости, отмечено звездочкой. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 6ºC в течение 30 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 18 ч фотопериода в течение 42 ч в 12-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 2 мл в каждой лунке.

Как показали результаты скрининга, абсцизовая кислота ингибирует процесс прорастания спор у мха в широком диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Практически полное подавление процесса прорастания спор наблюдается при концентрации абсцизовой кислоты 0,1 мкМ.

В случае со спорами мха Physcomitrella patens было установлено явление торможения процесса их прорастания, что находится в физиологическом соответствии этого явления с ингибиторной природой фитогормона абсцизовая кислота. Способ скрининга биологической активности при помощи культуры спор мхов позволяет выявить биологическую активность известного фитогормона в сверхнизких диапазонах концентраций, что не было прежде показано другими доступными методами, например, в тестах на всхожесть и прорастание семян.

Пример 2. В примере в качестве регулятора роста растений использовали короткий пептид RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1.

Пептид RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 является хорошо изученным членом семейства растительных пептидов CLE (Arabidopsis thaliana, фрагмент белка Q9XF04, UniProt) и характеризуется тем, что подавляет рост корней и процессы деления клеток в побеговых апикальных меристемах.

На Фиг. 3 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности. Символом «*» указана разность между средними выборочными долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 4ºC в течение 36 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 12 ч фотопериода в течение 48 ч в 24-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 1 мл в каждой лунке.

Тестирование данного пептида на спорах мха Physcomitrella patens показало, что соединение ингибирует процесс прорастания спор мха при концентрациях от 10 пМ до 1 нМ. В иных изученных диапазонах выше и ниже приведенных концентраций данный пептид не оказывает существенного влияния на процесс прорастания спор мха. Детектирование ингибирующей активности пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens находится в соответствии с его физиологической активностью в растениях, направленной на подавление процессов деления клеток.

Пример 3. В примере в качестве регулятора роста растений использовали пептид GFLVARPN, SEQ ID №2.

Пептид GFLVARPN, SEQ ID №2 является фрагментом малой субъединицы функционального фотосинтетического белка Рубиско мха Physcomitrella patens. Использование спор мха Physcomitrella patens позволило протестировать данный пептид на биологическую активность в широком диапазоне концентраций и установить его стимулирующий эффект при развитии нового организма мха из спор.

Так, на Фиг. 4 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида GFLVARPN, SEQ ID №2 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности. Символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 6ºC в течение 42 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 18 ч фотопериода в течение 36 ч в 12-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 2 мл в каждой лунке.

Как показали исследования, пептид GFLVARPN, SEQ ID №2 оказывает положительный эффект на прорастание спор Physcomitrella patens. При концентрации 10 пМ наблюдается максимальный эффект, который снижается как при снижении его концентрации, так и при повышении.

Пример 4. В примере в качестве потенциального регулятора роста растений использовали пептид IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3, обнаруженный в составе пептидных пулов мха Physcomitrella patens.

На Фиг. 5 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности, символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 8ºC в течение 30 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 16 ч фотопериода в течение 48 ч в 48-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 0,4 мл в каждой лунке.

Как видно из диаграммы на фиг. 5, данный пептид, SEQ ID №3 не оказывает существенного действия на процесс прорастания спор мха в исследованном широком диапазоне концентраций. Данный вывод говорит о том, что протестированный пептид не активен в отношении растительных клеток, находящихся в стадии выхода из состояния покоя, что не исключает проявления его активности на других этапах развития растений. Приведенный пример подчеркивает специфичность тест-системы, а именно то, что споры мха Physcomitrella patens продемонстрировали чувствительность в отношении как известных фитогормонов абсцизовой кислоты и пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1, так и нового пептида GFLVARPN, SEQ ID №2, но не продемонстрировали чувствительность к пептиду IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3 в широком диапазоне концентраций.

Пример 5. В примере в качестве потенциального регулятора роста растений использовали пептид WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4.

На Фиг. 6 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4 на процесс прорастания спор мха Polytrichum commune в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности, символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были собраны в естественной среде обитания в Государственном заказнике Звенигородская биологическая станция МГУ им. М.В. Ломоносова. Выделенные споры депонировали при температуре 10ºC в течение 3-х суток. Споры культивировали при температуре 16ºC в условиях 8 ч фотопериода в течение 72 ч в 6-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 4 мл в каждой лунке. Данный пример показывает чувствительность спор мха Polytrichum commune к действию пептида WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4, который стимулирует их прорастание при низких концентрациях от 10 нМ до 10 фМ.

Пример 6. В примере в качестве потенциального регулятора роста растений использовали пептид IAEIPTQKPAADVQFGSL, SEQ ID №5.

На Фиг. 7 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида IAEIPTQKPAADVQFGSL, S EQ I D № 5 на процесс прорастания спор мха Atrichum undulatum в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности, символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были собраны в естественной среде обитания в Государственном заказнике Звенигородская биологическая станция МГУ им. М.В. Ломоносова. Выделенные споры депонировали при температуре 4°C в течение 90 суток. Споры культивировали при температуре 28ºC в условиях 20 ч фотопериода в течение 24 ч в 96-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 50 мкл в каждой лунке. Данный пример показывает чувствительность спор мха Atrichum undulatum к действию пептида IAEIPTQKPAADVQFGSL, S EQ I D № 5, который стимулирует их прорастание при концентрациях от 10 нМ до 10 фМ.

Таким образом, приведенные данные по скринингу низкомолекулярных соединений, включая фитогормоны и пептиды, на спорах мха показывают высокую чувствительность и специфичность гомогенной клеточной тест-системы, применимость заявленного способа скрининга и системы скрининга для анализа биологической активности в широком диапазоне низких концентраций регуляторов роста растений. Аналогичные данные были получены при использовании спор ряда других видов зеленых мхов: Atrichum tenellum, Barbula unguiculata, Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum, Polytrichum juniperinum, Pottia truncata, Pottia intermedia, Weissia brachycarpa.

К преимуществам заявленного способа высокопроизводительного скрининга регуляторов роста растений и системы скрининга, предлагаемых в настоящем изобретении, является 1) невысокая стоимость комплекса работ и расходных материалов, 2) высокая производительность и высокий потенциал для автоматизации (роботизации) процесса, 3) короткие сроки получения ответной реакции (от 1 до 3 суток), 4) высокая стандартизируемость процесса тестирования - все материалы для тестирования подготавливаются в стандартных условиях, споры являются клеточным материалом, полученным в контролируемых условиях.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ высокопроизводительного скрининга регуляторов роста растений, комплект скрининга регуляторов роста растений и средство для скрининга регуляторов роста растений. Способ включает использование спор зеленых мхов в качестве клеточной тест-системы, выделение спор зеленого мха из гаметофоров зеленых мхов, культивирование клеточной тест-системы при добавлении кандидатов регуляторов роста растений и анализа роста клеточной тест-системы. В качестве показателя клеточной активности исследуемого вещества регулятора роста растений используют долю проросших спор зеленых мхов от их общего числа в опытном и контрольном образцах. Комплект включает клеточную тест-систему в виде спор зеленых мхов, культуральный планшет и микроскоп. Средство представляет собой споры зеленых мхов. Изобретения обеспечивают высокую чувствительность и специфичность гомогенной клеточной тест-системы при низких концентрациях тестируемых веществ, высокую стандартизируемость процесса тестирования и высокую воспроизводимость результатов теста. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 пр., 7 ил.

1. Способ высокопроизводительного скрининга регуляторов роста растений, в котором в качестве клеточной тест-системы используют споры зеленых мхов, включающий стадию подготовки, которая заключается в выделении спор зеленого мха из гаметофоров зеленых мхов путем механического разрушения спорофитов с одновременным переводом спор в водную суспензию в стерильной воде, а также центрифугирование для очистки, стадию культивирования клеточной тест-системы, к которой добавлены кандидаты регуляторов роста растений, и стадию анализа роста клеточной тест-системы, на которой пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида, добавленного в лунки культуральных планшетов, и с помощью видеокамеры, которой оборудован микроскоп, получают изображения спор в лунках, при этом в качестве показателя клеточной активности исследуемого вещества регулятора роста растений используют долю проросших спор зеленых мхов от их общего числа в опытном и контрольном образцах.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что споры зеленых мхов выбраны из растений, принадлежащих к видам Atrichum tenellum, Atrichum undulatum, Barbula unguiculata, Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrella patens, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum, Polytrichum commune, Polytrichum juniperinum, Pottia truncata, Pottia intermedia, Weissia brachycarpa.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделенные споры депонируют в стерильной воде при температуре 4 - 10°С на срок от 3 до 90 суток.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование спор зеленого мха осуществляют при температуре от 16 до 28°С в условиях фотопериода от 8 до 20 ч.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ роста клеточной тест-системы осуществляют в период от 24 до 72 ч после посева спор на стерильную среду.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ роста клеточной тест-системы осуществляют с помощью программных пакетов ImageJ.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проросшие споры зеленого мха определяют по формированию протонематического выроста.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кандидаты для регуляторов роста растений выбирают из группы низкомолекулярных соединений, состоящей из синтетических соединений, природных соединений, растительных экстрактов.

9. Комплект скрининга регуляторов роста растений для осуществления способа по п. 1, включающий клеточную тест-систему в виде спор зеленых мхов, культуральный планшет и микроскоп.

10. Комплект скрининга по п. 13, отличающийся тем, что микроскоп оборудован видеокамерой для микроскопии в светлом поле.

11. Комплект скрининга по п. 13, отличающийся тем, что культуральный планшет содержит от 6 до 96 до лунок.

12. Применение спор зеленых мхов для скрининга регуляторов роста растений способом по п. 1.