СПОСОБ СКРИНИНГА БАКТЕРИЙ, СТИМУЛИРУЮЩИХ РОСТ РАСТЕНИЙ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к области сельского хозяйства, биотехнологий и технологий увеличения продуктивности растений за счет использования бактерий, улучшающих рост растений. Комбинация методов выделения азотфиксирующих бактерий, их первичного скрининга на специфических средах, а также вторичного скрининга с помощью ПЦР делает возможным минимизировать затраты при большом объеме анализируемых почв. Способ может использоваться в обычных лабораториях. В частности способы, раскрытые здесь, полезны для повышения роста растений и/или урожайности растений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Путем сложных взаимодействий бактерии, улучшающие рост растений, используют различные механизмы, которые способствуют фиксации атмосферного азота, растворению органических и неорганических фосфатов и других питательных веществ, производят вторичные метаболиты, такие как сидерофоры, которые действуют как хелаторы железа [1] и производят фитогормоны, такие как ауксины, гиббереллины и цитокины. С другой стороны, бактерии, улучшающие рост растений, могут косвенно способствовать росту растений за счет производства антибиотиков и литических ферментов, которые вместе функционируют как биоконтроллеры фитопатогенов. Эти механизмы благоприятствуют использованию бактерий, улучшающих рост растений в качестве микробных биоудобрений и/или биопестицидов, поскольку ассоциация, включающая почву, растение и бактерию, является прекрасной альтернативой частичной или полной замене химических удобрений [2,3].

[0003] Микробиологические удобрения - это продукт, который обеспечивает посевам специфический эффект удобрения благодаря жизнедеятельности определенных микроорганизмов. Их можно разделить на азотфиксирующее бактериальное удобрение, фосфорное бактериальное удобрение, силикатное бактериальное удобрение и комплексное микробиологическое удобрение. Использование микробиологических удобрений может не только снизить производственные затраты и улучшить использование удобрений, но и содержать функциональные микроорганизмы, которые могут подавлять или предотвращать болезни, переносимые почвой, способствовать высвобождению нерастворимых минеральных питательных веществ, стимулировать рост урожая, улучшать его качество, регулировать баланс экосистемы и т.д. Микробиологические удобрения, используемые в сельскохозяйственном производстве, обладают преимуществами, с которыми не могут сравниться обычные химические удобрения: они не загрязняют окружающую среду, нетоксичны и безвредны для людей, домашнего скота и других животных; восстанавливает почву; повышают урожайность и качество сельскохозяйственных культур; имеют низкую стоимость; оказывают длительный эффект удобрения.

[0004] Типичная процедура изучения ризосферных бактерий заключается в том, чтобы в первую очередь проверять их на наличие полезных признаков, а затем инокулировать растения теми штаммами, которые дали наилучшие результаты [4].

[0005] Наиболее часто сообщаемыми механизмами стимулирования роста растений являются улучшение состояния питания растений за счет растворения фосфора [5] и фиксации азота [6] , а также бактериальный синтез соединений, таких как индолуксусная кислота [7] и сидерофоров [8].

[0006] Бактерии, фиксирующие атмосферный азот (N2), обитают как в тканях растений (например, в клубеньках, корнях), так и на границе раздела почва-корневая ризосфера и, следовательно, могут поставлять значительные количества азота для роста растений [9,10]. Фосфат-солюбилизирующие бактерии увеличивают биодоступность фосфора из почвы для растений [11]. Они растворяют нерастворимый неорганический (минеральный) фосфор и минерализуют нерастворимый органический фосфор [12]. В процессе бактериальной минерализации фосфора участвуют разные группы ферментов. Первая группа ферментов - это те, которые дефосфорилируют фосфорно-эфирную или фосфоангидридную связь органических соединений. Это неспецифические кислые фосфатазы (NSAP). Наиболее изученными среди этих NSAP-ферментов, выделяемых PSM, являются фосфомоноэстеразы, также называемые фосфатазами [13]. Эти ферменты могут быть кислотными или щелочными фосфомоноэстеразами [14]. Другой фермент, продуцируемый фосфат-солюбилизирующими бактериями в процессе минерализации органического фосфора - это фитаза. Этот фермент отвечает за высвобождение фосфора из органических материалов в почве, которые хранятся в форме фитата. Разложение фитата фитазой высвобождает фосфор в форме, доступной для использования в растениях [15].

[0007] Некоторые ризобактерии могут высвобождать калий (K) из нерастворимых минералов, таких как слюда, иллит и другие. Механизм солюбилизации калия в основном связан с выделением органических кислот, таких как лимонная, щавелевая, винная, янтарная и α-кетоглюконовая кислоты, которые либо непосредственно растворяют калий породы, либо хелатируют ионы кремния, переводя калий в раствор [16]. Железо (Fe) является исключительно важным микроэлементом для многих процессов растений, в том числе, для фотосинтеза [17]. Свободное Fe (II) быстро окисляется до Fe(III), а Fe (III) не является биодоступным из-за низкой растворимости, поэтому, несмотря на обилие Fe (III) в земной коре, количество доступного для усвоения Fe очень мало [18]. Микроорганизмы обладают механизмом получения ионов Fe за счет синтеза и высвобождения сидерофоров [19]. Сидерофоры - это низкомолекулярные соединения (500-1500 Да), обладающие высоким сродством к Fe (III) [20,21]. Основная функция сидерофоров заключается в переводе Fe в доступную для микроорганизмов форму [22]. Сидерофоры, продуцируемые почвенными микроорганизмами, обеспечивают растения Fe и усиливают их рост [23]. Сидерофоры также участвуют в контроле фитопатогенных микроорганизмов в ризосфере. Сидерофоры с явно выраженной противогрибковой активностью относятся к группе пиовердинов [8]. Пиовердины образуют стабильные комплексы с почвенным железом, что делает этот важный элемент недоступным для питания патогенных ризосферных микроорганизмов [24]. Ауксин, этилен, абсцизовая кислота, цитокинин и гиббереллин относятся к хорошо известным классам фитогормонов. Бактерии, стимулирующие рост растений, могут вызывать изменения в корнях, снабжая их значительным количеством ауксина, который будет действовать синергетически с эндогенным ауксином [25] и изменять развитие корневой системы растений [26]. Кроме того, ферменты, продуцируемые бактериями, улучшающими рост растений, такие как 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат дезаминаза, косвенно вносят вклад в архитектурные и функциональные модификации корня [27].

[0008] Существующая метаболическая характеристика штамма в отношении биохимических активностей, связанных со стимулированием роста растений, заключается в выращивании штаммов на чашках Петри с различными средами или оценка продукции какого-либо вещества аналитическими методами. Практически все методы характеристики штаммов в отношении биохимических активностей подразумевают первичное выделение чистых культур микроорганизмов, что часто требует достаточно большого количества времени и реактивов. После получения чистых культур проводят инокуляция на разные среды и оценка соответствующей активности по наличию роста или изменению окраски/прозрачности вокруг колонии.

[0009] Так, например, метод определения фосфат-солюбилизирующей активности заключается в культивации бактериальных изолятов в модифицированной агаровой среде с добавлением 2% (масса/объем) фосфата кальция при 30°C в течение 7 дней. Развитие светлых зон вокруг бактериальных колоний расценивается как положительная реакция солюбилизации фосфата специфическими бактериальными изолятами [28,29]. Способность бактерий солюбилизировать калий оценивается на агаре Александрова с добавлением слюды (0,2%) в качестве единственного источника К. Бактериальные культуры, образующие прозрачную зону, считаются солюбилизаторами К [30].

[0010] Для скрининга сидерофор-продуцирующей активности изоляты бактерий, улучшающих рост растений, инокулируют на чашках с агаром с хромом азуролом S (CAS). Образование оранжевого ореола вокруг бактериальной колонии указывает на продукцию сидерофоров [10.3390/plants11223065]. Для выявления штаммов, способных продуцировать целлюлазу, используют агаровую среду с карбоксиметил целлюлозой [31]. Бактериальные штаммы высевают на чашки Петри и инкубируют при 28°С в течение 48 ч, затем заливали на 30-40 мин 1% гексадецилтриметиламмоний бромидом. Появление неокрашенной области вокруг колонии свидетельствует о продукции целлюлазы [32].

[0011] Для определения активности деаминазы и каталазы 1-аминоциклопропан-1-карбоновой (ACC) кислоты бактериальные изоляты культивируют в минимально солевой среде Дворкина и Фостера, содержащей KH2PO4, Na2HPO4, MgSO4×7H2O, глюкозу, глюконовую кислоту, лимонную кислоту с микроэлементами и агар, pH 7,2, с дополнительными 3 мМ АСС в качестве единственного источника азота при 30°C в течение 7 дней. Колонии, выросшие на чашках, считаются продуцентами ферментов АСС-дезаминазы [29].

[0012] Также существуют методы количественной оценки биохимических характеристик микроорганизмов по показателям полезным для роста растений. Обычно такую оценку проводят путем посева бактериальных изолятов в жидкую питательную среду с последующей оценкой количества продукта интересующей реакции. Ацетиленовый метод определения активности азотфиксации основан на способности нитрогенезы восстанавливать ацетилен до этилена в количестве, пропорциональном количеству азота, которое может быть восстановлено в тех же условиях. Оценка активности азотфиксации проводится по измерению количества образовавшегося этилена с помощью газовой хроматографии с пламенным ионизационным детектором. Фосфат-солюбилизирующую активность оценивают, высевая бактерии на чашках Петри, содержащих агар Пиковской [33]. Способность изолятов растворять фосфор оценивается путем измерения полупрозрачного ореола во круг колонии. Количественно K-солюбилизацию оценивают путем посева бактериальных изолятов в 0,2% слюду с добавлением бульона Александрова (50 мл). Через 7 суток инкубации в супернатанте определяют содержание калия с помощью пламенной спектрофотометрии [34].

[0013] Для определения индолил-3-уксусной кислоты применяется несколько методов. Одним из таких методов является определение индолил-3-уксусной кислоты с помощью газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектором [35]. Данный способ требует применения дорогостоящего оборудования и сложной пробоподготовки. Второй способ определения индолил-3-уксусной кислоты заключается во взаимодействии с реактивом Сальковского (2 мл 0,5М раствора FeCl3 и 100 мл 37% HClO4) с образованием окрашенного соединения, концентрацию которого определяют спектрофотометрически (490 нм).

[0014] Однако данные способы занимают большое количество времени, требуют значительных трудозатрат и материальных вложений. Причем трудовые и временные затраты увеличиваются пропорционально количеству исследуемых микроорганизмов. То есть мало подходят для эффективного скрининга.

[0015] Одним из быстрых скрининговых методов является полимеразная цепная реакция. Так метод ПЦР используется для скрининга, например, нитрогеназной активности. Фиксация азота особенно хорошо подходит для генетических исследований, так как основной функциональный ген nifH, кодирующий редуктазу динитрогеназы, хорошо изучен и известно множество нуклеотидных последовательностей данного гена [10.1093/molbev/msh047]. Однако, для других генов количество доступных последовательностей гораздо меньше, что увеличивает вероятность “пропустить” наличие нужного гена из-за вариабельности генов между разными видами микроорганизмов. Таким образом, скрининг должен сочетать в себе как биохимическое тест-титрование на средах, так и ПЦР-анализ, то есть методы, дополняющие друг друга. Подобный метод скрининга будет решать задачи эффективного и дешевого способа поиска целевых микроорганизмов (полезных для роста растений), которые могут присутствовать в биологическом образце.

[0016] Так, в работе CN114774280A (Дата публикации 2022.07.22) описан метод скрининга бактерий гетеротрофной нитрификации и аэробной денитрификации в кислой почве рисовых полей, который включает этапы отбора почвенных проб, скрининга гетеротрофных нитрифицирующих штаммов, аэробных денитрифицирующих штаммов на селективных средах, их выделения и очистки; анализа гетеротрофной нитрификации, определения способности к аэробной денитрификации на селективных средах и биохимически, а так же ПЦР-анализ и идентификацию штаммов. Данный способ сочетает в себе несколько методов отбора, но не позволяет провести скрининг активностей помимо нитрификации и денитрификации, к тому же этап ПЦР касается только секвенирования гена 16S рРНК исследуемых бактерий.

ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯ

[0017] Чистая бактериальная культура - это культура, в которой практически все присутствующие бактериальные клетки принадлежат выбранному штамму.

[0018] Инокулят - суспензия клеток, являющаяся исходной для клеточной культуры и используемая для посева на питательную среду.

[0019] Ризосфера - участок почвы, окружающий корень растения и на который воздействуют корневые выделения и почвенные микроорганизмы.

[0020] Сидерофоры - это низкомолекулярные высокоаффинные хелаторы железа, которые способны извлекать железо из нерастворимых неорганических соединений.

[0021] Стимулирование роста растений - способность увеличивать или увеличивать по меньшей мере один из них для увеличения выхода белка из растения или увеличения урожая зерна растения.

[0022] Последовательность 16S рРНК - в микробиологии относится к последовательности, полученной путем характеристики нуклеотидов, которые содержат ген (гены) 16S рибосомальной РНК. Длина бактериальной 16S рРНК составляет приблизительно 1500 нуклеотидов.

[0023] ПЦР - полимеразная цепная реакция; метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе).

[0024] Фитогормоны - низкомолекулярные органические вещества, вырабатываемые растениями и выполняющие регуляторные функции.

[0025] CAS (Chrome Azurol S) - краситель хром азурол S.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0026] Настоящее изобретение относится к способу, позволяющему проводить скрининг большого числа бактерий на наличие активностей, стимулирующих рост растений. Способ по изобретению позволяет увеличить скорость и снизить временные и материальные затраты для проведения анализа большого количество одновременно исследуемых проб.

[0027] Задачей данного изобретения является разработка скринингового метода, с помощью которого можно исследовать сразу большое количество микроорганизмов на наличие комбинации свойств, полезных для роста растений.

[0028] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как создание технологии быстрого и доступного скрининга большого количества почвенных бактерий на наличие комбинации свойств, полезных для растений, с целью последующего создания микробиологических консорциумов, используемых в сельском хозяйстве для повышения продуктивности растений.

[0029] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленный способ скрининга включает в себя стадии:

(1) выращивание почвенных бактерий на безазотной среде Эшби;

(2) первичный скрининг и отбор индивидуальных штаммов азотфиксирующих бактерий на специфических средах;

(3) вторичный скрининг чистой культуры методом ПЦР на гены бактерий, определяющих активности, стимулирующие рост растений,

в котором очистку до чистых культур проводят на этапе отбора с помощью ПЦР.

[0030] В некоторых вариантах реализации изобретения для скрининга используют среду Эшби или другую среду, не содержащую источников азота, но отличающуюся от стандартного состава среды Эшби в отношении содержания солей и источников углерода.

[0031] В некоторых вариантах реализации изобретения в качестве источника микроорганизмов используют почвенную суспензию, полученную последовательным разведением в стерильном растворе или почвенные комочки, разложенные на агаризованной среде, или смывы с любых поверхностей (растения, плоды и т.д.), или ризосферу растений.

[0032] В некоторых вариантах реализации изобретения скрининг бактерий на наличие целевых активностей проводят на планшетах с плоским дном и/или чашках Петри.

[0033] В некоторых вариантах реализации изобретения скрининг бактерий на наличие целевых активностей с помощью специфических сред проводят методом перекалывания изолятов с чашек или методом инокуляции изолятов после выращивания их в жидкой среде.

[0034] В некоторых вариантах реализации изобретения состав сред в первичном скрининге позволяет детектировать признаки фосфат-солюбилизирующей активности, калий-солюбилизирующей активности, сидерофорпродуцирующей активности, целлюлозолитической активности, пектиназной активности, протеазной активности, хитиназной активности.

[0035] В некоторых вариантах реализации изобретения состав диагностирующих сред может включать рН-индикаторы, для которых интервал перехода окраски индикатора лежит внутри диапазона 5-7 или другие специфические красители.

[0036] В некоторых вариантах реализации изобретения вторичный скрининг методом ПЦР проводят для идентификации генов фиксации атмосферного азота, солюбилизации фосфатов, синтеза сидерофоров, метаболизма этилена и ауксинов.

[0037] В некоторых вариантах реализации изобретения аналитику первичного скрининга проводят спектрофотометрически.

[0038] В некоторых вариантах реализации изобретения чистую культуру бактерий предварительно анализируют на световом микроскопе.

[0039] В некоторых вариантах реализации аналитику вторичного скрининга проводят с помощью ПЦР в реальном времени при использовании интеркалирующих красителей.

[0040] В некоторых вариантах реализации аналитику вторичного скрининга проводят с помощью электрофоретической детекции в агарозном геле.

[0041] В некоторых вариантах реализации осуществление и аналитику вторичного скрининга проводят с помощью чиповых технологий.

[0042] Преимущество настоящего изобретения заключается в уменьшении трудозатратности существующих методов скрининга бактериальных штаммов на наличие активностей стимулирующих рост растений. Данный способ позволяет уменьшить время анализа и увеличить количество одновременно исследуемых штаммов. За счет отбора на нескольких стадиях исследования достигается выявление азотфиксирующих бактерий, обладающих наибольшим количеством активностей, и всестороннее исследование этих активностей. Например, вторая стадия планшетного скрининга позволяет осуществить поиск бактерий, продуцирующих кислоты, участвующие в солюбилизации неорганического фосфора и калия. Третья стадия (исследование методом ПЦР) позволяет определить наличие генов ответственных за солюбилизацию органического фосфора, синтез фитогормонов.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0043] На Рис. 1 представлена фотография почвенных комочков, инкубированных в течение 7 дней при 28°С на чашке Петри с безазотной средой Эшби. Вокруг почвенных комочков можно наблюдать ореол из азотфиксирующих бактерий.

[0044] На Рис. 2 приведены результаты скрининга 16 бактерий в 96-луночных планшетах.

[0045] На Рис. 3 приведены результаты секвенирования фрагмента последовательности 16S рРНК Agrobacterium tumefaciens

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0046] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.

[0047] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.

[0048] Заявленный способ определения наличия микроорганизмов, способствующих росту растений в биологическом образце, включающий:

(1) выращивание почвенных бактерий на безазотной среде Эшби, что позволяет отобрать штаммы бактерий, проявляющих азотфиксирующую активность. Выделение индивидуальных штаммов бактерий подтверждают морфологически (световая микроскопия).

(2) первичный скрининг и отбор индивидуальных штаммов азотфиксирующих бактерий, обладающих калий-солюбизизирующей, фосфат-солюбилизирующей, сидерофорпродуцирующей, целлюлозолитической активностью на 96-луночных планшетах со специфическими средами.

(3) вторичный скрининг чистых культур бактерий на гены, определяющих активности, стимулирующие рост растений, методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Таксономическое положение штаммов устанавливают секвенированием генов 16S рРНК.

[0049] На первой стадии использование безазотной среды Эшби позволяет выделить штаммы азотфиксирующих бактерий. Для приготовления среды Эшби смешивают следующие компоненты на 1 литр: маннит, сахароза или глюкоза - 20,0 г, калий сернокислый - 0,2 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2 г, кальций углекислый - 5,0 г, магний сернокислый - 0,2 г, натрий хлористый - 0,2 г, агар-агар - 15,0 г. Автоклавированную среду (2 атм, 121 С, 20 мин) заливают в чашки Петри. На поверхности среды раскладывают почвенные комочки диаметром 1-2 мм или готовят суспензию 0,1 г почвы в 50 мл стерильного физиологического раствора, после чего 100 мкл суспензии высевают на чашку Петри с агаризованной средой Эшби и распределяют шпателем Дригальского. Инкубируют при 28 С в течение 7 дней. Отдельные колонии переносят на чашки Петри со стерильной средой и методом истончающегося штриха получают индивидуальные штаммы, контролируют чистоту штаммов микроскопическим анализом.

[0050] На второй стадии 96-луночный планшет позволяет проводить одновременный анализ до 96 штаммов бактерий. Для анализа бактериальных штаммов используют набор из четырех планшетов. В лунках каждого из четырех планшетов содержится среда, которая под воздействием выделяемых бактериями веществ изменяет свой цвет.

Состав среды для определения фосфат-солюбилизирующей активности бактерий: среда для определения фосфат-солюбилизирующей активности бактерий включает (на 1 л): 5,0 г глюкозы; 0,1 г аммония сернокислого; 0,2 г калия хлористого; 5,0 г магния хлористого 6-водного; 2,5 г трикальция фосфата; 2,0 г раствора микроэлементов (CuSO4×5H2O - 0,04 г; ZnSO4×7H2O - 0,12 г; H3BO3 - 1,4 г; Na2MoO4×2H2O - 1 г; MnSO4×H2O - 1,175 г, полный объем до 1000 мл дистиллированной водой), добавляют бромфеноловый синий (0,1% раствор в 20% спирте) - 20 мл.

Состав среды для определения калий-солюбилизирующей активности бактерий: среда для определения калий-солюбилизирующей активности бактерий включает (на 1 л): 15,0 г агара микробиологического; 15,0 г глюкозы; 0,1 г аммония сернокислого; 20,0 бромкрезоловый красный или бромфеноловый красный (0.1% в 20%-ный спирт); 2,0 г калия алюмосиликата; 0,1 г кальция хлористого; 1,0 г магния хлористого 6-водного; 0,25 г магния серно-кислого 7-водного; 0,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного; 2,0 г раствора микроэлементов (CuSO4×5H2O - 0,04 г; ZnSO4×7H2O - 0,12 г; H3BO3 - 1,4 г; Na2MoO4×2H2O - 1 г; MnSO4×H2O - 1,175 г, полный объем доводят до 1000 мл дистиллированной водой), добавляют краситель бромкрезоловый пурпурный (0,1% раствор в 20% спирте) - 20 мл.

Состав среды для определения синтеза сидерофоров бактериями: среда для определения синтеза сидерофоров бактериями включает (на 1 л): 20 мл 1 мМ раствора хлорида железа в 10 мМ растворе соляной кислоты; 20 мл раствора гексадецилтриметиламмония бромида 0,038 г/мл; 900 мл LB-агар; 0,121 г хромазурол S.

Состав среды для определения целлюлозолитической активности бактерий: среда для определения целлюлозолитической активности бактерий включает (на 1л): 15,0 г агара микробиологического; 3,5 г аммония сернокислого; 1,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного; 3,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного; 0,25 г магния серно-кислого 7-водного; 1,0 г натрия хлористого; 10,0 карбоксиметилцеллюлозы, 1,0 г дрожжевого экстракта; 20 мл раствора красителя Конго красного (0,1%); 2,0 г раствора микроэлементов (CuSO4×5H2O - 0,04 г; ZnSO4×7H2O - 0,12 г; H3BO3 - 1,4 г; Na2MoO4×2H2O - 1 г; MnSO4×H2O - 1,175 г, полный объем доводят до 1000 мл дистиллированной водой).

[0051] В лунки планшетов стерильной петлей или зубочисткой добавляют аликвоту колонии бактерии, инкубируют в темноте, через 5-7 дней проводят оценку изменений окраски среды.

[0052] В одном из вариантов реализации возможен колориметрический анализ поглощения среды в лунках планшетов при помощи планшетного сканера на длине волны 450 нм. Поглощения в лунках планшетов до инокуляции бактерий принимают за нулевые значения и отнимают от значений поглощения после инкубирования с бактериями.

[0053] В некоторых вариантах реализации изобретения в состав диагностирующих сред могут входить рН-индикаторы, для которых интервал перехода окраски индикатора лежит внутри диапазона 5-7 или другие специфические красители, например, бромфеноловый синий, бромкрезоловый пурпурный, хромазурол S, конго красный.

[0054] В ответ на выделение бактериями кислоты и солюбилизацию нерастворимого фосфата происходит изменение цвета с сине-фиолетового на желтый; в результате солюбилизации калия происходит изменение среды с сиреневой (малиновой) на желтую; за счет выделения бактериями сидерофоров происходит изменение среды с зеленой на желтую; вследствие разрушения целлюлозы происходит осветление розовой среды. Проводят отбор бактерий, обладающих 3-4 активностями, стимулирующими рост растений. Проводят посев штаммов на чистые чашки Петри с агаризованной средой Эшби методом истощающего штриха для получения чистой культуры (подтверждается микроскопическим исследованием). Отобранные штаммы подвергают дальнейшему скринингу на наличие целевых генов.

[0055] На третьей стадии осуществляют скрининг генов, определяющих активности, методом ПЦР. В варианте осуществления настоящего изобретения для скрининга генов используют праймеры, соответствующие генам фиксации атмосферного азота, солюбилизации фосфатов, синтеза сидерофоров, метаболизма этилена и ауксинов. Чистые штаммы почвенных бактерий анализируют методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени на содержание генов: ферментов, обуславливающих солюбилизацию фосфата (бета пропеллер фитаза, дегидрогеназа глюкозы, кислая и щелочная фосфатаза, фитаза), синтеза сидерофоров, ACC-деаминазы (синтез этилена), IPA-декарбоксилазы (синтез ауксина).

[0056] Гены солюбилизации фосфатов: одним из основным ферментов, продуцируемых фосфат-солюбилизирующими бактериями, в процессе минерализации органического фосфора является фитаза. Этот фермент отвечает за высвобождение фосфора из органических материалов в почве, которые хранятся в форме фитата [15]. Для анализа генов солюбилизации фосфата используют шесть пар праймеров, последовательности которых и оптимальная температура отжига приведены в Табл. 1.

Таблица 1. Праймеры для анализа генов солюбилизации фосфатов. Ген Название праймера Последовательность праймера Температура отжига, С Ссылка Фитаза phyA_f gACgCAAACCATgCgCgACgTA 56 [36] phyA_r CATCTggCATgCCCTgCgCATA phyR_1233 TTACAAACTGCACGCCGGT 56 [37] phyF_1233 CAGAGTGAGCCGGAGCTGA bpp_r gACgCAgCCgAYgAYCCNgCN[dI]TNTgg 56 [38] brr_f CAggSCgCANRTC[dI]ACRTTRTT Дегидрогеназа глюкозы gcdR CGGCGTCATCCGGGSNTNYRAYRT 56 [39] gcdF GGGCATGTCCATGTCCCANADRTCRTG Щелочная фосфатаза ALPS-F730 CAGTGGGACGACCACGAGGT 56 [40] ALPS-1101 GAGGCCGATCGGCATGTCG Кислая фосфатаза acdPho_f AAGAGGGGCATTACCACTTTATTA 51 [41] acdPho_r CGCCTTCCCAATCRCCATACAT

[0057] Гены синтеза сидерофоров: для анализа генов синтеза сидерофоров фосфата используют пару праймеров, последовательности и оптимальная температура отжига которых приведены в Табл. 2.

Таблица 2. Праймеры для анализа генов синтеза сидерофоров Праймер Последовательность Температура отжига, С Ссылка F_sider GAGAATGGATTACAGAGGAT 56 [41] R_sider TTATGAACGAACAGCCACTT

[0058] Гены ферментов синтеза этилена и ауксина: ауксин, этилен, абсцизовая кислота, цитокинин и гиббереллин относятся к хорошо известным классам фитогормонов. Бактерии, способствующие росту растений, могут увеличивать плодородие вызывая изменения в корнях растений, снабжая их значительным количеством ауксина, который будет действовать синергетически с эндогенным ауксином и изменять развитие корневой системы растений [25]. Фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат дезаминаза, отвечает за синтез этилена и косвенно вносит вклад в архитектурные и функциональные модификации корня [42]. Фермент индол-3-пируват декарбоксилаза является ключевым ферментом синтеза гетероауксина, наиболее важного из ауксинов. Для анализа генов ферментов метаболизма фосфата этилена и ауксина использовали праймеры, последовательности и оптимальная температура отжига которых приведены в Табл. 3.

Таблица 3. Праймеры для анализа метаболизма этилена и ауксина Праймер Последовательность нуклеотидов Температура отжига, С Ссылка 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-деаминаза acdSF5 GGCAACAAGMYSCGCAAGCT 56 [43] acdSF8 TGAAGTGCGTSCTSGTGCAG accF ATgAATCTgAATCgTTTTgAAC 56 [44] accR TCAgCCgTTgCggAACAg индол-3-пируват декарбоксилаза ipdC_f CAYTTGAAAACKCAMTATACTG 51 [41] ipdC_r AAGAATTTGYWKGCCGAATCT asp_f GAGAATGGATTACAGAGGAT 56 [41] asp_r TTATGAACGAACAGCCACTT

[0059] Для проведения ПЦР чистую колонию бактерий касаются кончиком стерильной петли или зубочистки, ресуспендируют в 100 мкл стерильной воды, и используют по 5 мкл в качестве матрицы для анализа методом ПЦР в режиме реального времени на наличие генов, ответственных за стимулирование роста растений. С использованием температурного градиента амплификатора подбирают оптимальную температуру отжига для данных праймеров.

[0060] В преимущественном варианте реализации изобретения результаты ПЦР-скрининга анализируют с помощью электрофоретической детекции.

[0061] Скрининг генов бактерий методом ПЦР позволяет отобрать штаммы, обладающие наибольшим количеством активностей. Бактерии, с наибольшим количеством активностей, являются перспективными для разработки инокулянтов, применяемых в сельском хозяйстве.

[0062] Подводя итог, варианты осуществления настоящего изобретения позволяют быстро и эффективно проводить скрининг большого количества почвенных бактерий, и могут значительно улучшить скорость аналитики микробных консорциумов, чтобы в последствии использовать полученные результаты при создании искусственных микробиологических сообществ для использования в сельском хозяйстве и биотехнологиях.

[0063] Для того, чтобы более четко продемонстрировать технические решения, предоставляемые настоящим изобретением, и технические эффекты, производимые настоящим изобретением, способ определения наличия микроорганизмов, способствующих росту растений в биологическом образце, предусмотренный вариантами осуществления настоящего изобретения, будет подробно описан ниже в виде конкретных примеров.

ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Постадийная реализация заявленного способа определения наличия микроорганизмов, способствующих росту растений в биологическом образце.

[0064] Собрали различные образцы почвы Дзержинского района г. Новосибирск, Новосибирской области. Путем посева почвенных комочков на безазотную среду Эшби, получены штаммы азотфиксирующих бактерий (Рис. 1). Проводили скрининг 96 изолятов азотфиксирующих бактерий на 96-луночных планшетах. Результат оценивали в серии из трех экспериментов. В ответ на выделение бактериями кислоты и солюбилизацию нерастворимого фосфата происходит изменение цвета с сине-фиолетового на желтый; в результате солюбилизации калия происходит изменение среды с розовой на желтую; за счет выделения бактериями сидерофоров происходит изменение среды с зеленой на желтую; вследствие разрушения целлюлозы происходит осветление розовой среды. Полученные результаты представлены на Рис. 2.

[0065] Из Рис. 1 видно, что некоторые штаммы проявляли четыре типа активностей, например, штаммы ID: 4, 6 и 14. Для некоторых характерно три типа активностей, для штаммов ID 1, 2, 3, 10, 15. Два типа активностей проявляли штаммы 5, 8, 9, 12. Один тип активности характерен для штаммов ID 7, 11, 16.

[0066] Для дальнейшего скрининга ПЦР-анализа выбирали штаммы, проявляющие три и больше активностей: 1-4, 6, 10, 14, 15. Выбранные штаммы бактерий рассевали методом истощающего штриха на среде Эшби, проводили морфологический анализ с помощью окрашивания по Граму и Цилю, наращивали в ночной культуре на жидкой среде Эшби, осаждали центрифугированием и из осажденных клеток выделяли ДНК согласно инструкции производителя, используя “Набор для выделения ДНК” (Биолабмикс, Новосибирск, Россия).

[0067] Использовали 14 пар праймеров и оптимизированную температуру отжига и проводили скрининг 8 штаммов почвенных бактерий на наличие генов, экспрессия которых может оказывать положительное влияние на рост растений. Результат анализировали по разнице цикла выхода продукта по сравнению с контролем, не содержащим матрицу ДНК. В таблице 4 представлены полученные данные.

Таблица 4. Скрининг генов почвенных бактерий, экспрессия которых может оказывать положительное влияние на рост растений, методом ПЦР. Цифрами обозначена разница цикла выхода продукта по сравнению с контролем, не содержащим матрицу ДНК. 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-деаминаза Фитаза Дегидрогеназа Щ. фосфатаза К. фосфатаза индол-3-пируват декарбоксилаза Сидерофоры Число выявленных активностей acdSF acc phyA phy_1233 bpp gcd ALPS acdPho ipdC asp sider 1 2,6 8,3 3,5 6 15,8 9,7 0,7 13,8 8,98 6,4 нет 10 2 3,1 7,6 6,5 12 20,9 7,7 0,1 нет нет нет нет 7 3 8,0 9,2 нет 3,1 15,8 9,3 нет нет 16 6 нет 7 4 5,7 11,2 5,1 10,2 18,8 10,8 0,4 14,6 12 6,5 1,9 11 6 9,9 7,3 нет 4,5 15,5 8,1 нет 6,2 11,9 14,4 нет 8 10 10,5 15,7 нет 9 18 10,2 нет нет 12,9 нет нет 6 14 12,9 11,4 4,8 15 нет 9,9 нет нет 16,7 1137 нет 7 15 6,4 8,07 нет 1,94 16,7 11,7 нет нет 13,5 6,6 нет 7

[0068] Общее число генов, ответственных за стимулирование роста растений, приведено в последнем столбце таблицы. В результате выявили три штамма, обладающие наибольшим набором полезных активностей: ID 1, 4, и 6. Эти штаммы перспективны для разработки инокулятов.

[0069] Также скрининг генов почвенных бактерий позволяет выявить штаммы бактерий со взаимодополняющими свойствами для разработки микробных консорциумов. В природных условиях ни один вид почвенных микроорганизмов не существует изолированно, поэтому для применения в сельском хозяйстве считается более перспективным использование многовидовых консорциумов для создания инокулянта. Благодаря метаболическим взаимодействиям между разными штамами могут возникать новые функции на уровне сообщества. Эти функции могут оказывать положительное влияние на рост и развитие растений [45]

[0070] Путем пересаживания бактерий методом истончающего штриха получили чистые штаммы. Чистота бактериальных штаммов была показана методом световой микроскопии. Бактерии окрашивали по грамму. В результате второй стадии отбора почвенных бактерий на 96-луночных планшетах отобрано 8 наиболее перспективных штаммов. Третья стадия позволила выделить три наиболее перспективных.

[0071] Далее проводили таксономическую идентификацию 16 исследованных бактерий с помощью секвенирования гена 16S рРНК (табл. 5). Способы определения идентичности последовательностей хорошо известны специалистам в данной области. В качестве примера, а не ограничения, последовательности можно выровнять и определить их идентичность с использованием алгоритма BLASTn, доступного через Национальный центр биотехнологической информации (NCBI). На Рис. 3 для примера приведен фрагмент последовательности гена 16S рРНК Agrobacterium tumefaciens.

Таблица 5. Выделенные штаммы азотфиксирующих бактерий, использованные для дальнейших стадий анализа ID Штамм 1 Agrobacterium tumefaciens 2 Amoebophilus 3 Azotobacter chroococcum 4 Azomonas macrocytogenes 5 Burkholderia paludis 6 Dyadobacter fermentans 7 Flavobacterium sp. 8 Paenibacillus sp. 9 Pseudarthrobacter equi 10 Pseudomonas izuensis 11 Pseudomonas vancouverensis 12 Ralstonia pickettii 13 Rhizobium sp. 14 Serratia plymuthica 15 Sphingobacteriaceae 16 Stenotrophomonas bentonitica

[0072] В результате проведенного исследования представлено, что наибольшим числом активностей, стимулирующих рост растений, обладают штаммы: Agrobacterium tumefaciens, Azomonas macrocytogenes, Dyadobacter fermentans. Анализ литературных источников показал, что некоторые непатогенные штаммы Agrobacterium tumefaciens упоминаются в качестве бактерий стимулирующих рост растений. Например, бактерия A. tumefaciens CCNWGS0286, способна усиливать рост растений в среде, загрязненной металлами; для этого штамма бактерии характерен синтез сидерофоров [46,47]. Azomonas macrocytogenes - азотфиксирующая бактерия [48], в условиях дефицита железа выделяет флуоресцентный сидерофор, называемый азовердин [49]. Dyadobacter fermentans - грамотрицательная бактерия, успешно растет на безазотной среде, обладает способностью ферментировать глюкозу и сахарозу [50] Информация об исследованиях в качестве бактерий, улучшающих рост растений для этих штаммов в литературе отсутствует, поэтому данные штаммы могут быть предложены в качестве новых, перспективных штаммов для дальнейшей разработки биоудобрений.

[0073] Полученные данные о перспективности Agrobacterium tumefaciens, в качестве бактерии, стимулирующей рост растений, согласуются с литературными, что подтверждает эффективность разработанного метода.

[0074] Разработанный метод позволил выделить штаммы азотфиксирующих бактерий из почвы и отобрать наиболее перспективные для инокуляции в виде моноштамма или дальнейшей разработки консорциумов. Подводя итог, варианты осуществления настоящего изобретения позволяют быстро и эффективно проводить скрининг почвенных бактерий в больших объемах.

[0075] Вышеизложенное является лишь предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, но объем настоящего изобретения этим не ограничивается, и любой специалист в данной области может легко придумать изменения или в рамках технического объема настоящего раскрытия. Предполагается, что объем настоящего изобретения охватывает альтернативные варианты. Следовательно, объем охраны настоящего изобретения должен определяться объемом формулы изобретения.

Литература:

1. Villarreal-Delgado, M.F.; Villa-Rodríguez, E.D.; Cira-Chávez, L.A.; Estrada-Alvarado, M.I.; Parra-Cota, F.I.; De los Santos-Villalobos, S. El género Bacillus como agente de control biológico y sus implicaciones en la bioseguridad agrícola. Rev. Mex. Fitopatol. Mex. J. Phytopathol. 2018, 36, doi:10.18781/R.MEX.FIT.1706-5.

2. de los Santos-Villalobos, S.; Díaz-Rodríguez, A.M.; Ávila-Mascareño, M.F.; Martínez-Vidales, A.D.; Parra-Cota, F.I. COLMENA: A Culture Collection of Native Microorganisms for Harnessing the Agro-Biotechnological Potential in Soils and Contributing to Food Security. Diversity 2021, 13, 337, doi:10.3390/d13080337.

3. De los Santos Villalobos, S.; Parra Cota, F.I.; Herrera Sepúlveda, A.; Valenzuela Aragón, B.; Estrada Mora, J.C. Colmena: colección de microorganismos edáficos y endófitos nativos, para contribuir a la seguridad alimentaria nacional. Rev. Mex. Ciencias Agrícolas 2018, 9, 191-202, doi:10.29312/remexca.v9i1.858.

4. Schillaci, M.; Raio, A.; Sillo, F.; Zampieri, E.; Mahmood, S.; Anjum, M.; Khalid, A.; Centritto, M. Pseudomonas and Curtobacterium Strains from Olive Rhizosphere Characterized and Evaluated for Plant Growth Promoting Traits. Plants 2022, 11, 2245, doi:10.3390/plants11172245.

5. Timofeeva, A.; Galyamova, M.; Sedykh, S. Prospects for Using Phosphate-Solubilizing Microorganisms as Natural Fertilizers in Agriculture. Plants 2022, 11, 2119, doi:10.3390/plants11162119.

6. Saleem, A.R.; Brunetti, C.; Khalid, A.; Della Rocca, G.; Raio, A.; Emiliani, G.; De Carlo, A.; Mahmood, T.; Centritto, M. Drought response of Mucuna pruriens (L.) DC. inoculated with ACC deaminase and IAA producing rhizobacteria. PLoS One 2018, 13, e0191218, doi:10.1371/journal.pone.0191218.

7. Singh, R.P.; Jha, P.N. The Multifarious PGPR Serratia marcescens CDP-13 Augments Induced Systemic Resistance and Enhanced Salinity Tolerance of Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One 2016, 11, e0155026, doi:10.1371/journal.pone.0155026.

8. Timofeeva, A.M.; Galyamova, M.R.; Sedykh, S.E. Bacterial Siderophores: Classification, Biosynthesis, Perspectives of Use in Agriculture. Plants 2022, 11, 3065, doi:10.3390/plants11223065.

9. Timmusk, S.; Behers, L.; Muthoni, J.; Muraya, A.; Aronsson, A.-C. Perspectives and Challenges of Microbial Application for Crop Improvement. Front. Plant Sci. 2017, 8, doi:10.3389/fpls.2017.00049.

10. Lazali, M.; Bargaz, A. Examples of Belowground Mechanisms Enabling Legumes to Mitigate Phosphorus Deficiency. In Legume Nitrogen Fixation in Soils with Low Phosphorus Availability; Springer International Publishing: Cham, 2017; pp. 135-152.

11. Zhu, F.; Qu, L.; Hong, X.; Sun, X. Isolation and Characterization of a Phosphate-Solubilizing Halophilic Bacterium Kushneria sp. YCWA18 from Daqiao Saltern on the Coast of Yellow Sea of China. Evidence-Based Complement. Altern. Med. 2011, 2011, 1-6, doi:10.1155/2011/615032.

12. Sharma, S.B.; Sayyed, R.Z.; Trivedi, M.H.; Gobi, T.A. Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils. Springerplus 2013, 2, 587, doi:10.1186/2193-1801-2-587.

13. Nannipieri, P.; Giagnoni, L.; Landi, L.; Renella, G. Role of Phosphatase Enzymes in Soil. In; 2011; pp. 215-243.

14. Jorquera, M.A.; Crowley, D.E.; Marschner, P.; Greiner, R.; Fernández, M.T.; Romero, D.; Menezes-Blackburn, D.; De La Luz Mora, M. Identification of β-propeller phytase-encoding genes in culturable Paenibacillus and Bacillus spp. from the rhizosphere of pasture plants on volcanic soils. FEMS Microbiol. Ecol. 2011, 75, 163-172, doi:10.1111/j.1574-6941.2010.00995.x.

15. Richardson, A.E.; Simpson, R.J. Soil Microorganisms Mediating Phosphorus Availability Update on Microbial Phosphorus. Plant Physiol. 2011, 156, 989-996, doi:10.1104/pp.111.175448.

16. Meena, V.S.; Maurya, B.R.; Verma, J.P.; Aeron, A.; Kumar, A.; Kim, K.; Bajpai, V.K. Potassium solubilizing rhizobacteria (KSR): Isolation, identification, and K-release dynamics from waste mica. Ecol. Eng. 2015, 81, 340-347, doi:10.1016/j.ecoleng.2015.04.065.

17. Ganz, T.; Nemeth, E. Iron homeostasis in host defence and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 500-510, doi:10.1038/nri3863.

18. Miethke, M.; Marahiel, M.A. Siderophore-Based Iron Acquisition and Pathogen Control. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007, 71, 413-451, doi:10.1128/MMBR.00012-07.

19. Raymond, K.N.; Dertz, E.A.; Kim, S.S. Enterobactin: An archetype for microbial iron transport. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 100, 3584-3588, doi:10.1073/pnas.0630018100.

20. Li, K.; Chen, W.-H.; Bruner, S.D. Microbial siderophore-based iron assimilation and therapeutic applications. BioMetals 2016, 29, 377-388, doi:10.1007/s10534-016-9935-3.

21. Ratledge, C.; Dover, L.G. Iron Metabolism in Pathogenic Bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 2000, 54, 881-941, doi:10.1146/annurev.micro.54.1.881.

22. Dertz, E.A.; Xu, J.; Stintzi, A.; Raymond, K.N. Bacillibactin-Mediated Iron Transport in Bacillus s ubtilis. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 22-23, doi:10.1021/ja055898c.

23. Scavino, A.F.; Pedraza, R.O. The Role of Siderophores in Plant Growth-Promoting Bacteria. In Bacteria in Agrobiology: Crop Productivity; Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg, 2013; pp. 265-285.

24. Ambrosi, C.; Leoni, L.; Putignani, L.; Orsi, N.; Visca, P. Pseudobactin Biogenesis in the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Pseudomonas Strain B10: Identification and Functional Analysis of the l -Ornithine N 5 -Oxygenase ( psbA ) Gene. J. Bacteriol. 2000, 182, 6233-6238, doi:10.1128/JB.182.21.6233-6238.2000.

25. Haidar, B.; Ferdous, M.; Fatema, B.; Ferdous, A.S.; Islam, M.R.; Khan, H. Population diversity of bacterial endophytes from jute (Corchorus olitorius) and evaluation of their potential role as bioinoculants. Microbiol. Res. 2018, 208, 43-53, doi:10.1016/j.micres.2018.01.008.

26. Kudoyarova, G.R.; Vysotskaya, L.B.; Arkhipova, T.N.; Kuzmina, L.Y.; Galimsyanova, N.F.; Sidorova, L. V.; Gabbasova, I.M.; Melentiev, A.I.; Veselov, S.Y. Effect of auxin producing and phosphate solubilizing bacteria on mobility of soil phosphorus, growth rate, and P acquisition by wheat plants. Acta Physiol. Plant. 2017, 39, 253, doi:10.1007/s11738-017-2556-9.

27. Saraf, M.; Jha, C.K.; Patel, D. The Role of ACC Deaminase Producing PGPR in Sustainable Agriculture. In; 2010; pp. 365-385.

28. Meza, C.; Valenzuela, F.; Echeverría-Vega, A.; Gomez, A.; Sarkar, S.; Cabeza, R.A.; Arencibia, A.D.; Quiroz, K.; Carrasco, B.; Banerjee, A. Plant-growth-promoting bacteria from rhizosphere of Chilean common bean ecotype (Phaseolus vulgaris L.) supporting seed germination and growth against salinity stress. Front. Plant Sci. 2022, 13, doi:10.3389/fpls.2022.1052263.

29. Gupta, S.; Pandey, S. ACC Deaminase Producing Bacteria With Multifarious Plant Growth Promoting Traits Alleviates Salinity Stress in French Bean (Phaseolus vulgaris) Plants. Front. Microbiol. 2019, 10, doi:10.3389/fmicb.2019.01506.

30. Hu, X.; Chen, J.; Guo, J. Two Phosphate- and Potassium-solubilizing Bacteria Isolated from Tianmu Mountain, Zhejiang, China. World J. Microbiol. Biotechnol. 2006, 22, 983-990, doi:10.1007/s11274-006-9144-2.

31. Kasana, R.C.; Salwan, R.; Dhar, H.; Dutt, S.; Gulati, A. A Rapid and Easy Method for the Detection of Microbial Cellulases on Agar Plates Using Gram’s Iodine. Curr. Microbiol. 2008, 57, 503-507, doi:10.1007/s00284-008-9276-8.

32. Mghazli, N.; Bruneel, O.; Zouagui, R.; Hakkou, R.; Sbabou, L. Characterization of plant growth promoting activities of indigenous bacteria of phosphate mine wastes, a first step toward revegetation. Front. Microbiol. 2022, 13, doi:10.3389/fmicb.2022.1026991.

33. Ortega-Urquieta, M.E.; Valenzuela-Ruíz, V.; Mitra, D.; Hyder, S.; Elsheery, N.I.; Kumar Das Mohapatra, P.; Parra-Cota, F.I.; de los Santos-Villalobos, S. Draft Genome Sequence of Priestia sp. Strain TSO9, a Plant Growth-Promoting Bacterium Associated with Wheat (Triticum turgidum subsp. durum) in the Yaqui Valley, Mexico. Plants 2022, 11, 2231, doi:10.3390/plants11172231.

34. Negi, R.; Kaur, T.; Devi, R.; Kour, D.; Yadav, A.N. Assessment of nitrogen-fixing endophytic and mineral solubilizing rhizospheric bacteria as multifunctional microbial consortium for growth promotion of wheat and wild wheat relative Aegilops kotschyi. Heliyon 2022, 8, e12579, doi:10.1016/j.heliyon.2022.e12579.

35. Mazur, H.; Konop, A.; Synak, R. Indole-3-acetic acid in the culture medium of two axenic green microalgae. J. Appl. Phycol. 2001, 13, 35-42, doi:10.1023/A:1008199409953.

36. Zinin, N. V; Serkina, A. V; Gelfand, M.S.; Shevelev, A.B.; Sineoky, S.P. Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus. FEMS Microbiol. Lett. 2004, 236, 283-290, doi:10.1111/j.1574-6968.2004.tb09659.x.

37. Sun, Z.; Yue, Z.; Yang, X.; Hao, X.; Song, M.; Li, L.; Chen, C.; Chu, C.; Li, C. Efficient Phytase Secretion and Phytate Degradation by Recombinant Bifidobacterium longum JCM 1217. Front. Microbiol. 2019, 10, doi:10.3389/fmicb.2019.00796.

38. Huang, H.; Shi, P.; Wang, Y.; Luo, H.; Shao, N.; Wang, G.; Yang, P.; Yao, B. Diversity of Beta-Propeller Phytase Genes in the Intestinal Contents of Grass Carp Provides Insight into the Release of Major Phosphorus from Phytate in Nature. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75, 1508-1516, doi:10.1128/AEM.02188-08.

39. Cleton-Jansen, A.M.; Goosen, N.; Fayet, O.; van de Putte, P. Cloning, mapping, and sequencing of the gene encoding Escherichia coli quinoprotein glucose dehydrogenase. J. Bacteriol. 1990, 172, 6308-6315, doi:10.1128/jb.172.11.6308-6315.1990.

40. Hu, Y.; Xia, Y.; Sun, Q.; Liu, K.; Chen, X.; Ge, T.; Zhu, B.; Zhu, Z.; Zhang, Z.; Su, Y. Effects of long-term fertilization on phoD-harboring bacterial community in Karst soils. Sci. Total Environ. 2018, 628-629, 53-63, doi:10.1016/j.scitotenv.2018.01.314.

41. Raddadi, N.; Cherif, A.; Boudabous, A.; Daffonchio, D. Screening of plant growth promoting traits ofBacillus thuringiensis. Ann. Microbiol. 2008, 58, 47-52, doi:10.1007/BF03179444.

42. Bal, H.B.; Nayak, L.; Das, S.; Adhya, T.K. Isolation of ACC deaminase producing PGPR from rice rhizosphere and evaluating their plant growth promoting activity under salt stress. Plant Soil 2013, 366, 93-105, doi:10.1007/s11104-012-1402-5.

43. Bouffaud, M.-L.; Renoud, S.; Dubost, A.; Moënne-Loccoz, Y.; Muller, D. 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase producers associated to maize and other Poaceae species. Microbiome 2018, 6, 114, doi:10.1186/s40168-018-0503-7.

44. Dellâ™ Amico, E.; Cavalca, L.; Andreoni, V. Analysis of rhizobacterial communities in perennial Graminaceae from polluted water meadow soil, and screening of metal-resistant, potentially plant growth-promoting bacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 2005, 52, 153-162, doi:10.1016/j.femsec.2004.11.005.

45. Park, H.; Patel, A.; Hunt, K.A.; Henson, M.A.; Carlson, R.P. Artificial consortium demonstrates emergent properties of enhanced cellulosic-sugar degradation and biofuel synthesis. npj Biofilms Microbiomes 2020, 6, 59, doi:10.1038/s41522-020-00170-8.

46. Hao, X.; Xie, P.; Johnstone, L.; Miller, S.J.; Rensing, C.; Wei, G. Genome Sequence and Mutational Analysis of Plant-Growth-Promoting Bacterium Agrobacterium tumefaciens CCNWGS0286 Isolated from a Zinc-Lead Mine Tailing. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 5384-5394, doi:10.1128/AEM.01200-12.

47. Jian, L.; Bai, X.; Zhang, H.; Song, X.; Li, Z. Promotion of growth and metal accumulation of alfalfa by coinoculation with Sinorhizobium and Agrobacterium under copper and zinc stress. PeerJ 2019, 7, e6875, doi:10.7717/peerj.6875.

48. Page, W.J.; Collinson, S.K. Characterization of Azomonas macrocytogenes strains isolated from Alberta soils. Can. J. Microbiol. 1987, 33, 830-833, doi:10.1139/m87-145.

49. Wasielewski, E.; Atkinson, R.A.; Abdallah, M.A.; Kieffer, B. The Three-Dimensional Structure of the Gallium Complex of Azoverdin, a Siderophore of Azomonas macrocytogenes ATCC 12334, Determined by NMR Using Residual Dipolar Coupling Constants. Biochemistry 2002, 41, 12488-12497, doi:10.1021/bi025990a.

50. Chelius, M.K.; Triplett, E.W. Dyadobacter fermentans gen. nov., sp. nov., a novel gram-negative bacterium isolated from surface-sterilized Zea mays stems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000, 50, 751-758, doi:10.1099/00207713-50-2-751.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ определения наличия бактерий в биологическом образце, способствующих росту растений, включающий: (а) селекцию азотфиксирующих бактерий на безазотной среде; (б) первичный скрининг бактерий, способствующих росту растений, с использованием среды для оценки определенной активности, выбранной из группы: для оценки фосфат-солюбилизирующей активности, калий-солюбилизирующей активности, сидерофорпродуцирующей активности, целлюлозолитической активности, пектиназной активности, протеазной активности, хитиназной активности; (в) получение чистой культуры; (г) вторичный скрининг бактерий методом ПЦР на последовательности генов, продукты которых участвуют в реализации признаков бактерий для роста растений. Изобретение позволяет быстро и доступно осуществить скрининг большого количества почвенных бактерий на наличие комбинации свойств, полезных для растений, с целью последующего создания микробиологических консорциумов, используемых в сельском хозяйстве для повышения продуктивности растений. 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 1 пр.

1. Способ определения наличия бактерий в биологическом образце, способствующих росту растений, включающий:

(а) селекцию азотфиксирующих бактерий на безазотной среде;

(б) первичный скрининг бактерий, способствующих росту растений, с использованием среды для оценки определенной активности, выбранной из группы: для оценки фосфат-солюбилизирующей активности, калий-солюбилизирующей активности, сидерофорпродуцирующей активности, целлюлозолитической активности, пектиназной активности, протеазной активности, хитиназной активности;

(в) получение чистой культуры;

(г) вторичный скрининг бактерий методом ПЦР на последовательности генов, продукты которых участвуют в реализации признаков бактерий для роста растений.

2. Способ по п.1, где для скрининга используют среду Эшби или другую среду, не содержащую источников азота, но отличающуюся от стандартного состава среды Эшби в отношении содержания солей и источников углерода.

3. Способ по п.1, где в качестве источника бактерий используют:

почвенную суспензию, полученную последовательным разведением в стерильном растворе,

или почвенные комочки, разложенные на агаризованной среде,

или смывы с любых поверхностей, или ризосферу растений.

4. Способ по п.1, где скрининг бактерий на наличие активностей, способствующих росту растений, проводят на планшетах с плоским дном и/или чашках Петри.

5. Способ по п.1, где скрининг бактерий на наличие активностей, способствующих росту растений, с помощью сред для определения фосфат-солюбилизирующей активности бактерий, для определения калий-солюбилизирующей активности бактерий, для определения синтеза сидерофоров бактериями, для определения целлюлозолитической активности бактерий проводят методом перекалывания изолятов с чашек или методом инокуляции изолятов после выращивания их в жидкой среде.

6. Способ по п.1, где при скрининге бактерий на наличие активностей, способствующих росту растений, используют по меньшей мере один планшет, включающий среды для оценки определенной активности, выбранной из группы: фосфат-солюбилизирующей активности, калий-солюбилизирующей активности, сидерофорпродуцирующей активности, целлюлозолитической активности, пектиназной активности, протеазной активности, хитиназной активности.

7. Способ по п.6, где состав сред включает рН-индикаторы, для которых интервал перехода окраски индикатора лежит внутри диапазона 5-7.

8. Способ по п.1, где аналитику первичного скрининга проводят спектрофотометрически.

9. Способ по п.1, где оценку качества чистых культур, выделенных для вторичного скрининга методом ПЦР, проводят с помощью световой микроскопии.

10. Способ по п.1, где с помощью вторичного скрининга методом ПЦР проводят идентификацию генов, отвечающих за: фиксацию атмосферного азота, и/или солюбилизацию фосфатов, и/или синтез сидерофоров, и/или метаболизм этилена, и/или метаболизм ауксинов.

11. Способ по пп.9, 10, где результаты ПЦР оценивают в режиме реального времени с помощью добавления интеркалирующих красителей или электрофоретической детекцией.