Набор синтетических олигонуклеотидов для одновременного генотипирования 63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью, методом ПЦР с последующей гибридизацией Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной генетики, биотехнологии, молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики, относится к набору синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов для последующей гибридизации. Изобретение может быть использовано для исследования ДНК с целью вероятностного определения фенотипа по признакам: группа крови АВ0, гаплогруппа Y-хромосомы, цвет радужной оболочки глаза, цвет волос, цвет кожи и половая принадлежность.

Уровень техники

Актуальной проблемой криминалистики и судебно-медицинской экспертизы является поиск преступника по биологическим следам, оставленным на месте преступления. Одним из направлений ведения поиска является определение фенотипических признаков, связанных с внешностью (пол, цвет глаз, волос, кожи, форма носа, ушей, черепа, рост, вес, возраст и прочие), этносом и другими признаками, облегчающими оперативно-следственную работу (группа крови АВ0). Для части из перечисленных фенотипических признаков уже известны генетические детерминанты, в высокой степени с ними ассоциированные. Большая часть этих генетических детерминант представляет собой однонуклеотидные полиморфизмы, инсерции и делеции.

В настоящее время существует ряд методов, позволяющих генотипировать однонуклеотидные и инсерционно-делеционные полиморфизмы. Вот наиболее распространенные из них:

- аллель-специфичная ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продукта;

- аллель-специфичная ПЦР в реальном времени;

- ПЦР в реальном времени с последующим плавлением продукта (HRM – high resolution melting);

- секвенирование по Сэнгеру;

- секвенирование следующего поколения (NGS);

- ПЦР с последующей гибридизацией.

Известен ряд наборов синтетических олигонуклеотидов для генотипирования ДНК-маркеров, ассоциированных с фенотипическими признаками человека.

1. В патенте RU 2582216 C2 «БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП С НАБОРОМ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА В ГЕНАХ AB0, HLA-DQA1, AMEL, DARC, NAT2» заявлен набор дифференцирующих олигонуклеотидов и ПЦР-праймеров для анализа полиморфизма в генах АВ0, HLA-DQA1, AMEL, DARC, NAT2 с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов (биочипов). Данное изобретение предназначено для определения двух фенотипических признаков: половой принадлежности и группы крови. Кроме того, при исследовании подозреваемых лиц, оно позволяет сузить круг за счет трех полиморфных локусов: HLA-DQA1, DARC и NAT2. Способ генотипирования, заявленный в изобретении, представляет собой двухстадийную «гнездную» ПЦР с последующей гибридизацией на биологических микрочипах. Двустадийная «гнездная» ПЦР требует переноса амплифицированного в первом раунде продукта в пробирку со смесью для амплификации второго раунда; этот перенос создает высокие риски кросс-контаминации между анализируемыми образцами. По этой причине предлагаемый способ применим (со всеми мерами предосторожности) для научных исследований, но малопригоден для ответственной повседневной работы, в частности связанной с поимкой опасных преступников. Кроме того, из значимых поисковых признаков изобретение позволяет определять только пол и группу крови. Учитывая, что эффективность генотипирования деградированной ДНК находится в обратной зависимости от длины ампликонов, анализ таких образцов будет затруднен в связи с тем, что авторы изобретения подбирали праймеры в широких пределах: «Ампликоны всех локусов должны варьировать по длине в пределах 250-600 п.н. для первого раунда» (RU 2582216 C2, стр.7, строка 45).

2. Известен также патент RU 0002539733 «НАБОР ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ НУКЛЕОТИДОВ И БИОЧИП ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПОСОБЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ МАРКЕРОВ ГАПЛОГРУПП Y-ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА: M130 (C), M145 (DE), P257 (G), M69 (H), U179 (I), M304 (J), M185 (L), M231 (N), M175 (O), P224 (R). В изобретении предложена структура дифференцирующих олигонуклеотидов, биочип и способ его использования для генотипирования маркеров ряда гаплогрупп Y-хромосомы. Данное изобретение ограничено только гаплогруппами Y-хромосомы и не позволяет получать иную информацию о фенотипе. С методической точки зрения изобретение обладает тем же недостатком, что и описанное в п.1: способ генотипирования связан с применением двухстадийной «гнездной» ПЦР, создающей высокие риски контаминации, что недопустимо для рутинного использования. Дифференцирующие олигонуклеотиды, описанные в патенте, по своим термодинамическим характеристикам имеют достаточно высокую температуру плавления, что снижает специфичность гибридизации и точность определения гаплогруппы. Выбранный перечень маркеров гаплогрупп Y-хромосомы также неполноценен, т.к. отсутствует разделение гаплогрупп D и E (они детектируются одним общим маркером) и отсутствует маркер для гаплогруппы B. Вероятно, это связано с методическими ограничениями мультиплексности анализа, которые авторы данного изобретения не смогли преодолеть. Также данное изобретение позволяет определять только один тип значимых поисковых признаков – гаплогруппу Y-хромосомы.

3. Известно изобретение «Способ, тест-система и праймеры для определения гаплогрупп Y-хромосомы и этнической принадлежности человека», патент RU 2558231 C2. Предлагаемый в нем способ включает проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции в два этапа: по основным гаплогруппам N, J, I, Q, С, Е, D, G, О Y-хромосомного древа и затем по субгаплогруппам. Предлагаемый способ обладает рядом существенных методических недостатков. Во-первых, протокол исследования состоит из шести этапов, каждый из которых создает риски кросс-контаминации. Кроме того, такой многостадийный протокол слишком сложен для применения в рутинной практике. Во-вторых, способ предполагает амплификацию слишком длинных, для криминалистической практики, продуктов: до 527 п.н. (в среднем, более 350 п.н.); при исследовании высокодеградированной ДНК большинство таких локусов не будет успешно амплифицировано.

Ближайшим аналогом настоящего изобретения является инструмент, описанный в п.1, и он был принят за прототип изобретения. Первым, по значимости, недостатком прототипа, является недостаточный объем получаемой фенотипической поисковой информации. Одной из особенностей судебно-генетической экспертизы является малое количество ДНК в экспертных образцах. Вследствие этого необходимо получить как можно больше информации из этого ограниченного геномного материала. Оптимальным решением является получение всей возможной фенотипической информации в ходе одной мультиплексной ПЦР. Из признаков, значимых для поиска преступника, прототип позволяет определять только пол и группу крови. Такая ограниченность, возможно, связана с тем, что на момент создания прототипа не были известны генетические маркеры, ассоциированные с другими поисковыми признаками. К другим существенным недостаткам прототипа можно отнести высокий риск кросс-контаминации при применении данного изобретения на практике, вследствие двухстадийности ПЦР и значительную длину амплифицируемых продуктов в связи с применением «гнездной» ПЦР (область отжига праймеров занимает более 80 п.н., обычно 130-200 п.н.), что вносит ограничения в исследования деградированной ДНК.

Для устранения указанных недостатков, в предлагаемом изобретении не только расширен объем получаемой поисковой информации, но и решены методические проблемы прототипа. А именно, выбраны 63 генетических маркера, ассоциированные с группой крови АВ0, 13 основными гаплогруппами У-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью [1,2]. Для одновременной амплификации всех 63-х маркеров разработан и сбалансирован набор ПЦР-праймеров, позволяющий выполнить реакцию в одну стадию, что решает проблему кросс-контаминации, которая присуща прототипу. Одновременная амплификация всех значимых локусов позволяет получать поисковую информацию с минимального количества геномного материала, что особенно актуально для криминалистических экспертиз.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей настоящего изобретения является:

Создание для 63 маркеров, ассоциированных с вышеуказанными фенотипическими признаками, набора синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР, а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов для последующей гибридизации. Причем, праймеры должны быть подобраны таким образом, чтобы обеспечивать проведение ПЦР в одну стадию и в одной реакции для всех маркеров. Олигонуклеотидные ДНК-зонды должны быть подобраны таким образом, чтобы обеспечивать достоверное генотипирование методом гибридизации.

Поставленная задача технически решена следующим образом. Для преодоления присущих прототипу недостатков, и достижения требуемых эксплуатационных характеристик, в большей мере удовлетворяющих потребностям судебно-медицинской и криминалистической экспертизы, в заявляемом техническом решении были введены следующие усовершенствования. Были выбраны 63 маркера, для которых установлена достоверная ассоциация с заявленными фенотипическими признаками [1,2]. Для этих маркеров был подобран набор синтетических праймеров таким образом, чтобы получаемый ПЦР-продукт имел минимальную длину, что позволило бы повысить результативность при исследовании деградированной ДНК. Праймеры подобраны таким образом, чтобы эффективно амплифицировать все целевые локусы в ходе одной мультиплексной ПЦР, причем обратный праймер для каждого локуса имеет универсальную вставку по 3`-концу. Протяженность амплифицируемых фрагментов прототипа составляет от 58 до 139 нуклеотидов, среднее значение длины 72,8 нуклеотида, медиана 77,5 нуклеотида. В качестве способа генотипирования (определения присутствующих в образце аллелей всех маркеров) выбран гибридизационный анализ. Принцип гибридизационного анализа состоит в проведении реакции комплементарного взаимодействия между исследуемым продуктом мультиплексной ПЦР и набором олигонуклеотидных зондов (предварительно закрепленным на поверхности подложки, в микрокаплях геля, на микросферах и т.д.), каждый из которых соответствует определенной аллели маркера. Для детекции результата гибридизации могут быть использованы любые подходящие метки (флуоресцентные, радиоактивные, ферментативные и проч.), предварительно введенные в ПЦР-продукт посредством меченых дезоксинуклеотидтрифосфатов в ходе элонгации, либо путем использования предварительно меченого праймера, или иным способом. В приведенных далее примерах для введения метки мы использовали ПЦР с флуоресцентно меченным праймером.

Таким образом, заявляемым техническим решением устранены следующие недостатки прототипа:

- малый объем получаемой поисковой фенотипической информации;

- высокий риск кросс-контаминации вследствие двухстадийности ПЦР;

- высокая протяженность амплифицируемых фрагментов.

Основными аспектами данного изобретения являются синтетические олигонуклеотиды, приведенные в Таблицах 1 и 2, а также Перечне последовательностей (SEQ ID NО: 1–SEQ ID NЩ: 251).

Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации целевых локусов, содержащих генотипируемые маркеры, характеризуется тем, что содержит 1) локус-специфичные праймеры следующего нуклеотидного состава (SEQ ID NО: 1-SEQ ID NО: 107):

Таблица 1. ПЦР-праймеры для амплификации локусов, содержащих генотипируемые полиморфизмы

SEQ ID NO: Номер полиморфизма Название
праймера Последовательность 5’-3’ 1 rs6119471 ASIP_F AGAAGTAGCTGTACTAGACGGGATCC 2 rs6119471 ASIP_R CACTTGAGAGGAGGCTAACCCGA 3 rs3114908 ANKRD_F AGCAGGAAGGAGAACAGAGAAGGG 4 rs3114908 ANKRD_R CTAGGCCATGCGTCCCTTTCT 5 rs10756819 BNC_F ACTTCACTGGACCAGTTATTTTGGGTTTG 6 rs10756819 BNC_R GTCTTCCTAGACATCCCGTCATGAC 7 rs8051733 DEF_F GTGGTCTCTCTCTCGGCCTCAG 8 rs8051733 DEF_R GGCCCCTCTTCCACCCTGCCT 9 rs2238289 HERC89_F GATTCAGGTCTGCTGTCACTGCTCA 10 rs2238289 HERC89_R CATGAAGATTTCCCAGTTGTAGAGATT 11 rs6497292 HERC92 TGCCACAGGAACCAAAAAGTCAC 12 rs6497292 HERC92 ACAGGTTGTCTCCTGTGTCTTCA 13 rs1129038 HERC038 ACCAGGCAGCCTACAGTCTACACA 14 rs1129038 HERC038 AACGTCCTCGTGAGATGAGAGCC 15 rs12913832 HERC832 GCGAGGCCAGTTTCATTTGAG 16 rs12913832 HERC832 CCCTGATGATGATAGCGTGCAGA 17 rs1667394 HERC94 AGACGCAGCAATTCAAAACGTGCA 18 rs1667394 HERC94 CCTTTCAGTTCTATTCATTGTTTCTTTGTTTGTT 19 rs12203592 IRF592 GTGAATGACAGCTTTGTTTCATCCACT 20 rs12203592 IRF592 GTCATATGGCTAAACCTGGCACC 21 rs12821256 KITLG CAGGTGTGAAGTTGTGTGGCAGAAG 22 rs12821256 KITLG TGGAGCCAAGGGCATGTTACTACG 23 rs12896399 LOC105370627 GGCGATCCAATTCTTTGTTCTTT 24 rs12896399 LOC105370627 GGAAGGTTAATCTGCTGTGACA 25 rs4959270 LOC105374875 ACATGAGATCTGGGTGAGGAACAC 26 rs4959270 LOC105374875 AAGAACCACCATGTCAGTGTTCTTACC 27 rs3212355 MC1R55 AAGATGCCTGCAGTGGGTGCCAG 28 rs3212355 MC1R55 GCGTGGCCCCGAAGCCCAGCA 29 rs796296176 MC1R176 TCAACTCCACCCCCACAGCCAT 30 rs796296176 MC1R176 CCTCCAGGCACCGGGCTCCTG 31 rs1805005 MC1R05 CTGGTGAGCTTGGTGGAGAAC 32 rs1805005 MC1R05 GGTTCCGGTTCTTGGCGATG 33 rs1805006; rs2228479 2MCR06_F CACTCACCCATGTACTGCTTCATCTG 34 rs1805006; rs2228479 2MC8479_R GGAGGATGACGGCCGTCTCCA 35 rs11547464; rs1805007; rs201326893; rs1110400; rs1805008; rs885479 6MC464_F AGCCTCTGCTTCCTGGGCGCCA 36 rs11547464; rs1805007; rs201326893; rs1110400; rs1805008; rs885479 6MC5479_R TGCTGAAGACGACACTGGCCAC 37 rs1805009 MC1R09 ACCTCTTTCTCGCCCTCATCAT 38 rs1805009 MC1R09 CATGTCAGCACCTCCTTGAGC 39 rs1800407 OCA407 GCCGCGATGAGACAGAGCATGA 40 rs1800407 OCA407 GTGTGTGTGTGTGGCCAGGCA 41 rs1800414 OCA414 GGCATTTGGCGAGCAGAATCCCGT 42 rs1800414 OCA414 GCAGAGTAAATGAGCTGTGGTTTCT 43 rs1470608 OCA608 TGTTAGGGTTGATGGTAACCTTTGTT 44 rs1470608 OCA608 ACAGTTTGTAGACATTCTCTTAAAAATATTAATTTG 45 rs1545397 OCA397 GGATACTGACAATGGTTGTACAACTTTG 46 rs1545397 OCA397 TCATGGGGGAGAGAGAATGACTCA 47 rs12441727 OCA727 TCCCTGCCCCTTGGCTTGGCTCA 48 rs12441727 OCA727 GGTACCTCAAGGAGGATAAGGCTTT 49 rs2378249 PIGU AGCTAACTAAGGGCACAAGTCTA 50 rs2378249 PIGU CTTTTCAGCCCACACCTCTCCTCA 51 rs6059655 RALY TGTGAGGAAATCGAGGCTCAGAA 52 rs6059655 RALY TCCCTACGAGCTGATGCCCTGA 53 rs17128291 SLC291 GCCAGCACTGCCAAAATAACAAT 54 rs17128291 SLC291 CAGTAAAGAATCTGACAATGTGCAC 55 rs2402130 SLC130 TGCTGTATGGAAGTATTTGAACCA 56 rs2402130 SLC130 ATGATGATGATGATGATGATGGCAGC 57 rs1426654 SLC654 TCAGCCCTTGGATTGTCTCAGG 58 rs1426654 SLC654 ATTCAGGAGCTGAACTGCCCGC 59 rs28777 SLC777 CAGTTGATTTCATGTGATCCTCACA 60 rs28777 SLC777 CCCCTCCAAGAGTCGCATAGGAC 61 rs16891982 SLC982 GAGAAAGACTTACAAGAATAAAGTGAGGA 62 rs16891982 SLC982 GCCCTATAGTGCACACAACTCCAC 63 rs1042602 TYR602 TGCATTATTATGTGTCAATGGATGCA 64 rs1042602 TYR602 TCATGGGCAAAATCAATGTCTCT 65 rs1393350 TYR350 CTACTCTTCCTCAGTCCCTTCTCT 66 rs1393350 TYR350 GGGAAGGTGAATGATAACACGAACAGAT 67 rs1126809 TYR809 CCTTTTCCTCTGCAGTATTTTTGAG 68 rs1126809 TYR809 TGGGTGCATTGGCTTCTGG 69 rs683 TYRP TGAGTTATTAACTGTATTTTCTTTCACTTTATT 70 rs683 TYRP TCCCAGCTTTGAAAAGTATGCCTAGA 71 rs2032623 YB_F ACATACAGACTCTGTCTTTACATTTCAAAA 72 rs2032623 YB_R CAACATTGAGTAACCACTGTGT 73 rs35284970 YC_F CTGTACTTACTTTTATCTCCTCTTCTATTG 74 rs35284970 YC_R GTAAGTCGAATGCCCTTTCC 75 rs202084622 YD_F TGGTTTTCTGTCCCATTTGGGCC 76 rs202084622 YD_R TCGTGGGTTTTCTGGAATGAG 77 rs9786534 YE_F CACAACAAAAAAATAGATGGCTGGGT 78 rs9786534 YE_R CTCAAGCACTCCATCTGCCTA 79 rs2740980 YG_F CTCCGATTCCTTAATTATCCCAC 80 rs2740980 YG_R GTAAATCTTTCATCTCCAACCCC 81 rs576940616 YH_F TCCCTGTATTCTTGTGTCTACTG 82 rs576940616 YH_R TGCTCTCCTGAGGTGGTTTCT 83 rs2319818 YI_F GATCAATAACAAGTTCTGAAATTAAGGCTG 84 rs2319818 YI_R TTGCCAGCTCCTCTTTTCA 85 rs13447352 YJ_F GTGGGATTTTTTTAGATGTGTTCAAT 86 rs13447352 YJ_R ACGTCTTATACCAAAATATCACC 87 rs2032607 YL_F CCAAAGAGCCTCTCTAGCCGCA 88 rs2032607 YL_R CCCTCTGGTTAACATTTACAATTGC 89 rs9341278 YN_F CTAAAAAACAACATTTACTGTTTCTACTG 90 rs9341278 YN_R GACACCACAGAAATTACAGGTATGA 91 rs2032678 YO_F CCAGTGATTTAAACTCTCTGAATCA 92 rs2032678 YO_R TCTACTGATACCTTTGTTTCTGTTCATTCT 93 rs563604826 YQ_F TCTGCTGAGAAGCCTGCATAGC 94 rs563604826 YQ_R TCTTAAAGGCAGCTAGAGAGA 95 rs17307398 YR_F TGAATTCAGATTCTCTGGAATCTTGT 96 rs17307398 YR_R GGAAAGTTAGTGGTTTCAGTCA 97 rs9341308 YT_F TGGGCATTACTCTTTGCTCTC 98 rs9341308 YT_R AAACCTTATTATACACACAACCCG 99 rs8176719; rs8176720 ABO6_F CACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGA 100 rs8176719; rs8176720 ABO6_R GAATGGTGGTGTTCTGGAGC 101 rs8176741; rs8176742 ABO7_F TGGTGTGCGTGGACGTGGACA 102 rs8176741; rs8176742 ABO7_R GGGGTGCAGGGTGCCGA 103 - DYS14_F TGTTGTATCCTTCTCAGTGTTTCT 104 - DYS14_R GGTCACTTACACTTCCCCGA 105 - AMELXY_F ACCCCTTTGAAGTGGTACCAGAG 106 - AMELX_R TCCCATTAATGTCTGCATGTGGAGT 107 - AMELY_R TTCCCATTAGTGTCTGTATGTGGAGT

2) дополнительно, каждый обратный праймер (праймер, в названии которого указано «_R»,) с четным номером «Seq ID» (Seq ID NO:2, 4, 6 … 106), а также Seq ID NO: 107 имеет со стороны 5`-конца универсальную олигонуклеотидную вставку, например 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`, или любую иную. Таким образом, каждый локус-специфичный обратный праймер имеет следующую последовательность: 5`-TCATTGGATCTCATTANNN…NNN-3` , где “NNN…NNN” – его специфичная составляющая, а “TCATTGGATCTCATTA” – универсальная.

Локус-специфичные праймеры добавляют в количестве, обеспечивающем их конечную концентрацию от 1 нМ до 0,5 мкМ. Помимо приведенных праймеров, в реакционную смесь для амплификации вносят универсальный праймер, имеющий последовательность, идентичную универсальной вставке обратных праймеров, например, 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`. В случае применения флуоресцентного маркирования, используют универсальный праймер с флуорофором (например, Су5, Су7, Су7.5 и т.д.) по 5`-концу. Концентрация универсального праймера должна составлять от 0,1 мкМ до 100 мкМ. Также, в реакционную смесь для амплификации входят следующие компоненты:

- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP);

- полимераза (Taq-, HotTaq-, или иная);

- реакционный буфер, оптимизированный для работы соответствующей полимеразы, например: 70 mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C); 17 mM (NH₄)₂SO₄; 0.01% Tween-20. 2 ммоль MgCl₂;

- для флуоресцентного маркирования посредством встраивания флуоресцентно меченных дезоксинуклеотидтрифосфатов в растущую цепь ПЦР-продукта, в реакционную смесь вносят соответствующий меченый дезоксинуклеотидтрифосфат в концентрации, обеспечивающей эффективное мечение (например, 0,05 мМ дУТФ-Су5). Флуоресцентное маркирование может осуществляться как одним из способов, так и их сочетанием.

Подготовленная смесь для амплификации также должна содержать исследуемую ДНК в количестве не менее 1 пкг. В качестве исследуемого образца могут быть использованы образцы ДНК, выделенные из любого биологического материала, содержащего геномную ДНК (кровь, слюна, волосяная луковица, потожировые следы, сперма, мазки со слизистой и другие). Максимальное количество вносимой ДНК регламентируется лишь вязкостью ее раствора: при очень высоких концентрациях (более 1 мкг/мкл) возрастает вязкость раствора, что затрудняет его перенесение микродозатором. В этом случае рекомендуется разбавить раствор. Внесение компонентов в смесь для амплификации может происходить в любом порядке.

Амплификацию следует проводить в пробирках, стрипах, планшетах или иных емкостях, предназначенных для этой цели. После приготовления, смесь для амплификации помещают в прибор (амплификатор), обеспечивающий циклическую смену температур по заданной программе, например:

№ Температура Время Количество циклов 1 95°С 1 мин 1 2 95°С 30 сек 50 3 60°С 60 сек 4 72°С 20 сек 5 95°С 20 сек 50 6 50°С 10 сек 7 72°С 30 сек 8 72°С 5 мин 1

Амплификатор должен быть снабжен крышкой, нагреваемой до температуры, исключающей скопление конденсата в верхней части пробирки (стрипа, планшета), обычно 100-110ºС. Если используется прибор, не имеющий нагревающейся крышки, то при приготовлении смеси реагентов, в нее необходимо добавить минеральное масло для исключения испарения водной части смеси.

В ходе температурного циклирования на первом этапе (№№2-4) происходит симметричная амплификация всех входящих в набор локусов. Универсальный праймер имеет меньшую температуру отжига, чем локус-специфичные праймеры, поэтому на этой стадии он не участвует в реакции. Задача первой стадии – максимально эффективно амплифицировать локус в виде двуцепочечного фрагмента ДНК. Т.к. гибридизационный анализ требует присутствия одной цепи, комплементарной иммобилизованному ДНК-зонду (а в результате симметричной ПЦР первого этапа обе цепи связаны друг с другом), требуется стадия асимметричной амплификации. Это происходит на втором этапе: вследствие понижения температуры отжига, в реакцию вступает универсальный праймер. Т.к. он берется в существенно большей концентрации, чем локус-специфичные праймеры, на второй стадии происходит асимметричный синтез той цепи, которая комплементарна соответствующему ДНК-зонду. В итоге такой амплификации образуется смесь преимущественно одноцепочечных меченых ампликонов.

Разработанные нами зонды для генотипирования предлагаемой в данном изобретении панели маркеров приведены в Таблице 2 и перечне SEQ ID NО: 108-SEQ ID NО: 229.

Таблица 2. Аллель-специфичные ДНК-зонды для гибридизации

SEQ ID NO: Номер полиморфизма Название зонда Последовательность 5’-3’ 108 rs6119471 ASIP9471_C TCCCAGGTCTTACGC 109 rs6119471 ASIP9471_G CCAGGTgTTACGCA 110 rs3114908 ANKRD_C GCACTTCGTAGTGG 111 rs3114908 ANKRD_T GCACTTtGTAGTGG 112 rs10756819 BNC_G GGGTTTGGAGATCATA 113 rs10756819 BNC_A GGGTTTGGAAATCATAC 114 rs8051733 DEF_RA GAARGGCACGAGAC 115 rs8051733 DEF_G AAGGCgCGAGACA 116 rs2238289 HERC89_A TTCCCAGGCTCCAA 117 rs2238289 HERC89_G AATTCCCgGGCTC 118 rs6497292 HERC92_A CATGCAGCAAGGATG 119 rs6497292 HERC92_G GCAGCgAGGATGAA 120 rs1129038 HERC038_C CAGCGAGCGCTCTG 121 rs1129038 HERC038_T CGAGTGCTCTGCT 122 rs12913832 HERC832_A TGAGCATTAAATGTCAA 123 rs12913832 HERC832_G AGCATTAAGTGTCAAG 124 rs1667394 HERC94_T CGTGCATATACCAAA 125 rs1667394 HERC94_C CGTGCATAcACCAA 126 rs12203592 IRF592_C AGAAGGCAAATTCC 127 rs12203592 IRF592_T AGAAGGTAAATTCCCC 128 rs12821256 KITLG_T TTTAGTGTGCCGT 129 rs12821256 KITLG_C CCTTTAGcGTGCCG 130 rs12896399 LOC399_G TTTTGGGGTCTCTTTG 131 rs12896399 LOC399_T TTTGGGTTCTCTTTGTC 132 rs4959270 LOC270_C ACACTATGCCACTTC 133 rs4959270 LOC270_A CACTATGaCACTTCCA 134 rs3212355 MC55_C CACCGTCCCTGC 135 rs3212355 MC55_T ACCGTtCCTGCT 136 rs796296176 MC176_Del GCTGCCAACCAGAC 137 rs796296176 MC176_In CTGCCAAACCAGACA 138 rs1805005 MC05_G CTGGTGGTGGCCA 139 rs1805005 MC05_T TGGTGtTGGCCAC 140 rs1805006 MC06_C TTGTCGGACCTGCTG 141 rs1805006 MC06_A TGTCGGAACTGCTG 142 rs2228479 MC8479_G AGCAACGTGCTGGA 143 rs2228479 MC8479_A GAGCAACaTGCTGGA 144 rs11547464 MC464_G GACCGCTACATCTC 145 rs11547464 MC464_A GACCACTACATCTCC 146 rs1805007 MC07_C GACTGCGCTACCA 147 rs1805007 MC07_T GCACTGTGCTACCA 148 rs201326893 MC893_C GYGCTACCACAGCAT 149 rs201326893 MC893_A GYGCTAaCACAGC 150 rs1110400 MC400_T CACAGCATCGTGA 151 rs1110400 MC400_C CACAGCAcCGTGA 152 rs1805008 MC08_C CCTGCCGCGGGCGC 153 rs1805008 MC08_T CCCTGCCGTGGGCG 154 rs885479 MC5479_G CGGCGAGCCGT 155 rs885479 MC5479_A CGCGGCaAGCCG 156 rs1805009 MC09_G CATCGACCCCCTCAT 157 rs1805009 MC09_C ATCATCCACCCCCTC 158 rs1800407 OCA407_C CGTCCCCGGGAGAGC 159 rs1800407 OCA407_T CCGTCCCTGGGAGA 160 rs1800414 OCA414_T TATCCTATGCTGTAAGA 161 rs1800414 OCA414_C ATCCTAcGCTGTAAGAG 162 rs1470608 OCA608_T TCATTACAGATGGTGC 163 rs1470608 OCA608_C TTACAGAgGGTGCAA 164 rs1545397 OCA397_A TACTAAAATACACTGAATGA 165 rs1545397 OCA397_T TAAAATACtCTGAATGATATA 166 rs12441727 OCA727_G GCCTTGGGCAAAA 167 rs12441727 OCA727_A GGCCTTaGGCAAAA 168 rs2378249 PIGU_A GCACAGTAATGGGC 169 rs2378249 PIGU_G CACAGTAgTGGGCT 170 rs6059655 RALY_G TGGCGTGCTCAG 171 rs6059655 RALY_A TGAGTGGCaTGCT 172 rs17128291 SLC291_A TGAACTTTCCAGACTTTT 173 rs17128291 SLC291_G AACTTTCCgGACTTTT 174 rs2402130 SLC130_G CCCGTGGTAGCT 175 rs2402130 SLC130_A CCCGTGaTAGCTG 176 rs1426654 SLC654_G TGCAGGCGCAAC 177 rs1426654 SLC654_A GCAGGCaCAACTTTC 178 rs28777 SLC777_C ACAGCAGCCTCTGA 179 rs28777 SLC777_A CACAGCAGaCTCTGA 180 rs16891982 SLC982_C TGATGCACAAGCCCC 181 rs16891982 SLC982_G TGATGCAGAAGCCCC 182 rs1042602 TYR602_C TGGGGGATCTGAAAT 183 rs1042602 TYR602_A TTGGGGGATaTGAAAT 184 rs1393350 TYR350_G GCAACGAAATCTGTG 185 rs1393350 TYR350_A CTCTGCAACAAAATCTGT 186 rs1126809 TYR809_G GCTCCGAAGGCA 187 rs1126809 TYR809_A TGGCTCCaAAGGCA 188 rs683 TYRP_C ATATGTTAGCATTAAAGTTC 189 rs683 TYRP_A GCATATGTTAGaATTAAAGT 190 rs2032623 B_Del TGACTTAAAGATCAGGC 191 rs2032623 B_In ACTTAAAGTATCAGGCAC 192 rs35284970 YC_C TTGGATTTCCCTGCC 193 rs35284970 YC_T GGATTTCTCTGCCCA 194 rs202084622 YD_G GCCAGGCGTTCCT 195 rs202084622 YD_A GGCCAGGCaTTCCTT 196 rs9786534 YЕ.2_A CCTGTAATCCCAG 197 rs9786534 YЕ.2_T CCTGTTATCCCAG 198 rs2740980 YG_M257_G ATTTCTGGTGGCCC 199 rs2740980 YG_M257_A ATTTCTGATGGCCCA 200 rs576940616 YH_G CGGCGATGAAAGTTC 201 rs576940616 YH_T ACGGCGATtAAAGTTC 202 rs2319818 YI_U179_G ATGAAAGCCCAGGAC 203 rs2319818 YI_U179_A TGAAAACCCAGGACC 204 rs13447352 YJ_M304_A TTGTGAAACAACTGGTG 205 rs13447352 YJ_M304_C GTGACACAACTGGTG 206 rs2032607 YL_M185_C GAGGCCGCATGGT 207 rs2032607 YL_M185_T GAGGCTGCATGGTC 208 rs9341278 YN_M231_G CTACTGCTTTCGAATTGGG 209 rs9341278 YN_M231_A TACTGCTTTCAAATTGGG 210 rs2032678 YO_M175_IN CTCACTTCTCTTCTCAAGAAT 211 rs2032678 YO_M175_DEL CTCACTTCTCAAGAATGA 212 rs563604826 YQ_G TGTAGGTGACCTACCCT 213 rs563604826 YQ_A GTAGGTaACCTACCCT 214 rs17307398 YR_P224_C TGACATCTTCCCCTGCTG 215 rs17307398 YR_P224_T ACATCTTTCCCTGCTG 216 rs9341308 YT_A CCGAAAACCCACTAA 217 rs9341308 YT_G TCCCGAAgACCCAC 218 rs8176719 ABO6ex261w CTCGTGGTGACCCCT 219 rs8176719 ABO6ex261m CTCGTGGTACCCCTTG 220 rs8176720 ABO6ex297w AGGGCACATTCAACATC 221 rs8176720 ABO6ex297m AGGGCACGTTCAACAT 222 rs8176741 ABO7ex681w CTGACTCCGCTGTTC 223 rs8176741 ABO7ex681m CTGACTCCACTGTTCG 224 rs8176742 ABO7ex657w CGCGACCACGTGGGCG 225 rs8176742 ABO7ex657m GCGACCATGTGGG 226 - DYS_V1 TCTTCGGCCTTTCTAGTGGAGA 227 - DYS_Olig TCTAGTGGAGAGGTGCTCT 228 - AMELX CAGAGCATAAGGCCA 229 - AMELY CAGAGCATGATAAGACCA

Для генотипирования с помощью гибридизации, аллель-специфичные ДНК-зонды закрепляются любым известным способом на подложке. Для этого наиболее применима технология биочипов, как двумерных, с креплением зондов к плоскости, так и трехмерных, с иммобилизацией в массе пористого полимерного носителя. Для закрепления ДНК-зондов, к ним может быть привита соответствующая химическая группа, или любое иное соединение, способствующее реализации данной цели. ДНК-зонды располагают на подложке согласно заданной схеме. Схема расположения ячеек может быть произвольной, мы использовали схему, приведенную на Фиг.1. Для проведения гибридизации ПЦР-продукт обычно смешивают с буферным раствором, который также может содержать денатурирующие агенты (формамид, диметилсульфоксид, гуанидин и другие), и наносят на биочип. Условия гибридизации подбираются таким образом, чтобы флуоресцентно меченные одноцепочечные фрагменты ДНК специфично связывались с полностью комплементарными им ДНК-зондами, локально иммобилизованными на биочипе. Для того чтобы определить генотип образца, необходимо зарегистрировать флуоресцентное изображение биочипа. ДНК-зонды, образовавшие совершенные дуплексы с исследуемым фрагментом ДНК, будут флуоресцировать в соответствующем флуорофору диапазоне длин волн. Для регистрации флуоресцентного изображения могут быть использованы сканеры, широкопольные микроскопы, или иные подходящие для этого средства. Флуоресцентное изображение анализируется и обсчитывается с помощью программного обеспечения. Пример такого изображения приведен на Фиг. 2. На Фиг. 3 приведены варианты гибридизационного изображения в зависимости от аллельного состояния маркера в образце. Интерпретация результатов генотипирования проводится экспертом исходя из общеизвестных генетических принципов наследования биаллельных маркеров.

Список литературы:

1. S.Walsh, F.Liu A.Wollstein, L.Kovatsi, A.Ralf, A.Kosiniak-Kamysz, W.Branicki, M.Kayser. The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA. Forensic Science International: Genetics, 2013, Vol.7, Issue 1, P. 98-115.

2. F. Monteiro, G. Tavares, M. Ferreira, A. Amorim, P. Bastos, C. Rocha, F. Araújo, L. M. Cunha-Ribeiro. Technologies involved in molecular blood group genotyping. ISBT Science Series, 2011, V.6, P. 1–6.

Описание чертежей

На Фигуре 1 приведен один из множества возможных вариантов схемы расположения ячеек с олигонуклеотидными ДНК-зондами, который мы использовали для иллюстрации осуществления данного изобретения. Номера на схеме соответствуют номерам олигонуклеотидов в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 108-229). Данная схема не является принципиальной, и дизайн ее может быть произвольным.

На Фигуре 2 приведено флуоресцентное изображение биочипа после проведения гибридизации.

На Фигуре 3 показано три варианта аллельного состояния маркера: два варианта гомозиготного состояния (А) и (В

Осуществление изобретения

Пример 1. Олигонуклеотидный биочип для генотипирования 63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью.

Олигонуклеотидные ДНК-зонды синтезировали согласно перечню SEQ ID NО: 108-SEQ ID NО: 229 (Таблица №2) таким образом, что 3’-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой. Биочип изготавливали методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле аналогично описанному ранее (Патент на изобретение N 2175972 «Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа» Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999), а именно, готовили полимеризационную смесь, соответствующую 5% полиакриламидному гелю: 5% акриламид-бисакриламид (19:1), 40% глицерин, 2% ацетон, 1,2% ТЕМЕД, 0,1 М натрий фосфатный буфер, pH 7,0. Концентрация ДНК-зондов составляла 200 мкМ. Капли наносили с помощью роботизированной станции QArray 2 (Genetix Ltd, New Milton, Hampshire, UK) на пластиковую подложку. Ячейки наносили рядами, согласно схеме на Фиг.1. Диаметр капли 100-150 мкм. Полимеризацию проводили под УФ лампой в атмосфере азота. Время экспозиции 40 мин при длине волны 254 нм. После проведения сополимеризации проводили отмывку от непрореагировавших реагентов в дистиллированной воде. Биочип высушивали при комнатной температуре и помещали на хранение в темное сухое место.

Пример 2. Мультиплексная амплификация локусов, содержащих 63 генотипируемых ДНК-маркера методом ПЦР с целью наработки одноцепочечных флуоресцентно меченных фрагментов.

Из слюны испытуемых выделяли ДНК набором Lumipure (ООО «Биотех-индустрия», Москва). Для мультиплексной наработки всех анализируемых генов использовали ПЦР-праймеры SEQ ID NO: 1-107 в концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ, отличающиеся тем, что каждый обратный праймер с четным номером «Seq ID» (Seq ID NO:2, Seq ID NO:4… Seq ID NO:106) и Seq ID NO:107, имел со стороны 5`-конца универсальную олигонуклеотидную вставку, с последовательностью 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`. Флуоресцентно меченный (Су5-, возб./исп.: 640/657 нм) универсальный праймер Су5-TCATTGGATCTCATTA-3`добавляли в конечной концентрации 6 мкМ. ПЦР проводили на амплификаторе T-100 (Bio-Rad laboratories, США) в объеме 25 мкл реакционной смеси, составом: 1× буфер (67 мМ Трис-HCl, pH 8,6, 166 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% Тритон Х-100), 2,0 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого из dNTP («Силекс», Россия), ПЦР-праймеры (SEQ ID NO: 1-107) в концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ, 1 мкл геномной ДНК и 2,5 ед. акт. HotTaq-полимеразы («Сибэнзим», Россия). Амплификацию проводили по программе:

№ Температура Время Количество циклов 1 95°С 1 мин 1 2 95°С 30 сек 50 3 64°С 60 сек 4 72°С 20 сек 5 95°С 20 сек 50 6 50°С 10 сек 7 72°С 30 сек 8 72°С 5 мин 1

Пример 3. Гибридизация флуоресцентно меченного ПЦР-продукта на биочипе и регистрация результатов.

ПЦР-продукт, полученный в Примере 2, использовали для гибридизации на биочипе, полученном в Примере 1, в буфере следующего состава: 25% формамид (GibcoBRL), 5хSSPE. 30 мкл смеси вносили в гибридизационную камеру биочипа. Гибридизацию проводили в течение 5 ч при температуре 37°С. Отмывку выполняли в буфере 1х SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.

Регистрацию гибридизационной картины производили с помощью универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК), производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва). На Фиг.2 приведено флуоресцентное изображение биочипа после гибридизации и отмывки. На Фиг.3 приведены три возможных типичных флуоресцентных изображения маркера, отражающих его аллельное состояние. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программного обеспечения выходит за рамки настоящего изобретения.

--->

Перечень последовательностей

<110> Fesenko, Denis O

Ivanovskii, Ivan D

<120> Набор синтетических олигонуклеотидов для одновременного генотипирования

63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами

Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой

принадлежностью, методом ПЦР с последующей гибридизацией.

<130> HP 1.0

<160> 229

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_007_F

<400> 1

agaagtagct gtactagacg ggatcc 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_007_R

<400> 2

cacttgagag gaggctaacc cga 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_031_F

<400> 3

agcaggaagg agaacagaga aggg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_031_R

<400> 4

ctaggccatg cgtccctttc t 21

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_041_F

<400> 5

acttcactgg accagttatt ttgggtttg 29

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_041_R

<400> 6

gtcttcctag acatcccgtc atgac 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_059_F

<400> 7

gtggtctctc tctcggcctc ag 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_059_R

<400> 8

ggcccctctt ccaccctgcc t 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_083_F

<400> 9

gattcaggtc tgctgtcact gctca 25

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_083_R

<400> 10

catgaagatt tcccagttgt agagatt 27

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_101_F

<400> 11

tgccacagga accaaaaagt cac 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_101_R

<400> 12

acaggttgtc tcctgtgtct tca 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_119_F

<400> 13

accaggcagc ctacagtcta caca 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_119_R

<400> 14

aacgtcctcg tgagatgaga gcc 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_154_F

<400> 15

gcgaggccag tttcatttga g 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_154_R

<400> 16

ccctgatgat gatagcgtgc aga 23

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_170_F

<400> 17

agacgcagca attcaaaacg tgca 24

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_170_R

<400> 18

cctttcagtt ctattcattg tttctttgtt tgtt 34

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_192_F

<400> 19

gtgaatgaca gctttgtttc atccact 27

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_192_R

<400> 20

gtcatatggc taaacctggc acc 23

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_208_F

<400> 21

caggtgtgaa gttgtgtggc agaag 25

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_208_R

<400> 22

tggagccaag ggcatgttac tacg 24

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_223_F

<400> 23

ggcgatccaa ttctttgttc ttt 23

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_223_R

<400> 24

ggaaggttaa tctgctgtga ca 22

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_233_F

<400> 25

acatgagatc tgggtgagga acac 24

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_233_R

<400> 26

aagaaccacc atgtcagtgt tcttacc 27

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_240_F

<400> 27

aagatgcctg cagtgggtgc cag 23

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 01_240_R

<400> 28

gcgtggcccc gaagcccagc a 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_011_F

<400> 29

tcaactccac ccccacagcc at 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_011_R

<400> 30

cctccaggca ccgggctcct g 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_036_F

<400> 31

ctggtgagct tggtggagaa c 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_036_R

<400> 32

ggttccggtt cttggcgatg 20

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_042_F

<400> 33

cactcaccca tgtactgctt catctg 26

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_042_R

<400> 34

ggaggatgac ggccgtctcc a 21

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_061_F

<400> 35

agcctctgct tcctgggcgc ca 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_061_R

<400> 36

tgctgaagac gacactggcc ac 22

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_080_F

<400> 37

acctctttct cgccctcatc at 22

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_080_R

<400> 38

catgtcagca cctccttgag c 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_101_F

<400> 39

gccgcgatga gacagagcat ga 22

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_101_R

<400> 40

gtgtgtgtgt gtggccaggc a 21

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_113_F

<400> 41

ggcatttggc gagcagaatc ccgt 24

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_113_R

<400> 42

gcagagtaaa tgagctgtgg tttct 25

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_150_F

<400> 43

tgttagggtt gatggtaacc tttgtt 26

<210> 44

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_150_R

<400> 44

acagtttgta gacattctct taaaaatatt aatttg 36

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_215_F

<400> 45

ggatactgac aatggttgta caactttg 28

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_215_R

<400> 46

tcatggggga gagagaatga ctca 24

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_231_F

<400> 47

tccctgcccc ttggcttggc tca 23

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 02_231_R

<400> 48

ggtacctcaa ggaggataag gcttt 25

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_016_F

<400> 49

agctaactaa gggcacaagt cta 23

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_016_R

<400> 50

cttttcagcc cacacctctc ctca 24

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_030_F

<400> 51

tgtgaggaaa tcgaggctca gaa 23

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_030_R

<400> 52

tccctacgag ctgatgccct ga 22

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_063_F

<400> 53

gccagcactg ccaaaataac aat 23

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_063_R

<400> 54

cagtaaagaa tctgacaatg tgcac 25

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_082_F

<400> 55

tgctgtatgg aagtatttga acca 24

<210> 56

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_082_R

<400> 56

atgatgatga tgatgatgat ggcagc 26

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_100_F

<400> 57

tcagcccttg gattgtctca gg 22

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_100_R

<400> 58

attcaggagc tgaactgccc gc 22

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_107_F

<400> 59

cagttgattt catgtgatcc tcaca 25

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_107_R

<400> 60

cccctccaag agtcgcatag gac 23

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_124_F

<400> 61

gagaaagact tacaagaata aagtgagga 29

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_124_R

<400> 62

gccctatagt gcacacaact ccac 24

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_162_F

<400> 63

tgcattatta tgtgtcaatg gatgca 26

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_162_R

<400> 64

tcatgggcaa aatcaatgtc tct 23

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_182_F

<400> 65

ctactcttcc tcagtccctt ctct 24

<210> 66

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_182_R

<400> 66

gggaaggtga atgataacac gaacagat 28

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_194_F

<400> 67

ccttttcctc tgcagtattt ttgag 25

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 03_194_R

<400> 68

tgggtgcatt ggcttctgg 19

<210> 69

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_008_F

<400> 69

tgagttatta actgtatttt ctttcacttt att 33

<210> 70

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_008_R

<400> 70

tcccagcttt gaaaagtatg cctaga 26

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_027_F

<400> 71

acatacagac tctgtcttta catttcaaaa 30

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_027_R

<400> 72

caacattgag taaccactgt gt 22

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_045_F

<400> 73

ctgtacttac ttttatctcc tcttctattg 30

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_045_R

<400> 74

gtaagtcgaa tgccctttcc 20

<210> 75

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_056_F

<400> 75

tggttttctg tcccatttgg gcc 23

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_056_R

<400> 76

tcgtgggttt tctggaatga g 21

<210> 77

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_065_F

<400> 77

cacaacaaaa aaatagatgg ctgggt 26

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_065_R

<400> 78

ctcaagcact ccatctgcct a 21

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_085_F

<400> 79

ctccgattcc ttaattatcc cac 23

<210> 80

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_085_R

<400> 80

gtaaatcttt catctccaac ccc 23

<210> 81

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_112_F

<400> 81

tccctgtatt cttgtgtcta ctg 23

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_112_R

<400> 82

tgctctcctg aggtggtttc t 21

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_137_F

<400> 83

gatcaataac aagttctgaa attaaggctg 30

<210> 84

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_137_R

<400> 84

ttgccagctc ctcttttca 19

<210> 85

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_154_F

<400> 85

gtgggatttt tttagatgtg ttcaat 26

<210> 86

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_154_R

<400> 86

acgtcttata ccaaaatatc acc 23

<210> 87

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_177_F

<400> 87

ccaaagagcc tctctagccg ca 22

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 04_177_R

<400> 88

ccctctggtt aacatttaca attgc 25

<210> 89

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_003_F

<400> 89

ctaaaaaaca acatttactg tttctactg 29

<210> 90

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_003_R

<400> 90

gacaccacag aaattacagg tatga 25

<210> 91

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_013_F

<400> 91

ccagtgattt aaactctctg aatca 25

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_013_R

<400> 92

tctactgata cctttgtttc tgttcattct 30

<210> 93

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_065_F

<400> 93

tctgctgaga agcctgcata gc 22

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_065_R

<400> 94

tcttaaaggc agctagagag a 21

<210> 95

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_074_F

<400> 95

tgaattcaga ttctctggaa tcttgt 26

<210> 96

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_074_R

<400> 96

ggaaagttag tggtttcagt ca 22

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_087_F

<400> 97

tgggcattac tctttgctct c 21

<210> 98

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_087_R

<400> 98

aaaccttatt atacacacaa cccg 24

<210> 99

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_096_F

<400> 99

cacgcctctc tccatgtgca gtagga 26

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_096_R

<400> 100

gaatggtggt gttctggagc 20

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_115_F

<400> 101

tggtgtgcgt ggacgtggac a 21

<210> 102

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_115_R

<400> 102

ggggtgcagg gtgccga 17

<210> 103

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_119_F

<400> 103

tgttgtatcc ttctcagtgt ttct 24

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_119_R

<400> 104

ggtcacttac acttccccga 20

<210> 105

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_132_F

<400> 105

acccctttga agtggtacca gag 23

<210> 106

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_132_R

<400> 106

tcccattaat gtctgcatgt ggagt 25

<210> 107

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_141_F

<400> 107

ttcccattag tgtctgtatg tggagt 26

<210> 108

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_141_R

<400> 108

tcccaggtct tacgc 15

<210> 109

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_151_F

<400> 109

ccaggtgtta cgca 14

<210> 110

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_151_R

<400> 110

gcacttcgta gtgg 14

<210> 111

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_180_F

<400> 111

gcactttgta gtgg 14

<210> 112

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 05_180_R

<400> 112

gggtttggag atcata 16

<210> 113

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_007_F

<400> 113

gggtttggaa atcatac 17

<210> 114

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_007_R

<400> 114

gaarggcacg agac 14

<210> 115

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_016_F

<400> 115

aaggcgcgag aca 13

<210> 116

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_016_R

<400> 116

ttcccaggct ccaa 14

<210> 117

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_031_F

<400> 117

aattcccggg ctc 13

<210> 118

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_031_R

<400> 118

catgcagcaa ggatg 15

<210> 119

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_057_F

<400> 119

gcagcgagga tgaa 14

<210> 120

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_057_R

<400> 120

cagcgagcgc tctg 14

<210> 121

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_071_F

<400> 121

cgagtgctct gct 13

<210> 122

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_071_R

<400> 122

tgagcattaa atgtcaa 17

<210> 123

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_077_F

<400> 123

agcattaagt gtcaag 16

<210> 124

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_077_R

<400> 124

cgtgcatata ccaaa 15

<210> 125

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_087_F

<400> 125

cgtgcataca ccaa 14

<210> 126

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_087_R

<400> 126

agaaggcaaa ttcc 14

<210> 127

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_096_F

<400> 127

agaaggtaaa ttcccc 16

<210> 128

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_096_R

<400> 128

tttagtgtgc cgt 13

<210> 129

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_113_F

<400> 129

cctttagcgt gccg 14

<210> 130

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_113_R

<400> 130

ttttggggtc tctttg 16

<210> 131

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_125_F

<400> 131

tttgggttct ctttgtc 17

<210> 132

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_125_R

<400> 132

acactatgcc acttc 15

<210> 133

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_135_F

<400> 133

cactatgaca cttcca 16

<210> 134

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_135_R

<400> 134

caccgtccct gc 12

<210> 135

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_143_F

<400> 135

accgttcctg ct 12

<210> 136

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_143_R

<400> 136

gctgccaacc agac 14

<210> 137

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_153_F

<400> 137

ctgccaaacc agaca 15

<210> 138

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_153_R

<400> 138

ctggtggtgg cca 13

<210> 139

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_158_F

<400> 139

tggtgttggc cac 13

<210> 140

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_158_R

<400> 140

ttgtcggacc tgctg 15

<210> 141

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_167_F

<400> 141

tgtcggaact gctg 14

<210> 142

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 06_167_R

<400> 142

agcaacgtgc tgga 14

<210> 143

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_010_F

<400> 143

gagcaacatg ctgga 15

<210> 144

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_010_R

<400> 144

gaccgctaca tctc 14

<210> 145

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_023_F

<400> 145

gaccactaca tctcc 15

<210> 146

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_023_R

<400> 146

gactgcgcta cca 13

<210> 147

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_040_F

<400> 147

gcactgtgct acca 14

<210> 148

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_040_R

<400> 148

gygctaccac agcat 15

<210> 149

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_062_F

<400> 149

gygctaacac agc 13

<210> 150

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_062_R

<400> 150

cacagcatcg tga 13

<210> 151

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_082_F

<400> 151

cacagcaccg tga 13

<210> 152

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_082_R

<400> 152

cctgccgcgg gcgc 14

<210> 153

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_097_F

<400> 153

ccctgccgtg ggcg 14

<210> 154

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_097_R

<400> 154

cggcgagccg t 11

<210> 155

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_112_F

<400> 155

cgcggcaagc cg 12

<210> 156

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_112_R

<400> 156

catcgacccc ctcat 15

<210> 157

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_126_F

<400> 157

atcatccacc ccctc 15

<210> 158

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_126_R

<400> 158

cgtccccggg agagc 15

<210> 159

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_140_F

<400> 159

ccgtccctgg gaga 14

<210> 160

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_140_R

<400> 160

tatcctatgc tgtaaga 17

<210> 161

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_153_F

<400> 161

atcctacgct gtaagag 17

<210> 162

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 07_153_R

<400> 162

tcattacaga tggtgc 16

<210> 163

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_002_F

<400> 163

ttacagaggg tgcaa 15

<210> 164

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_002_R

<400> 164

tactaaaata cactgaatga 20

<210> 165

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_013_F

<400> 165

taaaatactc tgaatgatat a 21

<210> 166

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_013_R

<400> 166

gccttgggca aaa 13

<210> 167

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_033_F

<400> 167

ggccttaggc aaaa 14

<210> 168

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_033_R

<400> 168

gcacagtaat gggc 14

<210> 169

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_058_F

<400> 169

cacagtagtg ggct 14

<210> 170

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_058_R

<400> 170

tggcgtgctc ag 12

<210> 171

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_064_F

<400> 171

tgagtggcat gct 13

<210> 172

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_064_R

<400> 172

tgaactttcc agactttt 18

<210> 173

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_082_F

<400> 173

aactttccgg actttt 16

<210> 174

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_082_R

<400> 174

cccgtggtag ct 12

<210> 175

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_103_F

<400> 175

cccgtgatag ctg 13

<210> 176

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_103_R

<400> 176

tgcaggcgca ac 12

<210> 177

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_125_F

<400> 177

gcaggcacaa ctttc 15

<210> 178

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_125_R

<400> 178

acagcagcct ctga 14

<210> 179

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_139_F

<400> 179

cacagcagac tctga 15

<210> 180

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 08_139_R

<400> 180

tgatgcacaa gcccc 15

<210> 181

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_000_F

<400> 181

tgatgcagaa gcccc 15

<210> 182

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_000_R

<400> 182

tgggggatct gaaat 15

<210> 183

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_021_F

<400> 183

ttgggggata tgaaat 16

<210> 184

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_021_R

<400> 184

gcaacgaaat ctgtg 15

<210> 185

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_064_F

<400> 185

ctctgcaaca aaatctgt 18

<210> 186

<211> 12

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_064_R

<400> 186

gctccgaagg ca 12

<210> 187

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_072_F

<400> 187

tggctccaaa ggca 14

<210> 188

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_072_R

<400> 188

atatgttagc attaaagttc 20

<210> 189

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_084_F

<400> 189

gcatatgtta gaattaaagt 20

<210> 190

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_084_R

<400> 190

tgacttaaag atcaggc 17

<210> 191

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_109_F

<400> 191

acttaaagta tcaggcac 18

<210> 192

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_109_R

<400> 192

ttggatttcc ctgcc 15

<210> 193

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_117_F

<400> 193

ggatttctct gccca 15

<210> 194

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_117_R

<400> 194

gccaggcgtt cct 13

<210> 195

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_132_F

<400> 195

ggccaggcat tcctt 15

<210> 196

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 09_132_R

<400> 196

cctgtaatcc cag 13

<210> 197

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_001_F

<400> 197

cctgttatcc cag 13

<210> 198

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_001_R

<400> 198

atttctggtg gccc 14

<210> 199

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_026_F

<400> 199

atttctgatg gccca 15

<210> 200

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_026_R

<400> 200

cggcgatgaa agttc 15

<210> 201

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_035_F

<400> 201

acggcgatta aagttc 16

<210> 202

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_035_R

<400> 202

atgaaagccc aggac 15

<210> 203

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_047_F

<400> 203

tgaaaaccca ggacc 15

<210> 204

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_047_R

<400> 204

ttgtgaaaca actggtg 17

<210> 205

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_071_F

<400> 205

gtgacacaac tggtg 15

<210> 206

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_071_R

<400> 206

gaggccgcat ggt 13

<210> 207

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_085_F

<400> 207

gaggctgcat ggtc 14

<210> 208

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_085_R

<400> 208

ctactgcttt cgaattggg 19

<210> 209

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_117_F

<400> 209

tactgctttc aaattggg 18

<210> 210

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_117_R

<400> 210

ctcacttctc ttctcaagaa t 21

<210> 211

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_128_F

<400> 211

ctcacttctc aagaatga 18

<210> 212

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 10_128_R

<400> 212

tgtaggtgac ctaccct 17

<210> 213

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_006_F

<400> 213

gtaggtaacc taccct 16

<210> 214

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_006_R

<400> 214

tgacatcttc ccctgctg 18

<210> 215

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_020_F

<400> 215

acatctttcc ctgctg 16

<210> 216

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_020_R

<400> 216

ccgaaaaccc actaa 15

<210> 217

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_034_F

<400> 217

tcccgaagac ccac 14

<210> 218

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_034_R

<400> 218

ctcgtggtga cccct 15

<210> 219

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_059_F

<400> 219

ctcgtggtac cccttg 16

<210> 220

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_059_R

<400> 220

agggcacatt caacatc 17

<210> 221

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_084_F

<400> 221

agggcacgtt caacat 16

<210> 222

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_084_R

<400> 222

ctgactccgc tgttc 15

<210> 223

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_094_F

<400> 223

ctgactccac tgttcg 16

<210> 224

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_094_R

<400> 224

cgcgaccacg tgggcg 16

<210> 225

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_111_F

<400> 225

gcgaccatgt ggg 13

<210> 226

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_111_R

<400> 226

tcttcggcct ttctagtgga ga 22

<210> 227

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_135_F

<400> 227

tctagtggag aggtgctct 19

<210> 228

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 11_135_R

<400> 228

cagagcataa ggcca 15

<210> 229

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 12_013_F

<400> 229

cagagcatga taagacca 18

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов для последующей гибридизации. Изобретение может быть использовано для исследования ДНК с целью вероятностного определения фенотипа по признакам: группа крови АВ0, гаплогруппа Y-хромосомы, цвет радужной оболочки глаза, цвет волос, цвет кожи и половая принадлежность. Изобретение относится также к способу генотипирования ДНК-маркеров, ассоциированных с фенотипическими признаками, имеющими значение в практической криминалистике. Набор для генотипирования включает композицию, образованную парами праймеров для 63 локусов в геноме человека, позволяющую проводить мультиплексную ПЦР (последовательность праймеров приведена в SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 107). Также в композицию для генотипирования входят аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды для гибридизационного анализа (SEQ ID NO: 108-SEQ ID NO: 229). Праймеры подобраны таким образом, чтобы ПЦР-продукт имел минимальную длину, что позволяет успешно анализировать деградированные образцы ДНК. Композиция праймеров и олигонуклеотидных зондов подходит для различных технологических платформ, базирующихся на генотипировании с помощью амплификации ДНК с последующей гибридизацией. 3 пр., 2 табл., 3 ил.

1. Набор для генотипирования 63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью, методом ПЦР с последующей гибридизацией, состоящий из композиции ПЦР-праймеров SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 107 для амплификации указанных полиморфизмов, и аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов SEQ ID NO: 108-SEQ ID NO: 229 для генотипирования соответствующих полиморфизмов методом гибридизации.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что может быть составлен в сокращенном виде, путем исключения части праймеров и соответствующих олигонуклеотидных зондов.

3. Набор по п.1, отличающийся тем, что мечение ПЦР-продукта осуществляется с использованием флуорофора.

4. Набор по п.3, отличающийся тем, что флуоресцентное мечение ПЦР-продукта осуществляется с помощью праймера, имеющего соответствующую флуоресцентную метку по 5’-концу.

5. Набор по п.3, отличающийся тем, что флуоресцентное мечение ПЦР-продукта осуществляется с помощью флуоресцентно-меченного дезоксинуклеотидтрифосфата, встраивающегося в растущую цепь ДНК в ходе ПЦР.

6. Набор по п.3, отличающийся тем, что каждый локус-специфичный обратный праймер с четным номером «Seq ID» (Seq ID NO: 2, Seq ID NO: 4… Seq ID NO: 324), имеет со стороны 5`-конца универсальную олигонуклеотидную вставку, с последовательностью 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`, и универсальный ПЦР-праймер также имеет последовательность 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`.

7. Набор по п.6, отличающийся тем, что аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды иммобилизованы на поверхности подложки.

8. Набор по п.6, отличающийся тем, что аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды иммобилизованы в объеме полимерного носителя.