Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники.
В конце 2019 года в Китайской Народной Республике (КНР) произошла вспышка новой инфекции с эпицентром в городе Ухань (провинция Хубэй). Через некоторое время был обнаружен возбудитель данной инфекции, которым оказался неизвестный ранее коронавирус, получивший название SARS-CoV-2. В течение нескольких месяцев SARS-CoV-2 распространился по всему миру, став причиной пандемии, затронувшей более 200 стран. К 1 февраля 2021 года количество заболевших превысило 103 млн человек, а количество погибших превысило 2 млн человек.
Основные механизмы передачи коронавирусной инфекции - воздушно-капельный (или воздушно-пылевой) и контактный путь. Инкубационный период составляет в среднем 5-6 дней, после чего развиваются первые симптомы заболевания. Для COVID-19 характерными симптомами являются: повышение температуры тела, сухой кашель, отдышка, утомляемость. Реже встречаются - боль в горле, в суставах, насморк, головная боль. При этом тяжесть заболевания может варьироваться, от бессимптомной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома и смерти.
Быстрое распространение SARS-CoV-2 и высокий процент смертности создали острую необходимость в разработке эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом. Разработка безопасной и эффективной вакцины против SARS-CoV-2 в настоящее время является важнейшим глобальным приоритетом.
В течение года после начала пандемии различные фармацевтические компаний предложили свои варианты кандидатной вакцины против COVID-19.
Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована модифицированная мРНК, кодирующая мутантную форму S белка SARS-CoV-2. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 21 день (F.P. Polack et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med 2020; 383: 2603-2615).
Фармацевтическая компания Moderna в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК, кодирующая S белок SARS-CoV-2, которая окружена липидной оболочкой. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (L.A. Jackson et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. N Engl J Med 2020; 383:1920-1931 ).
Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. The Lancet. Vol. 397, Issue 10269, P 99-111, 2021).
Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. Схема вакцинации предусматривает однократную иммунизацию. (GenBankYP_009724390) (Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. The Lancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).
Исследовательские группы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical.в сотрудничестве с Медицинским центром Beth Israel Deaconess, с помощью технологии Janssen AdVac® создали несколько кандидатных вакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумя пролин-стабилизирующими мутациями. В настоящий момент исследуются две схемы вакцинации: однократная и двукратная с интервалом 8 недель (J. Sadoff et al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 2021 Jan 13. DOI: 10.1056 / NEJMoa2034201).
Таким образом, можно отметить, что большая часть вакцин против COVID-19 предполагают двукратную вакцинацию.
Каждая из представленных вакцин имеет свои сильные стороны и недостатки. Так, вакцины на основе РНК обладают менее выраженными побочными эффектами, но по сравнению с векторными вакцинами обладают меньшей иммуногенностью. Кроме того, РНК более хрупкая, чувствительная к условиям хранения.
Вакцины, основанные на рекомбинантных вирусных векторах, обладают высокой иммуногенностью. Однако недостатком данного типа вакцин является возможность формирования иммунного ответа на векторную часть, что затрудняет ревакцинацию. Также за счет того, что аденовирусы циркулируют в популяции человека, часть населения может иметь предсуществующий иммунитет против данных вирусов. Экспрессионные векторы, основанные на аденовирусах других млекопитающих, позволяют решить проблему с предсуществующим иммунитетом, однако, такие векторы хуже проникают в клетки человека, а за счет этого снижается эффективность вакцин.
Техническое решение согласно патенту РФ №2731342 (опубликован 01.09.2020), выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты фармацевтического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2:
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Кроме того, в данном патенте раскрыто применение указанных вариантов средств для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающее использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.
Нужно отметить, что такой способ применения имеет ряд недостатков. Так, например, каждый из компонентов фармацевтического средства может вызывать побочные эффекты и аллергические реакции, следовательно при двукратной схеме вакцинации, количество таких явлений будет возрастать. Также такая схема иммунизации имеет ряд практических трудностей, заключающихся в том, что необходимо обеспечить явку пациентов с определенным интервалом времени. Кроме того, имеется ряд логистических трудностей, связанных со своевременной доставкой нужных компонентов средства.
Таким образом, в области техники существует потребность в расширении арсенала фармацевтических средств, способных индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 у широких слоев населения.
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, содержащих один активный компонент, и при этом обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.
Раскрытие сущности изобретения
Решением технической задачи является вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Также создан вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Кроме того, заявлен вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
При этом, частном случае его выполнения, буферный раствор средства для восстановленной лиофилизированной формы содержит, масс %:
хлорид натрия
сахароза
магния хлорида гексагидрат
ЭДТА
полисорбат-80
вода
от 0,1044 до 0,1957
от 5,4688 до 10,2539
от 0,0015 до 0,0028
от 0,0003 до 0,0005
от 0,0037 до 0,0070
остальное.
Каждый вариант средства применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
При этом средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно.
Причем в частном случае выполнения средство интраназально вводят в дозе от 5*1010 до 5*1011 вирусных частиц, внутримышечно в дозе от 5*1010 до 5*1011 вирусных частиц. А совместное введение интраназально и внутримышечно осуществляют в дозе от 5*1010 до 5*1011 вирусных частиц внутримышечно, в дозе от 5*1010 до 5*1011 вирусных частиц интраназально.
Совместное введение предусматривает интраназальное и внутримышечное введение в рамках одной процедуры вакцинации.
Технический результат заключается в разработке средства, обеспечивающего развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.
Основная цель вакцинации - обеспечить эффективную и долгосрочную защиту от патогена. Одним из вариантов достижения этой цели является многократная вакцинация. Когда организм человека впервые встречает вакцинный антиген это приводит к активации двух основных компонентов адаптивного иммунного ответа: В-лимфоцитов и эффекторных Т-лимфоцитов. Активированные B-лимфоциты трансформируются в плазматические клетки, способные к продукции антител, а также превращаются в B-клетки памяти. Эффекторные Т-лимфоциты делятся на два основных типа: Т-хелперы (CD4+) и Т-киллеры (CD8+). Главной функцией Т-хелперов является поддержка в развитии гуморального или клеточного иммунного ответа. Основной функцией Т-киллеров является уничтожение повреждённых клеток собственного организма. Т-киллеры являются одним из главных компонентов антивирусного иммунитета. Однако через некоторое время после вакцинации, количество антиген-специфичных иммунных клеток в организме начинает уменьшаться, тогда вводят бустерную дозу вакцины, которая позволяет поддерживать количество антиген-специфичных Т- и В-клеток на должном уровне (обеспечивающем протекцию организма от патогена).
Разработка однокомпонентного средства, которое будет вызывать стойкий иммунный ответ после однократной иммунизации является сложной научно-практической задачей. При этом значимость такой разработки сложно переоценить. Однократное введение способно обеспечить более быстрые темпы массовой вакцинации, что в условиях пандемии имеет критическое значение. Также данное средство может быть полезно для экстренной вакцинации, для иммунизации мобильных групп граждан (кочевые народы и пр.) и др. Кроме того, можно отметить, что при однократном введении снижается неблагоприятное воздействие на человека: травматичность, количество побочных эффектов и аллергических реакций.
Преимуществами разработанного средства также является то, что лиофилизированная форма позволяет хранить его при температуре +2 и +8°С (в отличие от жидкой формы, которая храниться при отрицательных температурах), что обеспечивает удобство хранения и транспортировки.
Краткое описание фигур.
На фиг. 1
представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных лиофилизированной формой разработанного средства по варианту 1,
Ось ординат - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс - дни.
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день
Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.
На фиг. 2
представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных лиофилизированной формой разработанного средства по варианту 2,
Ось ординат - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс - дни.
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день
Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.
На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев лиофилизированной формой разработанного средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг. 4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев лиофилизированной формой разработанного средства по варианту 2 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - дни.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.
Осуществление изобретения.
Активным компонентом разработанного средства является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма аденовируса, со встроенной экспрессионной кассетой, содержащей ген антигена вируса SARS-CoV-2.
Аденовирусные векторы способны проникать в различные типы клеток человека, обеспечивают высокие уровни экспрессии целевого антигена, приводят к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. В ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России было разработано 3 варианта экспрессионных векторов на основе аденовирусов млекопитающих:
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
В качестве антигена был выбран S белок SARS-CoV-2, который находится на поверхности вирусной частицы. Это один из наиболее перспективных антигенов, позволяющих индуцировать мощный и длительный иммунный ответ. Также было показано, что антитела к S белку SARS-CoV-2 являются вирус-нейтрализующими.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы разработали различные варианты экспрессионных кассет, содержащих ген S белка.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор - это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК [Wang W., Jia YL., Li YC., Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao CP., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports - 2017. - Vol. 8. - P. 10416].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор - синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор β-актина курицы и химерный интрон (β-актина курицы и β-глобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора СAG выше, чем у промотора CMV. [Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. - 2014. - Vol. 13. - P. 1270-1277].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 - промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1α (EF-1α). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток [Wang X, Xu Z, Tian Z, Zhang X, Xu D, Li Q, Zhang J, Wang T. The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. J Cell Mol Med. 2017 Nov;21(11):3044-3054. doi: 10.1111/jcmm.13216. Epub 2017 May 30. PMID: 28557288; PMCID: PMC5661254.]. Ген EF-1α кодирует фактор элонгации-1α, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1α часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Таким образом, в результате проведенной работы было разработано 3 варианта средства.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3
2) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
3) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1 Получение активного компонента средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн 3 вариантов экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России: плазмида pAd26-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа, и плазмида pAd26-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd26-Ends, были получены плазмиды pAd26-Ends-CMV-S-CoV2, pAd26-Ends-CAG-S-CoV2, pAd26-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы human adenovirus 26-го серотипа: Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм human adenovirus26-го серотипа: Ad26-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 2. Получение активного компонента средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа.
В данной работе также использовали 3 варианта экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2 осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pAd5-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа (одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок; второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома)
- плазмида pAd5-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd5-Ends, были получены плазмиды pAd5-Ends-CMV-S-CoV2, pAd5-Ends-CAG-S-CoV2, pAd5-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы human adenovirus5-го серотипа: Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм human adenovirus5-го серотипа: Ad5-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 3. Получение активного компонента средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus25-го серотипа.
В данной работе использовали 3 варианта экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2 осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pSim25-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса обезьян 25-го серотипа
- плазмида pSim25-null, несущая геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pSim25-Ends, были получены плазмиды p-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2, p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2, p-Sim25-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса обезьян25-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы simian adenovirus25-го серотипа: simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм simian adenovirus25-го серотипа: simAd25-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 4. Разработка буферного раствора.
Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе (т.е. средство в лиофилизированной форме при восстановлении водой содержит буферный раствор), обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Для поддержания рН раствора в буфер добавили Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для лиофилизированной формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из активных компонентов средства:
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:4 (simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
Полученные средства лиофилизировали и хранили при температуре +2 и +8°С в течение 3 месяцев, затем оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 1 - Состав экспериментальных буферных растворов.
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для лиофилизированной формы средства при температуре +2°С и +8°С в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для лиофилизированной формы вакцины обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ:
Трис: от 0,0180 масс. % до 0,0338 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,1044 масс. % до 0,1957 масс. %;
Сахароза: от 5,4688 масс. % до 10,2539 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0015 масс. % до 0,0028 масс. %;
ЭДТА: от 0,0003 масс. % до 0,0005 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0037 масс. % до 0,0070 масс. %;
Растворитель: остальное.
Пример 5. Получение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме.
Для получения лиофилизированной лекарственной формы разработанного фармацевтического средства с возможностью длительного хранения при температурном режиме от 2 до 8°С, использовали буферный раствор, подобранный в примере 4, который смешивали с соответствующим активным компонентом.
С указанными составом были проведены три независимых цикла лиофилизации с использованием подобранной ранее программы лиофилизации (Таблица 2)
Таблица 2. Программа лиофилизации.
Критериями приемлемости для лиофилизированного препарата были выбраны: внешний вид - сухая пористая масса в виде таблетки, цельная или раскрошенная, белого или почти белого цвета; потеря в массе при высушивании (остаточная влажность) - не более 5 %, время восстановления (не более 5 минут), значение специфической активности в готовой лекарственной форме.
В результаты лиофильного высушивания были получены показатели, соответствующие критериям приемлемости.
Таким образом, были получены:
1. средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
2. средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
3. средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Пример 6. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при внутривенном и внутримышечном введении.
В данном исследовании оценивали острую токсичность:
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.
Расчет дозы средства проводили исходя из иммунизирующей дозы (108в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных - сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 108в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.
В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:
108в.ч. - близкая к эффективной дозе (ЭД) для мышей;
109в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;
1010в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;
1011в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;
Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:
1)Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
2) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
3) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
4) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
5) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
6) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
7) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
8) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
9) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
10) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
11) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
12) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
13) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Пример 7.
Определение эффективности иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против S белка SARS-CoV-2 через 21 день после введения средства лабораторным животным.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в лиофилизированной форме. Во флакон, содержащий разработанное средство в лиофилизированной форме 1011вирусных частиц/флакон, добавляли 1,0 мл воды для инъекций. В результате получили восстановленное лиофилизированное средство. Далее флакон встряхивали до полного растворения лиофилизата и вводили животным по 200мкл внутримышечно.
Были получены следующие группы животных:
1) Ad26-too-CMV-S-CoV2,
2) Ad26-too-CAG-S-CoV2,
3) Ad26-too-EF1-S-CoV2
4) Ad26-too
5) Ad5-too-CMV-S-CoV2,
6) Ad5-too-CAG-S-CoV2,
7) Ad5-too-EF1-S-CoV2
8) Ad5-too
9) simAd25-too-CMV-S-CoV2,
10) simAd25-too-CAG-S-CoV2,
11) simAd25-too-EF1-S-CoV2
12) simAd25-too
13) плацебо (буфер)
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Титр антител к S белку SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2.
Пример 8. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации
Цель данного эксперимента заключалась в определении напряженности иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев в различные сроки после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек
Во флакон, содержащий разработанное средство в лиофилизированной форме, добавляли 1,0 мл воды для инъекций. Далее флакон встряхивали до полного растворения лиофилизата. Разработанное средство вводили внутримышечно в дельтовидную мышцу (верхнюю треть наружной поверхности плеча). При невозможности введения в дельтовидную мышцу - средство вводили в латеральную широкую мышцу бедра.
Перед иммунизацией, а также через 14, 21, 28 и 42 дней, у пациентов отбирали образцы крови. Из полученных образцов выделяли сыворотку крови, которую в дальнейшем использовали для определения титра антител к S антигену вируса SARS-CoV-2.
Титр антител определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа, разработанной в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (РЗН 2020/10393 2020-05-18), которая позволяет определять титр IgG к RBD домену S антигена вируса SARS-CoV-2.
Планшеты с предварительно адсорбированным RBD (100 нг/лунку) промывали 5 раз
промывочным буфером. Далее в лунки планшета вносили в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля. В остальные лунки планшета добавляли серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец). Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С. После этого останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результат учитывали в течение 10 мин после остановки реакции путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны 450 нм.
Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором значение OD450 сыворотки иммунизированного участника превышает значение контрольной сыворотки (сыворотка участника до иммунизации) более чем в 2 раза.
Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев после введения различных вариантов разработанного средства представлены на фиг. 1, 2.
Как видно из представленных данных, иммунизация добровольцев обоими вариантами разработанного средства позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы добровольцев) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. При этом рост напряженности гуморального иммунного ответа отмечается с увеличением дней после иммунизации.
Пример 9. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки клеточного иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации.
Цель данного эксперимента заключалась определении напряженности клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Во флакон, содержащий разработанное средство в лиофилизированной форме, добавляли 1,0 мл воды для инъекций. Далее флакон встряхивали до полного растворения лиофилизата. Разработанное средство вводили внутримышечно в дельтовидную мышцу (верхнюю треть наружной поверхности плеча). При невозможности введения в дельтовидную мышцу - средство вводили в латеральную широкую мышцу бедра.
Перед иммунизацией, а также через 14 и 28 дней, у пациентов отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,077 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96л планшета (2*105 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 часа после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.
Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса. Полученные результаты представлены на Фиг. 3, 4.
Результаты проведенного исследования показали, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного иммунизацией добровольцев различными вариантами средства, согласно медиане значений пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, отмечается с увеличением дней после иммунизации. Во всех группах максимальные значения, пролиферирующих как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов наблюдаются на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днем исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях, пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов - p<0,001.
Таким образом, исходя из приведенных данных можно заключить, что иммунизация разработанным средством способна вызвать формирование напряженного антиген-специфического клеточного звена противоинфекционного иммунитета, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности в измеряемых параметрах до и после иммунизации.
Пример 10. Оценка нежелательных явлений у добровольцев после однократной и двукратной иммунизации вариантами разработанного средства.
Цель данного эксперимента заключалась определении побочных эффектов у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
3) Двукратная схема иммунизации, при которой вначале вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме 1011 вирусных частиц/дозу, а через 21 день вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме 1011 вирусных частиц/дозу, 20 человек.
В таблице 4 включены данные об основных нежелательных явлениях, зарегистрированных с момента начала исследования и вплоть до визита (телефонного контакта) 180-го дня в рамках исследования.
Таблица 4 - Основные нежелательные явления, наблюдаемые после однократного введения разработанного препарата по сравнению с двукратным введением.
Как видно из представленных данных однократная схема иммунизации разработанным средством для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме вызывает существенно меньше побочных эффектов, по сравнению с двукратной схемой иммунизации.
Пример 11. Определение эффективности интраназальной иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при интраназальном введении.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
1) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
2) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
3) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
4) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
5) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
6) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
7) Однократное интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Как видно из полученных результатов интраназальная иммунизация животных разработанным средством приводила к повышению титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме путем его интраназального введения.
Пример 12. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизации.
Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при совместном интраназальном введении и внутримышечном введении.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
1) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
2) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
3) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
4) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
5) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
6) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
7) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
8) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
9) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
10) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
11) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу
12) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
13) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
14) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
15) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
16) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
17) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
18) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в лиофилизированной форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
19) Интраназальное введение буферного раствора и одновременно внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
20) Интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
21) Внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу в/м
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу в/м
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу в/м
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу в/м
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу в/м
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу в/м
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу в/м
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозу в/м
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозу в/м
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозу в/м
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу в/м
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозу в/м
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу в/м
Буферный раствор в/м
Как видно из полученных результатов совместная интраназальная и внутримышечная иммунизация животных разработанным средством приводила к более мощному гуморальному иммунному ответу, по сравнению с иммунизацией только одним способом. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназального введения.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> федеральное государственное бюджетное учреждение
«Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени
почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
<120> Средство для индукции специфического иммунитета против вируса
тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2
в лиофилизированной форме (варианты).
<160> 7
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 4711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 1
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttggta ccatgtttgt gttccttgtg ttattgccac 660
tagtctctag tcagtgtgtg aacctgacca caagaaccca gctgcctcca gcctacacca 720
acagctttac cagaggcgtg tactaccccg acaaggtgtt cagatccagc gtgctgcact 780
ctacccagga cctgttcctg cctttcttca gcaacgtgac ctggttccac gccatccacg 840
tgtccggcac caatggcacc aagagattcg acaaccccgt gctgcccttc aacgacgggg 900
tgtactttgc cagcaccgag aagtccaaca tcatcagagg ctggatcttc ggcaccacac 960
tggacagcaa gacccagagc ctgctgatcg tgaacaacgc caccaacgtg gtcatcaaag 1020
tgtgcgagtt ccagttctgc aacgacccct tcctgggcgt ctactatcac aagaacaaca 1080
agagctggat ggaaagcgag ttccgggtgt acagcagcgc caacaactgc accttcgagt 1140
acgtgtccca gcctttcctg atggacctgg aaggcaagca gggcaacttc aagaacctgc 1200
gcgagttcgt gttcaagaac atcgacggct acttcaagat ctacagcaag cacaccccta 1260
tcaacctcgt gcgggatctg cctcagggct tctctgctct ggaacccctg gtggatctgc 1320
ccatcggcat caacatcacc cggtttcaga cactgctggc cctgcacaga agctacctga 1380
cacctggcga tagcagcagc ggatggacag ctggtgccgc cgcttactat gtgggctacc 1440
tgcagcctag aaccttcctg ctgaagtaca acgagaacgg caccatcacc gacgccgtgg 1500
attgtgctct ggatcctctg agcgagacaa agtgcaccct gaagtccttc accgtggaaa 1560
agggcatcta ccagaccagc aacttccggg tgcagcccac cgaatccatc gtgcggttcc 1620
ccaatatcac caatctgtgc cccttcggcg aggtgttcaa tgccaccaga ttcgcctctg 1680
tgtacgcctg gaaccggaag cggatcagca attgcgtggc cgactactcc gtgctgtaca 1740
actccgccag cttcagcacc ttcaagtgct acggcgtgtc ccctaccaag ctgaacgacc 1800
tgtgcttcac aaacgtgtac gccgacagct tcgtgatccg gggagatgaa gtgcggcaga 1860
ttgcccctgg acagacaggc aagatcgccg actacaacta caagctgccc gacgacttca 1920
ccggctgtgt gattgcctgg aacagcaaca acctggactc caaagtcggc ggcaactaca 1980
attacctgta ccggctgttc cggaagtcca atctgaagcc cttcgagcgg gacatctcca 2040
ccgagatcta tcaggccggc agcacccctt gtaacggcgt ggaaggcttc aactgctact 2100
tcccactgca gtcctacggc tttcagccca caaatggcgt gggctatcag ccctacagag 2160
tggtggtgct gagcttcgaa ctgctgcatg cccctgccac agtgtgcggc cctaagaaaa 2220
gcaccaatct cgtgaagaac aaatgcgtga acttcaactt caacggcctg accggcaccg 2280
gcgtgctgac agagagcaac aagaagttcc tgccattcca gcagtttggc cgggatattg 2340
ccgataccac agacgccgta cgagatcccc agacactgga aatcctggac atcacccctt 2400
gcagcttcgg cggagtgtct gtgatcaccc ctggcaccaa caccagcaat caggtggcag 2460
tgctgtacca ggacgtgaac tgtaccgaag tgcccgtggc cattcacgcc gatcagctga 2520
cacctacatg gcgggtgtac tccaccggca gcaatgtgtt tcagaccaga gccggctgtc 2580
tgatcggagc cgagcacgtg aacaatagct acgagtgcga catccccatc ggcgctggca 2640
tctgtgccag ctaccagaca cagacaaaca gccccagacg ggccagatct gtggccagcc 2700
agagcatcat tgcctacaca atgtctctgg gcgccgagaa cagcgtggcc tactccaaca 2760
actctatcgc tatccccacc aacttcacca tcagcgtgac cacagagatc ctgcctgtgt 2820
ccatgaccaa gaccagcgtg gactgcacca tgtacatctg cggcgattcc accgagtgct 2880
ccaacctgct gctgcagtac ggcagcttct gcacccagct gaatagagcc ctgacaggga 2940
tcgccgtgga acaggacaag aacacccaag aggtgttcgc ccaagtgaag cagatctaca 3000
agacccctcc tatcaaggac ttcggcggct tcaatttcag ccagattctg cccgatccta 3060
gcaagcccag caagcggagc ttcatcgagg acctgctgtt caacaaagtg acactggccg 3120
acgccggctt catcaagcag tatggcgatt gtctgggcga cattgccgcc agggatctga 3180
tttgcgccca gaagtttaac ggactgacag tgctgccacc actgctgacc gatgagatga 3240
tcgcccagta cacatctgcc ctgctggccg gcacaatcac aagcggctgg acatttggag 3300
ctggcgccgc tctgcagatc ccctttgcta tgcagatggc ctaccggttc aacggcatcg 3360
gagtgaccca gaatgtgctg tacgagaacc agaagctgat cgccaaccag ttcaacagcg 3420
ccatcggcaa gatccaggac agcctgagca gcacagcaag cgccctggga aagctgcagg 3480
acgtggtcaa ccagaatgcc caggcactga acaccctggt caagcagctg tcctccaact 3540
tcggcgccat cagctctgtg ctgaacgaca tcctgagcag actggacaag gtggaagccg 3600
aggtgcagat cgacagactg atcaccggaa ggctgcagtc cctgcagacc tacgttaccc 3660
agcagctgat cagagccgcc gagattagag cctctgccaa tctggccgcc accaagatgt 3720
ctgagtgtgt gctgggccag agcaagagag tggacttttg cggcaagggc taccacctga 3780
tgagcttccc tcagtctgcc cctcacggcg tggtgtttct gcacgtgaca tacgtgcccg 3840
ctcaagagaa gaatttcacc accgctccag ccatctgcca cgacggcaaa gcccactttc 3900
ctagagaagg cgtgttcgtg tccaacggca cccattggtt cgtgacccag cggaacttct 3960
acgagcccca gatcatcacc accgacaaca ccttcgtgtc tggcaactgc gacgtcgtga 4020
tcggcattgt gaacaatacc gtgtacgacc ctctgcagcc cgagctggac agcttcaaag 4080
aggaactgga taagtacttt aagaaccaca caagccccga cgtggacctg ggcgacatca 4140
gcggaatcaa tgccagcgtc gtgaacatcc agaaagagat cgaccggctg aacgaggtgg 4200
ccaagaatct gaacgagagc ctgatcgacc tgcaagaact ggggaagtac gagcagtaca 4260
tcaagtggcc ctggtacatc tggctgggct ttatcgccgg actgattgcc atcgtgatgg 4320
tcacaatcat gctgtgttgc atgaccagct gctgtagctg cctgaagggc tgttgtagct 4380
gtggcagctg ctgcaagttc gacgaggacg attctgagcc cgtgctcaaa ggagtcaaat 4440
tacattacac ataagatatc cgatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata 4500
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 4560
aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 4620
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 4680
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt a 4711
<210> 2
<211> 5984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CAG-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 2
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420
ccccccctcc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg 480
ggggcggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg 540
cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta 600
tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg 660
ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 720
tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 780
gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 840
aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg 900
tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc 960
gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg 1020
ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg 1080
gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca cccccctccc 1140
cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg tggcgcgggg 1200
ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct 1260
cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg cggctgtcga 1320
ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt 1380
cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc 1440
gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt 1500
gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc gcggggggac 1560
ggctgccttc ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct 1620
ctagaaagct tggtaccatg tttgtgttcc ttgtgttatt gccactagtc tctagtcagt 1680
gtgtgaacct gaccacaaga acccagctgc ctccagccta caccaacagc tttaccagag 1740
gcgtgtacta ccccgacaag gtgttcagat ccagcgtgct gcactctacc caggacctgt 1800
tcctgccttt cttcagcaac gtgacctggt tccacgccat ccacgtgtcc ggcaccaatg 1860
gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ccttcaacga cggggtgtac tttgccagca 1920
ccgagaagtc caacatcatc agaggctgga tcttcggcac cacactggac agcaagaccc 1980
agagcctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtcat caaagtgtgc gagttccagt 2040
tctgcaacga ccccttcctg ggcgtctact atcacaagaa caacaagagc tggatggaaa 2100
gcgagttccg ggtgtacagc agcgccaaca actgcacctt cgagtacgtg tcccagcctt 2160
tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca acttcaagaa cctgcgcgag ttcgtgttca 2220
agaacatcga cggctacttc aagatctaca gcaagcacac ccctatcaac ctcgtgcggg 2280
atctgcctca gggcttctct gctctggaac ccctggtgga tctgcccatc ggcatcaaca 2340
tcacccggtt tcagacactg ctggccctgc acagaagcta cctgacacct ggcgatagca 2400
gcagcggatg gacagctggt gccgccgctt actatgtggg ctacctgcag cctagaacct 2460
tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacca tcaccgacgc cgtggattgt gctctggatc 2520
ctctgagcga gacaaagtgc accctgaagt ccttcaccgt ggaaaagggc atctaccaga 2580
ccagcaactt ccgggtgcag cccaccgaat ccatcgtgcg gttccccaat atcaccaatc 2640
tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc ctctgtgtac gcctggaacc 2700
ggaagcggat cagcaattgc gtggccgact actccgtgct gtacaactcc gccagcttca 2760
gcaccttcaa gtgctacggc gtgtccccta ccaagctgaa cgacctgtgc ttcacaaacg 2820
tgtacgccga cagcttcgtg atccggggag atgaagtgcg gcagattgcc cctggacaga 2880
caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc tgtgtgattg 2940
cctggaacag caacaacctg gactccaaag tcggcggcaa ctacaattac ctgtaccggc 3000
tgttccggaa gtccaatctg aagcccttcg agcgggacat ctccaccgag atctatcagg 3060
ccggcagcac cccttgtaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttccca ctgcagtcct 3120
acggctttca gcccacaaat ggcgtgggct atcagcccta cagagtggtg gtgctgagct 3180
tcgaactgct gcatgcccct gccacagtgt gcggccctaa gaaaagcacc aatctcgtga 3240
agaacaaatg cgtgaacttc aacttcaacg gcctgaccgg caccggcgtg ctgacagaga 3300
gcaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt ttggccggga tattgccgat accacagacg 3360
ccgtacgaga tccccagaca ctggaaatcc tggacatcac cccttgcagc ttcggcggag 3420
tgtctgtgat cacccctggc accaacacca gcaatcaggt ggcagtgctg taccaggacg 3480
tgaactgtac cgaagtgccc gtggccattc acgccgatca gctgacacct acatggcggg 3540
tgtactccac cggcagcaat gtgtttcaga ccagagccgg ctgtctgatc ggagccgagc 3600
acgtgaacaa tagctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc tggcatctgt gccagctacc 3660
agacacagac aaacagcccc agacgggcca gatctgtggc cagccagagc atcattgcct 3720
acacaatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctactc caacaactct atcgctatcc 3780
ccaccaactt caccatcagc gtgaccacag agatcctgcc tgtgtccatg accaagacca 3840
gcgtggactg caccatgtac atctgcggcg attccaccga gtgctccaac ctgctgctgc 3900
agtacggcag cttctgcacc cagctgaata gagccctgac agggatcgcc gtggaacagg 3960
acaagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcagat ctacaagacc cctcctatca 4020
aggacttcgg cggcttcaat ttcagccaga ttctgcccga tcctagcaag cccagcaagc 4080
ggagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aagtgacact ggccgacgcc ggcttcatca 4140
agcagtatgg cgattgtctg ggcgacattg ccgccaggga tctgatttgc gcccagaagt 4200
ttaacggact gacagtgctg ccaccactgc tgaccgatga gatgatcgcc cagtacacat 4260
ctgccctgct ggccggcaca atcacaagcg gctggacatt tggagctggc gccgctctgc 4320
agatcccctt tgctatgcag atggcctacc ggttcaacgg catcggagtg acccagaatg 4380
tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca accagttcaa cagcgccatc ggcaagatcc 4440
aggacagcct gagcagcaca gcaagcgccc tgggaaagct gcaggacgtg gtcaaccaga 4500
atgcccaggc actgaacacc ctggtcaagc agctgtcctc caacttcggc gccatcagct 4560
ctgtgctgaa cgacatcctg agcagactgg acaaggtgga agccgaggtg cagatcgaca 4620
gactgatcac cggaaggctg cagtccctgc agacctacgt tacccagcag ctgatcagag 4680
ccgccgagat tagagcctct gccaatctgg ccgccaccaa gatgtctgag tgtgtgctgg 4740
gccagagcaa gagagtggac ttttgcggca agggctacca cctgatgagc ttccctcagt 4800
ctgcccctca cggcgtggtg tttctgcacg tgacatacgt gcccgctcaa gagaagaatt 4860
tcaccaccgc tccagccatc tgccacgacg gcaaagccca ctttcctaga gaaggcgtgt 4920
tcgtgtccaa cggcacccat tggttcgtga cccagcggaa cttctacgag ccccagatca 4980
tcaccaccga caacaccttc gtgtctggca actgcgacgt cgtgatcggc attgtgaaca 5040
ataccgtgta cgaccctctg cagcccgagc tggacagctt caaagaggaa ctggataagt 5100
actttaagaa ccacacaagc cccgacgtgg acctgggcga catcagcgga atcaatgcca 5160
gcgtcgtgaa catccagaaa gagatcgacc ggctgaacga ggtggccaag aatctgaacg 5220
agagcctgat cgacctgcaa gaactgggga agtacgagca gtacatcaag tggccctggt 5280
acatctggct gggctttatc gccggactga ttgccatcgt gatggtcaca atcatgctgt 5340
gttgcatgac cagctgctgt agctgcctga agggctgttg tagctgtggc agctgctgca 5400
agttcgacga ggacgattct gagcccgtgc tcaaaggagt caaattacat tacacataat 5460
tcactcctca ggtgcaggct gcctatcaga aggtggtggc tggtgtggcc aatgccctgg 5520
ctcacaaata ccactgagat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc 5580
cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt 5640
ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc 5700
agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca tatgctggct gccatgaaca 5760
aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat 5820
tccatagaaa agccttgact tgaggttaga tttttttata ttttgttttg tgttattttt 5880
tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 5940
tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatc 5984
<210> 3
<211> 5314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая EF1-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 3
ggtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaggaatt agcttggtac 1200
taatacgact cacaagcttg gtaccatgtt tgtgttcctt gtgttattgc cactagtctc 1260
tagtcagtgt gtgaacctga ccacaagaac ccagctgcct ccagcctaca ccaacagctt 1320
taccagaggc gtgtactacc ccgacaaggt gttcagatcc agcgtgctgc actctaccca 1380
ggacctgttc ctgcctttct tcagcaacgt gacctggttc cacgccatcc acgtgtccgg 1440
caccaatggc accaagagat tcgacaaccc cgtgctgccc ttcaacgacg gggtgtactt 1500
tgccagcacc gagaagtcca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca cactggacag 1560
caagacccag agcctgctga tcgtgaacaa cgccaccaac gtggtcatca aagtgtgcga 1620
gttccagttc tgcaacgacc ccttcctggg cgtctactat cacaagaaca acaagagctg 1680
gatggaaagc gagttccggg tgtacagcag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc 1740
ccagcctttc ctgatggacc tggaaggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt 1800
cgtgttcaag aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacaccc ctatcaacct 1860
cgtgcgggat ctgcctcagg gcttctctgc tctggaaccc ctggtggatc tgcccatcgg 1920
catcaacatc acccggtttc agacactgct ggccctgcac agaagctacc tgacacctgg 1980
cgatagcagc agcggatgga cagctggtgc cgccgcttac tatgtgggct acctgcagcc 2040
tagaaccttc ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggattgtgc 2100
tctggatcct ctgagcgaga caaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg aaaagggcat 2160
ctaccagacc agcaacttcc gggtgcagcc caccgaatcc atcgtgcggt tccccaatat 2220
caccaatctg tgccccttcg gcgaggtgtt caatgccacc agattcgcct ctgtgtacgc 2280
ctggaaccgg aagcggatca gcaattgcgt ggccgactac tccgtgctgt acaactccgc 2340
cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc aagctgaacg acctgtgctt 2400
cacaaacgtg tacgccgaca gcttcgtgat ccggggagat gaagtgcggc agattgcccc 2460
tggacagaca ggcaagatcg ccgactacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg 2520
tgtgattgcc tggaacagca acaacctgga ctccaaagtc ggcggcaact acaattacct 2580
gtaccggctg ttccggaagt ccaatctgaa gcccttcgag cgggacatct ccaccgagat 2640
ctatcaggcc ggcagcaccc cttgtaacgg cgtggaaggc ttcaactgct acttcccact 2700
gcagtcctac ggctttcagc ccacaaatgg cgtgggctat cagccctaca gagtggtggt 2760
gctgagcttc gaactgctgc atgcccctgc cacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa 2820
tctcgtgaag aacaaatgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct 2880
gacagagagc aacaagaagt tcctgccatt ccagcagttt ggccgggata ttgccgatac 2940
cacagacgcc gtacgagatc cccagacact ggaaatcctg gacatcaccc cttgcagctt 3000
cggcggagtg tctgtgatca cccctggcac caacaccagc aatcaggtgg cagtgctgta 3060
ccaggacgtg aactgtaccg aagtgcccgt ggccattcac gccgatcagc tgacacctac 3120
atggcgggtg tactccaccg gcagcaatgt gtttcagacc agagccggct gtctgatcgg 3180
agccgagcac gtgaacaata gctacgagtg cgacatcccc atcggcgctg gcatctgtgc 3240
cagctaccag acacagacaa acagccccag acgggccaga tctgtggcca gccagagcat 3300
cattgcctac acaatgtctc tgggcgccga gaacagcgtg gcctactcca acaactctat 3360
cgctatcccc accaacttca ccatcagcgt gaccacagag atcctgcctg tgtccatgac 3420
caagaccagc gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat tccaccgagt gctccaacct 3480
gctgctgcag tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgacag ggatcgccgt 3540
ggaacaggac aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc 3600
tcctatcaag gacttcggcg gcttcaattt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc 3660
cagcaagcgg agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgacactgg ccgacgccgg 3720
cttcatcaag cagtatggcg attgtctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc 3780
ccagaagttt aacggactga cagtgctgcc accactgctg accgatgaga tgatcgccca 3840
gtacacatct gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc 3900
cgctctgcag atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggagtgac 3960
ccagaatgtg ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg 4020
caagatccag gacagcctga gcagcacagc aagcgccctg ggaaagctgc aggacgtggt 4080
caaccagaat gcccaggcac tgaacaccct ggtcaagcag ctgtcctcca acttcggcgc 4140
catcagctct gtgctgaacg acatcctgag cagactggac aaggtggaag ccgaggtgca 4200
gatcgacaga ctgatcaccg gaaggctgca gtccctgcag acctacgtta cccagcagct 4260
gatcagagcc gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg 4320
tgtgctgggc cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt 4380
ccctcagtct gcccctcacg gcgtggtgtt tctgcacgtg acatacgtgc ccgctcaaga 4440
gaagaatttc accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga 4500
aggcgtgttc gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc 4560
ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt gtctggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat 4620
tgtgaacaat accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact 4680
ggataagtac tttaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgaca tcagcggaat 4740
caatgccagc gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa 4800
tctgaacgag agcctgatcg acctgcaaga actggggaag tacgagcagt acatcaagtg 4860
gccctggtac atctggctgg gctttatcgc cggactgatt gccatcgtga tggtcacaat 4920
catgctgtgt tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggctgttgta gctgtggcag 4980
ctgctgcaag ttcgacgagg acgattctga gcccgtgctc aaaggagtca aattacatta 5040
cacataagat ctagagtcgg ggcggccggc cgctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 5100
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 5160
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 5220
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 5280
tagcaggcat gctggggatc cgagtgtcga taag 5314
<210> 4
<211> 4678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 4
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccat 600
gtttgtgttc cttgtgttat tgccactagt ctctagtcag tgtgtgaacc tgaccacaag 660
aacccagctg cctccagcct acaccaacag ctttaccaga ggcgtgtact accccgacaa 720
ggtgttcaga tccagcgtgc tgcactctac ccaggacctg ttcctgcctt tcttcagcaa 780
cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc cggcaccaat ggcaccaaga gattcgacaa 840
ccccgtgctg cccttcaacg acggggtgta ctttgccagc accgagaagt ccaacatcat 900
cagaggctgg atcttcggca ccacactgga cagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa 960
caacgccacc aacgtggtca tcaaagtgtg cgagttccag ttctgcaacg accccttcct 1020
gggcgtctac tatcacaaga acaacaagag ctggatggaa agcgagttcc gggtgtacag 1080
cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcct ttcctgatgg acctggaagg 1140
caagcagggc aacttcaaga acctgcgcga gttcgtgttc aagaacatcg acggctactt 1200
caagatctac agcaagcaca cccctatcaa cctcgtgcgg gatctgcctc agggcttctc 1260
tgctctggaa cccctggtgg atctgcccat cggcatcaac atcacccggt ttcagacact 1320
gctggccctg cacagaagct acctgacacc tggcgatagc agcagcggat ggacagctgg 1380
tgccgccgct tactatgtgg gctacctgca gcctagaacc ttcctgctga agtacaacga 1440
gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctggat cctctgagcg agacaaagtg 1500
caccctgaag tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca 1560
gcccaccgaa tccatcgtgc ggttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct tcggcgaggt 1620
gttcaatgcc accagattcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tcagcaattg 1680
cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg 1740
cgtgtcccct accaagctga acgacctgtg cttcacaaac gtgtacgccg acagcttcgt 1800
gatccgggga gatgaagtgc ggcagattgc ccctggacag acaggcaaga tcgccgacta 1860
caactacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgtgtgatt gcctggaaca gcaacaacct 1920
ggactccaaa gtcggcggca actacaatta cctgtaccgg ctgttccgga agtccaatct 1980
gaagcccttc gagcgggaca tctccaccga gatctatcag gccggcagca ccccttgtaa 2040
cggcgtggaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggctttc agcccacaaa 2100
tggcgtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcatgcccc 2160
tgccacagtg tgcggcccta agaaaagcac caatctcgtg aagaacaaat gcgtgaactt 2220
caacttcaac ggcctgaccg gcaccggcgt gctgacagag agcaacaaga agttcctgcc 2280
attccagcag tttggccggg atattgccga taccacagac gccgtacgag atccccagac 2340
actggaaatc ctggacatca ccccttgcag cttcggcgga gtgtctgtga tcacccctgg 2400
caccaacacc agcaatcagg tggcagtgct gtaccaggac gtgaactgta ccgaagtgcc 2460
cgtggccatt cacgccgatc agctgacacc tacatggcgg gtgtactcca ccggcagcaa 2520
tgtgtttcag accagagccg gctgtctgat cggagccgag cacgtgaaca atagctacga 2580
gtgcgacatc cccatcggcg ctggcatctg tgccagctac cagacacaga caaacagccc 2640
cagacgggcc agatctgtgg ccagccagag catcattgcc tacacaatgt ctctgggcgc 2700
cgagaacagc gtggcctact ccaacaactc tatcgctatc cccaccaact tcaccatcag 2760
cgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta 2820
catctgcggc gattccaccg agtgctccaa cctgctgctg cagtacggca gcttctgcac 2880
ccagctgaat agagccctga cagggatcgc cgtggaacag gacaagaaca cccaagaggt 2940
gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcctatc aaggacttcg gcggcttcaa 3000
tttcagccag attctgcccg atcctagcaa gcccagcaag cggagcttca tcgaggacct 3060
gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggcttcatc aagcagtatg gcgattgtct 3120
gggcgacatt gccgccaggg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac tgacagtgct 3180
gccaccactg ctgaccgatg agatgatcgc ccagtacaca tctgccctgc tggccggcac 3240
aatcacaagc ggctggacat ttggagctgg cgccgctctg cagatcccct ttgctatgca 3300
gatggcctac cggttcaacg gcatcggagt gacccagaat gtgctgtacg agaaccagaa 3360
gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatc caggacagcc tgagcagcac 3420
agcaagcgcc ctgggaaagc tgcaggacgt ggtcaaccag aatgcccagg cactgaacac 3480
cctggtcaag cagctgtcct ccaacttcgg cgccatcagc tctgtgctga acgacatcct 3540
gagcagactg gacaaggtgg aagccgaggt gcagatcgac agactgatca ccggaaggct 3600
gcagtccctg cagacctacg ttacccagca gctgatcaga gccgccgaga ttagagcctc 3660
tgccaatctg gccgccacca agatgtctga gtgtgtgctg ggccagagca agagagtgga 3720
cttttgcggc aagggctacc acctgatgag cttccctcag tctgcccctc acggcgtggt 3780
gtttctgcac gtgacatacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg ctccagccat 3840
ctgccacgac ggcaaagccc actttcctag agaaggcgtg ttcgtgtcca acggcaccca 3900
ttggttcgtg acccagcgga acttctacga gccccagatc atcaccaccg acaacacctt 3960
cgtgtctggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aataccgtgt acgaccctct 4020
gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggataag tactttaaga accacacaag 4080
ccccgacgtg gacctgggcg acatcagcgg aatcaatgcc agcgtcgtga acatccagaa 4140
agagatcgac cggctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga tcgacctgca 4200
agaactgggg aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggctttat 4260
cgccggactg attgccatcg tgatggtcac aatcatgctg tgttgcatga ccagctgctg 4320
tagctgcctg aagggctgtt gtagctgtgg cagctgctgc aagttcgacg aggacgattc 4380
tgagcccgtg ctcaaaggag tcaaattaca ttacacataa gatatcgcgg ccgctcgagt 4440
ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 4500
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 4560
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 4620
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatctta 4678
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) | 2021 |
|
RU2743963C1 |
| Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей | 2021 |
|
RU2761904C1 |
| Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 для ревакцинации населения (варианты) | 2021 |
|
RU2744444C1 |
| Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у лиц старше 60 лет и/или имеющих хронические заболевания (варианты) | 2021 |
|
RU2744442C1 |
| Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) | 2020 |
|
RU2731342C1 |
| Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) (варианты) | 2022 |
|
RU2779634C1 |
| Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) | 2020 |
|
RU2731356C1 |
| Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса Ласса и способ его применения | 2024 |
|
RU2823965C1 |
| Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) | 2020 |
|
RU2720614C1 |
| Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты) | 2021 |
|
RU2765729C1 |
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описано средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Также представлен вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Кроме того, описан вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. При этом в частном случае его выполнения буферный раствор средства для восстановленной лиофилизированной формы содержит, масс. %: трис от 0,0180 до 0,0338; хлорид натрия от 0,1044 до 0,1957; сахарозу от 5,4688 до 10,2539; магния хлорида гексагидрат от 0,0015 до 0,0028; ЭДТА от 0,0003 до 0,0005; полисорбат-80 от 0,0037 до 0,0070; воду – остальное. При этом средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно. Изобретение обеспечивает развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 12 пр.
1. Cредство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
2. Cредство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
3. Cредство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
4. Средство по пп. 1-3, отличающееся тем, что восстановленная лиофилизированная форма содержит буферный раствор, масс. %:
5. Применение средства по пп. 1-3 для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, где указанное средство предназначено для интраназального или внутримышечного введения или совместного интраназального и внутримышечного введения.
6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для интраназального введения в дозе 5⋅1010- 5⋅1011 вирусных частиц.
7. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для внутримышечного введения в дозе 5⋅1010-5⋅1011 вирусных частиц.
8. Применение по п. 5, отличающееся тем, что при совместном введении интраназально и внутримышечно указанное средство внутримышечно вводят в дозе 5⋅1010-5⋅1011 вирусных частиц, а интраназально в дозе 5⋅1010-5⋅1011 вирусных частиц.
| Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 | 2020 |
|
RU2733834C1 |
| WO 2020243719 A1, 03.12.2020 | |||
| CN 111217917 B, 23.10.2020 | |||
| CN 110974950 B, 07.08.2020. | |||
