Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) Российский патент 2021 года по МПК C12N15/86 A61K39/215 A61P31/14 C12N7/00 

Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Уровень техники.

Эпидемия коронавирусной инфекции COVID-19, которая началась в конце 2019 года в Китайской Народной Республике, за несколько месяцев распространилась по всему миру и бросила беспрецедентный вызов современной системе здравоохранения. В настоящее время число заболевших COVID-19 более106млн человек, а число погибших более 2,3 млн человек.

Возбудителем заболевания является одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.

Коронавирус передается от человека к человеку воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Инкубационный период составляет в среднем 5-6 дней, после чего развиваются первые симптомы заболевания. Для COVID-19 характерными симптомами являются: повышение температуры тела, сухой кашель, отдышка, утомляемость. Реже встречаются - боль в горле, в суставах, насморк, головная боль. При этом тяжесть заболевания может варьироваться, от бессимптомной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома и смерти.

Быстрое распространение SARS-CoV-2 и высокий процент смертности создали острую необходимость в разработке эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом. Разработка безопасной и эффективной вакцины против SARS-CoV-2 в настоящее время является важнейшим глобальным приоритетом.

В течение года после начала пандемии различные фармацевтические компаний предложили свои варианты кандидатной вакцины против COVID-19.

Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована модифицированная мРНК, кодирующая мутантную форму S белка SARS-CoV-2. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 21 день (F.P. Polacketal. SafetyandEfficacyoftheBNT162b2 mRNACovid-19 Vaccine. NEnglJMed 2020; 383: 2603-2615).

Фармацевтическая компания Moderna в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК, кодирующая S белок SARS-CoV-2, которая окружена липидной оболочкой. Схема вакцинациипредполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (L. A. Jacksonetal. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report. NEnglJMed 2020; 383:1920-1931 ).

Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Схемавакцинациипредполагаетдвукратнуюиммунизациюсинтерваломв 28 дней (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. TheLancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021).

Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. Схема вакцинации предусматривает однократную иммунизацию. (GenBankYP_009724390) (Feng-CaiZhuetal. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. TheLancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).

Исследовательскиегруппы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical.всотрудничествесМедицинскимцентром Beth Israel Deaconess, спомощьютехнологии Janssen AdVac® создалинесколькокандидатныхвакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумяпролин-стабилизирующими мутациями. В настоящий момент исследуются две схемы вакцинации: однократная и двукратная с интервалом 8 недель (J. Sadoff etal. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. NEnglJMed, 2021 Jan 13.DOI: 10.1056 / NEJMoa2034201).

Таким образом, можно отметить, что большая часть вакцин против COVID-19 предполагают двукратную вакцинацию.

Каждая из представленных вакцин имеет свои сильные стороны и недостатки. Так, вакцины на основе РНК обладают менее выраженными побочными эффектами, но по сравнению с векторными вакцинами обладают меньшей иммуногенностью. Кроме того, РНК более хрупкая, чувствительная к условиям хранения.

Вакцины, основанные на рекомбинантных вирусных векторах, обладают высокой иммуногенностью. Однако недостатком данного типа вакцин является возможность формирования иммунного ответа на векторную часть, что затрудняет ревакцинацию. Также за счет того, что аденовирусы циркулируют в популяции человека, часть населения может иметь предсуществующий иммунитет против данных вирусов. Экспрессионные векторы, основанные на аденовирусах других млекопитающих, позволяют решить проблему с предсуществующим иммунитетом, однако, такие векторы хуже проникают в клетки человека, а за счет этого снижается эффективность вакцин.

Техническое решение согласно патенту РФ №2731342 (опубликован 01.09.2020), выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты фармацевтического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2:

- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.

- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.

- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.

Кроме того, в данном патенте раскрыто применение указанных вариантов средств для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающее использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.

Нужно отметить, что такой способ применения имеет ряд недостатков. Так, например, каждый из компонентов фармацевтического средства может вызывать побочные эффекты и аллергические реакции, следовательно при двукратной схеме вакцинации, количество таких явлений будет возрастать. Также такая схема иммунизации имеет ряд практических трудностей, заключающихся в том, что необходимо обеспечить явку пациентов с определенным интервалом времени. Кроме того, имеется ряд логистических трудностей, связанных со своевременной доставкой нужных компонентов средства.

Таким образом, в области техники существует потребность в расширении арсенала фармацевтических средств, способных индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 у широких слоев населения.

Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, содержащих один активный компонент, и при этом обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.

Раскрытие сущности изобретения

Решением технической задачи является вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

Также создан вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

Кроме того, заявлен вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

При этом,частном случае его выполнения, буферный раствор средства для жидкой формы содержит, масс. %:

трис от 0,1831 до 0,3432 хлорид натрия от 0,3313 до 0,6212 сахароза от 3,7821 до 7,0915 магния хлоридагексагидрат от 0,0154 до 0,0289 ЭДТА от 0,0029 до 0,0054 полисорбат-80 от 0,0378 до 0,0709 этанол 95% от 0,0004 до 0,0007 вода остальное

Каждый вариант средства применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

При этом средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно.

Причем в частном случае выполнения средство интраназально вводят в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц или внутримышечно в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц. А совместное введение интраназально и внутримышечно осуществляют в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц внутримышечно, в дозе от 5*10 10 до 5*1011вирусных частиц интраназально.

Совместное введение предусматривает интраназальное и внутримышечное введение в рамках одной процедуры вакцинации.

Технический результат заключается в разработке средства, обеспечивающего развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.

Основная цель вакцинации - обеспечить эффективную и долгосрочную защиту от патогена. Одним из вариантов достижения этой цели является многократная вакцинация. Когда организм человека впервые встречает вакцинный антиген это приводит к активации двух основных компонентов адаптивного иммунного ответа: В-лимфоцитов и эффекторных Т-лимфоцитов. Активированные B-лимфоциты трансформируются в плазматические клетки, способные к продукции антител, а также превращаются в B-клетки памяти. Эффекторные Т-лимфоциты делятся на два основных типа: Т-хелперы (CD4+) и Т-киллеры (CD8+). Главной функцией Т-хелперов является поддержка в развитии гуморального или клеточного иммунного ответа. Основной функцией Т-киллеров является уничтожение повреждённых клеток собственного организма. Т-киллеры являются одним из главных компонентов антивирусного иммунитета. Однако через некоторое время после вакцинации, количество антиген-специфичных иммунных клеток в организме начинает уменьшаться, тогда вводят бустерную дозу вакцины, которая позволяет поддерживать количество антиген-специфичных Т- и В-клеток на должном уровне (обеспечивающем протекцию организма от патогена).

Разработка однокомпонентного средства, которое будет вызывать стойкий иммунный ответ после однократной иммунизации является сложной научно-практической задачей. При этом значимость такой разработки сложно переоценить. Однократное введение способно обеспечить более быстрые темпы массовой вакцинации, что в условиях пандемии имеет критическое значение.Также данное средство может быть полезно для экстренной вакцинации, для иммунизации мобильных групп граждан (кочевые народы и пр.) и др. Кроме того, можно отметить, что при однократном введении снижается неблагоприятное воздействие на человека: травматичность, количество побочных эффектов и аллергических реакций.

Краткое описание фигур.

На фиг. 1

представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного

средства по варианту 1,

Ось ординат – титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.

Ось абсцисс – дни.

титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день

титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день

титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день

Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.

На фиг. 2

представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного средства по варианту 2,

Ось ординат – титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.

Ось абсцисс – дни.

титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день

титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день

титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день

Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.

На фиг.3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.

Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %.

Ось абсцисс – дни.

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.

Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.

На фиг.4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного средства по варианту 2 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.

Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %.

Ось абсцисс – дни.

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.

Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.

Осуществление изобретения.

Активным компонентом разработанного средства является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма аденовируса, со встроенной экспрессионной кассетой, содержащей ген антигена вируса SARS-CoV-2.

Аденовирусные векторы способны проникать в различные типы клеток человека, обеспечивают высокие уровни экспрессии целевого антигена, приводят к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. В ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России было разработано 3 варианта экспрессионных векторов на основе аденовирусов млекопитающих:

- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5

- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области

- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

В качестве антигена был выбран S белок SARS-CoV-2, который находится на поверхности вирусной частицы. Это один из наиболее перспективных антигенов, позволяющих индуцировать мощный и длительный иммунный ответ. Также было показано, что антитела к S белку SARS-CoV-2 являются вирус-нейтрализующими.

Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы разработали различные варианты экспрессионных кассет, содержащих ген S белка.

Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор – это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК [Wang W., Jia YL., Li YC., Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao CP., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports – 2017. – Vol. 8. – P. 10416].

Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор – синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор β-актина курицы и химерный интрон (β-актина курицы и β-глобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора СAG выше, чем у промотора CMV. [Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. – 2014. – Vol. 13. – P. 1270-1277].

Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 – промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1α (EF-1α). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток [Wang X, Xu Z, Tian Z, Zhang X, Xu D, Li Q, Zhang J, Wang T. The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. J Cell Mol Med. 2017 Nov;21(11):3044-3054. doi: 10.1111/jcmm.13216. Epub 2017 May 30. PMID: 28557288; PMCID: PMC5661254.]. Ген EF-1α кодирует фактор элонгации-1α, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1α часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.

Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.

Таким образом, в результате проведенной работы было разработано 3 варианта средства.

1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3

2) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

3) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1 Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа.

На первом этапе работы был разработан дизайн 3 вариантов экспрессионных кассет:

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.

Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).

Для получения рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России: плазмида pAd26-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа, и плазмида pAd26-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей.

На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd26-Ends, были получены плазмиды pAd26-Ends-CMV-S-CoV2, pAd26-Ends-CAG-S-CoV2, pAd26-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.

На следующем этапе плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.

В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы humanadenovirus 26-го серотипа: Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм humanadenovirus26-го серотипа:Ad26-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.

Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.

Пример 2. Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа.

В данной работе также использовали 3 варианта экспрессионных кассет:

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.

Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).

Для получения рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:

- плазмида pAd5-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа (одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок; второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома)

- плазмида pAd5-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.

На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd5-Ends, были получены плазмиды pAd5-Ends-CMV-S-CoV2, pAd5-Ends-CAG-S-CoV2, pAd5-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.

На следующем этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.

В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы humanadenovirus5-го серотипа: Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм humanadenovirus5-го серотипа:Ad5-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.

Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.

Пример 3. Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа.

В данной работе использовали 3 варианта экспрессионных кассет:

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.

Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).

Для получения рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:

- плазмида pSim25-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса обезьян 25-го серотипа

- плазмида pSim25-null, несущая геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.

На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pSim25-Ends, были получены плазмидыp-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2, p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2, p-Sim25-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса обезьян25-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.

На следующем этапе плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.

В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы simianadenovirus25-го серотипа: simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм simianadenovirus25-го серотипа: simAd25-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.

Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.

Пример 4. Разработка буферного раствора.

Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Для поддержания рН раствора в буфер добавили Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.

Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из активных компонентов средства:

1. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 (Ad26-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).

2. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 (Ad5-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).

3. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:4 (simAd25-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).

Полученные средства хранили при температуре -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.

Таблица 1 – Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы средства.

Таблица 1.

№
группы Состав буферного раствора Трис (мг) Хлорид натрия (мг) Сахароза (мг) Магния хлорида гексагидрат (мг) ЭДТА (мг) Полисорбат-80 (мг) Этанол 95% (мг) Вода 1 0,968 2,19 25 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 2 1,815 2,19 25 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 3 1,21 1,752 25 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 4 1,21 3,285 25 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 5 1,21 2,19 20 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 6 1,21 2,19 37,5 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 7 1,21 2,19 25 0,0816 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 8 1,21 2,19 25 0,153 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл 9 1,21 2,19 25 0,102 0,0152 0,25 0,0025 до 0,5 мл 10 1,21 2,19 25 0,102 0,0285 0,25 0,0025 до 0,5 мл 11 1,21 2,19 25 0,102 0,019 0,2 0,0025 до 0,5 мл 12 1,21 2,19 25 0,102 0,019 0,375 0,0025 до 0,5 мл 13 1,21 2,19 25 0,102 0,019 0,25 0,002 до 0,5 мл 14 1,21 2,19 25 0,102 0,019 0,25 0,00375 до 0,5 мл 15 1,21 2,19 25 0,102 0,019 0,25 0,0025 до 0,5 мл

Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы средства при температурах -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев не изменялся.

Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ (масс %):

Трис: от 0,1831 масс. % до 0,3432 масс. %;

Хлорид натрия: от 0,3313 масс. % до 0,6212 масс. %;

Сахароза: от 3,7821 масс. % до 7,0915 масс. %;

Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 масс. % до 0,0289 масс. %;

ЭДТА: от 0,0029 масс. % до 0,0054 масс. %;

Полисорбат-80: от 0,0378 масс. % до 0,0709 масс. %;

Этанол 95%: от 0,0004 масс. % до 0,0007 масс. %;

Растворитель: остальное.

Пример 5. Получение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме.

Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 1 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.

Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 2 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.

Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 3 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.

Активный компонент смешивается с компонентами буферного раствора во время технологического процесса. Фармацевтическое средство разливается в стерильные флаконы. Хранение производят в защищенном от света месте, при температуре не выше минус 18°С. Перед использованием необходимо достать из холодильной камеры и выдержать при комнатной температуре до полного размораживания не более 30 минут; перед применением перемешать, осторожно покачивая флакон (ампулу). Не допускается резко встряхивать препарат. Не допускается повторная заморозка.

Пример 6. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при внутривенном и внутримышечном введении.

В данном исследовании оценивали острую токсичность:

- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.

В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.

Расчет дозы средства проводили исходя из иммунизирующей дозы (108в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных – сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 108в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.

В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:

108в.ч. – близкая к эффективной дозе(ЭД) для мышей;

109в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;

1010в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;

1011в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;

Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:

1) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;

2) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;

3) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;

4) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;

5) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;

6) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;

7) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;

8) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;

9) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;

10) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;

11) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;

12) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;

13) плацебо (буферныйраствор), 20 мышей.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.

Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных:активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей.Физиологические функции:дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.

На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.

Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.

При макроскопическом исследовании не обнаруженовлияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.

Пример 7.

Определение эффективности иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.

Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против SARS-CoV-2 через 21 день после введения средства лабораторным животным.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 5*1010вирусных частиц/200мкл.

Были получены следующие группы животных:

1) Ad26-too-CMV-S-CoV2,

2) Ad26-too-CAG-S-CoV2,

3) Ad26-too-EF1-S-CoV2

4) Ad26-too

5) Ad5-too-CMV-S-CoV2,

6) Ad5-too-CAG-S-CoV2,

7) Ad5-too-EF1-S-CoV2

8) Ad5-too

9) simAd25-too-CMV-S-CoV2,

10) simAd25-too-CAG-S-CoV2,

11) simAd25-too-EF1-S-CoV2

12) simAd25-too

13) плацебо (буфер)

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 2.

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 2425 2 Ad26-too-CAG-S-CoV2, 2111 3 Ad26-too-EF1-S-CoV2 2786 4 Ad26-too 0 5 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 38802 6 Ad5-too-CAG-S-CoV2, 29407 7 Ad5-too-EF1-S-CoV2 33779 8 Ad5-too 0 9 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 14703 10 simAd25-too-CAG-S-CoV2, 16890 11 simAd25-too-EF1-S-CoV2 12800 12 simAd25-too 0 13 плацебо (буфер) 0

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2.

Пример 8. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации

Цель данного эксперимента заключалась в определении напряженности иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев в различные сроки после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.

В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.

1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формесодержащее в качестве единственного активного компонентаэкспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.

2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формесодержащее в качестве единственного активного компонентаэкспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек

Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14, 21, 28 и 42 дней, у пациентов отбирали образцы крови. Из полученных образцов выделяли сыворотку крови, которую в дальнейшем использовали для определения титра антител к S антигену вируса SARS-CoV-2.

Титр антител определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа, разработанной в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (РЗН 2020/10393 2020-05-18), которая позволяет определять титр IgG к RBD домену S антигена вируса SARS-CoV-2.

Планшеты с предварительно адсорбированным RBD (100 нг/лунку) промывали 5 раз

промывочным буфером. Далее в лунки планшета вносили в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.В остальные лунки планшета добавляли серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец).Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37 °С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгатамоноклональных антител, планшет закрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37 °С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С. После этого останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результат учитывали в течение 10 мин после остановки реакции путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны450 нм.

Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором значение OD450 сыворотки иммунизированного участника превышаетзначение контрольной сыворотки (сыворотка участника до иммунизации) более чем в 2 раза.

Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев после введения различных вариантов разработанного средства представлены на фиг.1,2.

Как видно из представленных данных, иммунизация добровольцев обоими вариантами разработанного средства позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы добровольцев) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. При этом рост напряженности гуморального иммунного ответа отмечается с увеличением дней после иммунизации.

Пример 9. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки клеточного иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации.

Цель данного эксперимента заключалась определении напряженности клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.

В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.

1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.

2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.

Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14 и 28 дней, у пациентов отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,077 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96л планшета (2*105 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 часа после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.

Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса. Полученные результаты представлены на Фиг.3,4.

Результаты проведенного исследования показали, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного иммунизацией добровольцев различными вариантами средства, согласно медиане значений пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, отмечается с увеличением дней после иммунизации. Во всех группах максимальные значения, пролиферирующих как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов наблюдаются на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днем исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях, пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов - p<0,001.

Таким образом, исходя из приведенных данных можно заключить, что иммунизация разработанным средством способна вызвать формирование напряженного антиген-специфического клеточного звена противоинфекционного иммунитета, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности в измеряемых параметрах до и после иммунизации.

Пример 10. Оценка нежелательных явлений у добровольцев после однократной и двукратной иммунизации вариантами разработанного средства.

Цельданного эксперимента заключалась определении побочных эффектов у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.

В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.

1) Однократноевнутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.

2) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.

3) Двукратная схема иммунизации, при которой вначале вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, а через 21 день вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, 20 человек.

В таблице 3включены данные об основных нежелательных явлениях, зарегистрированных с момента начала исследования и вплоть до визита (телефонного контакта) 180-го дня в рамках исследования.

Кол-во субъектов (%) Кол-во событий Группа 1
(Ad26-too-CMV-S-CoV2) Группа 2
(Ad5-too-CMV-S-CoV2) Группа 3
(Ad26-too-CMV-S-CoV2+ Ad5-too-CMV-S-CoV2) Лабораторные и инструментальные данные Повышение числа Т-лимфоцитов 3 (33.33%) 3 6 (66.67%) 6 7 (35.00%) 7 Снижение числа естественных клеток-киллеров 5 (55.56%) 5 4 (44.44%) 4 7 (35.00%) 8 Повышение числа B-лимфоцитов 3 (33.33%) 3 5 (55.56%) 5 5 (25.00%) 5 Повышение числа моноцитов 5 (55.56%) 5 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 Увеличение количества CD4-лимфоцитов 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 6 (30.00%) 6 Уменьшение процентного содержания лимфоцитов CD8 4 (44.44%) 4 0 (0.00%) 0 5 (25.00%) 5 Повышение количества CD8-лимфоцитов 1 (11.11%) 1 2 (22.22%) 2 4 (20.00%) 4 Повышение уровня иммуноглобулина Е (IgE) в крови 1 (11.11%) 1 2 (22.22%) 2 3 (15.00%) 3 Повышение скорости оседания эритроцитов 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 2 (10.00%) 2 Повышение числа естественных клеток-киллеров 0 (0.00%) 0 2 (22.22%) 2 4 (20.00%) 4 Уменьшение соотношения CD4/CD8 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 4 (20.00%) 4 Повышение числа лейкоцитов 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 Повышение числа тромбоцитов 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 Снижение количества CD4-лимфоцитов 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 2(10.00%) 2 Увеличение процентного содержания лимфоцитов 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 7(35.00%) 7 Увеличение соотношения CD4/CD8 0 (0.00%) 0 1 (11.11%) 1 2 (10.0%) 2 Общие нарушения и реакции в месте введения Боль в месте вакцинации 7 (77.78%) 7 5 (55.56%) 5 8 (40.00%) 10 Гипертермия 8 (88.89%) 9 2 (22.22%) 2 19 (55.00%) 35 Астения 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 11 (55.00%) 13 Боль 3 (33.33%) 4 2 (22.22%) 2 4 (20.00%) 7 Снижение аппетита 2 (22.22%) 2 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 Пирексия 0 (0.00%) 0 1 (11.11%) 1 1 (5.00%) 1 Нарушения со стороны нервной системы Головная боль 6 (66.67%) 6 3 (33.33%) 3 11 (55.00%) 15 Нарушения со стороны дыхательной системы, органов грудной клетки и средостения Боль в ротоглотке (орофарингеальная) 0 (0.00%) 0 1 (11.11%) 1 1 (5.00%) 1 Ринорея 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 4 (20.00%) 4 Першение в горле 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 2(10.00%) 2 Заложенность носа 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 Чихание 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 Вирусная инфекция верхних дыхательных путей 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 Желудочно-кишечные нарушения Диарея 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 3(15.00) 3 Нарушения со стороны иммунной системы Крапивница 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0

Как видно из представленных данных однократная схема иммунизации разработанным средством для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формевызывает существенно меньше побочных эффектов, по сравнению с двукратной схемой иммунизации.

Пример 11. Определение эффективности интраназальной иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.

Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при интраназальном введении.

В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:

1) Однократное интраназальноевведение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

2) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

3) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

4) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

5) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

6) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

7) Однократное интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.

Таблица 4 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Группа животных Титр антител Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозу 919 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозу 8445 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозу 6400 Ad26-too-CMV-S-CoV2,5*10¹¹вч/дозу 1838 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозу 19401 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозу 12800 Буферный раствор 0

Как видно из полученных результатов интраназальная иммунизация животных разработанным средством приводила к повышению титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме путем его интраназальноговведения.

Пример 12. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизации.

Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при совместном интраназальном введении и внутримышечном введении.

В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:

1) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

2) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу

3) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

4) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

5) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

6) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

7) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.

8) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу

9) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу

10) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

11) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу

12) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

13) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

14) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

15) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

16) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

17) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

18) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.

19) Интраназальное введение буферного раствора и одновременно внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).

20) Интраназальное введение буферного раствора(отрицательный контроль).

21) Внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Группа животных Титр антител 1 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 3200 2 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н 1056 3 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 2111 4 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м, 38802 5 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н 8445 6 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 33779 7 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 22286 8 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н 6400 9 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 16890 10 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 44572 11 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 44572 12 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰ вч/дозуи/н,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 51200 13 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰ вч/дозув/м 51200 14 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰ вч/дозу и/н,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозув/м 19401 15 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰вч/дозуи/н,
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹⁰ вч/дозу в/м 22286 16 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 3676 17 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н, 1213 18 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 2425 19 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 44572 20 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н 9701 21 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 33779 22 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 25600 23 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н 7352 24 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 19401 25 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 51200 26 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 51200 27 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹ вч/дозуи/н,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 51200 28 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹ вч/дозув/м 58813 29 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹ вч/дозу и/н,
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозув/м 22286 30 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹вч/дозуи/н,
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10¹¹ вч/дозу в/м 25600 31 Буферный раствор и/н
Буферный раствор в/м 0 32 Буферный раствор и/н 0 33 Буферный раствор в/м 0

Как видно из полученных результатов совместная интраназальная и внутримышечная иммунизация животных разработанным средством приводила к более мощному гуморальному иммунному ответу, по сравнению с иммунизацией только одним способом. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназальноговведения.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный

исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного

академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

<120>Средство для индукции специфического иммунитета против вируса

тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме

(варианты).

<160>7

<170>BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 4711

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал

полиаденилирования

<400> 1

atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata 60

acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat 120

aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga 180

gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc 240

ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt 300

atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat 360

gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag 420

tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc 480

aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga 540

ggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctggtaccgt 600

cgacgcggccgctcgagcctaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccac 660

tagtctctagtcagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacacca 720

acagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcact 780

ctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacg 840

tgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacgggg 900

tgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacac 960

tggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaag 1020

tgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaaca 1080

agagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagt 1140

acgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgc 1200

gcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacaccccta 1260

tcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgc 1320

ccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctga 1380

cacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacc 1440

tgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtgg 1500

attgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaa 1560

agggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttcc 1620

ccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctg 1680

tgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtaca 1740

actccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacc 1800

tgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcaga 1860

ttgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttca 1920

ccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactaca 1980

attacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctcca 2040

ccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctact 2100

tcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagag 2160

tggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaa 2220

gcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccg 2280

gcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattg 2340

ccgataccacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcacccctt 2400

gcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcag 2460

tgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctga 2520

cacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtc 2580

tgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggca 2640

tctgtgccagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagcc 2700

agagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaaca 2760

actctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgt 2820

ccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgct 2880

ccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacaggga 2940

tcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctaca 3000

agacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatccta 3060

gcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccg 3120

acgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctga 3180

tttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatga 3240

tcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggag 3300

ctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcg 3360

gagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcg 3420

ccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcagg 3480

acgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaact 3540

tcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccg 3600

aggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttaccc 3660

agcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgt 3720

ctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctga 3780

tgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccg 3840

ctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttc 3900

ctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttct 3960

acgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtga 4020

tcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaag 4080

aggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatca 4140

gcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtgg 4200

ccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtaca 4260

tcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatgg 4320

tcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagct 4380

gtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaat 4440

tacattacacataagatatccgatccaccggatctagataactgatcataatcagccata 4500

ccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctga 4560

aacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttaca 4620

aataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagtt 4680

gtggtttgtccaaactcatcaatgtatctt a 4711

<210> 2

<211> 5984

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CAG-промотор,

оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал

полиаденилирования

<400> 2

gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcc 60

catatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgccca 120

acgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaataggga 180

ctttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatc 240

aagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcct 300

ggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtat 360

tagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatct 420

ccccccctcccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatg 480

ggggcggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcgggg 540

cgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttcctttta 600

tggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcg 660

ctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggc 720

tctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggct 780

gtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttg 840

aggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtg 900

tgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggc 960

gcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtg 1020

ccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtggg 1080

gggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccc 1140

cgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcgggg 1200

ctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcct 1260

cgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcga 1320

ggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggactt 1380

cctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagc 1440

gggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgt 1500

gcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggac 1560

ggctgccttcggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggct 1620

ctagaaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagt 1680

gtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagag 1740

gcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgt 1800

tcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatg 1860

gcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagca 1920

ccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagaccc 1980

agagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagt 2040

tctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaa 2100

gcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctt 2160

tcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttca 2220

agaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcggg 2280

atctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaaca 2340

tcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagca 2400

gcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacct 2460

tcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatc 2520

ctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccaga 2580

ccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatc 2640

tgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaacc 2700

ggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttca 2760

gcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacg 2820

tgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacaga 2880

caggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattg 2940

cctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggc 3000

tgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcagg 3060

ccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcct 3120

acggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagct 3180

tcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtga 3240

agaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagaga 3300

gcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacg 3360

ccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggag 3420

tgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacg 3480

tgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcggg 3540

tgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagc 3600

acgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctacc 3660

agacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcct 3720

acacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatcc 3780

ccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagacca 3840

gcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgc 3900

agtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacagg 3960

acaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatca 4020

aggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagc 4080

ggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatca 4140

agcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagt 4200

ttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacat 4260

ctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgc 4320

agatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatg 4380

tgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatcc 4440

aggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccaga 4500

atgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagct 4560

ctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgaca 4620

gactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagag 4680

ccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgg 4740

gccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagt 4800

ctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatt 4860

tcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgt 4920

tcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatca 4980

tcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaaca 5040

ataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagt 5100

actttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgcca 5160

gcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacg 5220

agagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggt 5280

acatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgt 5340

gttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgca 5400

agttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataat 5460

tcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctgg 5520

ctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagc 5580

cccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgtt 5640

ggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatc 5700

agaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaaca 5760

aaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttat 5820

tccatagaaaagccttgacttgaggttagatttttttatattttgttttgtgttattttt 5880

tctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcc 5940

tgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatc 5984

<210> 3

<211> 5314

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая EF1-промотор,

оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал

полиаденилирования

<400> 3

ggtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagt 60

tggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactggg 120

aaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataa 180

gtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa 240

gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgcctt 300

gaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtg 360

ggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgagg 420

cctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcg 480

ctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttt 540

tctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttg 600

gggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcc 660

tgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctgg 720

tgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcgg 780

caccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaat 840

ggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcct 900

ttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacc 960

tcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatg 1020

cgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttga 1080

tgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctc 1140

agacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggaattagcttggtac 1200

taatacgactcacaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctc 1260

tagtcagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctt 1320

taccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctaccca 1380

ggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccgg 1440

caccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactt 1500

tgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacag 1560

caagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcga 1620

gttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctg 1680

gatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtc 1740

ccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagtt 1800

cgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacct 1860

cgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcgg 1920

catcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctgg 1980

cgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcc 2040

tagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgc 2100

tctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcat 2160

ctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatat 2220

caccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgc 2280

ctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgc 2340

cagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgctt 2400

cacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccc 2460

tggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctg 2520

tgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacct 2580

gtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagat 2640

ctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccact 2700

gcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggt 2760

gctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaa 2820

tctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgct 2880

gacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgatac 2940

cacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagctt 3000

cggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgta 3060

ccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctac 3120

atggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcgg 3180

agccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgc 3240

cagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcat 3300

cattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctat 3360

cgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgac 3420

caagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacct 3480

gctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgt 3540

ggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccc 3600

tcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcc 3660

cagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccgg 3720

cttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgc 3780

ccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgccca 3840

gtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgc 3900

cgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgac 3960

ccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcgg 4020

caagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggt 4080

caaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgc 4140

catcagctctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgca 4200

gatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagct 4260

gatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtg 4320

tgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagctt 4380

ccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaaga 4440

gaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagaga 4500

aggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagcc 4560

ccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcat 4620

tgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaact 4680

ggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaat 4740

caatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaa 4800

tctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtg 4860

gccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaat 4920

catgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcag 4980

ctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacatta 5040

cacataagatctagagtcggggcggccggccgctcgctgatcagcctcgactgtgccttc 5100

tagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgc 5160

cactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtg 5220

tcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaa 5280

tagcaggcatgctggggatccgagtgtcgataag 5314

<210> 4

<211> 4678

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал

полиаденилирования

<400> 4

atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata 60

acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat 120

aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga 180

gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc 240

ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt 300

atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat 360

gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag 420

tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc 480

aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga 540

ggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctggtaccat 600

gtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagtgtgtgaacctgaccacaag 660

aacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa 720

ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaa 780

cgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaa 840

ccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcat 900

cagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaa 960

caacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcct 1020

gggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacag 1080

cagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg 1140

caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctactt 1200

caagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctc 1260

tgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacact 1320

gctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctgg 1380

tgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacga 1440

gaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtg 1500

caccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca 1560

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggt 1620

gttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattg 1680

cgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacgg 1740

cgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgt 1800

gatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgacta 1860

caactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacct 1920

ggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct 1980

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaa 2040

cggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaa 2100

tggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccc 2160

tgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaactt 2220

caacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgcc 2280

attccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacgccgtacgagatccccagac 2340

actggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg 2400

caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcc 2460

cgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaa 2520

tgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacga 2580

gtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagccc 2640

cagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgc 2700

cgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcag 2760

cgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgta 2820

catctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcac 2880

ccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggt 2940

gttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaa 3000

tttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacct 3060

gctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtct 3120

gggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgct 3180

gccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcac 3240

aatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgca 3300

gatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaa 3360

gctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcac 3420

agcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacac 3480

cctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcct 3540

gagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggct 3600

gcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctc 3660

tgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtgga 3720

cttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggt 3780

gtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccat 3840

ctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcaccca 3900

ttggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacacctt 3960

cgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctct 4020

gcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaag 4080

ccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaa 4140

agagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgca 4200

agaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttat 4260

cgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctg 4320

tagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattc 4380

tgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataagatatcgcggccgctcgagt 4440

ctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaa 4500

acctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaact 4560

tgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata 4620

aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta 4678

<---

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описано средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. В другом варианте средство содержит в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. Еще в одном варианте средство содержит в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. При этом, в частном случае его выполнения, буферный раствор средства для жидкой формы содержит, масс. %: трис от 0,1831 до 0,3432, хлорид натрия от 0,3313 до 0,6212, сахароза от 3,7821 до 7,0915, магния хлоридагексагидрат от 0,0154 до 0,0289, ЭДТА от 0,0029 до 0,0054, полисорбат-80 от 0,0378 до 0,0709, этанол 95% от 0,0004 до 0,0007, вода остальное. Средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, обеспечивая эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 12 пр.

1. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

2. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

3. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

4. Средство по пп. 1-3, отличающееся тем, что дополнительно содержит буферный раствор, содержащий, масс. %:

трис от 0,1831 до 0,3432 хлорид натрия от 0,3313 до 0,6212 сахароза от 3,7821 до 7,0915 магния хлорида гексагидрат от 0,0154 до 0,0289 ЭДТА от 0,0029 до 0,0054 полисорбат-80 от 0,0378 до 0,0709 этанол 95% от 0,0004 до 0,0007 вода остальное

5. Применение средства по пп. 1-3 для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, где указанное средство предназначено для интраназального или внутримышечного введения или совместного интраназального и внутримышечного введения.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для интраназального введения в дозе 5*10¹⁰-5*10¹¹ вирусных частиц.

7. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для внутримышечного введения в дозе 5*10¹⁰-5*10¹¹ вирусных частиц.

8. Применение по п. 5, отличающееся тем, что при совместном введении интраназально и внутримышечно указанное средство внутримышечно вводят в дозе 5*10¹⁰-5*10¹¹ вирусных частиц, а интраназально в дозе 5*10¹⁰-5*10¹¹ вирусных частиц.