СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ RYR1, DMD И ESR1 МЕТОДОМ ПЦР В "РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ", А ТАКЖЕ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ПЦР В ФОРМАТЕ МИКРОЧИПА Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена эстрогенового рецептора (ESR1), влияющего на воспроизводительные качества свиноматок, а также генов рианодинового рецептора (RYR1) и дистрофина (DMD), обуславливающих возникновение стресс-синдрома свиней (Fujii J. Kinya О., Zorzato F. Identification of a Mutation in Porcine Ryanodine Receptor Associated with Malignant Hyperthermia // Science. - 1991. - №253. - P. 448-451; Brenig В., Brem G. Genomic organization and analysis of the 5' end of the porcine ryanodine receptor gene (ryr1) // FEBS Lett. - 1992. - Feb 24. - V. 298 (2-3). - P.277-279; Nonneman D.J., Brown-Brandl Т., Jones S.A., Wiedmann R.T., Rohrer G.A. A defect in dystrophin causes a novel porcine stress syndrome // BMC Genomics. - 2012. - №13. - P. 233.). Эти гены активно используются при проведении генетической оценки племенных свиней, поэтому предлагаемая система быстрого и высокопроизводительного генотипирования по данным генам перспективна для применения в селекционной работе в свиноводстве.

RYR1 - это один из ключевых генов, обуславливающих возникновение стресс-синдрома у свиней. Однонуклеотидная замена С1843 (аллель N) -> Т (аллель n) в экзоне этого гена вызывает изменение в аминокислотной последовательности рианодин-рецепторного белка и является причиной развития злокачественного гипертермического синдрома. Развитие синдрома способствует накоплению в мышцах молочной кислоты, что в свою очередь является серьезным дефектом, снижающим качество мясной продукции. По этой причине, согласно приказу МСХ РФ №431 от 17 ноября 2011 года, в России все хряки основного стада подлежат тестированию по гену RYR1.

Однако, как выяснилось в дальнейших исследованиях, RYR1 является не единственным геном, отвечающим за проявление стресс-синдрома у свиней. На Х-хромосоме был обнаружен и второй ген - DMD, полиморфизм которого также связан с возникновением стресс-синдрома. Нуклеотидная замена (85890_783; ss410758971, экзон 41) приводит к замене аргинина на триптофан в позиции 1958 (R1958W) аминокислотной последовательности гена дистрофина (DMD), участвующего в формировании мышечной ткани. По всей видимости, данная замена приводит к уменьшению экспрессии дистрофина в диафрагме, поясничной и длиннейшей мышце спины. (Hollinger K., Selsby J.Т. The physiological response of protease inhibition in dystrophic muscle // Acta Physiol. - 2013. - №208. - P. 234-244; Nonneman D.J., Brown-Brandl Т., Jones S.A., Wiedmann R.T., Rohrer G.A. A defect in dystrophin causes a novel porcine stress syndrome // BMC Genomics. - 2012. - №13. - P. 233).

Полиморфизм гена эстрогенового рецептора ESR1 давно изучается, известно два аллеля этого гена - А и В (Rothschild M.F. Genetics and reproduction in the pigs // Anim. Reprod. Sci. - 1996. - P. 143-151; Drogemuller C., Thiven U., Harlizius B. An AvaI and a MspA1I polymorphism at the porcine oestrogen receptor (ESR1) gene // Animal Genetics. - 1997. - №28. - P. 58-71), для которых была показана связь с хозяйственно-полезными признаками. Полиморфизм обусловлен сцепленной заменой нуклеотидов GG (аллель В) на AT (аллель А) в восьмом экзоне гена ESR1 (14418786-й и 14418789-й нуклеотиды на последовательности NC_010443.5). Эстрогеновый рецептор ESR1 имеет важное биологическое значение - он является белком-фактором транскрипции, передающим сигнал от гормона эстрагена. Также ген эстрагенового рецептора участвует в процессе развития эмбриона (Rothschild M.F., Vaske D.A., Tuggle С.K., Messer L.A., McLaren D.G., Short Т.Н., Eckardt G.R., Mileham A.J., Plastow G.S., Southwood O.I., Van der Steen H. The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litier size in pigs // Genetics. - 1996. - Vol. 93. - P. 201-205; Short Т.Н., Rothschild M.F., Southwood O.I., McLaren D.G., De Vries A., Van der Steen H., Eckardt G.R., Tuggle C.K., Helm J., Vaske D.A., Mileham A.J., Plastow G.S. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines // Anim. Sci. - 1997. - №75. - P. 3138-3142; Сметник А.А. Эстрогеновые рецепторы и их функции (обзор литературы) // Проблемы репродукции. - №3. - 2011. - С 31-37). На примере крупной белой породы показано влияние аллелей этого гена на один из важнейших признаков - многоплодие (Шейко И.П., Лобан Н.А., Василюк О.Я., Драбинович Д.С. Селекция на повышение многоплодия свиноматок крупной белой породы методом молекулярной генной диагностики // Известия Национальной академии наук Беларуси - №3. - 2006. - С. 77-81). Были проведены исследования распределения аллелей этого гена и для других пород свиней (Rothschild M.F., Larson R.G., Jacobson С., Pearson P. PvuII polymorphisms at the porcine estrogen-receptor locus (ESR) // Anim. Genet. - 1991. - №22. - P. 448; Drogemuller C., Thiven U., Harlizius B. An AvaI and a MspA1I polymorphism at the porcine oestrogen receptor (ESRL) gene // Animal Genetics. - 1997. - №28. - P. 58-71; Xu N.Y., Zhang S.Q., Peng S.H. Investigation on the distribution and their effects on reproduction traits of three major genes in Jinhua pigs // Yi Chuan Xue Bao. - 2003. - №30. - P. 1090-1096). Результат этих исследований показал, что в зависимости от породы, желательным может быть, как генотип ВВ, так и АА (Балацкий, В.Н. Овсяник Т.В. Ассоциация ESR-генотипов с репродуктивными качествами свиноматок и их распределение в популяциях свиней разных пород // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: материалы 6-ой Международной научной конференции. - 19-20 декабря 2006 г. - Дубровицы. - 2006. - С. 41-43).

Прототипами разработанных тест-систем выступали созданные ранее методики, основанные на технологии ПЦР-ПДРФ. Для гена ESR1 это тест-система, описанная в статье Short Т.Н. (Short Т.Н., Rothschild M.F., Southwood O.I., McLaren D.G., De Vries A., Van der Steen H., Eckardt G.R., Tuggle C.K., Helm J., Vaske D.A., Mileham A.J., Plastow G.S. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines // Anim. Sci. - 1997. - №75. - P. 3138-3142), для гена RYR1 - тест-система, показанная в работе Ковальчук М.А. (Ковальчук М.А., Ганджа А.И., Журина Н.В., Курак О.П., Симоненко В.П., Леткевич Л.Л., Кириллова И.В., Лукьянчик А.О. Генотипирование свиней по генам H-FABP и RYR1 методом ПЦР-ПДРФ // Зоотехническая наука Беларуси. - 2018. - Т. 53. - №1. - С. 109-116), а для гена DMD - тест-система, описанная в работе Костюниной О.В. (Костюнина О.В., Карпушкина Т.В., Форнара М.С., Зиновьева Н.А. Новый стресс-синдром у свиней, обусловленный мутацией в гене DMD // Свиноводство. - 2015. - №8. - С. 14-15). Указанные тест-системы позволяют четко выявлять аллельные состояния этих генов, но имеют общий недостаток по отношению к новым разработанным нами системам - они не могут применяться в условиях массового высокопроизводительного анализа по причине наличия этапов рестрикции ПЦР-продуктов и электрофореза фрагментов ДНК в агарозном геле. Повышение скорости анализа и одновременное его удешевление является особенно актуальным в настоящее время.

Задача нашего изобретения - создание простых в использовании тест-систем для определения аллелей А и В гена ESR1, аллелей N и n гена RYR1, а также аллелей С и Т гена DMD, пригодных для систем ПЦР в реальном времени и высокопроизводительных систем, выполняющих ПЦР в формате микрочипа. В последнем случае реализована возможность одновременного использования трех тест-систем при генотипировании свиней.

Технический результат изобретения достигнут следующим образом. Разработаны методики определения аллелей генов ESR1 и RYR1, базирующиеся на принципе полимеразной цепной реакции, специфичность протекания которой задана праймерами, а определение аллелей - флуоресцентно-мечеными зондами.

Принцип действия предложенных тест-систем заключается в следующем. С помощью специфичных праймеров в полимеразной цепной реакции синтезируется участок гена, содержащий внутри себя полиморфный нуклеотид/нуклеотиды. Для первой тест-системы - это участок гена RYR1, для второй - ESR1, для третьей - DMD. Флуоресцентно-меченые зонды, представляющие собой фрагмент однонитевой ДНК, комплементарный участку, содержащему полиморфный нуклеотид/нуклеотиды, могут образовывать ДНК-дуплексы с синтезируемым участком гена. Если аллельный вариант совпадает с последовательностью зонда, то происходит успешная гибридизация флуоресцентно-меченый зонда и его дальнейшее разрушение под действием фермента Taq-ДНК-полимеразы. При этом краситель высвобождается и происходит усиление флуоресценции.

Параметры зондов и праймеров оптимизированы под идентичные температурные условия реакции, что позволяет совместно использовать эти тест-системы в условиях одного эксперимента при высокопроизводительном генотипировании с помощью ПЦР-микрочипа.

Использовано два канала флуоресценции - FAM и VIC (HEX, R6G). Для гена ESR1 зонды помечены следующим образом: FAM - для аллеля A, R6G - для аллеля В; для гена RYR1: FAM - для аллеля n, R6G - для аллеля N; для гена DMD: FAM - для аллеля Т, R6G - для аллеля С. Выбор данных каналов обусловлен тем, что они являются стандартными для приборов, выполняющих детекцию результатов ПЦР по конечной точке или в режиме реального времени.

Предложенный способ отличается тем, что может применяться как на стандартных приборах ПЦР с детекцией результатов в реальном времени, так и на высокопроизводительных установках, использующих ПЦР-микрочипы.

Сущность изобретения - определение методом ПЦР в режиме реального времени либо высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа аллелей ДНК-маркера ESR1, влияющего на воспроизводительные качества свиноматок и ДНК-маркеров RYR1 и DMD, обуславливающих возникновение стресс-синдрома свиней.

В процессе работы тест-систем происходит амплификация трех участков ДНК генома домашней свиньи, содержащих полиморфные нуклеотиды. Для гена RYR1 - это фрагмент хромосомы №6 с 47357924-го по 47358031-й нуклеотид (согласно последовательности NC_010448.4, Sus scrofa isolate TJ Tabasco breed Duroc chromosome 6, Sscrofal1.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/84), для гена ESR1 - это участок первой хромосомы с 14418734-го по 14418818-й нуклеотид (согласно последовательности NC_010443.5, Sus scrofa isolate TJ Tabasco breed Duroc chromosome 1, Sscrofal1.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/84), для гена DMD - это фрагмент хромосомы X с 28309194-го по 28309268-й нуклеотид (согласно последовательности NC_010461.5, Sus scrofa isolate TJ Tabasco breed Duroc chromosome X, Sscrofal1.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/84). Ha данных ампликонах происходит аллель-специфичная гибридизация флуоресцентно-меченых зондов.

В случае гена RYR1 флуоресцентно-меченый зонд определяет 47357966-й нуклеотид 6-й хромосомы домашней свиньи (NC_010448.4), в случае гена DMD - 28309227-й нуклеотид хромосомы X, в случае гена ESR1 - 14418786 и 14418789 нуклеотиды 1-й хромосомы (NC_010443.5). Определение полиморфизма происходит по принципам TaqMan (для генов ESR1 и DMD) и Snake Primers (для гена RYR1) (Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' -> 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - V. 88. - P. 7276-7280; Kutyavin I. V. New approach to real-time nucleic acids detection: folding polymerase chain reaction amplicons into a secondary structure to improve cleavage of resonance energy transfer probes in 5'-nuclease assays // Nucleic Acids Research. - 2010. - Vol. 38. - №5).

Описание референтной группы

Для валидации разработанных тест-систем была создана референтная группа образцов с известными генотипами, которая состояла из 75 образцов ткани (ушной выщип), полученных от свиней трех пород: дюрок (25 образцов) крупная белая (25 образцов) и ландрас (25 образцов). Для гена RYR1 было взято дополнительно 14 образцов хряков линии MAXGRO™ по причине низкого полиморфизма гена RYR1 у свиней современной селекции пород дюрок, крупная белая и ландрас. ДНК выделяли с помощью коммерческих наборов ДНК Экстран 2 (ЗАО «Компания Синтол», Россия), генотипы свиней по генам RYR1, DMD и ESR1 в референтной группе определяли с помощью метода ПЦР-ПДРФ.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. - генотипирование референтных образцов с помощью метода ПЦР-ПДРФ, справа указана длина фрагментов ДНК после проведения рестрикции; А - ген RYR1, Б - ген ESR1, В - ген DMD.

На фиг. 1А представлен пример определения генотипов для гена RYR1. Образцы под номерами 1, 2, 3, 5 и 6 имеют генотип NN; образцы под номерами 4 и 8 имеют генотип Nn; образец под номером 7 имеет генотип nn.

На фиг. 1Б представлен пример определения генотипов для гена ESR1. Образцы под номерами 3 и 7 имеют генотип АА; образец под номером 1 имеет генотип АВ; образцы под номерами 2, 4, 5, 6 и 8 имеют генотип ВВ.

На фиг. 1В представлен пример определения генотипов для гена DMD. Образцы под номерами 1, 3, 4 и 5 имеют генотип Т0; образцы под номерами 2 и 6 имеют генотип С0.

Исследование референтных образцов с помощью методов ПЦР-ПДРФ выявило по гену RYR1 91% животных с генотипом NN; 7,9% животных с генотипом Nn и 1,1% животных с генотипом nn. Для гена ESR1 распределение было следующим: 77,3% животных обладали генотипом АА; 14,7% животных несли генотип АВ и 8% животных - ВВ. По гену DMD выявлено, что 92% животных несли генотип СС, 5,33% несли генотип СТ и 2,66% - генотип Т0.

Определение полиморфизма генов RYR1, ESR1 и DMD с помощью разработанных тест-систем выполняли следующим образом:

1. При использовании систем ПЦР в реальном времени готовили ПЦР-смесь следующего состава (20 мкл смеси в расчете на 1 образец):

20 мМ (NH₄)₂SO₄; 75 мМ Трис-HCl; рН=8,8; 0,1% (v/v) Tween 20; 2,5 мМ MgCl₂; 0,25 мМ дНТФ. В смесь вносили 0,2 Ед Taq-ДНК-полимеразы в расчете на 1 образец. Для проведения анализа брали 1 мкл геномной ДНК.

2. Для избирательной амплификации необходимого участка ДНК в ПЦР-смесь добавляли указанные ниже праймеры (10 пкМ/20 мкл реакционной смеси).

Для гена RYR1:

RYR-Sn-F (5'-TCGGCCACACCAGATGTCCTGTGTTCCCTGTGT-3');

RYR-Sn-R (5'-GTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC-3).

Для гена ESR1:

ESR1-TM-F (5'-AAGATGCAGAATCAAGTTTTATGAG-3');

ESR1 -TM-R (5 '-ACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3').

Для гена DMD:

DMD-TM-F (5'-TTCGAAAGTGAGCAAATTTGCTCTCA-3');

DMD-TM-R (5'-TGGCAGTGGAGCCAACTCAGAT-3').

3. Для выявления полиморфизма внутри амплифицируемой последовательности в ПЦР-смесь добавляли указанные ниже флуоресцентно-меченые зонды (5 пкМ/20 мкл реакционной смеси).

Для гена RYR1:

RYR-Sn-R6G (R6G-TGCGCTCCAACCAAGATCT-BHQ-1);

RYR-Sn-FAM (FAM-TGTGCTCCAACCAAGATCT-BHQ-1).

Для гена ESR1:

ESR1-TM-GG (R6G-CCAGCTGTTCTTGTCAAGTC-BHQ-1);

ESR1-ТМ-АТ (FAM-CCAACTTTTCTTGTCAAGTCC-BHQ-1).

Для гена DMD:

DMD-TM-FAM (FAM-TTTCCCACCAGCGCTTGC-BHQ-1);

DMD-TM-R6G (R6G-TTTCCCGCCAGCGCTTGC-BHQ-1).

4. Выполняли ПЦР по следующему протоколу:

первичная денатурация (95°С, 8 минут); (денатурация (95°С, 30 секунд), отжиг праймеров (60°С, 45 секунд), элонгация 72°С, 5 секунд) X 40 циклов. Определение флуоресценции происходит на этапе отжига праймеров.

5. Определение аллелей генов ESR1, RYR1 и DMD происходило в процессе реакции, где аллелям n (RYR1), A (ESR1) и Т (DMD) соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, а аллелям N (RYR1), В (ESR1) и С (DMD) соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G.

6. Для определения аллелей с помощью высокопроизводительных систем на основе ПЦР-микрочипов необходимо соблюдать инструкцию производителя оборудования, в соответствии с которой нужно добавлять праймеры и флуоресцентно-меченые зонды.

7. Корректность определения аллелей генов RYR1, ESR1 и DMD выявляли путем сравнения их с полученными ранее при использовании метода ПЦР-ПДРФ.

На фиг. 2. представлена схема разработанной тест-системы для определения аллелей гена RYR1 и примеры генотипирования.

На фиг. 2А представлена схема разработанной тест системы для определения аллелей гена RYR1.

На фиг. 2Б представлен пример определения аллелей гена RYR1 с помощью метода ПЦР в реальном времени.

На фиг. 2В представлен пример применения разработанной тест-системы для гена ESR1 на приборе высокопроизводительного генотипирования Fluidigm ЕР1, выполняющего ПЦР в формате микрочипа.

Фиг. 3. Схема разработанной тест-системы для определения аллелей гена ESR1 и примеры генотипирования.

На фиг. 3А представлена схема разработанной тест системы для определения аллелей гена ESR1.

На фиг. 3Б представлен пример определения аллелей гена ESR1 с помощью метода ПЦР в реальном времени.

На фиг. 3В представлен пример применения разработанной тест-системы для гена ESR1 на приборе высокопроизводительного генотипирования Fluidigm ЕР1, выполняющего ПЦР в формате микрочипа.

Фиг. 4. Схема разработанной тест-системы для определения аллелей гена DMD и примеры генотипирования.

На фиг. 4А представлена схема разработанной тест системы для определения аллелей гена DMD.

На фиг. 4Б представлен пример определения аллелей гена DMD с помощью метода ПЦР в реальном времени.

На фиг. 4В представлен пример применения разработанной тест-системы для гена DMD на приборе высокопроизводительного генотипирования Fluidigm ЕР1, выполняющего ПЦР в формате микрочипа.

Пример. Контрольное использование разработанных тест-систем для выявления аллельных вариантов генов RYR1, DMD и ESR1 выполнено с помощью метода ПЦР в реальном времени, а также на приборе высокопроизводительного генотипирования Fluidigm ЕР1.

Генотипирование выполнено на 89 образцах ДНК свиней и хряков трех пород - крупная белая (25 животных), ландрас (25 животных), дюрок (25 животных) и линии MAXGRO™ (14 животных).

Генотипирование по гену RYR1 выявило, что 91,01% животных из исследуемой выборки имели генотип NN (96% свиней крупной белой породы, 100% дюрков, 96% ландрасов, 57,14% животных линии MAXGRO™), 1,12% имели генотип nn (0% свиней крупной белой породы, 0% дюрков, 0% ландрасов, 7,14% животных линии MAXGRO™) и 7,87% оказались гетерозиготами (4% свиней крупной белой породы, 0% дюрков, 4% ландрасов, 35,71% животных линии MAXGRO™).

Генотипирование по гену ESR1 позволило определить, что 77,33% животных из исследуемой выборки имели генотип АА (40% свиней крупной белой породы, 100% дюрков, 92% ландрасов), 8% имели генотип ВВ (24% свиней крупной белой породы, 0% дюрков, 0% ландрасов) и 14,67% были гетерозиготны (36% свиней крупной белой породы, 0% дюрков, 8% ландрасов).

Результаты исследования полиморфизма гена DMD следующие. 92% животных обладают генотипом СС/С0 (100% животных крупной белой породы, 100% дюрков и 76% ландрасов), 5,33% имеют генотип СТ (0% свиней крупной белой породы, 0% дюрков и 16% ландрасов) и 2,66% несут генотип ТТ/Т0 (0% животных крупной белой породы, 0% дюрков и 8% ландрасов).

Проведенное генотипирование показывает, что разработанные тест-системы позволяют определять аллели генов RYR1, DMD и ESR1, оказывающие влияние на важные признаки у свиней - возникновение стресс-синдрома и многоплодие. Представленные тест-системы позволяют снизить время и себестоимость анализа по сравнению с системами, основанными на ПЦР-ПДРФ, и имеют перспективы для применения в селекционной работе в свиноводстве.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 1

<211> 33

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность прямого праймера (5'-3'). Название: RYR-Sn-F.

<400> 1 tcggccacac cagatgtcct gtgttccctg tgt 33

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность обратного праймера (5'-3'). Название: RYR-Sn-R.

<400> 1 gtttgtctgc agcagaagct c 21

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 3

<211> 25

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность прямого праймера (5'-3'). Название: ESR1-TM-F.

<400> 1 aagatgcaga atcaagtttt atgag 25

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 4

<211> 23

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность обратного праймера (5'-3'). Название: ESR1-TM-R.

<400> 1 acttcgaggg tcagtccaat tag 23

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 5

<211> 26

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность прямого праймера (5'-3'). Название: DMD-TM-F.

<400> 1 ttcgaaagtg agcaaatttg ctctca 26

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность обратного праймера (5'-3'). Название: DMD-TM-R.

<400> 1 tggcagtgga gccaactcag at 22

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 7

<211> 19

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность аллель-специфического зонда (5'-3'). Название: RYR-Sn-R6G. Первый нуклеотид содержит карбоксиродамин-6G, последний нуклеотид содержит Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tgcgctccaa ccaagatct 19

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 8

<211> 19

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность аллель-специфического зонда (5'-3'). Название: RYR-Sn-FAM. Первый нуклеотид содержит 6-карбоксифлуоресцеин, последний нуклеотид содержит Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tgtgctccaa ccaagatct 19

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность аллель-специфического зонда (5'-3'). Название: ESR1-TM-GG. Первый нуклеотид содержит карбоксиродамин-6G, последний нуклеотид содержит Black Hole Quencher-1.

<400> 1 ccagctgttc ttgtcaagtc 20

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 10

<211> 21

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность аллель-специфического зонда (5'-3'). Название: ESR1-TM-AT. Первый нуклеотид содержит 6-карбоксифлуоресцеин, последний нуклеотид содержит Black Hole Quencher-1.

<400> 1 ccaacttttc ttgtcaagtc C 21

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 11

<211> 18

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность аллель-специфического зонда (5'-3'). Название: DMD-TM-FAM. Первый нуклеотид содержит 6-карбоксифлуоресцеин, последний нуклеотид содержит Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tttcccacca gcgcttgc 18

<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

<120> Способ определения аллелей генов RYR1, DMD и ESR1 методом ПЦР в «реальном времени», а также с помощью высокопроизводительной ПЦР в формате микрочипа

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 12

<211> 18

<212> ДНК

<213> Sus scrofa

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность аллель-специфического зонда (5'-3'). Название: DMD-TM-R6G. Первый нуклеотид содержит карбоксиродамин-6G, последний нуклеотид содержит Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tttcccgcca gcgcttgc 18

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The forward primer nucleotide sequence (5'-3'). Title: RYR-Sn-F.

<400> 1 tcggccacac cagatgtcct gtgttccctg tgt 33

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The reverse primer nucleotide sequence (5'-3'). Title: RYR-Sn-R.

<400> 1 gtttgtctgc agcagaagct c 21

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The forward primer nucleotide sequence (5'-3'). Title: ESR1-TM-F.

<400> 1 aagatgcaga atcaagtttt atgag 25

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The reverse primer nucleotide sequence (5'-3'). Title: ESR1-TM-R.

<400> 1 acttcgaggg tcagtccaat tag 23

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The forward primer nucleotide sequence (5'-3'). Title: DMD-TM-F.

<400> 1 ttcgaaagtg agcaaatttg ctctca 26

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The reverse primer nucleotide sequence (5'-3'). Title: DMD-TM-R.

<400> 1 tggcagtgga gccaactcag at 22

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The nucleotide sequence of the allele-specific probe (5'-3'). Title: RYR-Sn-R6G. The first nucleotide contains a rhodamine 6G. The last nucleotide contains a Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tgcgctccaa ccaagatct 19

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The nucleotide sequence of the allele-specific probe (5'-3'). Title: RYR-Sn-FAM. The first nucleotide contains a 6-carboxyfluorescein. The last nucleotide contains a Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tgtgctccaa ccaagatct 19

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The nucleotide sequence of the allele-specific probe (5'-3'). Title: ESR1-TM-GG. The first nucleotide contains a rhodamine 6G. The last nucleotide contains a Black Hole Quencher-1.

<400> 1 ccagctgttc ttgtcaagtc 20

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The nucleotide sequence of the allele-specific probe (5'-3'). Title: ESR1-TM-AT. The first nucleotide contains a 6-carboxyfluorescein. The last nucleotide contains a Black Hole Quencher-1.

<400> 1 ccaacttttc ttgtcaagtc C 21

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The nucleotide sequence of the allele-specific probe (5'-3'). Title: DMD-TM-FAM. The first nucleotide contains a 6-carboxyfluorescein. The last nucleotide contains a Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tttcccacca gcgcttgc 18

<110> Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

<120> A method for determining alleles of RYR1, DMD and ESR1 genes by using real-time PCR and high throughput microchip-PCR

<140> 2019142092/20(082103)

<141>18.12.2019

<160> 12

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<223> The nucleotide sequence of the allele-specific probe (5'-3'). Title: DMD-TM-R6G. The first nucleotide contains a rhodamine 6G. The last nucleotide contains a Black Hole Quencher-1.

<400> 1 tttcccgcca gcgcttgc 18

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой набор тест-систем для определения аллелей N (нуклеотид С) и n (нуклеотид Т) гена RYR1 (однонуклеотидная замена С -> Т, 47357966-й нуклеотид в последовательности NC_010448.4), аллелей С (нуклеотид G) и Т (нуклеотид А) гена DMD (однонуклеотидная замена G -> А, 28309227-й нуклеотид в последовательности NC_010461.5) и аллелей А (нуклеотиды А, Т) и В (нуклеотиды G, G) гена ESR1 (две сцепленные между собой нуклеотидные замены А, Т -> G, G; нуклеотиды №14418786, №14418789 в последовательности NC_010443.5) методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени либо с помощью приборов высокопроизводительного генотипирования в формате ПЦР-микрочипов с детекцией по конечной точке. Аллелям n (RYR1), Т (DMD) и A (ESR1) соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, а аллелям N (RYR1), С (DMD) и В (ESR1) - увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G. Разработанные тест-системы могут применяться в племенной работе с породами свиней с целью проведения селекции по желательным аллелям генов RYR1, DMD, связанных с возникновением стресс-синдрома, и ESR1, оказывающего влияние на многоплодие. 4 ил.

Набор олигонуклеотидов, использование которых в полимеразной цепной реакции, выполняемой в режиме реального времени либо с помощью прибора высокопроизводительного генотипирования в формате ПЦР-микрочипа, позволяет определять аллели генов RYR1, DMD, связанных с развитием стресс-синдрома, и гена ESR1, ассоциированного с многоплодием, где:

для гена RYR1

RYR-Sn-F (5'-TCGGCCACACCAGATGTCCTGTGTTCCCTGTGT-3');

RYR-Sn-R (5'-GTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC-3);

RYR-Sn-R6G (R6G-TGCGCTCCAACCAAGATCT-BHQ-1);

RYR-Sn-FAM (FAM-TGTGCTCCAACCAAGATCT-BHQ-1);

для гена DMD

DMD-TM-F (5'-TTCGAAAGTGAGCAAATTTGCTCTCA-3');

DMD-TM-R (5'-TGGCAGTGGAGCCAACTCAGAT-3');

DMD-TM-FAM (FAM-TTTCCCACCAGCGCTTGC-BHQ-1);

DMD-TM-R6G (R6G-TTTCCCGCCAGCGCTTGC-BHQ-1);

для гена ESR1

ESR1-TM-F (5'-AAGATGCAGAATCAAGTTTTATGAG-3');

ESR1-TM-R (5'-ACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3');

ESR1-TM-GG (R6G-CCAGCTGTTCTTGTCAAGTC-BHQ-1);

ESR1-TM-AT (FAM-CCAACTTTTCTTGTCAAGTCC-BHQ-1),

аллелю n гена RYR1, аллелю T гена DMD и аллелю А гена ESR1 соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, а аллелю N гена RYR1, аллелю С гена DMD и аллелю В гена ESR1 соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G.