СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА FGFR3 МЕТОДОМ ПЦР В «РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ» Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена рецептора фактора роста фибробластов (FGFR3). В норме рецептор фактора роста фибробластов 3 (FGFR3). Член семейства рецепторов тирозинкиназы, действует как отрицательный регулятор роста костей, его функция заключается в регулировании оссификации (превращение хряща в кость) и ограничении удлинения скелета, тем самым обеспечивая правильную длину конечностей. (Smith, L. В., Belanger, J. M., & Oberbauer, A. M. (2012). Fibroblast growth factor receptor 3 effects on proliferation and telomerase activity in sheep growth plate chondrocytes. Journal of animal science and biotechnology, 3(1). 39 https://doi.org/10.1186/2049-1891-3-39). Данный способ определения аллелей может найти применение в области разведения и селекции животных. Способ может быть использован для диагностики наследственного заболевания хопдродисплазия. Своевременное определение генотипов родителей и правильное составление родительских пар в селекции овец позволит получать здоровое потомство, свободное от нежелательных аллелей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Прототипами разработанной тест-системы выступала созданная ранее методика, основанная на технологии ПЦР-ПДРФ. Для гена FGFR3 это тест-система, описанная в статье Beever J.E. (Beever J.E., Smit M.A., Meyers S.N., Hadfield T.S., Bottema С., Albretsen J., Cockett N.E. A single-base change in the tyrosine kinase II domain of ovine FGFR3 causes hereditary chondrodysplasia in sheep // Animal Genetics. - 2006. - №37. - P. 66-71). Данная тест-система позволяет достоверно выявлять аллельные состояния исследуемого гена, однако она имеет недостаток по отношению к новой разработанной нами системе - она не может применяться в условиях массового высокопроизводительного анализа по причине наличия этапов рестрикции ПЦР-продуктов и электрофореза фрагментов ДНК в агарозном геле.

Повышение скорости анализа и одновременное его удешевление является особенно актуальным в настоящее время.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущность изобретения - определение методом ПЦР в режиме реального времени аллелей гена FGFR3, влияющего на ростовые качества овец и обуславливающего наследственное заболевание хондродисплазия овец.

В процессе работы тест-систем происходит амплификация участка ДНК генома домашней овцы, содержащий полиморфные нуклеотиды. Для гена FGFR3 - это фрагмент хромосомы №6 с 117453860-го по 117453950-й нуклеотид] (согласно последовательности NC_056059.1, Ovis aries strain OAR USU_Benz2616 breed Rambouillet chromosome 6. ARS-U1 Ramb v2.0. whole genome shotgun sequence; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_056059.1). На данном ампликоне происходит аллель-специфичная гибридизация флуоресцентно-меченых зондов. Флуоресцентно-меченый зонд определяет 117453930-й нуклеотид 6-й хромосомы домашней овцы (NC 056059.1). Определение полиморфизма происходит по принципу TaqMan.

Определение полиморфизма гена FGFR3 с помощью разработанной тест-системы выполняли следующим образом:

1. При использовании системы ПЦР в реальном времени готовили ПЦР-смесь следующего состава (19 мкл смеси в расчете на 1 образец): 2 мкл реакционного буфера (10Х Taq Turbo буфер, ЗАО «Евроген». Россия). 12 мкл Н₂O, 2 мкл dNTPs, 1,8 мкл смеси праймеров (по 0,9 мкл прямого и обратного праймеров), 1 мкл смеси зондов (0,4 мкл зонд «FAM» и 0,6 мкл зонд «R6G»). 0,2 мкл SmartTaq ДНК полимеразы (ЗАО «Диалат Лтд.». Россия). Для проведения анализа брали 1 мкл геномной ДНК.

2. Для избирательной амплификации необходимого участка ДНК в ПЦР-смесь добавляли указанные ниже праймеры (10 пкМ/19 мкл реакционной смеси):

FGFR3-F (5'-GCCGTACCCTGGCATCCC-3'),

FGFR3-R (5'-AGGTCATGCGTGCAGTTGGC-3').

3. Для выявления полиморфизма внутри амплифицируемой последовательности в ПЦР-смесь добавляли указанные ниже флуоресцентно-меченые зонды (5 пкМ/19 мкл реакционной смеси):

FGFRp-FAM (5'-FAM-CGTGGAGGAGCTCTTCAAG-BHQ-1-3').

FGFR3-R6G (5'-R6G-CGAGGAGGAGCTCTTCAAG-BHQ-1-3').

4. Выполняли ПЦР по следующему протоколу: 120 с при 50°С (1 цикл): первичная; денатурация (95°С, 10 минут); (денатурация (95°С. 15 секунд), отжиг праймеров (61,5°С, 45 секунд), элонгация 72°С. 30 секунд) X 40 циклов; заключительный этап - 10 мин при 72 С.Определение флуоресценции происходит на этапе отжига праймеров.

5. Определение аллелей гена FGFR3 происходило в процессе реакции, где аллелю Т соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, а аллелю А соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G.

6. Корректность работы разработанной тест-системы определения аллелергена FGFR3 выявляли путем добавления в реакцию положительного (синтезирбван в ЗАО «Евроген») и отрицательного (H₂O) контролен.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлена теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма в гене FGFR3.

На фиг. 2 представлены многопараметрические графики различных аллельных вариантов гена FGFR3 полученные в результате проведения ПЦР в реальном времени.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Контрольное использование разработанной тест-системы для выявления аллельных вариантов гена FGFR3 выполнено с помощью метода ПЦР в реальном времени.

Генотипирование выполнено на 396 образцах ДНК овец, принадлежащих 6 российским породам: эдильбаевская (n=96), дорпер (n=6), суффолк (n=6), карачаевская (n=96), андийская (n=96), романовская (n=96). В таблице 1 представлены результаты генотипирования.

Генотипирование по гену FGFR3 выявило, что 98.99% животных из исследуемой выборки имели генотип Т/Т (100% овец эдильбаевской и романовской пород, а также животные породы дорпер. 83.3% породы суффолк, 97,92% карачаевской породы и 98,96% андийской породы), генотип А/А не был выявлен в исследуемой выборке и 1,01% оказались гетерозиготами (0% овец эдильбаевской и романовской пород, а также животные породы дорпер, 16,67% породы суффолк, 2,08% карачаевской породы и 1,04% андийской породы).

В результате генотипирования 396 голов овец, принадлежащих 6 российским породам, были выявлены 3 носителя - по одному в породах суффолк, карачаевская и андийская. Больных животных не обнаружено.

Проведенное генотипирование показывает, что разработанная тест-система позволяет определять аллели гена FGFR3, влияющего на ростовые качества овец и обуславливающего наследственное заболевание хондродисплазия овец. Представленная тест-система позволяет своевременно определять скрытых носителей заболевания (хондродисплазия), что впоследствии способствует получению здорового поголовья. Описанная тест-система позволяет снизить время и себестоимость анализа по сравнению с системами, основанными на ПЦР-ПДРФ, и имеет перспективы для применения в селекционной работе в овцеводстве.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан набор олигонуклеотидов, использование которых в полимеразной цепной реакции, выполняемой в режиме реального времени, позволяет определять аллели гена FGFR3, обуславливающего наследственное заболевание - хондродисплазию овец, где: FGFR3-F (5'-GCCGTACCCTGGCATCCC-3'); FGFR3-R (5'-AGGTCATGCGTGCAGTTGGC-3'); FGFR3-FAM (5'-FAM-CGTGGAGGAGCTCTTCAAG-BHQ-1-3'); FGFR3- R6G (5'-R6G-CGAGGAGGAGCTCTTCAAG-BHQ-1-3'), аллелю T соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, а аллелю А соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G. Заявленное изобретение позволяет определить скрытых носителей хондродисплазии. 2 ил., 1 табл.

Набор олигонуклеотидов, использование которых в полимеразной цепной реакции, выполняемой в режиме реального времени, позволяет определять аллели гена FGFR3, обуславливающего наследственное заболевание - хондродисплазию овец, где:

FGFR3-F (5'-GCCGTACCCTGGCATCCC-3');

FGFR3-R (5'-AGGTCATGCGTGCAGTTGGC-3');

FGFR3-FAM (5'-FAM-CGTGGAGGAGCTCTTCAAG-BHQ-1-3');

FGFR3- R6G (5'-R6G-CGAGGAGGAGCTCTTCAAG-BHQ-1-3'),

аллелю T соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, а аллелю А соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G.