ДРОЖЖИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЭКТОИН Российский патент 2021 года по МПК C12N15/81 C12P17/12 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области биопродукции эктоина.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидинкарбоновая кислота) является гетероциклической аминокислотой, естественным образом продуцируемой галофильными организмами в природе. Действительно, чтобы выжить в соленой окружающей среде, эти организмы вырабатывают эктоин как совместимый осмолит, который служит осмотическим противовесом.

Эктоин действительно также способен защищать нуклеиновые кислоты, белки, клеточные мембраны, а также целые клетки от денатурации, вызванной многочисленными аггресивными воздействиями внешней среды, такими как УФ-излучение, нагревание, замораживание или химические вещества, но также от денатурации, вызванной высыханием (см., например, Lentzen G et al. Appl Microbiol Biot. 2006; 72: 623-34 и Graf R et al. Clin Dermatol. 2008; 26: 326-33). Как таковой он используется в косметике для ухода за кожей.

Кроме того, было обнаружено, что эктоин представляет интерес в качестве стабилизатора белков, косметической добавки, усилителя ПЦР (полимеразная цепная реакция) и средства для защиты от высыхания микроорганизмов.

Благодаря этим выгодным свойствам эктоин все чаще вырабатывается в бактериальных процессах с использованием, в частности, галофильных бактерий, таких как Halomonas elongata. Однако эти способы требуют высокой концентрации соли, что усложняет процесс и приводит к увеличению затрат, связанных со значительной коррозией оборудования.

Кроме того, производство незаменимых аминокислот, таких как эктоин, через биосинтетические пути бактерий и дрожжей требует значительного количества восстановительной мощности в форме NADPH. Однако основным путем метаболизма глюкозы в этих микроорганизмах, и в частности в дрожжах, является гликолиз с последующей ферментацией, которая продуцирует только NADH. Таким образом, поддержание приемлемого баланса NADPH/NADH в микроорганизме, хотя и является сложным, представляет собой существенное условие для оптимизации биопродукции эктоина при сохранении жизнеспособного рекомбинантного микроорганизма.

Соответственно, в данной области все еще существует потребность в дополнительных способах получения эктоина, обеспечивающих его высокоэффективный синтез и секрецию.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, продуцирующим эктоин, в геноме которых:

(A) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаткиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(B) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как NAD (никотинамидадениндинуклеотид), так и NADP (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(C) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(D) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу MET2, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(iii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(E) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая эктоинсинтазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(F) (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, были удалены и/или разделены, и/или

(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, независимо находятся:

- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

- под контролем слабого промотера; и/или

- в дестабилизированной форме.

Как показано в прилагаемых примерах, рекомбинантные дрожжи согласно изобретению имеют повышенную продукцию эктоина.

Указанное полезное свойство может быть дополнительно увеличено путем рекомбинации дрожжей с дополнительными модификациями, описанными ниже.

Следовательно, рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, можно преимущественно использовать в способе получения эктоина, как описано ниже, или использовать для получения эктоина.

Настоящее изобретение также относится к способу получения эктоина, включающему стадии:

(а) культивирование рекомбинантных дрожжей согласно изобретению в культуральной среде и

(b) выделение эктоина из указанной культуральной среды.

Предпочтительно культуральная среда содержит по меньшей мере источник углерода, предпочтительно источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы и сахарозы.

Изобретение также относится к применению рекомбинантных дрожжей согласно изобретению для получения эктоина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения разработали генетически модифицированные микроорганизмы и, в частности, генетически модифицированные дрожжи, обладающие повышенной способностью продуцировать эктоин по сравнению с исходными микроорганизмами и в частности по сравнению с исходными дрожжами.

Эти генетически модифицированные микроорганизмы, включая эти генетически модифицированные дрожжи, описаны в настоящем описании.

Определения терминов

Термин «микроорганизм» в контексте настоящего описания относится к дрожжам, которые не модифицированы искусственно. Микроорганизм может быть «донором», если он обеспечивает генетический элемент для интеграции в микроорганизм-«акцептор», который будет экспрессировать этот чужеродный генетический элемент, или если он используется в качестве инструмента для генетических конструкций или экспрессии белка. Микроорганизм согласно изобретению выбран bp дрожжей, которые экспрессируют гены для биосинтеза эктоина.

Термин «рекомбинантный микроорганизм», или «генетически модифицированный микроорганизм», или «рекомбинантные дрожжи», или «генетически модифицированные дрожжи», как используется в данном документе, относится к дрожжам, генетически модифицированным или генетически сконструированным. Это означает, в соответствии с обычным значением этих терминов, что микроорганизм согласно изобретению не обнаружен в природе и модифицируется либо путем вставки, либо путем удаления, либо путем модификации генетических элементов эквивалентного микроорганизма, обнаруженного в природе. Его также можно модифицировать путем форсирования развития и эволюции новых метаболических путей, сочетая направленный мутагенез и эволюцию под определенным давлением отбора (см., например, WO 2004/076659).

Микроорганизм может быть модифицирован для экспрессии экзогенных генов, если эти гены вводятся в микроорганизм со всеми элементами, обеспечивающими их экспрессию в микроорганизме-хозяине. Микроорганизм может быть модифицирован для модуляции уровня экспрессии эндогенного гена. Модификация или «трансформация» микроорганизма, такого как дрожжи, экзогенной ДНК является обычной задачей для специалистов в данной области техники. В частности, генетическая модификация микроорганизма в соответствии с изобретением, более конкретно генетическая модификация(-и), определенная в данном документе, может быть осуществлена с использованием системы CRISPR-Cas, как описано у DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., Vol. 41, № 7, 2013: 4336-4343).

Термин «эндогенный ген» означает, что ген присутствовал в микроорганизме до каккой-либо генетической модификации в штамме дикого типа. Эндогенные гены могут быть сверхэкспрессированы путем введения гетерологичных последовательностей в дополнение к или для замены эндогенных регуляторных элементов или путем введения одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду. Эндогенные гены также могут быть модифицированы для модуляции их экспрессии и/или активности. Например, мутации могут быть введены в кодирующую последовательность для модификации продукта гена, или гетерологичные последовательности могут быть введены в дополнение или для замены эндогенных регуляторных элементов. Модуляция эндогенного гена может приводить к повышенной регуляции и/или усилению активности продукта гена или, альтернативно, к пониженной регуляции и/или ослаблению активности продукта эндогенного гена. Другим способом усиления экспрессии эндогенных генов является введение одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду.

Термин «экзогенный ген» означает, что ген был введен в микроорганизм с помощью средств, хорошо известных специалисту в данной области, причем этот ген не встречается в природе у микроорганизма дикого типа. Микроорганизм может экспрессировать экзогенные гены, если эти гены вводятся в микроорганизм со всеми элементами, обеспечивающими их экспрессию в микроорганизме-хозяине. Трансформация микроорганизмов с помощью экзогенной ДНК является обычной задачей для специалиста в данной области. Экзогенные гены могут быть встроены в хромосому хозяина или могут быть экспрессированы внехромосомно из плазмид или векторов. Разнообразные плазмиды, которые различаются точкой начала репликации и количеству копий в клетке, все известны в данной области. Последовательность экзогенных генов может быть адаптирована для ее экспрессии в микроорганизме-хозяине. Действительно, специалисту в данной области техники известно понятие предпочтения кодонов и того, как адаптировать нуклеиновые последовательности для конкретного предпочтения кодонов без модификации выведенного белка.

Термин «гетерологичный ген» означает, что ген получен из вида микроорганизма, отличного от микроорганизма-реципиента, который его экспрессирует. Это относится к гену, который не встречается в природе у микроорганизма.

В настоящей заявке все гены обозначены их общепринятыми названиями и со ссылками на их нуклеотидные последовательности и, в случае необходимости, на их аминокислотные последовательности. Используя приведенные ссылки на регистрационные номера для известных генов, специалисты в данной области способны определить эквивалентные гены в других организмах, бактериальных штаммах, дрожжах, грибах, млекопитающих, растениях и т.д. Эта рутинная работа преимущественно выполняется с использованием консенсусных последовательностей, которые могут быть определены путем проведения выравнивания последовательностей с генами, происходящими из других микроорганизмов, и разработки вырожденных зондов для клонирования соответствующего гена в другом организме.

Специалисту в данной области известны различные способы модулирования и, в частности, повышения или понижения экспрессии эндогенных генов. Например, способом усилить экспрессию или сверхэкспрессию эндогенных генов является введение одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду.

Другой способ заключается в замене эндогенного промотора гена более сильным промотором. Эти промоторы могут быть гомологичными или гетерологичными. Промоторы, представляющие особый интерес для настоящего изобретения, описаны более подробно в другом месте настоящего описания.

Экспрессионная конструкция нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать 5' и/или 3' узнаваемые последовательности и/или маркеры отбора.

Термин «сверхэкспрессия» означает, что экспрессия гена или фермента увеличивается по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Увеличение экспрессии фермента достигается путем увеличения экспрессии гена, кодирующего указанный фермент. Увеличение экспрессии гена может быть осуществлено всеми способами, известными специалисту в данной области. В этом отношении следует особо упомянуть использование сильного промотора выше нуклеиновой кислоты, подлежащей сверхэкспрессии, или введение множества копий указанной нуклеиновой кислоты между промотором, особенно сильным промотором, и терминатором.

Термин «сниженная экспрессия» означает, что экспрессия гена или фермента снижена по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Уменьшение экспрессии фермента достигается уменьшением экспрессии гена, кодирующего указанный фермент. Уменьшение экспрессии гена может быть осуществлено всеми способами, известными специалисту в данной области. В связи с этим следует особо упомянуть использование слабого промотора выше нуклеиновой кислоты, подлежащей сниженной экспрессии. Также можно упомянуть использование нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант указанного фермента, который менее активен, чем исходный фермент, или вариант указанного фермента, который быстрее разрушается в клетке, чем исходный фермент. Варианты исходного фермента, которые быстрее разрушаются, чем указанный исходный фермент, включают ферменты, меченные дегроном. Также можно упомянуть снижение экспрессии активатора транскрипции представляющего интерес гена.

Термин «индуцибельный промотор» используется для определения промотора, активность которого индуцирована, то есть повышена:

- в присутствии одного или более конкретных метаболитов. Чем выше концентрация метаболита в среде, тем сильнее активность промотора; или

- в присутствии низкой концентрации или в отсутствие одного или более метаболитов. Эти метаболиты отличаются от тех, чье присутствие в повышенной концентрации индуцирует активность промотора. Чем ниже концентрация метаболита в среде, тем сильнее активность промотора.

Термин «репрессируемый промотор» используется для определения промотора, чья активность подавлена, то есть снижена:

- в присутствии одного или более конкретных метаболитов. Чем выше концентрация метаболита в среде, тем слабее активность промотора; или

- в присутствии низкой концентрации или в отсутствие одного или более метаболитов. Эти метаболиты отличаются от тех, чье присутствие в повышенной концентрации подавляет активность промотора. Чем ниже концентрация метаболита в среде, тем слабее активность промотора.

В контексте настоящего изобртения термин «меченный дегроном» фермент означает фермент, содержащий добавленную сигнальную аминокислотную последовательность разрушения белка, которая служит сигналом разрушения, который будет вызывать разрушение указанного фермента, которое может представлять собой (i) убиквитин-независимое разрушение или (ii) убиквитин-зависимое разрушение. Указанный добавленный сигнал разрушения белка, который в данной области также называют «дегроном», охватывает аминокислотную последовательность, которая служит сигналом разрушения, причем указанная аминокислотная последовательность состоит из переносимого сигнала разрушения, вызывающего целевое разрушение белка. Дегроны включают «N-дегроны», которые являются переносимыми N-концевыми аминокислотами, которые вызывают разрушение целевого белка в соответствии с хорошо известным правилом N-конца (Bachmair et al., 1986, Science, Vol. 234 (4773): 179- 186). Нестабильная природа N-дегрона объясняется его первыми аминокислотами, которые склонны к модификациям посредством ацетилирования или аргинилирования и в конечном счете приводят к убиквитинированию и разрушению. Как правило, дегрону требуется по меньшей мере два компонента для обеспечения целевого разрушения белка: (i) метка распознавания мишени для разрушения, такая как полиубиквитиновая метка, и (ii) неструктурированная аминокислотная последовательность в непосредственной близости от метки распознавания для разрушения. Описание мечения белка дегроном, и в частности, мечения дегроном фермента, специалист в данной области может обратиться к Yu et al. (2015, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204), Cho et al. (2010, Genes & Development, Vol. 24: 438-442) или Fortmann et al. (2015, J Mol Biol, Vol. 427 (17): 2748-2756), Ravid et al. (2008, Nat Rev Mol Cell Biol, Vol. 9 (9): 679-690) и Hochstrasser (1996, Annu Rev Genet, Vol. 30: 405-439).

«Активность» фермента используется взаимозаменяемо с термином «функция» и в контексте изобретения обозначает способность фермента катализировать желаемую реакцию.

Термины «пониженная активность» или «ослабленная активность» фермента означают либо пониженную удельную каталитическую активность белка, полученную в результате мутации в аминокислотной последовательности, и/или пониженные концентрации белка в клетке, полученные в результате мутации нуклеотидной последовательности или делеции соответствующего родственного гена, или также мечения белка дегроном.

Термин «повышенная активность» фермента обозначает либо повышенную специфическую каталитическую активность фермента, и/или повышенное количество/доступность фермента в клетке, полученную, например, в результате сверхэкспрессии гена, кодирующего фермент.

Термины «кодирующий» или «кодирование» относятся к процессу, посредством которого полинуклеотид с помощью механизмов транскрипции и трансляции, продуцирует аминокислотную последовательность.

Ген(-ы), кодирующий фермент(-ы), рассматриваемый в настоящем изобретении, может быть экзогенным или эндогенным.

«Аттенюация» генов означает, что гены экспрессируются в меньшей степени, чем у немодифицированного микроорганизма. Аттенюация может быть достигнута средствами и способами, известными специалисту в данной области, и включающими делецию гена, полученную путем гомологичной рекомбинации, аттенюацию гена путем вставки внешнего элемента в ген или экспрессию гена под контролем слабого промотора. Специалисту в данной области известно множество промоторов разной силы, и то, какой промотор использовать для слабой экспрессии гена.

Способы, реализованные в настоящем изобретении, предпочтительно требуют применения одной или более хромосомных интегрирующих конструкций для стабильного введения гетерологичной нуклеотидной последовательности в конкретное положение на хромосоме или для функционального нарушения одного или более генов-мишеней в генетически модифицированной микробной клетке. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена-мишени предотвращает экспрессию соответствующего функционального белка. В некоторых вариантах осуществления нарушение гена-мишени приводит к экспрессии нефункционального белка из нарушенного гена.

Параметры хромосомных интегрирующих конструкций, которые могут варьироваться при реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, длины гомологичных последовательностей; нуклеотидную последовательность гомологичных последовательностей; длину интегрирующей последовательности; нуклеотидную последовательность интегрирующей последовательности; и нуклеотидную последовательность локуса-мишени. В некоторых вариантах осуществления эффективный диапазон длины каждой гомологичной последовательности составляет от 20 до 5000 пар оснований, предпочтительно от 50 до 100 пар оснований. В конкретных вариантах осуществления длина каждой гомологичной последовательности составляет около 50 пар оснований. Для получения дополнительной информации о длине гомологии, необходимой для нацеливания на гены, см. D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).

В некоторых вариантах осуществления (а) нарушенный ген(-ы), для вставки в который вышеуказанная(-ые) конструкция(-и) ДНК предназначена(-ы), может преимущественно содержать один или более селектируемых маркеров, подходящих для отбора трансформированных микробных клеток. Предпочтительно, указанный селектируемый маркер(-ы) содержится в ДНК конструкции(-ях) согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер представляет собой маркер устойчивости к антибиотику. Иллюстративные примеры маркеров устойчивости к антибиотикам включают, но не ограничиваются, продукты генов NAT1, AUR1-C, HPH, DSDA, KAN<R> и SH BLE. Продукт гена NAT 1 из S. noursei придает устойчивость к нурсеотрицину; продукт гена AUR1-C из Saccharomyces cerevisiae придает устойчивость к ауэробазидину A (AbA); продукт гена HPH из Klebsiella pneumonia придает устойчивость к гигромицину B; продукт гена DSDA из E.coli позволяет клеткам расти на чашках с D-серином в качестве единственного источника азота; ген KAN<R> из транспозона Tn903 придает устойчивость к G418; и продукт гена SH BLE из Streptoalloteichus hindustanus придает устойчивость к зеоцину (блеомицину).

В некоторых вариантах осуществления маркер устойчивости к антибиотику удаляют после выделения генетически модифицированной микробной клетки согласно изобретению. Специалист в данной области способен выбрать подходящий маркер в конкретном генетическом контексте.

В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер исправляет ауксотрофию (например, ауксотрофию питания) в генетически модифицированной микробной клетке. В таких вариантах осуществления исходная микробная клетка содержит функциональное нарушение в одном или более генных продуктах, которые функционируют в пути биосинтеза аминокислот или нуклеотидов, таких как, например, продукты генов HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 и URA3 в дрожжах, которые делают исходную микробную клетку неспособной к росту в среде без добавления одного или более питательных веществ (ауксотрофный фенотип). Ауксотрофный фенотип может быть затем исправлен путем трансформации исходной микробной клетки с помощью интеграции в хромосому, кодирующей функциональную копию нарушенного продукта гена (NB: функциональная копия гена может происходить от близких видов, таких как Kluveromyces, Candida и т. д.), и генерируемая генетически модифицированная микробная клетка может быть отобрана исходя из потери ауксотрофного фенотипа исходной микробной клетки.

Для каждой из последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих последовательность промотора, кодирующую последовательность (например, последовательность, кодирующую фермент) или последовательность терминатора, в настоящем документе описаны референсные последовательности. Настоящее описание также охватывает последовательности нуклеиновых кислот, имеющие определенный процент идентичности нуклеиновых кислот референсной последовательности нуклеиновой кислоты.

Для каждой или представляющей интерес аминокислотной последовательности в настоящем документе описаны референсные последовательности. Настоящее описание также охватывает аминокислотные последовательности (например, аминокислотные последовательности фермента), имеющие определенный процент идентичности аминокислот референсной аминокислотной последовательности.

По очевидным причинам во всем настоящем описании конкретная последовательность нуклеиновой кислоты или конкретная аминокислотная последовательность, которая соответствует, соответственно, рассматриваемой нуклеотидной или аминокислотной идентичности, должна дополнительно приводить к получению белка (или фермента), который отображает желаемую биологическую активность. В контексте данного документа «процент идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или между двумя аминокислотными последовательностями определяется путем сравнения обеих оптимально выровненных последовательностей в пределах окна сравнения.

Таким образом, часть нуклеотидной или аминокислотной последовательности в окне сравнения может включать вставки или делеции (например, «гэпы») по сравнению с референсной последовательностью (которая не включает эти вставки или эти делеции), чтобы получить оптимальное выравнивание обеих последовательностей.

Процент идентичности рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное нуклеиновое основание или идентичный аминокислотный остаток могут быть отмечены для обеих сравниваемых последовательностей, затем деления числа положений, в которых можно наблюдать идентичность между обоими нуклеиновыми основаниями или между обоими аминокислотными остатками, на общее число позиций в окне сравнения, затем результат умножают на сто, чтобы получить процент идентичности нуклеотидов между двумя последовательностями или процент идентичности аминокислот между двумя последовательностями.

Сравнение оптимального выравнивания последовательностей может выполняться с помощью компьютера с использованием известных алгоритмов.

Наиболее предпочтительно процент идентичности последовательности определяется с использованием программного обеспечения CLUSTAL W (версия 1.82), параметры которого устанавлены следующим образом: (1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAP OPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAP EXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram" и (18) TREE GRAP DISTANCES="hide".

«Ферментацию» или «культивирование» обычно проводят в ферментерах с подходящей культуральной средой, адаптированной к культивируемому микроорганизму, содержащей по меньшей мере один простой источник углерода и, если необходимо, субстратные кофакторы.

Описанные в настоящем документе микроорганизмы могут быть выращены в ферментационных средах для получения продукта из оксалоацетата. Для максимальной продукции эктоина штаммы микроорганизмов, используемые в качестве продуцентов-хозяев, предпочтительно имеют высокую степень потребления углеводов. Эти характеристики могут быть приданы путем мутагенеза и отбора, генной инженерии или могут быть природными. Ферментационная среда или «культуральная среда» для настоящих клеток может содержать по меньшей мере около 10 г/л глюкозы. Дополнительные углеродные субстраты могут включать, но не ограничиваться, моносахариды, такие как фруктоза, манноза, ксилоза и арабиноза; олигосахариды, такие как лактоза, мальтоза, галактоза или сахароза; полисахариды, такие как крахмал или целлюлоза, или их смеси, и неочищенные смеси из возобновляемых видов сырья, таких как пермеат подсырной сыворотки, кукурузный экстракт, сахарная свекольная патока и ячменный солод. Другие углеродные субстраты могут включать глицерин.

Следовательно, предполагается, что источник углерода, используемый в настоящем изобретении, может охватывать широкий спектр углеродсодержащих субстратов и будет ограничен только выбором организма.

Хотя предполагается, что все вышеупомянутые углеродные субстраты и их смеси являются подходящими в настоящем изобретении, предпочтительными углеродными субстратами являются глюкоза, фруктоза и сахароза или их смеси с С5-сахарами, такими как ксилоза и/или арабиноза, для микроорганизмов, модифицированных для использования C5-сахаров и, в частности, глюкозы.

Предпочтительным углеродным субстратом является глюкоза.

В дополнение к подходящему источнику углерода среда для ферментации может содержать подходящие минералы, соли, кофакторы, буферы и другие компоненты, известные специалистам в данной области, подходящие для выращивания культур и стимулирования ферментативного пути, необходимого для продуцирования желаемого продукта.

Кроме того, могут быть рассмотрены дополнительные генетические модификации, подходящие для выращивания рекомбинантных микроорганизмов согласно изобретению.

Термины «аэробные условия» относятся к концентрациям кислорода в культуральной среде, достаточным для того, чтобы аэробный или факультативно-анаэробный микроорганизм использовал кислород в качестве конечного акцептора электронов.

«Микроаэробное условие» относится к культуральной среде, в которой концентрация кислорода меньше, чем в воздухе, т.е. концентрация кислорода составляет до 6 % O₂.

«Подходящая культуральная среда» обозначает среду (например, стерильную, жидкую среду), содержащую питательные вещества, необходимые или полезные для поддержания и/или роста клетки, такие как источники углерода или углеродный субстрат, источники азота, например, пептон, дрожжевые экстракты, мясные экстракты, солодовые экстракты, мочевину, сульфат аммония, хлорид аммония, нитрат аммония и фосфат аммония; источники фосфора, например монокалийфосфат или дикалийфосфат; микроэлементы (например, соли металлов), например соли магния, соли кобальта и/или соли марганца; а также факторы роста, такие как аминокислоты, витамины, стимуляторы роста и тому подобное. Термин «углеродный источник», или «углеродный субстрат», или «источник углерода» в соответствии с настоящим изобретением обозначает любой источник углерода, который может быть использован специалистами в данной области для поддержания нормального роста микроорганизма, включая гексозы (такие как глюкоза, галактоза или лактоза), пентозы, моносахариды, олигосахариды, дисахариды (такие как сахароза, целлобиоза или мальтоза), мелассу, крахмал или его производные, целлюлозу, гемицеллюлозу и их комбинации.

Общие признаки генетических модификаций, введенных согласно изобретению

- Гены сверхэкспрессируют с помощью двух видов не взаимоисключающих модификаций:

Помещение их под контроль сильного промотора; и/или

Вставка множества копий рассматриваемого гена.

- Все модификации генома вводятся в дрожжи в соответствии с известными методами генной инженерии:

- Последовательные гены, включенные в генетическую конструкцию, которая вводится в геном дрожжей согласно изобретению, имеют следующую структуру:

Пром₁-ORF₁-терм₁-ORF₂-gene₂-терм₂-…/…- Пром_n-ORF_n-терм_n, где:

- Пром1 представляет собой последовательность, регулирующую экспрессию кодирующей последовательности ORF1,

- ORF1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желаемый белок PROT1 и, в частности, желаемый фермент PROT1,

- терм1 представляет собой последовательность терминатора транскрипции, которая опосредует терминацию транскрипции, обеспечивая сигналы во вновь синтезированной мРНК, которые запускают процессы, высвобождающие мРНК из транскрипционного комплекса, и

- «1», «2», …/… «n» может описывать или не описывать один и тот же ORF (открытая рамка считывания), промотор или терминатор. Порядок генов не имеет значения. «n» представляет собой целое число, обычно варьирующееся от 5 до 20. Эти конструкции вставляются в одну из дрожжевых хромосом в контролируемом положении. В некоторых вариантах осуществления сайт вставки не является существенным ни для функциональности вставленной конструкции, ни для жизнеспособности полученных в результате генетически модифицированных дрожжей.

- Когда дрожжами являются, например, Saccharomyces cerevisiae, гены, введенные в геном дрожжей и происходящие из других организмов, отличных от Saccharomyces cerevisiae, обычно «транскодированы» (как правило, оптимизированы по кодонам), что означает, что эти гены синтезируются с оптимальным использованием кодонов для экспрессии в S. cerevisiae. Нуклеотидная последовательность (а не белковая последовательность) некоторых генов из S. cerevisiae также была модифицирована («транскодирована») для минимизации рекомбинации с эндогенной копией указанного гена.

- Гены могут быть удалены с помощью стандартных процедур, используемых в генной инженерии дрожжей. В некоторых вариантах осуществления гены, являющиеся мишенью для делеции, могут быть разорваны путем вставки одной из вышеописанных генетических конструкций, или, альтернативно, гены, являющиеся мишенью для делеции, заменяют коротким участком нуклеотида.

- Понижение регуляции экспрессии гена можно получить путем нарушения эндогенной копии гена и замены ее копией ORF под контролем слабого промотора. Список и последовательности слабых промоторов описаны в другом месте настоящего описания.

- Ген можно сделать «индуцибельным или репрессируемым» путем удаления эндогенной копии гена (если необходимо) и помещения новой копии ORF под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора. Индуцибельный или репрессируемый промотор представляет собой промотор, активность которого модулируется или контролируется, то есть либо увеличивается, либо уменьшается при изменении условий окружающей среды или внешних раздражителей. Индукция или репрессия могут контролироваться искусственно, что включает индукцию или репрессию с помощью абиотических факторов, таких как химические соединения, не встречающиеся в природе в представляющем интерес организме, свет, уровень кислорода, тепло или холод. Список и последовательность индуцибельных или репрессируемых промоторов описаны в другом месте настоящего описания.

- Как уже указывалось в другом месте данного документа, белок может быть снижено эксперссирован путем дестабилизации с использованием технологии «дегрона», которая описана в Yu et al. 2015 (Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204). Вкратце, эта технология заключается во введении в последовательность белка модификации, которая делает его мишенью для разрушения. Она может состоять только из двух первых аминокислот, следуя принципу, известному как правило N-конца, или из более крупной последовательности, нацеливающей весь белок на убиквитин-протеасомный путь разрушения.

Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению

Авторы изобретения разработали рекомбинантные микроорганизмы и, в частности, рекомбинантные дрожжи, обладающие повышенной способностью продуцировать эктоин.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, имеющим повышенную продукцию эктоина, где повышенная продукция эктоина получена путем множества изменений, внесенных в их геном методами генной инженерии.

Данное изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, продуцирующим эктоин, в геноме которых:

(A) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу HOM3, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаткиназу АК, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(B) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты HOM2, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты HOM2, которая может использовать в качестве кофермента как NAD, так и NADP, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(C) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу EctB, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(D) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу MET2, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(iii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты EctA, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(E) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая эктоинсинтазу EctC, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(F) (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоти, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, были удалены, и/или

(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, независимо находятся:

- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

- под контролем слабого промотора; и/или

- в дестабилизированной форме.

Авторы изобретения обнаружили, что повышенная продукция эктоина дрожжевыми клетками может быть достигнута путем введения в геном этих дрожжевых клеток множества генетических изменений. Как полностью описано в настоящем документе, указанное множество генетических изменений включает сверхэкспрессию определенных генов, контролируемую экспрессию некоторых других генов, а также репрессию или делецию дополнительных других генов.

Авторы изобретения достигли увеличения продуцирования эктоина дрожжевыми клетками путем оптимизации метаболизма оксалоацетата и ацетил-КоА с тем, чтобы направить последующий искусственно модифицированный метаболический путь главным образом на выработку эктоина, в то же время, поддерживая оптимальную жизнеспособность получаемых в результате генетически модифицированных дрожжевых клеток.

После продолжительного периода исследований авторы настоящего изобретения определили, что высокая продукция эктоина дрожжевыми клетками достигается за счет увеличения превращения оксалоацетата в последовательные промежуточные метаболиты фосфоаспартил и аспартил-полуальдегид и, кроме того, за счет повышения превращения аспартил-полуальдегида в эктоин, при этом, в особенности, поддерживая окислительно-восстановительный статус и, более конкретно, адаптированный баланс NADH/NADPH, обеспечивающий хорошую жизнеспособность полученных в результате рекомбинантных дрожжевых клеток. Этот последний пункт является существенным и представляет значительную проблему для изобретателей на протяжении всей их исследовательской работы.

Предложенное решение в соответствии с изобретением неожиданно позволяет поддерживать жизнеспособное равновесие NADH/NADPH в дрожжевых клетках на всем пути продукции эктоина за счет потребления меньшей восстановительной способности, потребления восстановительной способности в форме NADH, а не NADPH, и/или производства NADH вместо NADPH.

Как подробно описано в настоящем описании, полученные рекомбинантные дрожжевые клетки генетически модифицированы таким образом, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию (i) гена, кодирующего аспартокиназу (HOM3), и/или (ii) гена, кодирующего аспартаткиназу (AK), в частности гена, кодирующего аспартаткиназу (AK), предпочтительно сверхэкспрессию гена аспартаткиназы (AK).

Кроме того, рекомбинантные дрожжи в соответствии с изобретением содержат дополнительные генетические модификации для оптимального использования промежуточного метаболита фосфоаспартила для продуцирования аспартил-полуальдегида, причем указанные дополнительные генетические модификации включают сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты (HOM2), и/или гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как NADH, так и NADPH.

Кроме того, рекомбинантные дрожжи в соответствии с изобретением содержат дополнительные генетические модификации для оптимального использования промежуточного метаболита аспартил-полуальдегида для продукции эктоина, причем указанные дополнительные генетические модификации включают (i) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена диаминобутират-аминотрансферазы (EctB), (ii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена, кодирующего гомосерин-O-ацетилтрансферазу (MET2; METX), и/или гена ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты (EctA), (iii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена эктоинсинтазы (EctC) и (iv) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена гомосериндегидрогеназы (HOM6).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению указанные дрожжи содержат дополнительные генетические модификации для оптимального использования промежуточного метаболита оксалоацетата для продуцирования аспартата, причем указанные дополнительные генетические модификации включают (i) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена аспартаттрансаминазы (AAT2) и/или (ii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена глутаматдегидрогеназы, которая превращает оксоглутарат в глутамат (GDH).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению указанные дрожжи содержат дополнительные генетические модификации для оптимальной секреции продуцируемого эктоина, причем указанные дополнительные генетические модификации включают (i) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена общей пермеазы аминокислот (AGP3), (ii) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена пермеазы 3 аминокислот с разветвленной цепью (BAP3), (iii) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена пермеазы 2 аминокислот с разветвленной цепью (BAP2), (iv) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена общей пермеазы аминокислот (GAP1), (v) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена высокоаффинной пермеазы глутамина (GNP1), (vi) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена общей пермеазы аминокислот (AGP1), (vii) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена низкоаффинной пермеазы метионина (MUP3; MUP1), (viii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена вероятного транспортера (AQR1) и/или (ix) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена транспортера полиамина 1 (TPO1).

В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот, пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, общую пермеазу аминокислот GAP1, высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, общую пермеазу аминокислот AGP1, низкоаффинную пермеазу метионина MUP3 и высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, независимо представляет собой нуклеиновую кислоту из дрожжей, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae.

Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению продуцируют эктоин с более высоким выходом, чем исходные дрожжи, которые не содержат генетических модификаций, описанных выше.

Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению были генетически сконструированы так, чтобы стимулировать экспрессию ферментов, использующих NADH, а не NADPH, таких как соответствующая глутаматдегидрогеназа или соответствующая дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессированная дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты состоит из эндогенного гена S. cerevisiae, который находится под контролем сильных промоторов и/или индуцибельных или репрессируемых промоторов.

В некоторых вариантах осуществления дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты предпочтительно кодируется геном S. cerevisiae HOM2.

В некоторых вариантах осуществления дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты наиболее предпочтительно кодируется вариантом гена HOM2 S. cerevisiae , который кодирует мутированный белок HOM2, который использует как NAD, так и NADP, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах. Такой вариант гена, например, иллюстрируется в примерах и называется HOM2-2. Он соответствует гену HOM2 S. cerevisiae, мутированному, как описано ниже.

Природа мутаций, нацеленных на несколько аминокислотных остатков в варианте дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты для ослабления высокой селективности HOM2 в отношении NADP в качестве кофермента и усиления аффинности фермента к NAD, известна специалисту в данной области и описана, например, в Faehnle, C. R. et al., Journal of Molecular Biology 1055-1068 (2005). В частности, можно упомянуть мутацию S39 в E39, соответствующую замене нуклеотидов TCT в положении от 115 до 117 нуклеотидной последовательности на нуклеотиды GAG.

В соответствии с номенклатурой аминокислот, хорошо известной специалисту в данной области, S представляет собой серин, и E представляет собой глутаминовую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления аспартокиназа наиболее предпочтительно кодируется геном HOM3 S. cerevisiae, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего аспартокиназу

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессия гена, кодирующего аспартокиназу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартокиназу. Аспартокиназа и ген, кодирующий аспартокиназу, охватываемые изобретением, подробно описаны в других частях настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартокиназу, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию аспартокиназы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий аспартокиназу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

В этих вариантах осуществления контролируемая экспрессия гена, кодирующего аспартокиназу, может быть получена путем вставки в месте расположения открытой рамки считывания аспартокиназы природных дрожжей индуцибельной регуляторной последовательности, такой как индуцибельный или репрессируемый промотор, который заменяет эндогенный промотор, первоначально присутствующий в дрожжевом геноме в этом месте расположения генома.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что при сверхэкспрессии гена, кодирующего аспартокиназу, достигается контролируемый уровень превращения аспартата в аспартилфосфат (аспартил-P), также называемый фосфоаспартил, который должен способствовать высокому уровню жизнеспособности рекомбинантных дрожжей согласно изобретению. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая аспартокиназу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартокиназу, представляет собой ген HOM3 из Saccharomyces cerevisiae, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартокиназу, помещают под контроль сильного промотора pCCW12 или индуцибельного или репрессируемого промотора pCUP-1-1.

В качестве иллюстрации, ген аспартокиназы может быть встроен в ген HOM6 и/или в ген SAM3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего аспартаткиназу

Альтернативно или в дополнение к сверхэкспрессии и/или контролируемой экспрессии аспартокиназы, как обсуждалось выше, рекомбинантные дрожжи согласно изобретению также могут быть такими, что они включают сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена, кодирующего аспартаткиназу.

Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего аспартаткиназу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаткиназну. Аспартаткиназа и ген, кодирующий аспартаткиназу, которые охватываются изобретением, подробно описаны в других частях настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаткиназу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию аспартаткиназы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий аспартаткиназу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что с помощью контролируемой экспрессии гена, кодирующего аспартаткиназу, достигается контролируемый уровень превращения аспартата в аспартилфосфат (аспартил-Р), который будет способствовать высокому уровню жизнеспособности рекомбинантных дрожжей согласно изобретению.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаткиназу, представляет собой ген AK из Bacillus subtilis, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаткиназу, помещают под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора pACU7.

В качестве иллюстрации, ген аспартаткиназы может быть встроен в ген TRP1, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей по изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты. Дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты и ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которые охватываются настоящим изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может усиливать превращение промежуточного метаболита аспартилфосфата (аспартил-Р) в аспартил-полуальдегид. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

В некоторых вариантах осуществления дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты может представлять собой вариант фермента, который использует как NADH, так и NADPH для катализа превращения аспартилфосфата (аспартил-P) в аспартил-полуальдегид.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, представляет собой ген HOM2 из Saccharomyces cerevisiae или альтернативно вариант HOM2, использующий как NADH, так и NADPH, как показано в приведенных в настоящем описании примерах и обсуждалось ранее.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, помещают под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора pACU5 или сильного промотора pCCW12.

В качестве иллюстрации ген дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть встроен в ген HIS3 и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего диаминобутират-аминотрансферазу

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего диаминобутират-аминотрансферазу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую диаминобутират-аминотрансферазу. Диаминобутират-аминотрансфераза и ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую диаминобутират-аминотрансферазы, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию диаминобутират-аминотрансферазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может усиливать превращение промежуточного метаболита аспартил-полуальдегида в 2,4-диаминобутират. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, представляет собой ген EctB из Pseudomonas aeruginosa или ген EctB из Halomonas elongata (иногда также называемого Chromohalobacter salexigens), как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, помещают под контроль сильного промотора pCCW12 и/или сильного промотора pTDH3.

В качестве иллюстрации ген диаминобутират-аминотрансферазы может быть встроен в ген HOM6, и/или в ген SAM3, и/или в ген MUP3, и/или в ген URA3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего гомосерин-O-ацетилтрансферазу

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего гомосерин-O-ацетилтрансферазу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую гомосерин-O-ацетилтрансферазу. Гомосерин-O-ацетилтрансфераза и ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, которые охватываются настоящим изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую гомосерин-O-ацетилтрансферазу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию гомосерин-O-ацетилтрансферазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия гомосерин-O-ацетилтрансферазы позволяет и, следовательно, повышает уровень превращения промежуточного метаболита 2,4-диаминобутирата-в ацетил-2,4-диаминобутират, в присутствии ацетил-КоА. То же самое применимо, когда, по меньшей мере одна последовательность, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, представляет собой ген MET2 из Saccharomyces cerevisiae, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, представляет собой ген METX из Corynebacterium glutamicum, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В особенно предпочтительном варианте осуществления рекомбинантные дрожжи согласно изобретению содержат по меньшей мере один ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, который представляет собой ген MET2 из Saccharomyces cerevisiae, и по меньшей мере один ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, который представляет собой ген METX от Corynebacterium glutamicum.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, независимо для каждой копии указанного гена, если присутствует несколько копий, помещают под контроль сильного промотора pPDC1 или индуцибельного или репрессируемого промотора pACU6.

В качестве иллюстрации, ген гомосерин-O-ацетилтрансферазы может быть встроен в ген SAM3 и/или в ген HIS3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты. Ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты и ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты позволяет и, следовательно, повышает уровень превращения промежуточного метаболита 2,4-диаминобутирата в ацетил-2,4-диаминобутират в присутствии ацетил-КоА. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, представляет собой ген EctA из Halomonas elongata (иногда также называемого Chromohalobacter salexigens), как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, помещают под контроль сильного промотора pPDC1.

В качестве иллюстрации ген ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть встроен в ген LYP1 и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В конкретном варианте осуществления рекомбинантные дрожжи согласно изобретению являются такими, что их геном содержит:

- по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, которая сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и предпочтительно под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и

- по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетилтрансферазу EctA диаминомасляной кислоты, которая сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и предпочтительно под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего эктоинсинтазу

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего эктоинсинтазу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую эктоинсинтазу. Эктоинсинтаза и ген, кодирующий эктоинсинтазу, которые охватываются настоящим изобретением, подробно описаны в других частях настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую эктоинсинтазу, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие всокую экспрессию эктоинсинтазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий эктоинсинтазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия эктоинсинтазы позволяет и, следовательно, повышает уровень превращения промежуточного метаболита ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая эктоинсинтазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий эктоинсинтазу, представляет собой ген EctC из Halomonas elongata, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий эктоинсинтазу, помещают под контроль сильного промотора pTDH3 и/или сильного промотора pTEF1.

Иллюстративно, ген эктоинсинтазы может быть встроен в ген LYP1, и/или в ген MUP3, и/или в ген URA3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Делеция или пониженная экспрессия гомосериндегидрогеназы

Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению дополнительно определяются как имеющие геном, в котором:

(i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, были удалены и/или разорваны, и/или

(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, независимо находятся:

- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

- под контролем слабого промотора; и/или

- в дестабилизированной форме.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что пониженная экспрессия гена гомосериндегидрогеназы должна увеличивать продукцию 2,4-диаминобутирата рекомбинантными дрожжами за счет снижения потребления полученного аспартил-полуальдегида путем его превращения в гомосерин.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия гомосериндегидрогеназы может быть сделана выполняемой при определенных условиях, например, путем помещения экспрессии этого гена под контроль репрессируемых регуляторных последовательностей, таких как индуцибельные или репрессируемые промоторы.

Способы подавления экспрессии генов, разрыва генов-мишеней или делеции генов-мишеней хорошо известны специалисту в данной области.

Экспрессируемая гомосериндегидрогеназа также включает вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей дестабилизированную гомосериндегидрогеназу. Дестабилизированная гомосериндегидрогеназа представляет собой вариант гомосериндегидрогеназы, который быстрее разрушается в дрожжевой клетке, чем исходная гомосериндегидрогеназа.

В предпочтительных вариантах осуществления дестабилизированная гомосериндегидрогеназа состоит из меченного дегроном белка гомосериндегидрогеназы.

Например, ген гомосериндегидрогеназы может быть разорван loxP или, например, URA3.Kl-loxP, и, таким образом, удален (что также можно назвать инактивированным).

Альтернативно, он может быть разорван кассетой, содержащей представляющие интерес гены, как показано в приведенных примерах.

АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)

Фермент аспартокиназа представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат. Аспартокиназа, кодируемая геном Saccharomyces cerevisiae, может называться HOM3.

Способ, применяемый для измерения уровня активности аспартокиназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному Stadtman et al. (1961, J Biol Chem, Vol. 236 (7): 2033-2038).

Предпочтительной аспартокиназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ (код фермента) 2.7.2.4.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Bacillus subtilis и дрожжей. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 1, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 1 кодирует аспартокиназу, происходящую из Saccharomyces cerevisiae, которую также может называться HOM3.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 25 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68%, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83%, 84%, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активностью той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78%, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность аспартокиназы из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером NP010972 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 2, описанной в настоящем документе.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотной идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, аспартокиназа, происходящая из Aquamarina atlantica, имеет 25 % аминокислотную идентичность аспартокиназе с SEQ ID NO: 2.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 25 % аминокислотную идентичность референсной последовательностью нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательностью, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательностью, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности.

Как указано выше, уровень экспрессии аспартокиназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, таким как определено более подробно далее в настоящем доументе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аспартокиназу.

Как указано в другом месте настоящего описания, аспартокиназа сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартокиназы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартокиназы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей аспартокиназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В еще дополнительных вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартокиназы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей аспартокиназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

АСПАРТАТКИНАЗА (AK)

Фермент аспартаткиназа представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат. Аспартаткиназа, кодируемая геном Bacillus subtilis, может называться AK.

Способ, применяемый для измерения уровня активности аспартаткиназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области и является таким же, как тот, который был указан ранее для аспартокиназы.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Bacillus subtilis и дрожжей. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.

Что касается последовательности нуклеиновой кислоты, ее можно отнести к последовательности, описанной под номером NC_000964.3 в базе данных NCBI.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 %, идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 3, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 3 кодирует аспартаткиназу, происходящую из Bacillus subtilis, которая также может называться AK.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 25 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность аспартаткиназы из Bacillus substilis специалист в данной области может найти под регестрационным номером NP_389558.2 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 4, описанной в настоящем документе.

Согласно другому конкретному варианту осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 4, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, аспартаткиназа, происходящая из Aquamarina atlantica, имеет 25 % аминокислотную идентичность аспартокиназой с SEQ ID NO: 4.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 25 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 % , 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотной идентичности референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии аспартаткиназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аспартаткиназу.

Как указано в другом месте настоящего описания, аспартаткиназа сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаткиназы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаткиназы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей аспартаткиназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаткиназы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей аспартаткиназу, в пределах генома указанных рекомбинантных дрожжей.

ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

Дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты представляет собой белок, который, как известно из данной области техники, катализирует NADPH-зависимое образование L-аспартат-полуальдегида посредством восстановительного дефосфорилирования L-аспартил-4-фосфата. Дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, кодируемую геном Saccharomyces cerevisiae, можно назвать HOM2.

Способ, применяемый для измерения уровня активности дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, известен специалистам в данной области.

Предпочтительной дегидрогеназой полуальдегида аспарагиновой кислоты в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.2.1.11.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой вариант или мутант дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты из Saccharomyces cerevisiae, где указанный вариант фермента или указанный мутант фермента использует как NADH, так и NADPH для каталитических реакций. Такие варианты или мутантные ферменты известны в данной области и ранее обсуждались в настоящем тексте.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичности нуклеиновой кислоты нуклеинове кислотой, выбранной из группы, состоящей из референсных последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновые кислоты с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 кодируют дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, происходящую из Saccharomyces cerevisiae, которая в данном документе также может обобщено называться HOM2.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует NADPH-зависимое образование L-аспартат-полуальдегида путем восстановительного дефосфорилирования L-аспартил-4-фосфата.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 27 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 95 %, 98 % и 99 % нуклеотидной идентичности указанным референсным последовательностям нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанным референсным последовательностям нуклеиновых кислот, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером NP010442 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO. 7, описанной в настоящем документе.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере, 80 %, аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты, происходящая из Lactobacillus wasatchensis, имеет 27 % аминокислотную идентичность дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты с SEQ ID NO: 7.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать NADPH-зависимое образование L-аспартат-полуальдегида посредством восстановительного дефосфорилирования L-аспартил-4-фосфата.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 27 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсой аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотной идентичности указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положении, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты.

Как указано в другом месте настоящего описания, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В других вариантах осуществления изобретения сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

Фермент диаминобутират-аминотрансфераза представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения аспартил-полуальдегида в присутствии глутамата в 2,4-диаминобутират. Диаминобутират-аминотрансфераза, кодируемая геном Halomonas elongata, может называться EctB или EctB.He.

Способ, применяемый для измерения уровня активности диаминобутират-аминотрансферазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, стр. 91-99.

Предпочтительной диаминобутират аминотрансферазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.6.1.76.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из бактерий, и особенно из Pseudomonas aeruginosa, Halomonas elongata или Sporocarcina newyorkensisn, и предпочтительно из Pseudomonas aeruginosa или Halomonas elongata.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение аспартил-полуальдегида в присутствии глутамата в 2,4-диаминобутират.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 35 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 % , 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидной идентичности указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательности диаминобутират-аминотрансферазы из Halomonas elongata специалист в данной области может найти под регистрационным номером WP_013332345.1 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, описанным в настоящем документе.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение аспартил-полуальдегида в присутствии глутамата в 2,4-диаминобутират.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 35 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии диаминобутират-аминотрансферазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную диаминобутира-аминотрансферазу.

Как указано в другом месте настоящего описания, диаминобутират-аминотрансфераза сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей диаминобутират-аминотрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей диаминобутират-аминотрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)

Фермент гомосерин-O-ацетилтрансфераза представляет собой белок, который описан в данной области для катализа реакции между ацетил-КоА и 2,4-диаминобутиратом в КоА и ацетил-2,4-диаминобутират. Гомосерин-O-ацетилтрансфераза, кодируемая геном Saccharomyces cerevisiae, может называться MET2.

Способ, применяемый для измерения уровня активности гомосерин-O-ацетилтрансферазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Shuzo Yamagata (1987, The Journal of Bacteriology, Vol. 169 (8): 3458-3463).

Предпочтительной гомосерин-O-ацетилтрансферазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.3.1.31.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Corynebacterium glutamicum и дрожжей. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую (-ые)кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, представляет собой нуклеиновую кислоту из бактерии, в частности из бактерии, выбранной независимо из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Haemophilius influenza, Streptomyces lavendulae, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumonia и Mycobacterium tuberculosis.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 12, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 12 кодирует гомосерин-O-ацетилтрансферазу, происходящую из Saccharomyces cerevisiae, которая также может назваться MET2. Гомосерин-O-ацетилтрансфераза, происходящая из Corynebacterium glutamicum, обычно называется METX.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует реакцию между ацетил-КоА и 2,4-диаминобутиратом в КoA и ацетил-2,4-диаминобутират.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 27 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность гомосерин-O-ацетилтрансферазы из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером NP014122 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 13, описанной в данном документе.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, гомосерин-O-ацетилтрансфераза, происходящая из Aquamarina atlantica, имеет 27 % аминокислотную идентичность гомосерин-O-ацетилтрансферазе с SEQ ID NO: 13.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать реакцию между ацетил-КоА и 2,4-диаминобутиратом в КoA и ацетил-2,4-диаминобутират.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 27 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии гомосерин-O-ацетилтрансферазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гомосерин-O-ацетилтрансферазу.

Как указано в другом месте настоящего описания, в некоторых вариантах осуществления изобретения гомосерин-O-ацетилтрансфераза сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия гомосерин-O-ацетилтрансферазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия гомосерин-О-ацетилтрансферазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей гомосерин-O-ацетилтрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия гомосерин-О-ацетилтрансферазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей гомосерин О-ацетилтрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА ДИАМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ (EctA)

Фермент ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения 2,4-диаминобутирата в присутствии ацетил-КоА в ацетил-2,4-диаминобутират. Ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты, кодируемая геном Halomonas elongata, может называться EctA или EctA.He.

Способ, применяемый для измерения уровня активности ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, стр. 91-99.

Предпочтительной ацетилтрансферазой диаминомасляной кислоты в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.3.1.178.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из бактерий, и особенно из Chromohalobacter salexigens, Pseudomonas aeruginosa, Thaurea sp.28 или Halomonas elongata.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 30 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 14, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение 2,4-диаминобутирата в присутствии ацетил-КоА в ацетил-2,4-диаминобутират.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 30 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты из Halomonas elongata специалист в данной области может найти под регистрационным номером WP_035409657.1 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 15, описанной в данном документе.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 30 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение 2,4-диаминобутирата в присутствии ацетил-КоА в ацетил-2,4-диаминобутират.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 30 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % , 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты.

Как указано в другом месте настоящего описания, ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть результатом контроля соответствующего гена с поомщью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

Эктоинсинтаза (EctC)

Фермент эктоинсинтаза представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин. Эктоинсинтаза, кодируемая геном Halomonas elongata, может называться EctC или EctC.He.

Способ, применяемый для измерения уровня активности эктоинсинтазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, стр. 91-99.

Предпочтительной эктоинсинтазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.2.1.108.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из бактерий, и особенно из Pseudomonas aeruginosa, Halomonas elongata или Micrococcus luteus.

Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 16, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 35 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 % , 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность эктоинсинтазы из Halomonas elongata специалист в данной области может найти под регистрационным номером WP_013332346 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 17, описанной в данном документе.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 35 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной рференсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность рефересной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии эктоинсинтазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную эктоинсинтазу.

Как указано в другом месте настоящего описания, эктоинсинтаза сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия эктоинсинтазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия эктоинсинтазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей эктоинсинтазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В других вариантах осуществления изобретения сверхэкспрессия эктоинсинтазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей эктоинсинтазу, в пределах генома указанных рекомбинантных дрожжей.

ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)

Фермент гомосериндегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения L-гомосерина в L-аспартат-4-полуальдегид в присутствии NAD или NADP. Гомосериндегидрогеназа, кодируемая геном Saccharomyces cerevisiae, может называться HOM6.

Способ, применяемый для измерения уровня активности гомосериндегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Calnyanto et al. (2006, Microbiology, Vol. 152: 105-112).

Предпочтительной гомосериндегидрогеназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.3.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая гомосериндегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая гомосериндегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая гомосериндегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 18. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 18 кодирует гомосериндегидрогеназу, происходящую из Saccharomyces, которую также можно назвать HOM6.

Аминокислотную последовательность гомосериндегидрогеназы из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером AJR75529 или NP012673 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 19, описанной в данном документе.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии гомосериндегидрогеназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях соответственно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гомосериндегидрогеназу.

Как указано в другом месте настоящего описания, в некоторых вариантах осуществления изобретения гомосериндегидрогеназа (а) полностью или частично удалена или разорвана, или (b) находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; под контролем слабого промотора; и/или в дестабилизированной форме в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.

Конкретные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин

Cверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия аспартаттрансаминазы

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаттрансаминазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

Фермент аспартаттрансаминаза (также известный как аспартатаминотрансфераза) представляет собой белок, который описан в данной области для катализа реакции L-аспартата и 2-оксоглутарата для получения оксалоацетата и L-глутамата. Фермент аспартаттрансаминаза, кодируемый геном Saccharomyces cerevisiae, может называться AAT2.

В соответствии с этими вариантами осуществления сверхэкспрессия гена, кодирующего аспартаттрансаминазу, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаттрансаминазу. Аспартаттрансаминаза и ген, кодирующий аспартаттрансаминазу, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаттрансаминазу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию аспартаттрансаминазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим воплощениям рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, по меньшей мере, один ген, кодирующий аспартат-трансаминазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может вызывать высокий уровень превращения оксалоацетата в аспартат. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая аспартаттрансаминазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

Способ, применяемый для измерения уровня активности аспартаттрансаминазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Yagi et al. (1982, Biochem, VOl. 92: 35-43).

В некоторых вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаттрансаминазу, представляет собой ген AAT2 из Saccharomyces cerevisiae, как показано в приведенных в данном описанни примерах.

В предпочтительных вариантах осуществления аспартатаминотрансфераза кодируется AAT2-геном A. Thaliana.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаттрансаминазу, помещают под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора pACU1, или сильного промотора pADH1, или сильного промотора pPGK1.

В качестве иллюстрации, ген AAT2 может быть вставлен в ген CAN1, и/или в ген GNP1, и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.

Предпочтительная аспартаттрансаминаза в настоящем описании известна под шифром КФ 2.6.1.1.

Нуклеиновая(-ые) кислота(и), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из архебактерий. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжевого организма, и наиболее предпочтительно Saccharomyces cerevisiae.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая аспартаттрансаминазу или AAT2, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 39 %, предпочтительно по меньшей мере 65 % и предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует реакцию L-аспартата и 2-оксоглутарата с образованием оксалоацетата и L-глутамата.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 39 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 % , 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность аспартаттрансаминазы AAT2 из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может може найти под регистрационным номером NP013127 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 21, описанной в данном документе. В качестве иллюстрации, аспартаттрансаминаза, происходящая из E. coli, имеет 39 % аминокислотную идентичность аспартаттрансаминазе AAT2 с SEQ ID NO: 21.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 39 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать реакцию L-аспартата и 2-оксоглутарата с образованием оксалоацетата и L-глутамата.

Как описано в настоящем документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 39 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % , 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность рефренсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии аспартаттрансаминазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях соответственно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аспартаттрансаминазу.

Как указано в другом месте настоящего описания, аспартаттрансаминаза сверхэкспрессируется в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей аспартаттрансаминазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей аспартаттрансаминазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия глутаматдегидрогеназы

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, которая превращает оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

Соответственно, в конкретном варианте осуществления геном рекомбинантных дрожжей согласно настоящему изобретению такой, что по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, которая превращает оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

Фермент глутаматдегидрогеназа (также известный как NAD-специфическая глутаматдегидрогеназа) представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения 2-оксоглутарата с получением L-глутамата. Таким образом, глутаматдегидрогеназа представляет собой фермент, специфически участвующий в химической реакции, включающей превращение 2-оксоглутарата в L-глутамат в присутствии NADH.

В соответствии с этими вариантами осуществления сверхэкспрессия гена, кодирующего фермент глутаматдегидрогеназу, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую глутаматдегидрогеназу. Глутаматдегидрогеназа и кодирующий глутаматдегидрогеназу ген, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.

В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую глутаматдегидрогеназу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию глутаматдегидрогеназы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы путем преобразования оксоглутарата в глутамат одновременно генерирует NAD. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая глутаматдегидрогеназу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

Способ, применяемый для измерения уровня активности глутаматдегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Noor and Punekar (2005, Microbiology, Vol. 151: 1409-1419).

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, кодирует глутаматдегидрогеназу, которая использует NADH вместо NADPH, в частности, ген GDH из Entodinium caudatum (представлен как GDH.Eca или GDH2.Eca) или Saccharomyces cerevisiae (представлен как GDH2), как показано в приведенных в настоящем документе примерах. В конкретном варианте осуществления указанный ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, кодирует глутаматдегидрогеназу из Entodinium caudatum.

Предпочтительной глутаматдегидрогеназой в настоящем описании может представлять собой, в частности, фермент, имеющий шифр КФ 1.4.1.2.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, помещают под контроль сильного промотора pTDH3 или индуцибельного или репрессируемого промотора pCUP1-1.

В качестве иллюстрации ген глутаматдегидрогеназы может быть встроен в ген HIS3 и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем документе примерах.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Entodinium caudatum, Bacillus subtilis, Clostridium symbiosium.

В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 49 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO. 22 кодирует глутаматдегидрогеназу, происходящую из Entodinium caudatum, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована по кодонам для ее экспрессии в дрожжах, и особенно в Saccharomyces cerevisiae.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение 2-оксоглутарата для получения L-глутамата.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 49 % нуклеотидную идентичность рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы.

Аминокислотную последовательность глутаматдегидрогеназы из Entodinium caudatum специалист в данной области может найти под регистрационным номером AAF15393 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 23, описанной в настоящем документе. В качестве иллюстрации глутаматдегидрогеназа, происходящая из Giardia intestinalis, имеет 49 % аминокислотную идентичность глутаматдегидрогеназе с SEQ ID NO: 23.

Согласно другому конкретному варианту осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 49 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.

Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение 2-оксоглутарата для получения L-глутамата.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 49 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 % , 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.

Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.

Как упомянуто выше, уровень экспрессии глутаматдегидрогеназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях соответственно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную глутаматдегидрогеназу.

Как указано в другом месте настоящего описания, глутаматдегидрогеназа сверхэкспрессируется в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.

В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей глутаматдегидрогеназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей глутаматдегидрогеназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.

Выделение представляющих интерес соединений

В других вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению выделение продуцируемого эктоина за пределы дрожжевой клетки может быть усилено посредством (i) экспрессии генов, кодирующих пермеазы дрожжей, и (ii) экспрессии генов, кодирующих белки-экспортеры аминокислот, или (iii) как экспрессии генов, кодирующих пермеазы дрожжей, так и экспрессии генов, кодирующих белки-экспортеры аминокислот.

Пониженная экспрессия гена(-ов), кодирующего(-их) пермеазу

Как описано ниже, гены, кодирующие пермеазу, которые могут быть пониженно экспрессированы в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению, включают AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 и MUP1.

AGP1 представляет собой общую пермеазу 1 аминокислот из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность AGP1 можно найти под регистрационным номером NP_009905 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178671 в базе данных NCBI.

AGP3 является общей пермеазой 3 аминокислоты из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность AGP3 можно найти под регистрационным номером NP_116600 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрацинным номером NM_001179912 в базе данных NCBI.

BAP3 представляет собой пермеазу аминокислоты валина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность BAP3 можно найти под регистрационным номером NP_010331 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001180354 в базе данных NCBI.

BAP2 представляет собой пермеазу аминокислот Leu/Val/Ile из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность BAP2 можно найти под регистрационным номером NP_009624 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178416 в базе данных NCBI.

GAP1 является общей пермеазой аминокислот из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность GAP1 можно найти под регистрационным номером NP_012965.3 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001179829 в базе данных NCBI.

GNP1 является высокоаффинной пермеазой глутамина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность GNP1 можно найти под регистрационным номером NP_010796 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001180816 в базе данных NCBI.

MUP3 представляет собой низкоаффинную пермеазу метионина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность MUP3 можно найти под регистрационным номером NP_011827 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001179116 в базе данных NCBI.

MUP1 представляет собой низкоаффинную пермеазу метионина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность MUP можно найти под регистрационным номером NP_011569 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181184 в базе данных NCBI.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению указанные рекомбинантные дрожжи дополнительно определяются как обладающие пониженной экспрессией одного или более генов, кодирующих пермеазу, которые охватывают пермеазы AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 и MUP1.

Соответственно, в конкретном варианте осуществления геном рекомбинантных дрожжей согласно изобретению является таким, что была выполнена по меньшей мере одна из следующих модификаций:

(A) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот AGP3, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот AGP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот AGP3, была вставлена;

(B) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена;

(C) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена;

(D) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот GAP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот GAP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот GAP1, была вставлена;

(E) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена;

(F) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот AGP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот AGP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот AGP1, была вставлена;

(G) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную низкоаффинную пермеазу метионина мMUP3, была вставлена;

(H) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, была вставлена;

(I) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая вероятный транспортер AQR1, сверхэкспрессируется; и/или

(J) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая транспортер полиамина 1, сверхэкспрессируется.

В конкретном варианте осуществления были выполнены по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере три из этих модификаций.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения считают, что пониженная экспрессия любого из генов пермеазы должна увеличивать выделение продуцируемого эктоина за пределы дрожжевой клетки, например, в питательную среду.

Что касается пермеаз, пониженная экспрессия одного или более из этих генов включает полное подавление их экспрессии, например, разрывом или делецией указанного одного или более генов пермеазы.

В некоторых вариантах осуществления пониженная экспрессия гена, кодирующего пермеазу, может быть сделана зависящей от определенных условий, например, путем помещения экспрессии этого гена под контроль репрессируемых регуляторных последовательностей, таких как индуцибельные или репрессируемые промоторы.

Способы подавления экспрессии генов, разрыва генов-мишеней или делеции генов-мишеней хорошо известны специалисту в данной области.

Что касается гена пермеазы, то пониженная экспрессия также подразумевает вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей дестабилизированный белок пермеазы, или вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей дестабилизированный белок пермеазы, или и то, и другое.

Дестабилизированная пермеаза представляет собой вариант пермеазы, который быстрее разрушается внутри дрожжевой клетки, чем исходная пермеаза.

В предпочтительных вариантах осуществления дестабилизированная пермеаза состоит из меченного дегроном белка пермеазы.

Как показано в примерах, ген AGP3, ген BAP3, ген GAP1, ген GNP1 и ген MUP3 могут быть разорваны loxP и, таким образом, удалены.

Сверхэкспрессия гена(-ов), кодирующего(-их) белок-экспортер аминокислот

Как описано ниже, гены, кодирующие белок-экспортер, которые могут быть сверхэкспрессированы в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению, включают AQR1 и TPO1.

AQR1 является транспортером из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность AQR1 можно найти под регистрационным номером NP_014334 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182903 в базе данных NCBI.

ТРО1 является транспортером полиаминов из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность TPO1 можно найти под регистрационным номером NP_013072 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181848 в базе данных NCBI.

В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессия гена, кодирующего транспортер, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более дополнительных копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую указанный транспортер.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия гена, кодирующего транспортер, должна увеличивать выделение продуцируемого эктоина за пределы дрожжевой клетки, например, в культуральную среду.

В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия гена, кодирующего транспортер, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более дополнительных копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую ген транспортера. В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую транспортер, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию указанного транспортера, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В некоторых других вариантах осуществления одну копию гена, кодирующего транспортер, вставляют в выбранное положение в геноме дрожжей. В этих других вариантах осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую транспортер, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию указанного транспортера, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий белок-экспортер аминокислот, AQR1 помещают под контроль сильного промотора pTEF3.

В качестве иллюстрации ген AQR1 может быть вставлен в ген PYK1, как это показано в примерах, приведенных в настоящем описании.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий белок-экспортер аминокислот, TPO1 находится под контролем сильного индуцибельного или репрессируемого промотора pSAM4 или сильного конститутивного промотора pTEF1.

TPO1-1 может использоваться вместо TPO1. ТРО1-1 представляет собой искусственный аллель, в котором лизины 10, 49, 86, 143, 144 и 145 заменены аргининами.

Авторы изобретения полагают, что эти модификации защищают TPO1 от разрушения по убиквитин-протеасомному пути, тем самым стабилизируя его.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий белок-экспортер аминокислот, TPO1 находится под контролем сильного промотора pTEF3.

В качестве иллюстрации ген TPO1 может быть вставлен в ген PYK1, как это показано в примерах, приведенных в настоящем документе.

Для дополнительного увеличения продукции эктоина рекомбинантные дрожжи согласно изобретению могут содержать дополнительные генетические изменения, так что они продуцируют большие количества промежуточного продукта оксалоацетата. Эти необязательные генетические изменения описаны в настоящем документе ниже.

Дополнительные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантных дрожжей согласно настоящему изобретению продукция эктоина может быть дополнительно увеличена путем помещения указанных рекомбинантных дрожжей в условия, приводящие к увеличению продукции промежуточного метаболита оксалоацетата.

Помещение указанных рекомбинантных дрожжей в условия, приводящие к увеличению продукции оксалоацетата, может быть осуществлено путем введения дополнительных генетических модификаций в геном дрожжей.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что оптимальное увеличение продукции эктоина может быть достигнуто путем внесения дополнительных генетических изменений в рекомбинантные дрожжи продуцирующие, эктоин, которые описаны ниже.

Первые дополнительные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин

В соответствии с этими первыми дополнительными вариантами осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин, согласно изобретению, выполняют дополнительные генные модификации рекомбинантных дрожжей с целью увеличения продукции промежуточного продукта фосфоенолпирувата (PEP).

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что дополнительные генетические изменения, вносимые в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, (i) вызывают сверхпродукцию NADPH, (ii) вызывают контролируемое и сбалансированное превращение фосфоенолпирувата в оксалоацетат и пируват, соответственно, и (iii) вызывают пониженное превращение пирувата в этанол и перенаправление в сторону превращения фосфоенолпирувата в оксалоацетат.

Эти дополнительные генетические изменения, внесенные с помощью генной инженерией в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, согласно изобретению, более подробно описаны ниже.

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы (также называемой MET19 или ZWF1) и декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 1 (также называемой GND1). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретатения считают, что сверхэкспрессия MET19 и GND1 вызывает увеличение продукции NADPH.

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию фосфоенолпируваткарбоксилазы (также называемой PEPC или PPC) и/или фосфоенолпируваткарбоксикиназы [АТФ] (также называемой PCK1 или PEPCK).

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать пониженную экспрессию пируваткиназы 1 (также называемой PYK1 или CDC19) и пируваткиназы 2 (также называемой PYK2). В некоторых из этих вариантов осуществления ген PYK2 может быть удален вместо обеспечения пониженной экспрессии.

В некоторых из этих вариантов осуществления один или более генов, кодирующих пируватдекарбоксилазу, инактивированы, предпочтительно путем делеции. Гены, кодирующие пируватдекарбоксилазу, охватывают гены, называемые PDC1, PDC5 и PDC6, соответственно. В соответствии с некоторыми из этих вариантов осуществления гены PDC1 и/или PDC6 инактивированы предпочтительно путем разрыва или делеции, тогда как другой ген, кодирующий пируватдекарбоксилазу, PDC5 остается неизменным; или его экспрессия снижена путем контроля с помощью слабого промотора.

В некоторых из этих вариантов осуществления активность алкогольдегидрогеназы рекомбинантных дрожжей снижена путем изменения экспрессии одного или более генов, кодирующих алкогольдегидрогеназу. В некоторых из этих вариантов осуществления экспрессия ADH1 снижена путем помещения гена под контроль слабого промотора или путем продуцирования дестабилизированного фермента ADH1. В некоторых из этих вариантов осуществления один или более из ADH3, ADH4 и ADH5 могут быть инактивированы, предпочтительно путем разрыва или делеции.

В некоторых из этих вариантов осуществления экзогенный ген, кодирующий ацетилдегидрогеназу (также называемую MHPF), может быть введен в дрожжевой геном и сверхэкспрессирован.

В некоторых из этих вариантов осуществления экзогенный ген, кодирующий ацетаткиназу (также называемую ACKA), может быть введен в дрожжевой геном и сверхэкспрессирован.

В некоторых из этих вариантов осуществления экзогенный ген, кодирующий фосфатацетилтрансферазу (также называемую PTA), может быть введен в дрожжевой геном и сверхэкспрессирован.

Глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа

Фермент глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения D-глюкозо-6-фосфата в 6-фосфо-D-глюконо-1,5-лактон с сопутствующим восстановлением NADP до NADPH.

Способ, применяемый для измерения уровня активности глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Kuby, S. et al. (1966) Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9, 116-117.

Предпочтительной глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.49.

Аминокислотную последовательность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы (также называемой MET19) можно найти под регистрационным номером NP_014158.1 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001183079.1 в базе данных UniProt.

6-фосфоглюконатдегидрогеназа, декарбоксилирующая 1

Фермент декарбоксилирующая 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 1 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа окислительного декарбоксилирования 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата и СО₂, с сопутствующим восстановлением NADP до NADPH.

Способ, применяемый для измерения уровня активности декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области техники.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в He W. et al. (2007) BMC Structural Biology, 7:38.

Предпочтительной декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназой 1 в настоящем описании, является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.44.

Аминокислотную последовательность декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 1 (также называемой GND1) можно найти под регистрационным номером NP_012053 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001179314 в базе данных NCBI.

Пируваткиназа 1

Фермент пируваткиназа 1 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения пирувата в фосфоенолпируват в присутствии АТФ.

Способ, применяемый для измерения уровня активности пируваткиназы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Susan-resiga и Nowak (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245).

Предпочтительной пируваткиназой 1 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.7.1.40.

Аминокислотную последовательность пируваткиназы 1 (также называемой PYK1) можно найти под регистрационным номером NP_009362 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178183 в базе данных NCBI.

Пируваткиназа 2

Фермент пируваткиназа 2 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения пирувата в фосфоенолпируват в присутствии АТФ. Пируваткиназа 2 может использоваться дрожжевой клеткой в условиях, когда уровень гликолитического потока очень низок.

Способ, применяемый для измерения уровня активности пируваткиназы 2, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Susan-resiga и Nowak (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245).

Предпочтительной пируваткиназой 2 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.7.1.40.

Аминокислотную последовательность пируваткиназы 2 (также называемой PYK2) можно найти под регистрационным номером NP_014992 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001183767 в базе данных NCBI.

Изофермент пируватдекарбоксилазы 1

Изофермент пируватдекарбоксилазы 1 представляет собой белок, который описан в данной области техники как участвующий в неокислительном превращении пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода во время спиртового брожения.

Способ, применяемый для измерения уровня активности изофермента пируватдекарбоксилазы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).

Предпочтительным изоферментом пируватдекарбоксилазы 1 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.1.

Аминокислотную последовательность изофермента пируватдекарбоксилазы 1 (также называемой PDC1) можно найти под регистрационным номером NP_013145 в базе данных UniProt. Последовательности нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181931 в базе данных NCBI.

Изофермент пируватдекарбоксилазы 5

Изофермент пируватдекарбоксилазы 5 представляет собой белок, который описан в данной области техники как участвующий в неокислительном превращении пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода во время спиртового брожения.

Способ, применяемый для измерения уровня активности изофермента пируватдекарбоксилазы 5, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).

Предпочтительный изофермент пируватдекарбоксилазы 5 в настоящем описании представляет собой фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.1.

Аминокислотную последовательность изофермента пируватдекарбоксилазы 5 (также называемой PDC5) можно найти под регистрационным номером NP_013235 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182021 в базе данных NCBI.

Изофермент пируватдекарбоксилазы 6

Изофермент пируватдекарбоксилазы 6 представляет собой белок, который описан в данной области техники как участвующий в неокислительном превращении пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода во время спиртового брожения.

Способ, применяемый для измерения уровня активности изофермента пируватдекарбоксилазы 5, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).

Предпочтительным изоферментом пируватдекарбоксилазы 6 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.1.

Аминокислотную последовательность изофермента пируватдекарбоксилазы 6 (также называемой PDC6) можно найти под регистрационным номером NP_013235 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182021 в базе данных NCBI.

Ацетальдегиддегидрогеназа

Ацетальдегиддегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения ацетальдегида в ацетил-КоА с использованием NAD и кофермента А.

Способ, применяемый для измерения уровня активности ацетальдегиддегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Fisher et al. (2013) Chemi. Biol. Interact. 202 70-77.

Предпочтительной ацетальдегиддегидрогеназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.10.

Аминокислотную последовательность ацетальдегиддегидрогеназы (также называемой MHPF) можно найти под регистрационным номером NP_414885 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к той, которая раскрыта под регистрационным номером NC_000913.3 в базе данных NCBI.

Ацетаткиназа

Ацетаткиназа представляет собой белок, который описан в данной области для образования ацетилфосфата из ацетата и АТФ.

Способ, применяемый для измерения уровня активности ацетаткиназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Sagers et al. J.Bacteriology (1961) 82 233-238.

Аминокислотную последовательность ацетаткиназы (также называемой ACKA) можно найти под регистрационным номером NP_416799 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к той, которая раскрыта под регистрационным номером NC_000913.3 в базе данных NCBI.

Фосфатацетилтрансфераза

Фосфатацетилтрансфераза представляет собой белок, который описан в данной области для катализа обратимого взаимопревращения ацетил-КоА и ацетилфосфата.

Способ, применяемый для измерения уровня активности фосфатацетилтрансферазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Castano-Cerezo and Canovas, Microbial Cell Factories 2009, 8:54.

Предпочтительной фосфатацетилтрансферазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.3.1.8.

Аминокислотную последовательность фосфатацетилтрансферазы (также называемой PTA) можно найти под регистрационным номером NP_416800 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к той, которая раскрыта под регистрационным номером NC_000913 в базе данных NCBI.

Алкогольдегидрогеназа 1

Алкогольдегидрогеназа 1 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.

Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.

Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 1 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.

Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 1 (также называемой ADH1) можно найти под регистрационным номером NP_014555 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001183340 в базе данных NCBI.

Алкогольдегидрогеназа 3

Алкогольдегидрогеназа 3 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.

Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 3, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.

Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 3 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.

Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 3 (также называемой ADH3) можно найти под регистрационным номером NP_013800 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182582 в базе данных NCBI.

Алкогольдегидрогеназа 4

Алкогольдегидрогеназа 4 представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.

Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 4, относится к общим знаниям специалистам в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.

Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 4 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.

Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 4 (также называемой ADH4) можно найти под регистрационным номером NP_011258 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181122 в базе данных NCBI.

Алкогольдегидрогеназа 5

Алкогольдегидрогеназа 5 представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.

Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 5, относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.

Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 5 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.

Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 5 (также называемой ADH5) можно найти под регистрационным номером NP_009703 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178493 в базе данных NCBI.

Вторые дополнительные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин

В соответствии с этими дополнительными вариантами осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин, согласно изобретению, выполняют дополнительные генетические модификации рекомбинантных дрожжей с целью увеличения продукции промежуточного продукта фосфоенолпирувата (PEP).

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что дополнительные генетические изменения, вносимые в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, (i) вызывают сверхпродукцию NADPH, (ii) вызывают контролируемое и сбалансированное превращение фосфоенолпирувата в оксалоацетат и пируват, соответственно, и (iii) вызывают пониженное превращение пирувата в этанол и перенаправление в сторону превращения фосфоенолпирувата в оксалоацетат.

Для этой цели авторы изобретения разработали совершенно новый метаболический путь, начинающийся от фосфенолпирувата и заканчивающийся продукцией оксалоацетата.

Эти дополнительные генетические изменения, внесенные с помощью генной инженерии в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, согласно изобретению, более подробно описаны ниже.

Согласно этим вариантам осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать пониженную экспрессию пируваткиназы 1 (также называемую PYK1) и, необязательно, также пируваткиназы 2 (также называемую PYK2). В некоторых из этих вариантов осуществления PYK1 может быть пониженно экспрессирован путем помещения гена под контроль слабого промотора или индуцибельного или репрессируемого промотора. В некоторых из этих вариантов осуществления PYK2 может быть инактивирован, например, путем разрыва или делеции. В некоторых из этих вариантов осуществления ген PYK1 может быть удален, а не пониженно экспрессирован. В некоторых из этих вариантов осуществления ген PYK1 и ген PYK2 могут быть удалены, а не пониженно экспрессированы.

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию фосфоенолпируваткарбоксикиназы [АТФ] (также называемую PCK, или PCKA, или PEPCK), либо (i) путем конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) посредством индуцибельной сверхэкспрессии.

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию в цитоплазме малатдегидрогеназы, такой как пероксисомальная малатдегидрогеназа (также называемая MDH3), либо (i) путем конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) путем индуцибельной сверхэкспрессии.

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию NADP-зависимой малатдегидрогеназы 3 (также называемый ME3 или NADP-ME3), либо (i) путем конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) путем индуцибельной сверхэкспрессии.

В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать пониженную экспрессию одной или более алкогольдегидрогеназ(-ы), предпочтительно, одной или более алкогольдегидрогеназ(-ы), выбранных из группы, включающей алкогольдегидрогеназу 1 (также называемую ADH1), алкогольдегидрогеназу 3 (также называемую ADH3), алкогольдегидрогеназу 4 (также называемую ADH4) и алкогольдегидрогеназу 5 (также называемую ADH5), например (i) путем помещения соответствующей кодирующей последовательности под контроль слабого промотора или индуцибельного или репрессируемого промотора или (ii) путем продуцирования дестабилизированной формы указанной алкогольдегидрогеназы(ы).

Тем не менее, в соответствии с этими вариантами осуществления, генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию экзогенной ацетальдегиддегидрогеназы (также называемой MHPF), либо (i) посредством конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) посредством индуцибельной сверхэкспрессии.

Фосфоенолпируваткарбоксикиназа (PPCK)

Фермент фосфоенолкарбоксикиназа [АТФ] представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения оксалоацетата в фосфоенолпируват посредством прямого переноса фосфорила между нуклеозидтрифосфатом и оксалоацетатом.

Способ, применяемый для измерения уровня активности фосфоенолкарбоксикиназы [АТФ], относится к общим знаниям специалиста в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Bazaes S. et al. (2007) The Protein Journal, 26, 265-269 и Mariët J. Van der Werf et al.·(1997) Arch Microbiol 167: 332-342.

Предпочтительной фосфоенолкарбоксикиназой [АТФ] в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.49.

Аминокислотную последовательность фосфоенолкарбоксикиназы [АТФ] (также называемой PCKA) можно найти под регистрационным номером NP_417862 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты, ее можно отнести к последовательности, описанной под регистрационным номером NC_000913 в базе данных NCBI.

Предпочтительная фосфоенолкарбоксикиназа в соответствии с изобретением может быть выбрана из фосфоенолпируваткарбоксикиназы PPCK, такой как PEPCK, имеющей шифр КФ 4.1.1.32.

Малатдегидрогеназа

Фермент малатдегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения малата в оксалоацетат в присутствии NADH.

Способ, применяемый для измерения уровня активности малатдегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области. Например, можно упомянуть коммерчески доступный набор, продаваемый Sigma, под названием «Набор для анализа малатдегидрогеназы» под номером MAK196-1KT.

Аминокислотную последовательность малатдегидрогеназы (также называемой MDH3) можно найти под регистрационным номером NP_010205 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_00118037 в базе данных NCBI.

NADP-зависимая малатдегидрогеназа 3

Фермент NADP-зависимая малатдегидрогеназа 3 представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения малата в пируват в присутствии NADP.

Способ, применяемый для измерения уровня активности NADP-зависимой малатдегидрогеназы 3, относится к общим знаниям специалистам в данной области.

В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Gerrard-Wheeler et al. FEBS Journal 276 (2009) 5665-5677.

Предпочтительной NADP-зависимой малатдегидрогеназой 3 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.40.

Аминокислотную последовательность NADP-зависимой малатдегидрогеназы 3 (также называемой NADP-ME3 или ME3) можно найти под регистрационным номером NP_197960 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_122489 в базе данных NCBI.

Алкогольдегидрогеназа 1, алкогольдегидрогеназа 3, алкогольдегидрогеназа 4, алкогольдегидрогеназа 5 и ацетальдегиддегидрогеназа являются такими, как указано в данном документе выше.

ПРОМОТОРЫ

Как описано в настоящем документе, экспрессия представляющих интерес генов, которые генетически сконструированы для получения рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, включает соответствующие регуляторные последовательности, которые являются функциональными в клетках дрожжей, в том числе в Saccharomyces cerevisiae.

Как описано в настоящем описании, различные промоторы могут быть использованы для желаемой экспрессии представляющих интерес кодирующих последовательностей, которые включают (i) конститутивные сильные промоторы (также называемые сильными промоторами в настоящем тексте), (ii) конститутивные слабые промоторы (также называемые слабыми промоторами в настоящем тексте) и (iii) индуцибельные или репрессируемые промоторы. Список дрожжевых промоторов с их относительной активностью в разных средах можно найти в Keren et al. (2013) Molecular Systems Biology 9: 701.

Промоторы, обеспечивающие конститутивную сверхэкспрессию данного гена, можно найти в литературе (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251).

Сильные промоторы, представляющие особый интерес в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:

• pTDH3 (SEQ ID NO: 24),

• pENO2 (SEQ ID NO: 25),

• pTEF KI (SEQ ID NO: 26),

• pTEF3 (SEQ ID NO: 27),

• pTEF1 (SEQ ID NO: 28),

• pADH1 (SEQ ID NO: 29),

• pGMP1 (SEQ ID NO: 30),

• pFBA1 (SEQ ID NO: 31),

• pPDC1 (SEQ ID NO: 32),

• pCCW12 (SEQ ID NO: 33), и

• pGK1 (SEQ ID NO: 34).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления сильный промотор согласно изобретению независимо выбран из группы, состоящей из pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 и pGK1.

Слабые промоторы, представляющие особый интерес в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:

• pURA3 (SEQ ID NO: 36),

• pRPLA1 (SEQ ID NO: 37),

• pNUP57 (SEQ ID NO: 119), и

• pGAP1 (SEQ ID NO: 120).

Согласно конкретному варианту осуществления слабый промотор согласно изобретению независимо выбран из группы, состоящей из pURA3, pRPLA1, pNUP57 и pGAP1.

Как упоминалось ранее, индуцибельные или репрессируемые промоторы представляют собой промоторы, активность которых контролируется наличием или отсутствием биотических или абиотических факторов, и также количеством указанного фактора. Соответственно, для некоторых промоторов их активность, в частности, будет индуцирована и, следовательно, увеличена, когда количество данного фактора увеличивается или является увеличенным, и, соответственно, активность этих же промоторов может быть подавлена и, таким образом, уменьшена, когда количество указанного фактора уменьшается или является уменьшенным. Количество указанного фактора(-ов) в культуральной среде рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, содержащих индуцибельные или репрессируемые промоторы, может быть определено и, таким образом, контролироваться специалистом в данной области.

Например, увеличение количества метионина в культуральной среде рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, содержащих промотор pSAM4, будет индуцировать и, следовательно, увеличивать транскрипцию гена под контролем этого промотора. Напротив, уменьшение количества метионина в указанной культуральной среде приведет к репрессии и, следовательно, к уменьшенной транскрипции гена под контролем этого промотора.

В другом примере увеличение количества меди в культуральной среде рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, содержащих промотор pCTR1, будет репрессировать и, таким образом, уменьшать транскрипцию гена под контролем этого промотора. Напротив, уменьшение количества меди в указанной культуральной среде приведет к индуцированной и, следовательно, повышенной транскрипции гена под контролем этого промотора.

По этой причине следующие промоторы упоминаются в настоящем тексте как «индуцибельные или репрессируемые промоторы».

Согласно первому варианту осуществления индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут быть выбраны из группы, включающей промоторы, индуцируемые или репрессируемые медью, промоторы, индуцируемые или репрессируемые метионином, и промоторы, индуцируемые или репрессируемые треонином, и, в частности, выбраны из группы, состоящей из:

• pSAM4 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 38),

• pCUP1-1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 39),

• pCUP1.cgla - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 40),

• pCUP1.sba - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 41),

• pACU1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 42),

• pACU2 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 43),

• pACU3p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 44),

• pACU4p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 45),

• pACU5 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 46),

• pACU6 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 47),

• pACU7 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 48),

• pACU8 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 49),

• pACU9 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 50),

• pACU10p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 51),

• pACU11 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 52),

• pACU12 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 53),

• pACU13 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 54),

• pACU14 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 55),

• pACU15 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 56),

• pGAL/CUP1p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 57),

• pCRS5 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 58), и

• pCHA1 - индуцируемый или репрессируемый треонином (SEQ ID NO: 59).

В соответствии с этим вариантом осуществления индуцибельный или репрессируемый промотор согласно изобретению может, в частности, независимо быть выбран из группы, состоящей из pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5 , pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 и pCHA1.

Таким образом, активность этих промоторов индуцируется увеличивающимся присутствием метионина, меди или треонина, как указано выше, и их активность уменьшается, то есть подавляется, когда количество метионина, меди или треонина уменьшается.

Согласно второму варианту осуществления индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут быть выбраны из группы, включающей промоторы, индуцируемые или репрессируемые медью, промоторы, индуцируемые или репрессируемые лизином, и промоторы, индуцируемые или репрессируемые метионином, и, в частности, быть выбраны из группы, состоящей из:

• pCTR1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 60),

• pCTR3 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 61),

• pCUR1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 62),

• pCUR2 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 63),

• pCUR3 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 64),

• pCUR4 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 65),

• pCUR5p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 66)

• pCUR6 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 67),

• pCUR7 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 68),

• pCUR8 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 69),

• pCUR9 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 70),

• pCUR10 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 71),

• pCUR11 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 72),

• pCUR12 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 73),

• pCUR13 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 74),

• pCUR14 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 75),

• pCUR15 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 76),

• pCUR16 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 77),

• pCUR17 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 78),

• pLYS1 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 79),

• pLYS4 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 80),

• pLYS9 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 81),

• pLYR1p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 82),

• pLYR2p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 83),

• pLYR3p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 84),

• pLYR4p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 85),

• pLYR5p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 86),

• pLYR6p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 87),

• pLYR7p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 88),

• pLYR8 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 89),

• pLYR9 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 90),

• pLYR10 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 91),

• pLYR11 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 92),

• pMET17 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 93),

• pMET6 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 94),

• pMET14 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 95),

• pMET3 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 96),

• pSAM1 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 97),

• pSAM2 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 98),

• pMDH2 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 35),

• pJEN1 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 118),

• pICL1 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 119),

• pADH2 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 120), и

• pMLS1 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 121).

В соответствии с этим конкретным вариантом осуществления индуцибельный или репрессируемый промотор согласно изобретению может независимо быть выбиран из группы, состоящей из pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 и pMLS1.

Таким образом, активность этих промоторов подавляется увеличивающимся присутствием метионина, меди, лизина или глюкозы, как указано выше, и их активность увеличивается, то есть индуцируется, когда количество метионина, меди, лизина или глюкозы уменьшается.

В конкретном варианте осуществления индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут быть выбраны из группы, включающей промоторы, индуцируемые или репрессируемые медью, промоторы, индуцируемые или репрессируемые глюкозой, промоторы, индуцируемые или репрессируемые лизином, промоторы, индуцируемые или репрессируемые метионином, и промоторы, индуцируемые или репрессируемые треонином.

В более конкретном варианте осуществления индуцибельный или репрессируемый промотор по изобретению может быть независимо выбран из группы, состоящей из pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 и pMLS1.

Более конкретно, указанные промоторы, одинаковые или разные, могут предпочтительно характеризоваться последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80 % идентичность последовательностям SEQ ID NO: 24-98 и 116-121.

Синтетические промоторы, как описано в Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58, также могут быть использованы.

Сильные, слабые и индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут происходить из любого организма из класса Saccharomycetes и, в частности, могут независимо происходить из организма, выбранного из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii, Ashbya gossypii, Kluveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida glabrata, Candida tropicalis, Debaryomyces castelii, Yarrowia lipolitica и Cyberlindnera jadinii.

Сильные, слабые и индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению предпочтительно могут происходить из организма, выбранного из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii и Kluveromyces lactis.

ТЕРМИНАТОРЫ

Как описано в данном документе, экспрессия представляющих интерес генов, которые были генетически сконструированы для получения рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, включает соответствующие последовательности терминаторов транскрипции, которые функционируют в клетках дрожжей, в том числе в Saccharomyces cerevisiae.

Указанные терминаторы транскрипции, одинаковые или разные, можно найти в литературе Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.

Терминаторы, представляющие особый интерес в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:

• tTDH2 из гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, изофермент 2 (ген TDH2 соответствует последовательности SEQ ID NO: 99),

• tCYC1 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 100),

• tTDH3 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 101) и

• tADH1 из гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу (ген ADH1 соответствует последовательности SEQ ID NO: 102),

• tADH2 из гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу (ген ADH2 соответствует последовательности SEQ ID NO: 103),

• tTPI1 из гена, кодирующего триозофосфатизомеразу (ген TPI1 соответствует последовательности SEQ ID NO: 104),

• tMET17 из гена, кодирующего O-ацетилгомосерин-O-ацетилсеринсульфгидрилазу (ген Met17 соответствует последовательности SEQ ID NO: 105),

• tENO2 из гена, кодирующего енолазу II (ген ENO2 соответствует последовательности SEQ ID NO: 106),

• tMET3 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 107) и

• tPGK1 из гена, кодирующего 3-фосфоглицераткиназу (ген PGK1 соответствует последовательности SEQ ID NO: 108),

• tDIT1 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 109),

• tRPL3 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 110),

• tRPL41B (соответствует последовательности SEQ ID NO: 111),

• tRPL15A (соответствует последовательности SEQ ID NO: 112),

• tIDP1 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 113).

Более конкретно, указанный терминатор, одинаковый или различный, предпочтительно может быть охарактеризован последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80 % идентичность последовательностям SEQ ID NO: 99-113.

РЕКОМБИНАНТНЫЕ ДРОЖЖИ

Как правило, дрожжи могут быстро расти, и могут быть культивированы при более высокой плотности по сравнению с бактериями, и не требуют асептической среды в промышленных условиях. Кроме того, дрожжевые клетки легче отделить от культуральной среды по сравнению с бактериальными клетками, что значительно упрощает процесс выделения и очистки продукта.

Предпочтительно, дрожжи согласно изобретению могут быть выбраны из рода Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus или Malassezia.

Более предпочтительно, дрожжи могут быть Crabtree(Крэбтри)-положительными дрожжами рода Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces или Brettanomycces.

Более предпочтительно, дрожжи могут относиться к видам Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa или Torulaspora glabrata.

Более предпочтительно, рекомбинантные дрожжи могут принадлежать к роду Saccharomyces и предпочтительно к виду Saccharomyces cerevisiae.

Как упомянуто выше, рекомбинантные дрожжи согласно изобретению обладают пируватдекарбоксилазной активностью, которая снижается путем введения по меньшей мере одной ДНК-конструкции, выбранной из тех, которые описаны в настоящем документе.

Способы, применяемые для вставки конкретной ДНК-конструкции в ген, относятся к общим знаниям специалиста в данной области. Связанный способ описан более подробно в настоящем документе в примерах, приведенных ниже.

УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Настоящее изобретение также относится к применению рекомбинантных дрожжей, таких как определенные выше, для получения эктоина.

Настоящее изобретение также относится к способу получения эктоина, включающему следующие стадии:

- обеспечение рекомбинантного микроорганизма, как описано ранее, культивирование рекомбинантного микроорганизма в культуральной среде, содержащей источник углерода, и

- выделение эктоина.

Как правило, микроорганизмы согласно изобретению выращивают при температуре в диапазоне от около 20 до около 37°С, предпочтительно при температуре в диапазоне от 27 до 34°С, в соответствующей культуральной среде.

Когда рекомбинантные дрожжи согласно изобретению принадлежат к виду S. cerevisiae, температура может предпочтительно составлять в диапазоне от 27 до 34°С в подходящей культуральной среде.

Подходящими питательными средами для дрожжей являются обычные коммерческие готовые среды, такие как бульон, который включает основу азотного агара для дрожжей, сульфат аммония и декстрозу в качестве источника углерода/энергии, или среда YPD, смесь пептона, дрожжевого экстракта и декстрозы в оптимальных пропорциях для выращивания. Также могут быть использованы другие определенные или синтетические питательные среды, и специалисту в области микробиологии или ферментации будут известны подходящие среды для роста конкретного микроорганизма.

Термин «подходящая культуральная среда» определен выше.

Примеры известных питательных сред для рекомбинантных дрожжей в соответствии с настоящим изобретением известны специалисту в данной области и представлены в следующей публикации D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).

Подходящие диапазоны рН для ферментации могут составлять от 3,0 до 7,5, где рН от 4,5 до 6,5 является предпочтительным в качестве начального условия.

Ферментация может проводиться в аэробных или микроаэробных условиях.

Количество продукта в ферментационной среде может быть определено с использованием ряда методов, известных в данной области, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или газовой хроматографии (ГХ).

Настоящий процесс может использовать периодический метод ферментации. Классическая периодическая ферментация представляет собой закрытую систему, в которой состав среды устанавливается в начале ферментации и не подвергается искусственным изменениям во время ферментации. Таким образом, в начале ферментации средe засеивают желаемым организмом или организмами, и ферментация может происходить без добавления чего-либо в систему. Как правило, однако, «периодическая» ферментация является периодической в отношении добавления источника углерода, и часто предпринимаются попытки контроля таких факторов, как температура, pH и концентрация кислорода. В периодических системах состав метаболитов и биомассы системы постоянно изменяется до момента, когда ферментация прекращается. В периодических культурах клетки проходят через статическую фазу задержки роста в логарифмическую фазу быстрого роста и, наконец, в стационарную фазу, где скорость роста уменьшается или останавливается. Без обработки клетки в стационарной фазе в конечном итоге погибнут. Клетки в логарифмической фазе обычно отвечают за основную массу продукции конечного продукта или промежуточного продукта.

Система стационарного культивирования с подпиткой (система Fed-Batch) также может быть использована в настоящем изобретении. Система Fed-Batch похожа на типичную периодическую систему, за исключением того, что субстрат источника углерода добавляют порциями по мере ферментации. Системы Fed-Batch полезны, когда катаболитная репрессия (например, репрессия глюкозы) способна ингибировать метаболизм клеток и когда желательно иметь ограниченные количества субстрата в среде. Измерение фактической концентрации субстрата в системах Fed-Batch является сложным и поэтому оценивается на основе изменений измеряемых факторов, таких как pH, растворенный кислород и парциальное давление отработанных газов, таких как CO₂.

Ферментации являются общепринятыми и хорошо известными в данной области техники, и примеры могут быть найдены в Sunderland et al., (1992), включенной в настоящее описание посредством ссылки. Хотя настоящее изобретение выполняют в периодическом режиме, предполагается, что способ может быть адаптирован к непрерывной ферментации.

Непрерывная ферментация представляет собой открытую систему, в которой определенную ферментационную среду непрерывно добавляют в биореактор и одновременно убирают равное количество кондиционированной среды для обработки. Непрерывная ферментация, как правило, поддерживает культуры с постоянной высокой плотностью, где клетки в основном находятся в логарифмической стадии роста.

Непрерывная ферментация позволяет модулировать один фактор или любое количество факторов, которые влияют на рост клеток или концентрацию конечного продукта. Например, в одном способе будут поддерживать ограничение питательных веществ, таких как источник углерода или уровень азота, на фиксированном уровне, в то время как все другие параметры будут изменяться. В других системах ряд факторов, влияющих на рост, может изменяться непрерывно, в то время как концентрацию клеток, измеренная по мутности среды, поддерживают постоянной. Непрерывные системы стремятся поддерживать условия роста в устойчивом состоянии, и, таким образом, потеря клеток из-за откачиваемой среды должна быть сбалансирована скоростью роста клеток в процессе ферментации. Способы модуляции питательных веществ и факторов роста для процессов непрерывной ферментации, а также методы максимизации скорости образования продукта хорошо известны в области промышленной микробиологии.

Предполагается, что настоящее изобретение может быть осуществлено с использованием периодических, Fed-Batch или непрерывных процессов и что любой известный способ ферментации будет подходящим. Кроме того, предполагается, что клетки могут быть иммобилизованы на субстрате в качестве цельноклеточных катализаторов и подвергнуты условиям ферментации для осуществления получения.

Чтобы дополнительно улучшить продукцию эктоина, конкретный вариант осуществления может состоять из культивирования рекомбинантных дрожжевых клеток в подходящей культуральной среде, такой как указано выше, где указанная культуральная среда содержит оптимальное количество источника углерода, в частности, глюкозы.

Предпочтительно клетки культивируют в такой оптимальной культуральной среде в течение только части всей продолжительности культивирования. В некоторых вариантах осуществления дрожжевые клетки инкубируют в указанной оптимальной культуральной среде через 10 часов или более после начала культивирования, что охватывает 11, 12, 13, 14, 15 или 16 часов или более после начала культивирования.

Предпочтительно клетки культивируют в такой оптимальной культуральной среде в течение периода времени от 5 до 15 часов, что включает от 6 до 10 часов, например 8 часов, после начала культивирования.

В предпочтительных вариантах осуществления источник углерода, содержащийся в указанной оптимальной культуральной среде, состоит из глюкозы. В предпочтительных вариантах осуществления указанная оптимальная культуральная среда содержит 12 мас.% или более глюкозы, включая 15 мас.% или более глюкозы. В предпочтительных вариантах осуществления указанная оптимальная культуральная среда содержит не более 40 мас.% глюкозы, что включает не более 35 мас.% глюкозы.

Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, описанных выше, способ получения эктоина согласно изобретению может дополнительно включать, между этапами (а) и (с), промежуточную стадию (b), состоящую из культивирования дрожжевых клеток в указанной оптимальной культуральной среде.

ОЧИСТКА ЭКТОИНА

Согласно конкретному аспекту изобретения ферментативное получение эктоина включает стадию выделения эктоина из культуральной среды. Выделение эктоина из культуральной среды является обычной задачей для специалиста в данной области. Оно быть осуществлено с помощью ряда методик, хорошо известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, дистилляцию, отдувку газом, испарение через полупроницаемую мембрану, селективное осаждение или жидкостную экстракцию. Специалист в данной области знает, как адаптировать параметры каждого метода в зависимости от характеристик материала, подлежащего разделению.

Дрожжи в качестве модели микроорганизма в настоящем изобретении были сохранены в том смысле, что синтезированный эктоин полностью выделяется за пределы клеток, что упрощает процесс очистки.

Синтезированный эктоин могут быть собран дистилляцией. Дистилляция может включать необязательный компонент, отличный от культуральной среды, чтобы облегчить выделение эктоина путем образования азеотропа, и в частности с водой. Этот необязательный компонент представляет собой органический растворитель, такой как циклогексан, пентан, бутанол, бензол, толуол, трихлорэтилен, октан, диэтиловый эфир или их смесь.

Отдувку газом осуществляют с помощью отдувочного газа, выбранного из гелия, аргона, диоксида углерода, водорода, азота или их смеси.

Жидкостную экстракцию осуществляют с помощью органического растворителя в качестве гидрофобной фазы, такого как пентан, гексан, гептан или додекан.

Термины «между…и…» и «в пределах от…до…» следует понимать как включающие пределы, если не указано иное.

Следующие примеры и графические материалы представлены в качестве иллюстрации и не подразумевают ограничение изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Протокол получения рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae согласно изобретению

Все реализованные далее рекомбинантные штаммы Saccharomyces cerevisiae были сконструированы из стандартных штаммов с использованием стандартной процедуры молекулярной генетики дрожжей (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).

Кластер из упомянутых далее генов был встроен в рекомбинантные дрожжи за один раз с использованием способности дрожжей эффективно рекомбинировать свободные концы ДНК, имеющие гомологию последовательности.

Кроме того, для лучшего понимания следующих генотипов:

- ade2, his3, leu2, trp1 и ura3 являются маркерными генами ауксотрофии.

- Буквы в нижнем регистре означают, что рассматриваемый ген неактивен, буквы в верхнем регистре отражают активный ген.

- «::»: за названием гена означает, что ген разорван тем, что следует далее (если вставлено более одного гена, они отмечаются в скобках []). Разрыв гена сопровождается полной делецией кодирующей последовательности, но при этом сохраняется промотор. В результате ген, за которым следует «::», является неактивеным и отмечен буквами в нижнем регистре. Если это не указано, транскрипция вставленного гена контролируется промотором разорванного гена.

- «gene.Kl» означает, что ген происходит от Kluyveromyces lactis.

Более конкретно, кодирующие последовательности, подлежащие клонированию, были искусственно синтезированы. Для гетерологичных последовательностей (не дрожжевых) нуклеиновые последовательности были модифицированы для получения синонимичной кодирующей последовательности с использованием дрожжевых кодонов. Используя рестриктазу и классическую технологию клонирования, каждую синтетическую последовательность клонировали между промотором транскрипции и терминатором транскрипции. Каждой промоторной последовательности предшествовало от 50 до 200 нуклеотидных последовательностей, гомологичных последовательности терминатора вышестоящего гена. Аналогично, за терминатором каждого гена (геном, содержащим промотор-кодирующую последовательность-терминатор) следуют последовательности, гомологичные гену, непосредственно следующим за ним. Таким образом, каждое звено, подлежащее встраиванию, имеет от 50 до 200 перекрывающихся нуклеотидов как с вышерасположенным звеном, так и с нижерасположенным. Промотору первого звена предшествуют от 50 до 200 нуклеотидов, гомологичных нуклеотиду хромосомы дрожжей для локуса, в который он будет встроен. Аналогично, за терминатором последнего звена следуют от 50 до 200 нуклеотидов, гомологичных нуклеотиду хромосомы дрожжей для локуса, в который он будет встроен.

Затем каждое звено амплифицируют с помощью ПЦР из плазмидных конструкций, получая Х звеньев линейной ДНК, имеющих перекрывающиеся последовательности. По крайней мере, один из этого гена является ауксотрофным маркером, позволяющим выбрать событие рекомбинации. Все линейные фрагменты трансформируются в дрожжах за один раз, и рекомбинантные дрожжи отбирают для ауксотрофии, связанной с используемым маркером. Целостность последовательности затем проверяют с помощью ПЦР и секвенирования.

Пример 2: Сравнительные примеры для получения эктоина

А. Сначала получают два рекомбинантных штамма: YA3370-20 и YA3371-46. Эти два штамма были рекомбинированы таким образом, чтобы включать только часть модификаций согласно изобретению.

Соответственно, эти два штамма являются следующими:

YA3370-20: ade2, can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4, his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4, hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5, leu2, lyp1::[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2, pyk1::[LEU2.Kl-RS,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF3-AQR1-tRPL41B, pCUR3-PYK1-tPYK1], sam3::[pPDC1-METX.Cg-tRPL3-pTDH3-MHPF.ec-tIDP1]x2, trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6, ura3

YA3371-46: ade2, can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4, his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4, hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5, leu2, lyp1::[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2, pyk1::[LEU2.Kl-RS,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF3-AQR1-tRPL41B, pCUR3-PYK1-tPYK1], sam3::[pCCW12-ECTB.Pa-tRPL3-pTDH3-MHPF.Ec-tRPL41B]x4, trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6, ura3

PEPCK-1 является формой PEPCK, стабилизированной путем модификации аминокислоты аргинина в положении 2 глицином.

PPC-5 является более стабильной формой PPC, в которой был добавлен аланин в N+1.

Все эти штаммы выращивали в течение 24 часов в YE (дрожжевой экстракт) 2% и в глюкозе 8%, и через 8 часов добавляли 500 мкМ CuSO₄. Содержание эктоина в среде анализировали через 24 часа с использованием метода предколоночной дериватизации AccQ-Tag для определения аминокислот с использованием набора для дериватизации AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit от Waters, как рекомендовано производителем.

Количество эктоина, полученное с этими различными штаммами, соответственно:

- YA3370-20: 1 г/л^-1.

- YA3371-46: 1,55 г/л^-1.

Для сравнения, нативный штамм не продуцирует эктоин.

Из этого сравнительного эксперимента следует, что рекомбинантный штамм, содержащий модификации согласно изобретению, продуцирует большее количество эктоина при культивировании в тех же условиях, что и другие рекомбинантные штаммы, не содержащие все генетические модификации согласно изобретению.

B. Также были получены пять других рекомбинантных штаммов: YA3380-40B, YA3595-25 и YA3595-34.

Эти три штамма являются следующими:

YA3380-40B: gnp1::[LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[pACU5-ME3.At- tRPL3 -pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x11, hom6::[ TRP1.Kl, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[LEU2.Kl, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], trp1, ura3

YA3595-25: ade2, gnp1::[LEU2.Kl-RS,pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, hom6::[ TRP1.Kl, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[ pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3 -pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7, trp1, ura3::[ pCCW12-ECTB.Ab- tRPL3 -pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x14

YA3595-34: ade2, gnp1::[LEU2.Kl-RS,pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, hom6::[TRP1.Kl, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[LEU2.Kl, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7, trp1, ura3::[ pCCW12-ECTB.Ab- tRPL3 -pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x9

Штаммы YA3380-40B и YA3595-25 выращивали в течение 24 часов в среде YPA (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 0,01% гемисульфат аденина), 8% глюкозы, 50 мМ (NH₄)₂SO₄ и 0,5 мМ метионина и 0,85 мМ треонина. Содержание эктоина в среде анализировали через 24 часа с использованием метода предколоночной дериватизации AccQ-Tag для определения аминокислот с использованием набора для дериватизации AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit от Waters, как рекомендовано производителем.

PEPCK-1 является формой PEPCK, стабилизированной путем модификации аминокислоты аргинина в положении 2 глицином.

Количество эктоина, полученное с этими двумя штаммами, соответственно:

- YA3380-40B: 211 мг/л^-1.

- YA3595-25: 1,29 г/л^-1.

Для сравнения, нативный штамм не продуцирует эктоин.

Штамм YA3595-34, а также штамм YA3595-25 выращивали в течение 24 часов в среде YPA (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 0,01% гемисульфат аденина), сахароза 8%, 50 мМ (NH₄)₂SO₄ и 0,5 мМ метионина и 0,85 мМ треонина. Содержание эктоина в среде анализировали через 24 часа с использованием метода предколоночной дериватизации AccQ-Tag для определения аминокислот с использованием набора для дериватизации AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit от Waters, как рекомендовано производителем.

Количество эктоина, полученное с этими двумя штаммами, соответственно:

- YA3595-25: 2,63 г/л^-1.

- YA3595-34: 2,58 г/л^-1.

Для сравнения, нативный штамм не продуцирует эктоин.

Из этого сравнительного эксперимента следует, что рекомбинантный штамм, содержащий модификации согласно изобретению, продуцирует большее количество эктоина при культивировании в тех же условиях, что и другие рекомбинантные штаммы, не содержащие все генетические модификации согласно изобретению.

C. Также были получены три других рекомбинантных штамма: YA4440, YA4442 и YA4444.

Эти три штамма являются следующими:

YA4440: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2Δ201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1, pCCW12-GDH2-tRPL3, pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7

YA4442: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2Δ201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1, pCCW12-GDH1-tRPL3, pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7

YA4444: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2Δ201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1, pCCW12-GDH2.Eca-tRPL3, pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7

GDH1 и GDH2 являются эндогенными ферментами Saccharomyces cerevisiae, тогда как GDH2.Eca является ферментом GDH из Entodimium caudatum.

Эти штаммы выращивали в колбах Эрленмейера при 28°С в течение 16 ч в дрожжевом экстракте 2%, сахарозе 8%, метионине 0,5 мМ, треонине 4,2 мМ, мочевине 50 мМ, витамине В5 4 мкМ, витамине В1 6 мкМ, витамине В6 10 мкМ, витамине B10 1,5 мкМ, витамине B3 2,9 мкМ, витамине B2 0,5 мкМ, витамине B8 0,08 мкМ, витамине B9 4,5 нМ, CuSO₄ 500 мкМ. Через 16 часов добавляли 500 мкМ CuSO₄ и 100 мМ мочевины и культуры выращивали в течение еще 8 часов.

Продукцию эктоина затем оценивали по существу, как описано в Ono H, et al. (1999) Journal of Bacteriology, p, 91-99, за исключением того, что эктоин обнаруживали с помощью ВЭЖХ-УФ.

В этих условиях YA4440 продуцировал 6,4 г/л эктоина, YA4442 продуцировал 4,7 г/л эктоина и YA4444 производил 6,1 г/л эктоина. Напоминаем, что в этих же условиях штамм дикого типа (например, нерекомбинантный) не продуцирует определяемое количество эктоина.

Эти три штамма идентичны, но для фермента GDH сверхэкспрессированы. Приведенные выше результаты показывают, что сверхэкспрессия NADH-зависимого GDH (GDH2 в YA4440 и GDH2.Eca в YA4444) позволяет продуцировать больше эктоина, чем сверхэкспрессия NADPH-зависимого GDH (GDH1 в YA4442).

Таким образом, сверхэкспрессия NADH-зависимой глутаматдегидрогеназы позволяет продуцировать больше эктоина, чем сверхкспрессия NADPH-зависимой глутаматдегидрогеназы (GDH1).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АЛЬДЕРИ

<120> ДРОЖЖИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЭКТОИН

<130> PR75767

<150> EP17305910

<151> 2017-07-11

<160> 121

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1583

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)

<220>

<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)

<400> 1

atgccaatgg atttccaacc tacatcaagt cattcgaact gggtcgtgca aaagttcggt 60

ggtacatctg tcggtaaatt tcccgtccaa atagtggatg acattgtgaa gcactattct 120

aaacctgacg gcccaaacaa taatgtcgct gtcgtttgtt ccgcccgttc ttcatacacc 180

aaggctgaag gtaccacttc tcgtcttttg aaatgttgtg atttggcttc gcaagaatct 240

gaatttcaag acattatcga agttatcaga caagaccata tcgataatgc cgaccgcttc 300

attctcaatc ctgccttgca agccaagtta gtggatgata ccaataaaga acttgaactg 360

gtcaagaaat atttaaatgc ttcaaaagtt ttgggtgaag tgagttcacg tacagtagat 420

ctggtgatgt catgtggtga gaagttgagt tgtttgttca tgactgcttt atgtaatgac 480

cgtggctgta aggccaaata tgtggatttg agccacattg ttccctctga tttcagtgcc 540

agcgctttgg ataacagttt ctacactttc ctggttcaag cattgaaaga aaaattggcc 600

ccctttgtaa gtgctaaaga gcgtatcgtt ccagtcttta cagggttttt tggtttagtt 660

ccaactggtc ttctgaatgg tgttggtcgt ggctataccg atttatgtgc cgctttgata 720

gcagttgctg taaatgctga tgaactacaa gtttggaagg aagttgatgg tatatttact 780

gctgatcctc gtaaggttcc tgaagcacgt ttgctagaca gtgttactcc agaagaagct 840

tctgaattaa catattatgg ttccgaagtt atacatcctt ttacgatgga acaagttatt 900

agggctaaga ttcctattag aatcaagaat gttcaaaatc cattaggtaa cggtaccatt 960

atctacccag ataatgtagc aaagaagggt gaatctactc caccacatcc tcctgagaac 1020

ttatcctcat ctttctatga aaagagaaag agaggtgcca ctgctatcac caccaaaaat 1080

gacattttcg tcatcaacat tcattccaat aagaaaaccc tatcccatgg tttcctagct 1140

caaatattta ccatcctgga taagtacaag ttagtcgtag atttaatatc tacttctgaa 1200

gttcatgttt cgatggcttt gcccattcca gatgcagact cattaaaatc tctgagacaa 1260

gctgaggaaa aattgagaat tttaggttct gttgatatca caaagaagtt gtctattgtt 1320

tcattagttg gtaaacatat gaaacaatac atcggcattg ctggtaccat gtttactact 1380

cttgctgaag aaggcatcaa cattgaaatg atttctcaag gggcaaatga aataaacata 1440

tcctgcgtta tcaatgaatc tgactccata aaagcgctac aatgtattca tgccaagtta 1500

ctaagtgagc ggacaaatac ttcaaaccaa tttgaacatg ccattgatga acgtttagaa 1560

caattgaaaa gacttggaat taa 1583

<210> 2

<211> 526

<212> ПРТ

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)

<220>

<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)

<400> 2

Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val Gln

1 5 10 15

Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val Asp

20 25 30

Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn Val

35 40 45

Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly Thr

50 55 60

Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser Glu

65 70 75 80

Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn Ala

85 90 95

Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp Asp

100 105 110

Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser Lys

115 120 125

Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser Cys

130 135 140

Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp Arg

145 150 155 160

Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser Asp

165 170 175

Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val Gln

180 185 190

Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg Ile

195 200 205

Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu Leu

210 215 220

Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile Ala

225 230 235 240

Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp Gly

245 250 255

Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp

260 265 270

Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu

275 280 285

Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile Pro

290 295 300

Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile Ile

305 310 315 320

Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His Pro

325 330 335

Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly Ala

340 345 350

Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His Ser

355 360 365

Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr Ile

370 375 380

Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu Val

385 390 395 400

His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys Ser

405 410 415

Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp Ile

420 425 430

Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys Gln

435 440 445

Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu Gly

450 455 460

Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile Ser

465 470 475 480

Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile His

485 490 495

Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu His

500 505 510

Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile

515 520 525

<210> 3

<211> 1215

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)

<220>

<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)

<400> 3

atggctatta tcgtccaaaa attcggagga actagcgtta aggatgacaa agggagaaag 60

ttggccttag ggcacattaa ggaggcaatt tcagagggtt ataaggtggt tgtagttgta 120

tcggctatgg gtagaaaagg ggacccctac gcgacggact cactattggg tttactttac 180

ggggatcaat cagcaatcag cccaagagag caggatctgc tgctatcatg tggagaaacc 240

atatcctcgg ttgtgttcac cagcatgtta ttagataatg gagtaaaagc agcagccctg 300

acgggagccc aggctggttt tttaaccaac gatcagcata ctaatgcaaa aattatagag 360

atgaagcctg aacgtctttt cagtgttctt gcaaaccacg acgcagttgt cgtcgctgga 420

tttcagggcg ctaccgagaa aggagatact accacaatcg gtagaggtgg ctcggacacg 480

tcagctgcag ccctaggtgc tgctgttgat gcagagtaca tagatatctt tactgacgta 540

gaaggggtga tgaccgcaga tccaagagta gtagaaaatg caaagccact accagtggta 600

acttataccg aaatctgcaa cttggcttac caaggtgcta aggtaatatc tccaagagct 660

gtggaaattg ctatgcaagc aaaggttcct atccgtgtta ggagtactta ttcaaacgat 720

aaaggtacgt tagtaactag tcatcatagt tccaaagttg gctctgacgt ctttgaaagg 780

ttaatcactg gtatcgcaca tgttaaagac gtcactcaat tcaaggtccc ggcgaaaata 840

ggtcaatata acgttcaaac agaagtgttt aaagcgatgg cgaatgccgg tatatctgtc 900

gatttcttta atattacacc ctctgaaata gtatatacag tcgcgggtaa taagactgaa 960

acagctcaaa ggattttgat ggatatgggc tatgatccta tggtcacaag aaattgtgcc 1020

aaggtgtctg ccgtgggtgc tggcattatg ggtgtcccag gtgtgacatc gaaaattgtt 1080

tctgccttat ctgaaaaaga aattccgatt ttgcaatctg ctgattccca tacaacaatt 1140

tgggttttgg ttcatgaagc cgatatggtt cctgctgtta atgccttgca cgaagttttt 1200

gaattgtcca aataa 1215

<210> 4

<211> 404

<212> ПРТ

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)

<220>

<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)

<400> 4

Met Ala Ile Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Lys Asp Asp

1 5 10 15

Lys Gly Arg Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Lys Glu Ala Ile Ser Glu

20 25 30

Gly Tyr Lys Val Val Val Val Val Ser Ala Met Gly Arg Lys Gly Asp

35 40 45

Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Leu Leu Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Gln Ser

50 55 60

Ala Ile Ser Pro Arg Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ser Cys Gly Glu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Val Phe Thr Ser Met Leu Leu Asp Asn Gly Val Lys

85 90 95

Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Leu Thr Asn Asp Gln

100 105 110

His Thr Asn Ala Lys Ile Ile Glu Met Lys Pro Glu Arg Leu Phe Ser

115 120 125

Val Leu Ala Asn His Asp Ala Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Ala

130 135 140

Thr Glu Lys Gly Asp Thr Thr Thr Ile Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Asp Ala Glu Tyr Ile Asp Ile

165 170 175

Phe Thr Asp Val Glu Gly Val Met Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Glu

180 185 190

Asn Ala Lys Pro Leu Pro Val Val Thr Tyr Thr Glu Ile Cys Asn Leu

195 200 205

Ala Tyr Gln Gly Ala Lys Val Ile Ser Pro Arg Ala Val Glu Ile Ala

210 215 220

Met Gln Ala Lys Val Pro Ile Arg Val Arg Ser Thr Tyr Ser Asn Asp

225 230 235 240

Lys Gly Thr Leu Val Thr Ser His His Ser Ser Lys Val Gly Ser Asp

245 250 255

Val Phe Glu Arg Leu Ile Thr Gly Ile Ala His Val Lys Asp Val Thr

260 265 270

Gln Phe Lys Val Pro Ala Lys Ile Gly Gln Tyr Asn Val Gln Thr Glu

275 280 285

Val Phe Lys Ala Met Ala Asn Ala Gly Ile Ser Val Asp Phe Phe Asn

290 295 300

Ile Thr Pro Ser Glu Ile Val Tyr Thr Val Ala Gly Asn Lys Thr Glu

305 310 315 320

Thr Ala Gln Arg Ile Leu Met Asp Met Gly Tyr Asp Pro Met Val Thr

325 330 335

Arg Asn Cys Ala Lys Val Ser Ala Val Gly Ala Gly Ile Met Gly Val

340 345 350

Pro Gly Val Thr Ser Lys Ile Val Ser Ala Leu Ser Glu Lys Glu Ile

355 360 365

Pro Ile Leu Gln Ser Ala Asp Ser His Thr Thr Ile Trp Val Leu Val

370 375 380

His Glu Ala Asp Met Val Pro Ala Val Asn Ala Leu His Glu Val Phe

385 390 395 400

Glu Leu Ser Lys

<210> 5

<211> 1098

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

<220>

<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

<400> 5

atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60

attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctcttctaga 120

tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180

tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240

gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300

ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360

gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420

gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480

ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540

actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatt 600

ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660

aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720

atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780

tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840

gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900

gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960

ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020

tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080

gcaagaaact tgatttaa 1098

<210> 6

<211> 1098

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

<220>

<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

<400> 6

atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60

attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctctgagaga 120

tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180

tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240

gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300

ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360

gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420

gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480

ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540

actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatc 600

ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660

aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720

atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780

tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840

gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900

gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960

ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020

tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080

gcaagaaact tgatttaa 1098

<210> 7

<211> 365

<212> ПРТ

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

<220>

<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)

<400> 7

Met Ala Gly Lys Lys Ile Ala Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Ser Val

1 5 10 15

Gly Gln Arg Phe Ile Leu Leu Leu Ala Asn His Pro His Phe Glu Leu

20 25 30

Lys Val Leu Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ala Gly Lys Lys Tyr Val Asp

35 40 45

Ala Val Asn Trp Lys Gln Thr Asp Leu Leu Pro Glu Ser Ala Thr Asp

50 55 60

Ile Ile Val Ser Glu Cys Lys Ser Glu Phe Phe Lys Glu Cys Asp Ile

65 70 75 80

Val Phe Ser Gly Leu Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Ala Ile Glu Lys Glu

85 90 95

Phe Met Glu Ala Gly Ile Ala Ile Val Ser Asn Ala Lys Asn Tyr Arg

100 105 110

Arg Glu Gln Asp Val Pro Leu Ile Val Pro Val Val Asn Pro Glu His

115 120 125

Leu Asp Ile Val Ala Gln Lys Leu Asp Thr Ala Lys Ala Gln Gly Lys

130 135 140

Pro Arg Pro Gly Phe Ile Ile Cys Ile Ser Asn Cys Ser Thr Ala Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Leu Lys Pro Leu Ile Glu Lys Phe Gly Pro Ile Asp

165 170 175

Ala Leu Thr Thr Thr Thr Leu Gln Ala Ile Ser Gly Ala Gly Phe Ser

180 185 190

Pro Gly Val Pro Gly Ile Asp Ile Leu Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ile

195 200 205

Gly Gly Glu Glu Asp Lys Met Glu Trp Glu Thr Lys Lys Ile Leu Ala

210 215 220

Pro Leu Ala Glu Asp Lys Thr His Val Lys Leu Leu Thr Pro Glu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Val Ser Ala Gln Cys Asn Arg Val Ala Val Ser Asp Gly His

245 250 255

Thr Glu Cys Ile Ser Leu Arg Phe Lys Asn Arg Pro Ala Pro Ser Val

260 265 270

Glu Gln Val Lys Thr Cys Leu Lys Glu Tyr Val Cys Asp Ala Tyr Lys

275 280 285

Leu Gly Cys His Ser Ala Pro Lys Gln Thr Ile His Val Leu Glu Gln

290 295 300

Pro Asp Arg Pro Gln Pro Arg Leu Asp Arg Asn Arg Asp Ser Gly Tyr

305 310 315 320

Gly Val Ser Val Gly Arg Ile Arg Glu Asp Pro Leu Leu Asp Phe Lys

325 330 335

Met Val Val Leu Ser His Asn Thr Ile Ile Gly Ala Ala Gly Ser Gly

340 345 350

Val Leu Ile Ala Glu Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ile

355 360 365

<210> 8

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Pseudomonas aeruginosa

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<400> 8

atggctcacg ttgctacatc agttatcgag gaccaaccct tacgcgccac tcccgcagaa 60

ggcgagactc tgtacgagtt ctcccaatct cctctcttag aacgtcagtc tcgccaagag 120

agcaatgctc gaagctatcc acgtagaata ccacttgcat taaagaaggc ccgaggtctg 180

ctagtggaag acgtcgaagg gaggactttc attgactgtc tcgccggtgc aggaacccta 240

gcattgggac ataatcaccc ggtagttata gaagccatta gacaggttct tgctgatgaa 300

ttgcccttgc acaccttaga tttgacgacc cctgtgaagg accaattcgt ccaggattta 360

tttgggttgc tcccacctgc tttggcagcg gaagccaaga tccaattctg tgggccaaca 420

ggaacagacg cagttgaggc cgctcttaag cttgtgcgga cggcgactgg ccgttctaca 480

atactaagtt ttcaaggagg atatcacgga atgtcccaag gtgcactggg cttgatgggc 540

aacctcggtc caaagaagcc attgggcgca gtactctcaa ccggcgtcca attcctccca 600

tacccgtacg attacagatg tccattcggt ctgggtggcg aagctggagt caaggcgaat 660

ctacattact tagaaaattt gctcaatgat cctgaaggag gtgtacaatt gccggccgct 720

gtcattgttg aagttgtaca aggcgaaggt ggggtcgtgc cagcagattt ggactggtta 780

cgaggattac gtaggattac tgagcaggcc ggtgtagccc ttattgtgga tgaaattcaa 840

tccggctttg cgcgtactgg tcggatgttc gcctttgagc atgccggcat cgtgcctgat 900

gtggtagtgc tttccaaagc tatcggtggc tccctccctt tagctgtggt cgtatatcgg 960

gaatggctag acaagtggca acctggggca catgctggaa ccttcagagg caatcagatg 1020

gcgatggcag ctggcagtgc agtcatgaga tacctaaaag agcatgatct ggcagcccat 1080

gcagccgcca tgggcgaacg actagctgag catctcagga tcttgcagag agactatccg 1140

cagttaggtg atatacgagg ccgcggctta atgttaggtg tcgagatagt agatccgcag 1200

ggcgaagctg acgctctagg tcatccaccc actgacggag ccctggcctc gcgggtacaa 1260

cgggaatgtt tgagaagagg tctcatattg gaattaggcg ggcgacacgg atctgttgta 1320

agattcttgc cacctttgat tattggggca gaacagatag acgaagtggc gcgtagattt 1380

gccagggcat taggagctgc ccttgctggg taa 1413

<210> 9

<211> 1266

<212> ДНК

<213> Halomonas elongata

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<400> 9

atgcagacac aaatcttgga acgtatggaa tccgacgtca gaacgtactc aagatctttc 60

cctgtagtct ttaccaaggc gcgaaatgct cgacttaccg acgaagaagg gcgagagtac 120

atagacttcc tagcaggcgc tggtacgcta aattatgggc ataacaatcc acacctgaag 180

caagcattac tcgactacat tgattcagac ggcattgtcc atggtctgga tttctggacc 240

gcggcaaagc gcgattacct tgagacactc gaagaggtca ttttgaaacc gcgtggtttg 300

gactataagg ttcacttacc gggcccaacg ggcaccaatg cagttgaagc cgccattcgt 360

ttggccaggg tcgccaaagg tcgtcataat attgtctctt ttacaaatgg ctttcacggt 420

gttactatgg gcgctctggc gacgaccggt aacagaaagt ttcgggaagc gacaggtggc 480

gtccctactc aggcagcgag cttcatgcca tttgacgggt atcttggctc ttccactgat 540

acacttgatt acttcgaaaa gttattgggt gataagtcag gtgggcttga tgtgccagcc 600

gcggtaatag ttgaaacagt ccaaggagaa ggcggaataa acgttgcggg acttgagtgg 660

ctcaagagat tagaaagcat ttgtagagca aatgatattt tgttaatcat cgatgatata 720

caagccggct gcggaagaac tggaaagttc ttctcattcg aacatgctgg tattactcct 780

gatattgtca caaactcgaa atctttgtca ggatatggtt tgccctttgc tcatgtgctt 840

atgagaccgg agcttgataa atggaaacca ggacaatata acggaacatt ccggggtttc 900

aatctagctt tcgcgaccgc tgctgcagca atgaggaaat actggtcgga cgatacgttt 960

gaacgagacg ttcaaaggaa agctagaata gttgaggaaa gatttggtaa aatcgcagct 1020

tggctttctg aaaacggtat tgaagcttcc gaacggggta ggggtttgat gagaggtatc 1080

gacgttggtt ctggggacat agcagataaa attacgcatc aagcgtttga aaatggttta 1140

atcatcgaaa caagtggtca agatggtgag gttgttaaat gcttatgccc cttaaccata 1200

ccagatgaag atttagtaga aggtttagac atattagaaa ctagcacaaa acaagccttc 1260

tcttaa 1266

<210> 10

<211> 470

<212> ПРТ

<213> Pseudomonas aeruginosa

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<400> 10

Met Ala His Val Ala Thr Ser Val Ile Glu Asp Gln Pro Leu Arg Ala

1 5 10 15

Thr Pro Ala Glu Gly Glu Thr Leu Tyr Glu Phe Ser Gln Ser Pro Leu

20 25 30

Leu Glu Arg Gln Ser Arg Gln Glu Ser Asn Ala Arg Ser Tyr Pro Arg

35 40 45

Arg Ile Pro Leu Ala Leu Lys Lys Ala Arg Gly Leu Leu Val Glu Asp

50 55 60

Val Glu Gly Arg Thr Phe Ile Asp Cys Leu Ala Gly Ala Gly Thr Leu

65 70 75 80

Ala Leu Gly His Asn His Pro Val Val Ile Glu Ala Ile Arg Gln Val

85 90 95

Leu Ala Asp Glu Leu Pro Leu His Thr Leu Asp Leu Thr Thr Pro Val

100 105 110

Lys Asp Gln Phe Val Gln Asp Leu Phe Gly Leu Leu Pro Pro Ala Leu

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Lys Ile Gln Phe Cys Gly Pro Thr Gly Thr Asp Ala

130 135 140

Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu Val Arg Thr Ala Thr Gly Arg Ser Thr

145 150 155 160

Ile Leu Ser Phe Gln Gly Gly Tyr His Gly Met Ser Gln Gly Ala Leu

165 170 175

Gly Leu Met Gly Asn Leu Gly Pro Lys Lys Pro Leu Gly Ala Val Leu

180 185 190

Ser Thr Gly Val Gln Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Tyr Arg Cys Pro

195 200 205

Phe Gly Leu Gly Gly Glu Ala Gly Val Lys Ala Asn Leu His Tyr Leu

210 215 220

Glu Asn Leu Leu Asn Asp Pro Glu Gly Gly Val Gln Leu Pro Ala Ala

225 230 235 240

Val Ile Val Glu Val Val Gln Gly Glu Gly Gly Val Val Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Asp Trp Leu Arg Gly Leu Arg Arg Ile Thr Glu Gln Ala Gly Val

260 265 270

Ala Leu Ile Val Asp Glu Ile Gln Ser Gly Phe Ala Arg Thr Gly Arg

275 280 285

Met Phe Ala Phe Glu His Ala Gly Ile Val Pro Asp Val Val Val Leu

290 295 300

Ser Lys Ala Ile Gly Gly Ser Leu Pro Leu Ala Val Val Val Tyr Arg

305 310 315 320

Glu Trp Leu Asp Lys Trp Gln Pro Gly Ala His Ala Gly Thr Phe Arg

325 330 335

Gly Asn Gln Met Ala Met Ala Ala Gly Ser Ala Val Met Arg Tyr Leu

340 345 350

Lys Glu His Asp Leu Ala Ala His Ala Ala Ala Met Gly Glu Arg Leu

355 360 365

Ala Glu His Leu Arg Ile Leu Gln Arg Asp Tyr Pro Gln Leu Gly Asp

370 375 380

Ile Arg Gly Arg Gly Leu Met Leu Gly Val Glu Ile Val Asp Pro Gln

385 390 395 400

Gly Glu Ala Asp Ala Leu Gly His Pro Pro Thr Asp Gly Ala Leu Ala

405 410 415

Ser Arg Val Gln Arg Glu Cys Leu Arg Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu

420 425 430

Gly Gly Arg His Gly Ser Val Val Arg Phe Leu Pro Pro Leu Ile Ile

435 440 445

Gly Ala Glu Gln Ile Asp Glu Val Ala Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu

450 455 460

Gly Ala Ala Leu Ala Gly

465 470

<210> 11

<211> 421

<212> ПРТ

<213> Halomonas elongata

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<220>

<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)

<400> 11

Met Gln Thr Gln Ile Leu Glu Arg Met Glu Ser Asp Val Arg Thr Tyr

1 5 10 15

Ser Arg Ser Phe Pro Val Val Phe Thr Lys Ala Arg Asn Ala Arg Leu

20 25 30

Thr Asp Glu Glu Gly Arg Glu Tyr Ile Asp Phe Leu Ala Gly Ala Gly

35 40 45

Thr Leu Asn Tyr Gly His Asn Asn Pro His Leu Lys Gln Ala Leu Leu

50 55 60

Asp Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Ile Val His Gly Leu Asp Phe Trp Thr

65 70 75 80

Ala Ala Lys Arg Asp Tyr Leu Glu Thr Leu Glu Glu Val Ile Leu Lys

85 90 95

Pro Arg Gly Leu Asp Tyr Lys Val His Leu Pro Gly Pro Thr Gly Thr

100 105 110

Asn Ala Val Glu Ala Ala Ile Arg Leu Ala Arg Val Ala Lys Gly Arg

115 120 125

His Asn Ile Val Ser Phe Thr Asn Gly Phe His Gly Val Thr Met Gly

130 135 140

Ala Leu Ala Thr Thr Gly Asn Arg Lys Phe Arg Glu Ala Thr Gly Gly

145 150 155 160

Val Pro Thr Gln Ala Ala Ser Phe Met Pro Phe Asp Gly Tyr Leu Gly

165 170 175

Ser Ser Thr Asp Thr Leu Asp Tyr Phe Glu Lys Leu Leu Gly Asp Lys

180 185 190

Ser Gly Gly Leu Asp Val Pro Ala Ala Val Ile Val Glu Thr Val Gln

195 200 205

Gly Glu Gly Gly Ile Asn Val Ala Gly Leu Glu Trp Leu Lys Arg Leu

210 215 220

Glu Ser Ile Cys Arg Ala Asn Asp Ile Leu Leu Ile Ile Asp Asp Ile

225 230 235 240

Gln Ala Gly Cys Gly Arg Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Glu His Ala

245 250 255

Gly Ile Thr Pro Asp Ile Val Thr Asn Ser Lys Ser Leu Ser Gly Tyr

260 265 270

Gly Leu Pro Phe Ala His Val Leu Met Arg Pro Glu Leu Asp Lys Trp

275 280 285

Lys Pro Gly Gln Tyr Asn Gly Thr Phe Arg Gly Phe Asn Leu Ala Phe

290 295 300

Ala Thr Ala Ala Ala Ala Met Arg Lys Tyr Trp Ser Asp Asp Thr Phe

305 310 315 320

Glu Arg Asp Val Gln Arg Lys Ala Arg Ile Val Glu Glu Arg Phe Gly

325 330 335

Lys Ile Ala Ala Trp Leu Ser Glu Asn Gly Ile Glu Ala Ser Glu Arg

340 345 350

Gly Arg Gly Leu Met Arg Gly Ile Asp Val Gly Ser Gly Asp Ile Ala

355 360 365

Asp Lys Ile Thr His Gln Ala Phe Glu Asn Gly Leu Ile Ile Glu Thr

370 375 380

Ser Gly Gln Asp Gly Glu Val Val Lys Cys Leu Cys Pro Leu Thr Ile

385 390 395 400

Pro Asp Glu Asp Leu Val Glu Gly Leu Asp Ile Leu Glu Thr Ser Thr

405 410 415

Lys Gln Ala Phe Ser

420

<210> 12

<211> 1461

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)

<220>

<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)

<400> 12

atgtcgcata ctttaaaatc gaaaacgctc caagagctgg acattgagga gattaaggaa 60

actaacccat tgctcaaact agttcaaggg cagaggattg ttcaagttcc ggaactagtg 120

cttgagtctg gcgtggtcat aaataatttc cctattgctt ataagacgtg gggtacactg 180

aatgaagctg gtgataatgt tctggtaatt tgtcatgcct tgactgggtc cgcagatgtt 240

gctgactggt ggggccctct tctgggtaac gacttagcat tcgacccatc aaggtttttt 300

atcatatgtt taaactctat gggctctcca tatgggtctt tttcgccatt aacgataaat 360

gaggagacgg gcgttagata tggacccgaa ttcccattat gtactgtgcg cgatgacgtt 420

agagctcaca gaattgttct ggattctctg ggagtaaagt caatagcctg tgttattggt 480

ggctctatgg gggggatgct gagtttggaa tgggctgcca tgtatggtaa ggaatatgtg 540

aagaatatgg ttgctctggc gacatcagca agacattctg cctggtgcat atcgtggtct 600

gaggctcaaa gacaatcgat ttactcagat cccaactact tggacgggta ctatccggta 660

gaggagcaac ctgtggccgg actatcggct gcacgtatgt ctgcattgtt gacgtacagg 720

acaagaaaca gtttcgagaa caaattctcc agaagatctc cttcaatagc acaacaacaa 780

aaagctcaaa gggaggagac acgcaaacca tctactgtca gcgaacactc cctacaaatc 840

cacaatgatg ggtataaaac aaaagccagc actgccatcg ctggcatttc tgggcaaaaa 900

ggtcaaagcg tggtgtccac cgcatcttct tcggattcat tgaattcttc aacatcgatg 960

acttcggtaa gttctgtaac gggtgaagtg aaggacataa agcctgcgca gacgtatttt 1020

tctgcacaaa gttacttgag gtaccagggc acaaagttca tcaataggtt cgacgccaat 1080

tgttacattg ccatcacacg taaactggat acgcacgatt tggcaagaga cagagtagat 1140

gacatcactg aggtcctttc taccatccaa caaccatccc tgatcatcgg tatccaatct 1200

gatggactgt tcacatattc agaacaagaa tttttggctg agcacatacc gaagtcgcaa 1260

ttagaaaaaa ttgaatctcc cgaaggccac gatgccttcc tattggagtt taagctgata 1320

aacaaactga tagtacaatt tttaaaaacc aactgcaagg ccattaccga tgccgctcca 1380

agagcttggg gaggtgacgt tggtaacgat gaaacgaaga cgtctgtctt tggtgaggcc 1440

gaagaagtta ccaactggta g 1461

<210> 13

<211> 486

<212> ПРТ

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)

<220>

<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)

<400> 13

Met Ser His Thr Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Glu

1 5 10 15

Glu Ile Lys Glu Thr Asn Pro Leu Leu Lys Leu Val Gln Gly Gln Arg

20 25 30

Ile Val Gln Val Pro Glu Leu Val Leu Glu Ser Gly Val Val Ile Asn

35 40 45

Asn Phe Pro Ile Ala Tyr Lys Thr Trp Gly Thr Leu Asn Glu Ala Gly

50 55 60

Asp Asn Val Leu Val Ile Cys His Ala Leu Thr Gly Ser Ala Asp Val

65 70 75 80

Ala Asp Trp Trp Gly Pro Leu Leu Gly Asn Asp Leu Ala Phe Asp Pro

85 90 95

Ser Arg Phe Phe Ile Ile Cys Leu Asn Ser Met Gly Ser Pro Tyr Gly

100 105 110

Ser Phe Ser Pro Leu Thr Ile Asn Glu Glu Thr Gly Val Arg Tyr Gly

115 120 125

Pro Glu Phe Pro Leu Cys Thr Val Arg Asp Asp Val Arg Ala His Arg

130 135 140

Ile Val Leu Asp Ser Leu Gly Val Lys Ser Ile Ala Cys Val Ile Gly

145 150 155 160

Gly Ser Met Gly Gly Met Leu Ser Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Gly

165 170 175

Lys Glu Tyr Val Lys Asn Met Val Ala Leu Ala Thr Ser Ala Arg His

180 185 190

Ser Ala Trp Cys Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Arg Gln Ser Ile Tyr

195 200 205

Ser Asp Pro Asn Tyr Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Glu Glu Gln Pro

210 215 220

Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Arg Met Ser Ala Leu Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Thr Arg Asn Ser Phe Glu Asn Lys Phe Ser Arg Arg Ser Pro Ser Ile

245 250 255

Ala Gln Gln Gln Lys Ala Gln Arg Glu Glu Thr Arg Lys Pro Ser Thr

260 265 270

Val Ser Glu His Ser Leu Gln Ile His Asn Asp Gly Tyr Lys Thr Lys

275 280 285

Ala Ser Thr Ala Ile Ala Gly Ile Ser Gly Gln Lys Gly Gln Ser Val

290 295 300

Val Ser Thr Ala Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Ser Ser Thr Ser Met

305 310 315 320

Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Gly Glu Val Lys Asp Ile Lys Pro Ala

325 330 335

Gln Thr Tyr Phe Ser Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Thr Lys

340 345 350

Phe Ile Asn Arg Phe Asp Ala Asn Cys Tyr Ile Ala Ile Thr Arg Lys

355 360 365

Leu Asp Thr His Asp Leu Ala Arg Asp Arg Val Asp Asp Ile Thr Glu

370 375 380

Val Leu Ser Thr Ile Gln Gln Pro Ser Leu Ile Ile Gly Ile Gln Ser

385 390 395 400

Asp Gly Leu Phe Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Phe Leu Ala Glu His Ile

405 410 415

Pro Lys Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Ser Pro Glu Gly His Asp Ala

420 425 430

Phe Leu Leu Glu Phe Lys Leu Ile Asn Lys Leu Ile Val Gln Phe Leu

435 440 445

Lys Thr Asn Cys Lys Ala Ile Thr Asp Ala Ala Pro Arg Ala Trp Gly

450 455 460

Gly Asp Val Gly Asn Asp Glu Thr Lys Thr Ser Val Phe Gly Glu Ala

465 470 475 480

Glu Glu Val Thr Asn Trp

485

<210> 14

<211> 579

<212> ДНК

<213> Halomonas elongata

<220>

<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)

<220>

<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)

<400> 14

atgactccca caacagaaaa ttttactcct agtgcagatc tggctcgccc ttcagtggct 60

gacaccgtta ttggctccgc caagaaaaca ctattcatca gaaagcctac cacggacgat 120

ggttggggta tctacgagtt agttaaggcg tgcccaccct tggacgtaaa ctctggatac 180

gcttacttat tattagccac gcaatttagg gatacgtgtg ctgtcgctac cgacgaggaa 240

ggggagatcg ttggctttgt atcaggatac gttaagcgta acgcacctga tacctatttt 300

ctatggcaag ttgctgtggg cgaaaaggct cgtgggacgg gtcttgcaag aagattagtc 360

gaagccgtat tgatgagacc aggtatggga gatgtccggc acctggagac taccataact 420

cctgataacg aagcaagctg gggtctcttt aaacgacttg ccgatagatg gcaagcgcca 480

ttgaattcta gggaatattt ctctactggt cagttgggtg gtgaacatga tccggaaaat 540

ctggtgagaa ttggaccgtt cgaaccacag caaatttaa 579

<210> 15

<211> 192

<212> ПРТ

<213> Halomonas elongata

<220>

<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)

<220>

<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)

<400> 15

Met Thr Pro Thr Thr Glu Asn Phe Thr Pro Ser Ala Asp Leu Ala Arg

1 5 10 15

Pro Ser Val Ala Asp Thr Val Ile Gly Ser Ala Lys Lys Thr Leu Phe

20 25 30

Ile Arg Lys Pro Thr Thr Asp Asp Gly Trp Gly Ile Tyr Glu Leu Val

35 40 45

Lys Ala Cys Pro Pro Leu Asp Val Asn Ser Gly Tyr Ala Tyr Leu Leu

50 55 60

Leu Ala Thr Gln Phe Arg Asp Thr Cys Ala Val Ala Thr Asp Glu Glu

65 70 75 80

Gly Glu Ile Val Gly Phe Val Ser Gly Tyr Val Lys Arg Asn Ala Pro

85 90 95

Asp Thr Tyr Phe Leu Trp Gln Val Ala Val Gly Glu Lys Ala Arg Gly

100 105 110

Thr Gly Leu Ala Arg Arg Leu Val Glu Ala Val Leu Met Arg Pro Gly

115 120 125

Met Gly Asp Val Arg His Leu Glu Thr Thr Ile Thr Pro Asp Asn Glu

130 135 140

Ala Ser Trp Gly Leu Phe Lys Arg Leu Ala Asp Arg Trp Gln Ala Pro

145 150 155 160

Leu Asn Ser Arg Glu Tyr Phe Ser Thr Gly Gln Leu Gly Gly Glu His

165 170 175

Asp Pro Glu Asn Leu Val Arg Ile Gly Pro Phe Glu Pro Gln Gln Ile

180 185 190

<210> 16

<211> 414

<212> ДНК

<213> Halomonas elongata

<220>

<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)

<220>

<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)

<400> 16

atgatagttc gtaacctgga ggaagctagg caaacagata gattagtgac cgctgagaat 60

ggcaactggg acagtaccag attatcatta gctgaggacg gaggtaattg ttcttttcac 120

attaccagaa tatttgaagg gactgaaact cacatacact acaagcatca ctttgaagcc 180

gtttactgca tcgagggtga aggagaagtc gaaaccctcg ctgatggaaa gatctggccc 240

ataaaacctg gggatattta tattttggat cagcatgacg aacatttgct tagggcttcg 300

aaaactatgc atctagcatg cgtattcacg ccgggtctaa ctggtaatga agttcatcga 360

gaagacggtt cctatgcacc agcggatgaa gcagatgatc agaaaccact ttaa 414

<210> 17

<211> 137

<212> ПРТ

<213> Halomonas elongata

<220>

<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)

<220>

<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)

<400> 17

Met Ile Val Arg Asn Leu Glu Glu Ala Arg Gln Thr Asp Arg Leu Val

1 5 10 15

Thr Ala Glu Asn Gly Asn Trp Asp Ser Thr Arg Leu Ser Leu Ala Glu

20 25 30

Asp Gly Gly Asn Cys Ser Phe His Ile Thr Arg Ile Phe Glu Gly Thr

35 40 45

Glu Thr His Ile His Tyr Lys His His Phe Glu Ala Val Tyr Cys Ile

50 55 60

Glu Gly Glu Gly Glu Val Glu Thr Leu Ala Asp Gly Lys Ile Trp Pro

65 70 75 80

Ile Lys Pro Gly Asp Ile Tyr Ile Leu Asp Gln His Asp Glu His Leu

85 90 95

Leu Arg Ala Ser Lys Thr Met His Leu Ala Cys Val Phe Thr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Gly Asn Glu Val His Arg Glu Asp Gly Ser Tyr Ala Pro Ala

115 120 125

Asp Glu Ala Asp Asp Gln Lys Pro Leu

130 135

<210> 18

<211> 1080

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)

<220>

<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)

<400> 18

atgagcacta aagttgttaa tgttgccgtt atcggtgccg gtgttgttgg ttcagctttc 60

ttggatcaat tgttagccat gaagtctacc attacttaca atctagttct tttggctgaa 120

gctgagcgtt ctttaatctc caaggacttt tctccattaa atgttggttc tgattggaag 180

gctgctttag cagcctccac tactaaaacg ttgcctttgg atgatttaat tgctcatttg 240

aagacttcac ctaagccagt cattttggtt gataacactt ccagcgctta cattgctggt 300

ttttacacta agtttgtcga aaatggtatt tccattgcta ctccaaacaa gaaggccttt 360

tcctctgatt tggctacctg gaaggctctt ttctcaaata agccaactaa cggttttgtc 420

tatcatgaag ctaccgtcgg tgctggtttg cctatcatca gtttcttaag agaaattatt 480

caaaccggtg acgaagttga aaaaattgaa ggtatcttct ctggtactct atcttatatt 540

ttcaacgagt tctccactag tcaagctaac gacgtcaaat tctctgatgt tgtcaaagtt 600

gctaaaaaat tgggttatac tgaaccagat ccaagagatg atttgaatgg gttggatgtt 660

gctagaaagg ttaccattgt tggtaggata tctggtgtgg aagttgaatc tccaacttcc 720

ttccctgtcc agtctttgat tccaaaacca ttggaatctg tcaagtctgc tgatgaattc 780

ttggaaaaat tatctgatta cgataaagat ttgactcaat tgaagaagga agctgccact 840

gaaaataagg tattgagatt cattggtaaa gtcgatgttg ccaccaaatc tgtgtctgta 900

ggaattgaaa agtacgatta ctcacaccca ttcgcatcat tgaagggatc agataacgtt 960

atttccatca agactaagcg ttacaccaat cctgttgtca ttcaaggtgc cggtgccggt 1020

gctgccgtta ctgccgctgg tgttttgggt gatgttatca agattgctca aagactttaa 1080

<210> 19

<211> 308

<212> ПРТ

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)

<220>

<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)

<400> 19

Met Ser Thr Lys Val Val Asn Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Val

1 5 10 15

Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Glu Ala Glu Arg Ser Leu Ile Ser Lys

35 40 45

Asp Phe Ser Pro Leu Asn Val Gly Ser Asp Trp Lys Ala Ala Leu Ala

50 55 60

Ala Ser Thr Thr Lys Thr Leu Pro Leu Asp Asp Leu Ile Ala His Leu

65 70 75 80

Lys Thr Ser Pro Lys Pro Val Ile Leu Val Asp Asn Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Tyr Ile Ala Gly Phe Tyr Thr Lys Phe Val Glu Asn Gly Ile Ser Ile

100 105 110

Ala Thr Pro Asn Lys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Lys

115 120 125

Ala Leu Phe Ser Asn Lys Pro Thr Asn Gly Phe Val Tyr His Glu Ala

130 135 140

Thr Val Gly Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Phe Leu Arg Glu Ile Ile

145 150 155 160

Gln Thr Gly Asp Glu Val Glu Lys Ile Glu Gly Ile Phe Ser Gly Thr

165 170 175

Leu Ser Tyr Ile Phe Asn Glu Phe Ser Thr Ser Gln Ala Asn Asp Val

180 185 190

Lys Phe Ser Asp Val Val Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Tyr Thr Glu

195 200 205

Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu Asn Gly Leu Asp Val Ala Arg Lys Val

210 215 220

Thr Ile Val Gly Arg Ile Ser Gly Val Glu Val Glu Ser Pro Thr Ser

225 230 235 240

Phe Pro Val Gln Ser Leu Ile Pro Lys Pro Leu Glu Ser Val Lys Ser

245 250 255

Ala Asp Glu Phe Leu Glu Lys Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Asp Leu Thr

260 265 270

Gln Leu Lys Lys Glu Ala Ala Thr Glu Asn Lys Val Leu Arg Phe Ile

275 280 285

Gly Lys Val Asp Val Ala Thr Lys Ser Val Ser Val Gly Ile Glu Lys

290 295 300

Tyr Asp Tyr Ser

305

<210> 20

<211> 1257

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)

<220>

<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)

<400> 20

atgtctgcca ctctgttcaa taacatcgaa ttgctgcccc ctgatgccct ttttggtatt 60

aagcaaaggt acgggcaaga tcaacgtgct accaaggtcg acttgggtat cggggcctac 120

agagacgaca acggtaaacc atgggtcttg ccaagtgtta aagccgccga aaagctaatt 180

cataacgaca gctcctacaa ccatgaatac ctcggtatta ccggtctgcc aagtttgaca 240

tctaacgccg ccaagatcat cttcggtacg caatccgatg cctttcagga agacagagta 300

atctcagtac aatcactgtc tggtacgggt gctcttcata tatctgcgaa gtttttttca 360

aaattcttcc cagataaact ggtctatttg tctaagccta cttgggccaa ccacatggcc 420

atttttgaga atcaaggctt gaaaacggcg acttaccctt actgggccaa cgaaactaag 480

tctttggacc taaacggctt tctaaatgct attcaaaaag ctccagaggg ctccattttc 540

gttctgcact cttgcgccca taacccaact ggtctggacc ctactagtga acaatgggtt 600

caaatcgttg atgctatcgc ctcaaagaac cacatcgcct tatttgacac cgcctaccaa 660

gggtttgcca ctggagattt ggacaaggat gcctatgctg tgcgtctagg tgtggagaag 720

ctttcaacgg tctctcccgt ctttgtctgt cagtcctttg ccaagaacgc cggtatgtac 780

ggtgagcgtg taggttgttt ccatctagca cttacaaaac aagctcaaaa caaaactata 840

aagcctgctg ttacatctca attggccaaa atcattcgta gtgaagtgtc caacccaccc 900

gcctacggcg ctaagattgt cgctaaactg ttggaaacgc cagaattaac ggaacagtgg 960

cacaaggata tggttaccat gtcctccaga attacgaaaa tgaggcacgc attaagagac 1020

catttagtca agttgggcac tcctggcaac tgggatcata tagtaaatca atgcgggatg 1080

ttctccttta cagggttgac tcctcaaatg gttaaacgac ttgaagaaac ccacgcagtt 1140

tacttggttg cctcaggtag agcttctatt gctggattga atcaaggaaa cgtggaatac 1200

gtggctaaag ccattgatga agtggtgcgc ttctatacta ttgaagctaa attgtaa 1257

<210> 21

<211> 418

<212> ПРТ

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)

<220>

<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)

<400> 21

Met Ser Ala Thr Leu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Pro Pro Asp Ala

1 5 10 15

Leu Phe Gly Ile Lys Gln Arg Tyr Gly Gln Asp Gln Arg Ala Thr Lys

20 25 30

Val Asp Leu Gly Ile Gly Ala Tyr Arg Asp Asp Asn Gly Lys Pro Trp

35 40 45

Val Leu Pro Ser Val Lys Ala Ala Glu Lys Leu Ile His Asn Asp Ser

50 55 60

Ser Tyr Asn His Glu Tyr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Pro Ser Leu Thr

65 70 75 80

Ser Asn Ala Ala Lys Ile Ile Phe Gly Thr Gln Ser Asp Ala Phe Gln

85 90 95

Glu Asp Arg Val Ile Ser Val Gln Ser Leu Ser Gly Thr Gly Ala Leu

100 105 110

His Ile Ser Ala Lys Phe Phe Ser Lys Phe Phe Pro Asp Lys Leu Val

115 120 125

Tyr Leu Ser Lys Pro Thr Trp Ala Asn His Met Ala Ile Phe Glu Asn

130 135 140

Gln Gly Leu Lys Thr Ala Thr Tyr Pro Tyr Trp Ala Asn Glu Thr Lys

145 150 155 160

Ser Leu Asp Leu Asn Gly Phe Leu Asn Ala Ile Gln Lys Ala Pro Glu

165 170 175

Gly Ser Ile Phe Val Leu His Ser Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Leu

180 185 190

Asp Pro Thr Ser Glu Gln Trp Val Gln Ile Val Asp Ala Ile Ala Ser

195 200 205

Lys Asn His Ile Ala Leu Phe Asp Thr Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Thr

210 215 220

Gly Asp Leu Asp Lys Asp Ala Tyr Ala Val Arg Leu Gly Val Glu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Thr Val Ser Pro Val Phe Val Cys Gln Ser Phe Ala Lys Asn

245 250 255

Ala Gly Met Tyr Gly Glu Arg Val Gly Cys Phe His Leu Ala Leu Thr

260 265 270

Lys Gln Ala Gln Asn Lys Thr Ile Lys Pro Ala Val Thr Ser Gln Leu

275 280 285

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Glu Val Ser Asn Pro Pro Ala Tyr Gly Ala

290 295 300

Lys Ile Val Ala Lys Leu Leu Glu Thr Pro Glu Leu Thr Glu Gln Trp

305 310 315 320

His Lys Asp Met Val Thr Met Ser Ser Arg Ile Thr Lys Met Arg His

325 330 335

Ala Leu Arg Asp His Leu Val Lys Leu Gly Thr Pro Gly Asn Trp Asp

340 345 350

His Ile Val Asn Gln Cys Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Thr Pro

355 360 365

Gln Met Val Lys Arg Leu Glu Glu Thr His Ala Val Tyr Leu Val Ala

370 375 380

Ser Gly Arg Ala Ser Ile Ala Gly Leu Asn Gln Gly Asn Val Glu Tyr

385 390 395 400

Val Ala Lys Ala Ile Asp Glu Val Val Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ala

405 410 415

Lys Leu

<210> 22

<211> 1317

<212> ДНК

<213> Entodinium caudatum

<220>

<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)

<220>

<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)

<400> 22

atgatagatt tagaagcgag aaaccctgct caacccgaat tcattcaagc cagtagagaa 60

gtaatcgaat cgatcattga tgttgttaat agcaatccga aatacctgga aaacaaaatt 120

ttggagagaa ttacggaacc aaacctaatt cacgaattca aagtcgaatg ggagaatgac 180

aagcacgaaa tcatggtgaa caaaggttat cgtattcagt tcaataatgc gataggtccc 240

tataagggag gcctaaggtt tcacagagca gtcactctag gtactctgaa attccttggt 300

tttgaacaga tatttaagaa ttccttgaca ggattaccta tgggaggtgg caaaggtggt 360

tcagattttg atcctagagg taaatcagat gccgagattt taagattctg taggtctttt 420

atgacttcgt tgttcaaata tattgggcca gagatagatg ttcctgctgg agatataggt 480

gtcggaggta gggaaattgg ttacttgttt ggccaataca aaagactgac ccaacaacat 540

gaaggagttc taactggtaa gggtcttaac tggggtggct ctcttgttag acctgaagcc 600

acaggttttg gaacgatgta ttttgctaac gaagtcttac atgcacatgg tgacgacatc 660

aaggggaaaa ccattgccat atccggattt ggtaatgttg cctttggtgc tgtcttaaaa 720

gcgaaacaat taggcgctaa ggtagtcact atatctggcc cagatggtta catttatgac 780

gagaatggga taaacaccga cgagaaaatc aactacatgt tggaattaag agcctcaaat 840

aatgatgtgg ttgcgccatt tgcagagaag tttggtgcaa aattcatacc agggaagaag 900

ccatgggaag ttccagtgga tatggctttt ccctgtgcca ttcagaacga attgaatgcc 960

gaagatgctg ccactttaca taagaatgga gtgaaatatg tgatcgagac atccaatatg 1020

ggctgtacag cagatgctgt gcaatacttc attaagaacc gtattgtttt cgctccgggt 1080

aaagcagcta atgctggtgg tgttgcagta tctgggttgg aaatgagcca aaactcaatg 1140

aagttgaact ggacagctga agaagttgac gctaaattga agaatatcat gaccaatatt 1200

catgcaagtt gcgtaaagga aggaaaagag agtgacgggt atatcaatta cgttaaaggc 1260

gcaaatatag caggcttcaa gaaagtagct gatgcaatgg tagatcttgg ctattaa 1317

<210> 23

<211> 438

<212> ПРТ

<213> Entodinium caudatum

<220>

<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)

<220>

<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)

<400> 23

Met Ile Asp Leu Glu Ala Arg Asn Pro Ala Gln Pro Glu Phe Ile Gln

1 5 10 15

Ala Ser Arg Glu Val Ile Glu Ser Ile Ile Asp Val Val Asn Ser Asn

20 25 30

Pro Lys Tyr Leu Glu Asn Lys Ile Leu Glu Arg Ile Thr Glu Pro Asn

35 40 45

Leu Ile His Glu Phe Lys Val Glu Trp Glu Asn Asp Lys His Glu Ile

50 55 60

Met Val Asn Lys Gly Tyr Arg Ile Gln Phe Asn Asn Ala Ile Gly Pro

65 70 75 80

Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Arg Ala Val Thr Leu Gly Thr Leu

85 90 95

Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu

100 105 110

Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Arg Gly Lys

115 120 125

Ser Asp Ala Glu Ile Leu Arg Phe Cys Arg Ser Phe Met Thr Ser Leu

130 135 140

Phe Lys Tyr Ile Gly Pro Glu Ile Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly

145 150 155 160

Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu

165 170 175

Thr Gln Gln His Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Asn Trp Gly

180 185 190

Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu Ala Thr Gly Phe Gly Thr Met Tyr Phe

195 200 205

Ala Asn Glu Val Leu His Ala His Gly Asp Asp Ile Lys Gly Lys Thr

210 215 220

Ile Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn Val Ala Phe Gly Ala Val Leu Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gln Leu Gly Ala Lys Val Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly

245 250 255

Tyr Ile Tyr Asp Glu Asn Gly Ile Asn Thr Asp Glu Lys Ile Asn Tyr

260 265 270

Met Leu Glu Leu Arg Ala Ser Asn Asn Asp Val Val Ala Pro Phe Ala

275 280 285

Glu Lys Phe Gly Ala Lys Phe Ile Pro Gly Lys Lys Pro Trp Glu Val

290 295 300

Pro Val Asp Met Ala Phe Pro Cys Ala Ile Gln Asn Glu Leu Asn Ala

305 310 315 320

Glu Asp Ala Ala Thr Leu His Lys Asn Gly Val Lys Tyr Val Ile Glu

325 330 335

Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Ala Asp Ala Val Gln Tyr Phe Ile Lys

340 345 350

Asn Arg Ile Val Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val

355 360 365

Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ser Met Lys Leu Asn Trp

370 375 380

Thr Ala Glu Glu Val Asp Ala Lys Leu Lys Asn Ile Met Thr Asn Ile

385 390 395 400

His Ala Ser Cys Val Lys Glu Gly Lys Glu Ser Asp Gly Tyr Ile Asn

405 410 415

Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala

420 425 430

Met Val Asp Leu Gly Tyr

435

<210> 24

<211> 554

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pTDH3" <223> "pTDH3

<220>

<223> pTDH3

<220>

<223> pTDH3

<400> 24

ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 60

tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 120

aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 180

tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 240

ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 300

ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 360

aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 420

agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 480

tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca 540

cataaacaaa caaa 554

<210> 25

<211> 550

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pENO2" <223> "pENO2

<220>

<223> pENO2

<220>

<223> pENO2

<400> 25

cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac 60

caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa aactggcatc cactaattga tacatctaca 120

caccgcacgc cttttttctg aagcccactt tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg 180

aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca 240

tttggttcat cgtggttcat taattttttt tctccattgc tttctggctt tgatcttact 300

atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat 360

ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca 420

aacgcaattg taattaattc ttattttgta tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt 480

tttattttat ttttcttttc ttagtttctt tcataacacc aagcaactaa tactataaca 540

tacaataata 550

<210> 26

<211> 419

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pTEF Kl" <223> "pTEF Kl

<220>

<223> pTEF Kl

<220>

<223> pTEF Kl

<400> 26

ctctctcgca ataacaatga acactgggtc aatcatagcc tacacaggtg aacagagtag 60

cgtttataca gggtttatac ggtgattcct acggcaaaaa tttttcattt ctaaaaaaaa 120

aaagaaaaat ttttctttcc aacgctagaa ggaaaagaaa aatctaatta aattgatttg 180

gtgattttct gagagttccc tttttcatat atcgaatttt gaatataaaa ggagatcgaa 240

aaaatttttc tattcaatct gttttctggt tttatttgat agtttttttg tgtattatta 300

ttatggatta gtactggttt atatgggttt ttctgtataa cttcttttta ttttagtttg 360

tttaatctta ttttgagtta cattatagtt ccctaactgc aagagaagta acattaaaa 419

<210> 27

<211> 598

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pTEF3" <223> "pTEF3

<220>

<223> pTEF3

<220>

<223> pTEF3

<400> 27

ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat 60

atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt 120

ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca 180

cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240

cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 300

ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 360

ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 420

gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 480

taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 540

ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaa 598

<210> 28

<211> 383

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pTEF1" <223> "pTEF1

<220>

<223> pTEF1

<220>

<223> pTEF1

<400> 28

gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 60

ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt 120

tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg 180

cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca 240

gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg 300

ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctacgata cagttctcac 360

atcacatccg aacataaaca acc 383

<210> 29

<211> 700

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pADH1" <223> "pADH1

<220>

<223> pADH1

<220>

<223> pADH1

<400> 29

gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat 60

aataccttcg ttggtctccc taacatgtag gtggcggagg ggagatatac aatagaacag 120

ataccagaca agacataatg ggctaaacaa gactacacca attacactgc ctcattgatg 180

gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt 240

ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt 300

ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa 360

aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt 420

tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca 480

cgcacactac tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga 540

aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt 600

ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt 660

tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 700

<210> 30

<211> 549

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pGPM 1" <223> "pGPM 1

<220>

<223> pGPM 1

<220>

<223> pGPM 1

<400> 30

gccaaacttt tcggttaaca catgcagtga tgcacgcgcg atggtgctaa gttacatata 60

tatatatata tatatatata tatatatata gccatagtga tgtctaagta acctttatgg 120

tatatttctt aatgtggaaa gatactagcg cgcgcaccca cacacaagct tcgtcttttc 180

ttgaagaaaa gaggaagctc gctaaatggg attccacttt ccgttccctg ccagctgatg 240

gaaaaaggtt agtggaacga tgaagaataa aaagagagat ccactgaggt gaaatttcag 300

ctgacagcga gtttcatgat cgtgatgaac aatggtaacg agttgtggct gttgccaggg 360

agggtggttc tcaactttta atgtatggcc aaatcgctac ttgggtttgt tatataacaa 420

agaagaaata atgaactgat tctcttcctc cttcttgtcc tttcttaatt ctgttgtaat 480

taccttcctt tgtaattttt tttgtaatta ttcttcttaa taatccaaac aaacacacat 540

attacaata 549

<210> 31

<211> 650

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pFBA1" <223> "pFBA1

<220>

<223> pFBA1

<220>

<223> pFBA1

<400> 31

acgcaagccc taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct 60

tcacatacgt tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa 120

tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg 180

ggattcttct atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct 240

ctttcgggct caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac 300

tgagcacgta accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg 360

ttaataccat ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat 420

caacagatcg cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt 480

aaattttatc cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa 540

agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc 600

ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 650

<210> 32

<211> 700

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pPDC1" <223> "pPDC1

<220>

<223> pPDC1

<220>

<223> pPDC1

<400> 32

ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag 60

cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc 120

cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca 180

taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt 240

ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta 300

tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct 360

ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg 420

tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag 480

ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg 540

aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg 600

gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac 660

tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 700

<210> 33

<211> 998

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pCCW12" <223> "pCCW12

<220>

<223> pCCW12

<220>

<223> pCCW12

<400> 33

aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca 60

aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca 120

tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc 180

aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc 240

gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc 300

ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt 360

agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat 420

agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca 480

gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg 540

cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa 600

aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca 660

agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta 720

cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg 780

cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa 840

ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt 900

ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa 960

attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata 998

<210> 34

<211> 700

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pGK1" <223> "pGK1

<220>

<223> pGK1

<220>

<223> pGK1

<400> 34

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700

<210> 35

<211> 913

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pMDH2" <223> "pMDH2

<220>

<223> pMDH2

<220>

<223> pMDH2

<400> 35

ccttcgctaa ataataaacc tgaactgtac ttagcgaagc cttcatagca cctacgtaca 60

cgtatatata gacattttac gtaatggaga aactgaggtt tttgttttca ctttttttct 120

ttctttttca ctattgctcg aaccgcctgc gatgagctaa gaaaaaaaag tgaaagaaat 180

catagaaagc aaaaatgaga ttatatagcc cagagccctc ttctggcgcc tgtcccaagg 240

cggaccaaca acaacacttg cccaaaccta agaaaatccc ctcatacttt tccgtttgta 300

tctcctactt tcttacttcc tttttttctt ctttatttgc ttggtttacc attgaagtcc 360

atttttacta cagacaatag ctagtcattc gctatcttcc gtttgtcact ttttttcaaa 420

tttctcatct atatagcgaa gtacggaaaa gatgtcactt gccggcatct cggccttccc 480

cggccaaatg gactcatcat ctacgatacg gcccctttaa tccgcaatta ctttgcccat 540

tcggccgtag ccgttctaaa gccgccgtgc cttgccccca atactcccct aatgatccgg 600

gaagttccgg tttttttcct ttgtttagtg gcattttgtg ttgcccaagg ttgggaaggt 660

ccgatttgac tttaaggaac tacggaaggt atctaaggtt tctaaaaaca atatacacgc 720

gcgtgcgtag atatataaag ataaagattt atcgatatga gataaagatt gctgcatgat 780

tctccttctg attctttttc cctgtatata ttttctcccc ttctgtataa atcgtacagt 840

cagaagtagt ccagaatata gtgctgcaga ctattacaaa agttcaatac aatatcataa 900

aagttatagt aac 913

<210> 36

<211> 406

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pURA3" <223> "pURA3

<220>

<223> pURA3

<220>

<223> pURA3

<400> 36

ggtacccaaa ccgaagttat ctgatgtaga aaaggattaa agatgctaag agatagtgat 60

gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac cttttttgcg aggcatattt 120

atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg tggctgtggt ttcagggtcc 180

ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg 240

aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact 300

tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt 360

aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatc 406

<210> 37

<211> 535

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pRPLA1" <223> "pRPLA1

<220>

<223> pRPLA1

<220>

<223> pRPLA1

<400> 37

tcaagttgga tactgatctg atctctccgc cctactacca gggaccctca tgattaccgc 60

tcgaatgcga cgtttcctgc ctcataaaac tggcttgaaa atatttattc gctgaacagt 120

agcctagctt ataaaaattt catttaatta atgtaatatg aaaactcaca tgccttctgt 180

ttctaaaatt gtcacagcaa gaaataacat taccatacgt gatcttatta aactctagta 240

tcttgtctaa tacttcattt aaaagaagcc ttaaccctgt agcctcatct atgtctgcta 300

catatcgtga ggtacgaata tcgtaagatg ataccacgca actttgtaat gatttttttt 360

ttttcatttt ttaaagaatg cctttacatg gtatttgaaa aaaatatctt tataaagttt 420

gcgatctctt ctgttctgaa taatttttag taaaagaaat caaaagaata aagaaatagt 480

ccgctttgtc caatacaaca gcttaaaccg attatctcta aaataacaag aagaa 535

<210> 38

<211> 400

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pSAM4" <223> "pSAM4

<220>

<223> pSAM4

<220>

<223> pSAM4

<400> 38

agattttggt gttagatggt actcttgcat atgtaacctt taataaattt tgcaaatcga 60

attcctttgt aacgtgcaaa gcattttata gcctggcgct cgcattgtta agcaacaggc 120

ggtgcggcaa cgttgaaatg tttcacgcag ggttttttac gtactgcacg gcattctgga 180

gtgaaaaaaa atgaaaagta cagctcgaag ttttttgtcc atcggttgta ctttgcagag 240

tattagtcat ttttgatatc agagtactac tatcgaagca tttttacgct tgaataactt 300

gaatattatt gaaagcttag ttcaaccaag ctgaaaagaa ccattattca acataattgg 360

aaatcatttc gttactaaat cgtccgaaaa ttgcagaaaa 400

<210> 39

<211> 505

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pCUP1-1" <223> "pCUP1-1

<220>

<223> pCUP1-1

<220>

<223> pCUP1-1

<400> 39

cggcaaactt caacgatttc tatgatgcat tttataatta gtaagccgat cccattaccg 60

acatttgggc gctatacgtg catatgttca tgtatgtatc tgtatttaaa acacttttgt 120

attatttttc ctcatatatg tgtataggtt tatacggatg atttaattat tacttcacca 180

ccctttattt caggctgata tcttagcctt gttactagtt agaaaaagac atttttgctg 240

tcagtcactg tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc 300

gtcttttccg ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgcaatatgg attgtcagaa 360

tcatataaaa gagaagcaaa taactccttg tcttgtatca attgcattat aatatcttct 420

tgttagtgca atatcatata gaagtcatcg aaatagatat taagaaaaac aaactgtaca 480

atcaatcaat caatcatcac ataaa 505

<210> 40

<211> 500

<212> ДНК

<213> Candida glabrata

<220>

<223> pCUP1.Cgla" <223> "pCUP1.Cgla

<220>

<223> pCUP1.Cgla

<220>

<223> pCUP1.Cgla

<400> 40

cacaccacac aaccgtcagc accccggctg tacgtctgtg aaggctgcgg tatagacacg 60

gactgcgata cagaactcat gacttatatc tgtagactcc tctgcttcaa tgcgaactcc 120

aggatcaccg aatagcatgc gatgagctgt tgattcttat atataattat ctattgcatt 180

ttttttttaa tgctgcatgg gggggcctag taaatcaccc gtacaagtca cgcgtgagag 240

aaagagaagg gccctttcgt cgtggaagcg tggatcgtga gcgacctgtt tctaaatata 300

gcttttgggt aggatattat attaagtgaa attttattag agggtaaatg tatgtgaaag 360

ttatgtataa tatgttgcta aattagcgat cgtgaatgca tagaatctaa tcgttataga 420

aaaccgcaac ttgtgctgtt ttgttgtgtt ttcttgtcgt ttttttatat tatttatcta 480

gtattttgct ttagttgtta 500

<210> 41

<211> 425

<212> ДНК

<213> Saccharomyces bayanus

<220>

<223> pCUP1.Sba" <223> "pCUP1.Sba

<220>

<223> pCUP1.Sba

<220>

<223> pCUP1.Sba

<400> 41

agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta 60

tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg 120

acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat 180

tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga 240

tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc 300

aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc 360

tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc 420

ataaa 425

<210> 42

<211> 741

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU1" <223> "pACU1

<220>

<223> pACU1

<220>

<223> pACU1

<400> 42

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 540

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 600

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 660

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 720

tctattaccc ccatccatac a 741

<210> 43

<211> 757

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU2" <223> "pACU2

<220>

<223> pACU2

<220>

<223> pACU2

<400> 43

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg 360

tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg 420

ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgaattccac gtgaagctgt cgatattggg 480

gaactgtggt ggttggcaaa tgactaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac 540

tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg 600

atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc 660

ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca 720

gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 757

<210> 44

<211> 498

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU3p" <223> "pACU3p

<220>

<223> pACU3p

<220>

<223> pACU3p

<400> 44

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180

attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240

gttccagcaa aaaagactac caacgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360

ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480

caaggagaaa aaactata 498

<210> 45

<211> 498

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU4p" <223> "pACU4p

<220>

<223> pACU4p

<220>

<223> pACU4p

<400> 45

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180

aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240

actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360

ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480

caaggagaaa aaactata 498

<210> 46

<211> 530

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU5" <223> "pACU5

<220>

<223> pACU5

<220>

<223> pACU5

<400> 46

ggaggacgaa acaaaaaagt gaaaaaaaat gaaaattttt ttggaaaacc aagaaatgaa 60

ttatatttcc gtgtgagacg acatcgtcga atatgattca gggtaacagt attgatgtaa 120

tcaatttcct acctgaatct aaaattcccg gaattcgaaa aagacatttt tgctgtcagt 180

cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttccagaag caaaaagagc gatgcgtctt 240

ttccgctgaa ccgttccagc aaaaaagact accaacgaat tccgagcaga tccgccaggc 300

gtgtatatat agcgtggatg gccaggcaac tttagtgctg acacatacag gcatatatat 360

atgtgtgcga cgacacatga tcatatggca tgcatgtgct ctgtatgtat ataaaactct 420

tgttttcttc ttttctctaa atattctttc cttatacatt aggacctttg cagcataaat 480

tactatactt ctatagacac acaaacacaa atacacacac taaattaata 530

<210> 47

<211> 867

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU6" <223> "pACU6

<220>

<223> pACU6

<220>

<223> pACU6

<400> 47

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540

ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600

ctaccaacga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660

aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720

taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840

tacaattcta ttacccccat ccataca 867

<210> 48

<211> 867

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU7" <223> "pACU7

<220>

<223> pACU7

<220>

<223> pACU7

<400> 48

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660

aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720

taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840

tacaattcta ttacccccat ccataca 867

<210> 49

<211> 1119

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU8" <223> "pACU8

<220>

<223> pACU8

<220>

<223> pACU8

<400> 49

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540

ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600

ctaccaacga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc 660

tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa 720

aaaagactac caacgaattc gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc 780

ttttgctggc atttcttcca gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc 840

cagcaaaaaa gactaccaac gaattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900

actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960

cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020

tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080

cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119

<210> 50

<211> 624

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU9" <223> "pACU9

<220>

<223> pACU9

<220>

<223> pACU9

<400> 50

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgaaaaa 240

gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc tggcatttct tccagaagca 300

aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa aaaagactac caacgaattc 360

gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc ttttgctggc atttcttcca 420

gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc cagcaaaaaa gactaccaac 480

gaattcgggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg atatgtatat 540

ggtggtaatg ccatgtaata tgattattaa acttctttgc gtccatccaa aaaaaaagta 600

agaatttttg aaaattcaat ataa 624

<210> 51

<211> 876

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU10p" <223> "pACU10p

<220>

<223> pACU10p

<220>

<223> pACU10p

<400> 51

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attggttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180

aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240

actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca 300

gcggaaaaga cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg 360

acagtgactg acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac 420

ggttcagcgg aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat 480

ctcttgacag tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc 540

tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa 600

aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tccaattcgg atgataatgc 660

gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 720

attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 780

tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 840

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 876

<210> 52

<211> 633

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU11" <223> "pACU11

<220>

<223> pACU11

<220>

<223> pACU11

<400> 52

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattcgaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120

ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180

aaaaagacta ccaacgaatt ccaccgcacg ccttttttct gaagcccact ttcgtggact 240

ttgccatata tgcaaaattc atgaagtgtg ataccaagtc agcatacacc tcactagggt 300

agtttctttg gttgtattga tcatttggtt catcgtggtt cattaatttt ttttctccat 360

tgctttctgg ctttgatctt actatcattt ggatttttgt cgaaggttgt agaattgtat 420

gtgacaagtg gcaccaagca tatataaaaa aaaaaagcat tatcttccta ccagagttga 480

ttgttaaaaa cgtatttata gcaaacgcaa ttgtaattaa ttcttatttt gtatcttttc 540

ttcccttgtc tcaatctttt atttttattt tatttttctt ttcttagttt ctttcataac 600

accaagcaac taatactata acatacaata ata 633

<210> 53

<211> 1119

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU12" <223> "pACU12

<220>

<223> pACU12

<220>

<223> pACU12

<400> 53

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660

gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720

aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780

cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840

acagcaaaaa tgtctttttc caattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900

actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960

cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020

tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080

cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119

<210> 54

<211> 1497

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU13" <223> "pACU13

<220>

<223> pACU13

<220>

<223> pACU13

<400> 54

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660

gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720

aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780

cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840

acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac ggttcagcgg 900

aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat ctcttgacag 960

tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt 1020

cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct 1080

tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga 1140

acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga 1200

atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg tctttttcca attctaatta agttagtcaa 1260

ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct 1320

tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc 1380

tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt 1440

cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 1497

<210> 55

<211> 1011

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU14" <223> "pACU14

<220>

<223> pACU14

<220>

<223> pACU14

<400> 55

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattggaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120

ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180

aaaaagacta ccaacgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg tcaagagatt 240

cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg ctgaaccgtt 300

ccagcaaaaa agactaccaa cgaattcgaa aaagacattt ttgctgtcag tcactgtcaa 360

gagattcttt tgctggcatt tcttccagaa gcaaaaagag cgatgcgtct tttccgctga 420

accgttccag caaaaaagac taccaacgaa ttcgaaaaag acatttttgc tgtcagtcac 480

tgtcaagaga ttcttttgct ggcatttctt ccagaagcaa aaagagcgat gcgtcttttc 540

cgctgaaccg ttccagcaaa aaagactacc aaccaattcc accgcacgcc ttttttctga 600

agcccacttt cgtggacttt gccatatatg caaaattcat gaagtgtgat accaagtcag 660

catacacctc actagggtag tttctttggt tgtattgatc atttggttca tcgtggttca 720

ttaatttttt ttctccattg ctttctggct ttgatcttac tatcatttgg atttttgtcg 780

aaggttgtag aattgtatgt gacaagtggc accaagcata tataaaaaaa aaaagcatta 840

tcttcctacc agagttgatt gttaaaaacg tatttatagc aaacgcaatt gtaattaatt 900

cttattttgt atcttttctt cccttgtctc aatcttttat ttttatttta tttttctttt 960

cttagtttct ttcataacac caagcaacta atactataac atacaataat a 1011

<210> 56

<211> 398

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pACU15" <223> "pACU15

<220>

<223> pACU15

<220>

<223> pACU15

<400> 56

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgttggt 240

agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc gctctttttg cttctggaag 300

aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc 360

gggctcttta catttccaca acatataagt aagattag 398

<210> 57

<211> 428

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pGAL/CUP1p" <223> "pGAL/CUP1p

<220>

<223> pGAL/CUP1p

<220>

<223> pGAL/CUP1p

<400> 57

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180

attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240

gttccagcaa aaaagactac caacgcaata tggattgtca gaatcatata aaagagaagc 300

aaataactcc ttgtcttgta tcaattgcat tataatatct tcttgttagt gcaatatcat 360

atagaagtca tcgaaataga tattaagaaa aacaaactgt acaatcaatc aatcaatcat 420

cacataaa 428

<210> 58

<211> 518

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pCRS5" <223> "pCRS5

<220>

<223> pCRS5

<220>

<223> pCRS5

<400> 58

gtggacgaaa agacataact gcagaagtac agctgccttt atttcttgtg gtcatttatt 60

gcttttattt tcaagtcaga tatacaagaa aatcaaatcc catcgtcaac gtcacgtata 120

aacgattaat ttacagtaat accatactct accaacatta ttttagtccg acgttcagtc 180

ctgtaggtgt tccaaatcct tctggcattg acttctgtgc agaaaccctt caaaatgagt 240

tccactttac gtcagatcgc ataacaaccg gtcatatatt tttttctttt gctaaacccc 300

ctactgcaag cacttttaag aaaaagaaca ataaatgcgt ctttattgct gtgtggaagt 360

gatttttgtc tttcggacaa aaaaaggata gggatgcgag agggctgtga agtagtgatc 420

aagcggggcc tatataagaa gggcgcacat cgtcccccct aagaatagcg aagcgatatt 480

acactgaaca ctacaatgtc aaatagtact caataaat 518

<210> 59

<211> 510

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pCHA1" <223> "pCHA1

<220>

<223> pCHA1

<220>

<223> pCHA1

<400> 59

gatctctgct gacgttgtat ccacagatct aattgcaaga tagcctcttg cgaccttatt 60

aaaagcctct ccgtgatatc ctctagggct tgggttgcca ttaatcgatg tgtccttgtt 120

tccttatgcg agctgtttct tatctatctt atggtcccat tctttactgc actgtttaca 180

ttttgatcaa ttgcgaaatg ttcctactat ttttcttttt ctcttttcgc gagtactaat 240

caccgcgaac ggaaactaat gagtcctctg cgcggagaca tgattccgca tgggcggctc 300

ctgttaagcc ccagcggaaa tgtaattcca ctgagtgtca ttaaatagtg ccaaagcttt 360

atcaaattgt ttgcgatgag ataagataaa agggacaata tgaggaggaa cacaggtata 420

taaatatcgc caaataaaag gaaaatgttt atacagtttt ctctttttta agtgctggat 480

agacaagaga caggaaaatt aaccagcgag 510

<210> 60

<211> 601

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pCTR1" <223> "pCTR1

<220>

<223> pCTR1

<220>

<223> pCTR1

<400> 60

caagtccgat tgttcctctt caggagcttc ctgaaccaaa ctttttccgc aaggccgcat 60

tttgaaccgt attttgctcg ttccagcctt tccacgtttt tgttatctaa gcaacttggc 120

acatttccct actatactac aaaccgatac gtaaatactt ccctaaatag catatgaatt 180

attcagtaat ttttaaggat cgaaactgca cctcaactat tcgttactgt ggttatgttc 240

tcatgtattg atgcaaatca tgggatattt gctcaagacg acggtaaaat gagcaaaaat 300

ggcacgatcc tgaaaagagc acttttcaag attcgggcta caaaatgcaa cataaaaaat 360

gttgtattgt catctcgaca gggtcttgta tgttttattc ctcttatgat tagttcacat 420

tagtaaaaca gatacgcagt gtgctcttaa taaacaacta ctccatagct ttatttgcat 480

aacaaaactt ttaagcacaa acttaaacag gtggagtaat agttcggcgg cgactcaaat 540

tacatttgtt ggaagaatcg aatagaaaat aaaaaaaagt gtattatatt tgacattcaa 600

a 601

<210> 61

<211> 522

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pCTR3" <223> "pCTR3

<220>

<223> pCTR3

<220>

<223> pCTR3

<400> 61

gatgtgatga caaaacctct tccgataaaa acatttaaac tattaacaaa caaatggatt 60

cattagatct attacattat gggtggtatg ttggaataaa aatcaactat catctactaa 120

ctagtattta cgttactagt atattatcat atacggtgtt agaagatgac gcaaatgatg 180

agaaatagtc atctaaatta gtggaagctg aaacgcaagg attgataatg taataggatc 240

aatgaatatt aacatataaa acgatgataa taatatttat agaattgtgt agaattgcag 300

attccctttt atggattcct aaatcctcca ggagaacttc tagtatatct acatacctaa 360

tattattgcc ttattaaaaa tggaatccca acaattacat caaaatccac attctcttca 420

cttctccgat agacttgtaa tttatcttat ttcatttcct aacactttga tcgaagaaga 480

gggataacaa cagacgaaaa cacatttaag ggctatacaa ag 522

<210> 62

<211> 675

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR1" <223> "pCUR1

<220>

<223> pCUR1

<220>

<223> pCUR1

<400> 62

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420

tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa taaccgaagt 480

gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata agatatatat 540

aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct ctcttgtctt 600

ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata caattctatt 660

acccccatcc ataca 675

<210> 63

<211> 674

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR2" <223> "pCUR2

<220>

<223> pCUR2

<220>

<223> pCUR2

<400> 63

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgatt 360

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420

ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 480

tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 540

aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 600

tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 660

cccccatcca taca 674

<210> 64

<211> 794

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR3" <223> "pCUR3

<220>

<223> pCUR3

<220>

<223> pCUR3

<400> 64

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

taggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 480

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 540

ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 600

tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 660

aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 720

tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 780

cccccatcca taca 794

<210> 65

<211> 850

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR4" <223> "pCUR4

<220>

<223> pCUR4

<220>

<223> pCUR4

<400> 65

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 480

gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatggcacg atcctcaatt 540

gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatcccatg acaattctaa 600

ttaagttagt caaggcgcca tcctcatgaa aactgtgtaa cataataacc gaagtgtcga 660

aaaggtggca ccttgtccaa ttgaacacgc tcgatgaaaa aaataagata tatataaggt 720

taagtaaagc gtctgttaga aaggaagttt ttcctttttc ttgctctctt gtcttttcat 780

ctactatttc cttcgtgtaa tacagggtcg tcagatacat agatacaatt ctattacccc 840

catccataca 850

<210> 66

<211> 491

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR5p" <223> "pCUR5p

<220>

<223> pCUR5p

<220>

<223> pCUR5p

<400> 66

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 180

caaatatggc acgatcctca attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 240

caaatatggc acgatcccaa ttcggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg 300

gggtaattaa tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag 360

ctgcataacc actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa 420

atgtcataaa agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag 480

aaaaaactat a 491

<210> 67

<211> 833

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR6" <223> "pCUR6

<220>

<223> pCUR6

<220>

<223> pCUR6

<400> 67

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 360

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 420

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 480

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt catgatcgca aaatggcaaa tggcacgtga 540

agctgtcgat attggggaac tgtggtggtt ggcaaatgac taattaagtt agtcaaggcg 600

ccatcctcat gaaaactgtg taacataata accgaagtgt cgaaaaggtg gcaccttgtc 660

caattgaaca cgctcgatga aaaaaataag atatatataa ggttaagtaa agcgtctgtt 720

agaaaggaag tttttccttt ttcttgctct cttgtctttt catctactat ttccttcgtg 780

taatacaggg tcgtcagata catagataca attctattac ccccatccat aca 833

<210> 68

<211> 803

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR7" <223> "pCUR7

<220>

<223> pCUR7

<220>

<223> pCUR7

<400> 68

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 360

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 420

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 480

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 540

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 600

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 660

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 720

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 780

ctttttacaa caaatataaa aca 803

<210> 69

<211> 863

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR8" <223> "pCUR8

<220>

<223> pCUR8

<220>

<223> pCUR8

<400> 69

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 420

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840

ctttttacaa caaatataaa aca 863

<210> 70

<211> 863

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR9" <223> "pCUR9

<220>

<223> pCUR9

<220>

<223> pCUR9

<400> 70

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 420

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840

ctttttacaa caaatataaa aca 863

<210> 71

<211> 923

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR10" <223> "pCUR10

<220>

<223> pCUR10

<220>

<223> pCUR10

<400> 71

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 480

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 540

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 600

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 660

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 720

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 780

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 840

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 900

ctttttacaa caaatataaa aca 923

<210> 72

<211> 983

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR11" <223> "pCUR11

<220>

<223> pCUR11

<220>

<223> pCUR11

<400> 72

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 540

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 600

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 660

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 720

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 780

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 840

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 900

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 960

ctttttacaa caaatataaa aca 983

<210> 73

<211> 1043

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR12" <223> "pCUR12

<220>

<223> pCUR12

<220>

<223> pCUR12

<400> 73

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 420

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 480

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 600

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020

ctttttacaa caaatataaa aca 1043

<210> 74

<211> 1043

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR13" <223> "pCUR13

<220>

<223> pCUR13

<220>

<223> pCUR13

<400> 74

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 600

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020

ctttttacaa caaatataaa aca 1043

<210> 75

<211> 1223

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR14" <223> "pCUR14

<220>

<223> pCUR14

<220>

<223> pCUR14

<400> 75

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 600

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 660

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 720

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 780

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 840

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 900

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 960

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1020

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1080

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1140

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1200

ctttttacaa caaatataaa aca 1223

<210> 76

<211> 1283

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR15" <223> "pCUR15

<220>

<223> pCUR15

<220>

<223> pCUR15

<400> 76

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 420

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 480

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 600

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 660

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 720

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 780

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 840

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 900

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 960

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 1020

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1080

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1140

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1200

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1260

ctttttacaa caaatataaa aca 1283

<210> 77

<211> 686

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR16" <223> "pCUR16

<220>

<223> pCUR16

<220>

<223> pCUR16

<400> 77

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120

cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180

cacgatcctc aatgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag caaatatggc 240

acgatcctga attccaccgc acgccttttt tctgaagccc actttcgtgg actttgccat 300

atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag ggtagtttct 360

ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc cattgctttc 420

tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg tatgtgacaa 480

gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt tgattgttaa 540

aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt ttcttccctt 600

gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat aacaccaagc 660

aactaatact ataacataca ataata 686

<210> 78

<211> 747

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pCUR17" <223> "pCUR17

<220>

<223> pCUR17

<220>

<223> pCUR17

<400> 78

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120

cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180

cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 240

cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 300

cacgatcctg aattccaccg cacgcctttt ttctgaagcc cactttcgtg gactttgcca 360

tatatgcaaa attcatgaag tgtgatacca agtcagcata cacctcacta gggtagtttc 420

tttggttgta ttgatcattt ggttcatcgt ggttcattaa ttttttttct ccattgcttt 480

ctggctttga tcttactatc atttggattt ttgtcgaagg ttgtagaatt gtatgtgaca 540

agtggcacca agcatatata aaaaaaaaaa gcattatctt cctaccagag ttgattgtta 600

aaaacgtatt tatagcaaac gcaattgtaa ttaattctta ttttgtatct tttcttccct 660

tgtctcaatc ttttattttt attttatttt tcttttctta gtttctttca taacaccaag 720

caactaatac tataacatac aataata 747

<210> 79

<211> 500

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pLYS1" <223> "pLYS1

<220>

<223> pLYS1

<220>

<223> pLYS1

<400> 79

gcaagttaac attagggaga acgtggggcc ttcctccatg agtgcagagc aattgaagat 60

gtttagaggt ttaaaggaga ataaccagtt gctggatagc tctgtgccag ctacagttta 120

tgccaaattg gcccttcatg gtattcctga cggtgttaat ggacagtact tgagctataa 180

tgaccctgcc ttggcggact ttatgccttg aggatagcag gtacatataa attgttacat 240

actaagtcga tgagtcaaaa aagactctta tacatttata cattttgcat tattattttt 300

tttttccagc ggaatttgga attccgctct caaccgccaa aattcccctg cgatttcagc 360

gacaaagagt cataaagtca tcctcgagaa accacgatga aatatataaa aagcccatct 420

tccctgacgg aaactggtat tttaggaggc ataccataag ataacaacga aaacgcttta 480

tttttcacac aaccgcaaaa 500

<210> 80

<211> 650

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pLYS4" <223> "pLYS4

<220>

<223> pLYS4

<220>

<223> pLYS4

<400> 80

ttgaaaaatg cgaagttgaa gtgccataga agagaaacag cccacacagg ggagaagccc 60

actggaaagg gggcactgac caactttaaa taggaaacag aagataccac aagccagcga 120

tacaacagca ccaaacaccg aaaagaatag ccaaagctgt cctctggtgt tggaaaaact 180

ggaaaaaacg caactgcgtt ggctgctacg gtgaaaaatt ttcctatgac ttttttcact 240

gcttgttcgt gcgaaattac cgcaaacccg gtaaaatgta cacgtatcaa gtgataaaca 300

atttcgtgtc aagtgagcag aatggagcga tttggaaaaa aaaaattttt attgtttttt 360

cccccgggat tttgctcgag atgactgaaa ttttgtaatc gatgagtcta taccagaggc 420

agcaaatatc accaacatac acaggtatac acaatctcat gtccacacac acgtacagac 480

acgcacatat atatatatat atatatatcc ccataggtat ttatatatac aaaagaatcc 540

tcgtgtgttt gtgtgtgcaa tagctagttt tgcgctgcct cttatagtag acaatatcac 600

tttttcaata aaatagaact tgcaaggaaa caaaattgta tcgcttcaag 650

<210> 81

<211> 500

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pLYS9" <223> "pLYS9

<220>

<223> pLYS9

<220>

<223> pLYS9

<400> 81

acatatgcaa gagtcttatg tatcgtatct aagtgccacg taggggattc ccatcatttg 60

atgatttcca aatataatac ctgtagagag cggtggagca aaagtcaaat tttaatcgca 120

actgcagaca agtcaagctg aggaaattgt ggatgatctc ttgtttcttt tgatattcac 180

cacaacagaa gtgaagagtg tgattgcggt tactactgac cacgaagcaa tgcgtttagt 240

agtgaaaaga attactcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag 300

tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag 360

atgatagaaa gtagcacaga atttggctta atggtatata aaccgtaggg tcctggtaaa 420

attacatggg aaggatcctt aggcagtagg gaaaacttat caggacaatt gagttatatt 480

aacgtattat atattttaat 500

<210> 82

<211> 494

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR1p" <223> "pLYR1p

<220>

<223> pLYR1p

<220>

<223> pLYR1p

<400> 82

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300

ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360

aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420

caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480

gagaaaaaac tata 494

<210> 83

<211> 494

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR2p" <223> "pLYR2p

<220>

<223> pLYR2p

<220>

<223> pLYR2p

<400> 83

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300

ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360

aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420

caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480

gagaaaaaac tata 494

<210> 84

<211> 616

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR3p" <223> "pLYR3p

<220>

<223> pLYR3p

<220>

<223> pLYR3p

<400> 84

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300

ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360

tatcagcaat agatgataga aagaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420

ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480

aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540

ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600

aggagaaaaa actata 616

<210> 85

<211> 616

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR4p" <223> "pLYR4p

<220>

<223> pLYR4p

<220>

<223> pLYR4p

<400> 85

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420

ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480

aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540

ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600

aggagaaaaa actata 616

<210> 86

<211> 738

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR5p" <223> "pLYR5p

<220>

<223> pLYR5p

<220>

<223> pLYR5p

<400> 86

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420

aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480

ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 540

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 600

ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 660

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 720

caaggagaaa aaactata 738

<210> 87

<211> 1104

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR6p" <223> "pLYR6p

<220>

<223> pLYR6p

<220>

<223> pLYR6p

<400> 87

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300

ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360

tatcagcaat agatgataga aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa 420

aattcgcttt gtagtgaaaa ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga 480

attatcagca atagatgata gaaacaattg ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga 540

aaaattcgct ttgtagtgaa aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg 600

gaattatcag caatagatga tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg 660

gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa 720

tggaattatc agcaatagat gatagaaaga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt 780

tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc 840

aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa caattcggat gataatgcga ttagtttttt 900

agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat 960

ataaatggaa aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt 1020

acttcttatt caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 1080

taacgtcaag gagaaaaaac tata 1104

<210> 88

<211> 1836

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR7p" <223> "pLYR7p

<220>

<223> pLYR7p

<220>

<223> pLYR7p

<400> 88

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgtttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420

aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480

ggaatttcga ttccagagta tgagcaattg tttctatcat ctattgctga taattccatt 540

ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca 600

acggaatttc gattccagag tatgaggaat tctttctatc atctattgct gataattcca 660

ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag cgaatttttc 720

caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg ctgataattc 780

cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt 840

tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag caattgtttc tatcatctat tgctgataat 900

tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt 960

tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata 1020

attccattgg aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa 1080

tttttccaac ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc tttctatcat ctattgctga 1140

taattccatt ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg 1200

aatttttcca acggaatttc gattccagag tatgagcaat tgtttctatc atctattgct 1260

gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag 1320

cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg 1380

ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa 1440

agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat 1500

tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac 1560

aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg agcaattcgg atgataatgc 1620

gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 1680

attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 1740

tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 1800

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 1836

<210> 89

<211> 981

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR8" <223> "pLYR8

<220>

<223> pLYR8

<220>

<223> pLYR8

<400> 89

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420

atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480

attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540

agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600

gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660

aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720

aacaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 960

tctattaccc ccatccatac a 981

<210> 90

<211> 981

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR9" <223> "pLYR9

<220>

<223> pLYR9

<220>

<223> pLYR9

<400> 90

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420

ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480

attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540

atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag 600

gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660

acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720

agcaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 960

tctattaccc ccatccatac a 981

<210> 91

<211> 1225

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR10" <223> "pLYR10

<220>

<223> pLYR10

<220>

<223> pLYR10

<400> 91

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420

ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480

attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540

atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag 600

gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660

acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720

aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg aaattctcaa taccctttat 780

tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac ggaatttcga ttccagagta 840

tgaggaattc tttctatcat ctattgctga taattccatt ggaaattctc aatacccttt 900

attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca acggaatttc gattccagag 960

tatgagcaat tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa 1020

taaccgaagt gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata 1080

agatatatat aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct 1140

ctcttgtctt ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata 1200

caattctatt acccccatcc ataca 1225

<210> 92

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> pLYR11" <223> "pLYR11

<220>

<223> pLYR11

<220>

<223> pLYR11

<400> 92

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420

atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480

attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540

agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600

gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660

aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720

aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa aattcgcttt gtagtgaaaa 780

ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga attatcagca atagatgata 840

gaaagaattc ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga aaaattcgct ttgtagtgaa 900

aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg gaattatcag caatagatga 960

tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg 1020

aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat 1080

gatagaaaca attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 1140

aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 1200

taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 1260

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 1320

tacaattcta ttacccccat ccataca 1347

<210> 93

<211> 686

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pMET17" <223> "pMET17

<220>

<223> pMET17

<220>

<223> pMET17

<400> 93

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgagg 360

tcacatgatc gcaaaatggc aaatggcacg tgaagctgtc gatattgggg aactgtggtg 420

gttggcaaat gactaattaa gttagtcaag gcgccatcct catgaaaact gtgtaacata 480

ataaccgaag tgtcgaaaag gtggcacctt gtccaattga acacgctcga tgaaaaaaat 540

aagatatata taaggttaag taaagcgtct gttagaaagg aagtttttcc tttttcttgc 600

tctcttgtct tttcatctac tatttccttc gtgtaataca gggtcgtcag atacatagat 660

acaattctat tacccccatc cataca 686

<210> 94

<211> 510

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pMET6" <223> "pMET6

<220>

<223> pMET6

<220>

<223> pMET6

<400> 94

ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc ggagtcaggt 60

gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc gaactcgttt 120

agtcgcgaac gtgcaaaagg ccaatatttt tcgctagagt catcgcagtc atggcagctc 180

tttcgctcta tctcccggtc gcaaaactgt ggtagtcata gctcgttctg ctcaattgag 240

aactgtgaat gtgaatatgg aacaaatgcg atagatgcac taatttaagg gaagctagct 300

agttttccca actgcgaaag aaaaaaagga aagaaaaaaa aattctatat aagtgataga 360

tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt tgttaaactc 420

ttcctttatc ataaaaaagc aagcatctaa gagcattgac aacactctaa gaaacaaaat 480

accaatataa tttcaaagta catatcaaaa 510

<210> 95

<211> 508

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pMET14" <223> "pMET14

<220>

<223> pMET14

<220>

<223> pMET14

<400> 95

cctatgcatg tttagagcaa gcgcctttgt gagccctccc ggttacgacg ccttggcaat 60

gtagcagata actctgcact tctagaatca ttccactacg acatttggct catcaccagc 120

tcgcgagaaa tgtaaataag ccaacaacca agaatgcgta acattaaaga atacagttgc 180

tttcatttcg gcgtgatggt acggcaccca cggttcctta cattattctc gaaaaatagc 240

tgcacgcttt tccaggaata aaagaccgtg ccactaattt cacgtgatca atatatttac 300

aagccacctc aaaaaatgtg gcaatggaga agaggatgaa cgactcaata tgacttcaac 360

ttcatgaatt tgtcaaaata tctatataag atgcaaaatt tctatacaac atcagttgcg 420

tatccgttaa tgtcgttcat tttctctctt tgttcgaact tgacatcaag aaaagttgga 480

attatttctc caagcacact gtacacca 508

<210> 96

<211> 552

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pMET3" <223> "pMET3

<220>

<223> pMET3

<220>

<223> pMET3

<400> 96

aacgatatgt acgtagtggt ataaggtgag ggggtccaca gatataacat cgtttaattt 60

agtactaaca gagacttttg tcacaactac atataagtgt acaaatatag tacagatatg 120

acacacttgt agcgccaacg cgcatcctac ggattgctga cagaaaaaaa ggtcacgtga 180

ccagaaaagt cacgtgtaat tttgtaactc accgcattct agcggtccct gtcgtgcaca 240

ctgcactcaa caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca 300

cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct 360

cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 420

aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt 480

gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa 540

agtataatta ac 552

<210> 97

<211> 363

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pSAM1" <223> "pSAM1

<220>

<223> pSAM1

<220>

<223> pSAM1

<400> 97

gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa 60

tactttcttt tttttttttc acaggaaaac tgtggtggcg cccttgccta ctagtgcatt 120

tcttttttcg ggttcttgtc tcgacgaaat tttagcctca tcgtagtttt tcactctggt 180

atcgatgaaa aagggaagag taaaaagttt tccgtttagt acttaatggg attggtttgg 240

gacgtatata tcgactggtg ttgtctgtta ttcatcgttg tttttcggtt agcttcgaaa 300

aaaaaataga gtaaaaacca ggaatttacc ctaaaaacaa gaaaaaataa gataaacgaa 360

aat 363

<210> 98

<211> 500

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pSAM2" <223> "pSAM2

<220>

<223> pSAM2

<220>

<223> pSAM2

<400> 98

gagctttgct ctattatata agataaaata tgcactaaaa gtttgcattt ctttacataa 60

ctaaaactaa gacattatgc atagcttacc tgatcaaaaa gtatgtaaac ttgttaacat 120

cttcacatgt gattcatctg gtcgtacttt cttgcggtgc agtgtaatat ttctacccac 180

gtgactataa ttgagcttga aaactgtggc gtttttccac cgatgggtcc acgccagata 240

ttaaccgaag ccaaaatacc gatgaaattt ctgagatagc tcttgtaaac gacgtcaaat 300

cttcatatgc aaggagatct tgatttcttt ttggtagtca tctgtcgtct tgaggcgtat 360

aagaaggagg ttatatctgt cctttctaca aagtattttc gagaatcttg cttctgcccc 420

ttttttcttt ttttaaaagg tttaaaaaac ataactgtct tcaatatatc cagtatttac 480

gacaatatac aaacataatc 500

<210> 99

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tTDH2" <223> "tTHD2

<220>

<223> tTDH2

<220>

<223> tTHD2

<400> 99

atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60

acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120

gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180

aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240

cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300

<210> 100

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tCYC1" <223> "tCYC1

<220>

<223> tCYC1

<220>

<223> tCYC1

<400> 100

acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60

cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120

cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180

ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240

agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct tcgcagttta cactctcatc 300

<210> 101

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tTDH3" <223> "tTDH3

<220>

<223> tTDH3

<220>

<223> tTDH3

<400> 101

gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60

tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120

tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180

atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240

aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300

<210> 102

<211> 354

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tADH1" <223> "tADH1

<220>

<223> tADH1

<220>

<223> tADH1

<400> 102

actagttcta gagcggccgc caccgcggtg ggcgaatttc ttatgattta tgatttttat 60

tattaaataa gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt 120

aaaacgaaaa ttcttattct tgagtaactc tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt 180

atagcatgag gtcgctctta ttgaccacac ctctaccggc atgccgagca aatgcctgca 240

aatcgctccc catttcaccc aattgtagat atgctaactc cagcaatgag ttgatgaatc 300

tcggtgtgta ttttatgtcc tcagaggaca acacctgttg taatcgttct tcca 354

<210> 103

<211> 301

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tADH2" <223> "tADH2

<220>

<223> tADH2

<220>

<223> tADH2

<400> 103

gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta 60

tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt 120

ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc 180

attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca 240

acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat 300

t 301

<210> 104

<211> 299

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tTPI1" <223> "tTPI1

<220>

<223> tTPI1

<220>

<223> tTPI1

<400> 104

gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa 60

taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg agccacttaa 120

atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg 180

cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa 240

gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc 299

<210> 105

<211> 299

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tMET17" <223> "tMET17

<220>

<223> tMET17

<220>

<223> tMET17

<400> 105

gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60

tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac 120

tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180

gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240

ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt 299

<210> 106

<211> 305

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tENO2" <223> "tENO2

<220>

<223> tENO2

<220>

<223> tENO2

<400> 106

ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata 60

gtttagaaca ctttatatta acgaatagtt tatgaatcta tttaggttta aaaattgata 120

cagttttata agttactttt tcaaagactc gtgctgtcta ttgcataatg cactggaagg 180

ggaaaaaaaa ggtgcacacg cgtggctttt tcttgaattt gcagtttgaa aaataactac 240

atggatgata agaaaacatg gagtacagtc actttgagaa ccttcaatca gctggtaacg 300

tcttc 305

<210> 107

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tMET3" <223> "tMET3

<220>

<223> tMET3

<220>

<223> tMET3

<400> 107

tcgtcataaa atgctcccat ctcaaaagta gggcaaaatt catgatcgac cgcgcaaaat 60

aaatagattt gcaaataagt tttgtatgta catttattaa tatatataat atatcaaaag 120

aaaaaaatca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgcactctt attcagtcat caattacaaa 180

acctagagat agcgatggtg catattcaat aaaaaactcc ttatactgtc gagaaagctt 240

attattggta cttctcgaag atactaaaaa aggttaattt ttggagacgg aggcaatagc 300

<210> 108

<211> 301

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tPGK1" <223> "tPGK1

<220>

<223> tPGK1

<220>

<223> tPGK1

<400> 108

attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60

gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120

ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180

taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240

tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt 300

a 301

<210> 109

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tDIT1" <223> "tDIT1

<220>

<223> tDIT1

<220>

<223> tDIT1

<400> 109

taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60

cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120

atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180

tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240

caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300

<210> 110

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tRPL3" <223> "tRPL3

<220>

<223> tRPL3

<220>

<223> tRPL3

<400> 110

gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta 60

aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa 120

gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac 180

tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc 240

ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat 300

<210> 111

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tRPL41B" <223> "tRPL41B

<220>

<223> tRPL41B

<220>

<223> tRPL41B

<400> 111

gcggattgag agcaaatcgt taagttcagg tcaagtaaaa attgatttcg aaaactaatt 60

tctcttatac aatcctttga ttggaccgtc atcctttcga atataagatt ttgttaagaa 120

tattttagac agagatctac tttatattta atatctagat attacataat ttcctctcta 180

ataaaatatc attaataaaa taaaaatgaa gcgatttgat tttgtgttgt caacttagtt 240

tgccgctatg cctcttgggt aatgctatta ttgaatcgaa gggctttatt atattaccct 300

<210> 112

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tRPL15A" <223> "tRPL15A

<220>

<223> tRPL15A

<220>

<223> tRPL15A

<400> 112

gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat 60

actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa 120

tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagcaa acccctaccc 180

cctcttctca atcctcccct caggcagaac ttatctacct gtatcaagga gcggacgagg 240

gagtcctaat tgttctacgt ataccaatgc tagcagctta cataggtggt ggcactacca 300

<210> 113

<211> 300

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> tIDP1" <223> "tIDP1

<220>

<223> tIDP1

<220>

<223> tIDP1

<400> 113

tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt tttttttcat tttttaaagt gttatactta 60

gttatgctct aggataatga actacttttt tttttttttt tttactgtta tcataaatat 120

atatacctta ttgttgtttg caaccgtcgg ttaattcctt atcaaggttc cccaagttcg 180

gatcattacc atcaatttcc aacattttca tgagttcttc ttcttcatta ccgtgtttta 240

gggggctgtt cgcacttcta atagggctat caccaagctg ttctaattcg tccaaaagtt 300

<210> 114

<211> 1089

<212> ДНК

<213> Kluveromyces lactis

<220>

<223> Leu2" <223> "Leu2

<220>

<223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<400> 114

atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 60

gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 120

catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 180

ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 240

ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 300

tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 360

aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 420

tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 480

agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 540

ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 600

agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 660

ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 720

attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 780

ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 840

ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 900

gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 960

agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 1020

ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 1080

ttggcttaa 1089

<210> 115

<211> 362

<212> ПРТ

<213> Kluveromyces lactis

<220>

<223> Leu2 " <223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<400> 115

Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg

20 25 30

Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala

35 40 45

Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser

50 55 60

Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp

65 70 75 80

Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys

85 90 95

Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp

100 105 110

Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu

130 135 140

Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr

145 150 155 160

Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala

165 170 175

Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn

180 185 190

Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile

195 200 205

Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser

210 215 220

Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val

225 230 235 240

Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val

245 250 255

Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu

260 265 270

Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser

275 280 285

Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu

290 295 300

Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly

305 310 315 320

Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg

325 330 335

Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala

340 345 350

Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala

355 360

<210> 116

<211> 499

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pNUP57

<220>

<223> pNUP57

<400> 116

tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60

gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120

cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180

agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240

atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300

tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360

aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420

atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480

ttgttgacca attgatcac 499

<210> 117

<211> 451

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pGAP1

<220>

<223> pGAP1

<400> 117

cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60

ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120

ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180

ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga 240

tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg 300

tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca 360

aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac 420

agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a 451

<210> 118

<211> 998

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pJEN1

<220>

<223> pJEN1

<400> 118

aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca 60

gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa 120

gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac 180

tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta 240

aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct 300

tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta 360

gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac 420

aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc 480

tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg 540

ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600

atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660

agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720

tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780

ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840

caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900

tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960

gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998

<210> 119

<211> 450

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pICL1

<220>

<223> pICL1

<400> 119

ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60

ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120

aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180

atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240

gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300

ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360

tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420

tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450

<210> 120

<211> 598

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pADH2

<220>

<223> pADH2

<400> 120

tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60

gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120

atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180

taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240

acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300

accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420

atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480

ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540

atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598

<210> 121

<211> 793

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> pMLS1

<220>

<223> pMLS1

<400> 121

tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60

gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120

tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180

agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240

cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300

gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360

gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420

ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480

atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540

tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600

tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660

aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720

tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780

aagaattaag aaa 793

<---

Группа изобретений относится к области биопродукции эктоина. Предложены рекомбинантные дрожжи для получения эктоина, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаткиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора. Также в геноме указанных дрожжей по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как никотинамидадениндинуклеотид (NAD), так и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP), сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора. Также в геноме указанных дрожжей по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора. Также в геноме указанных дрожжей по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора. Также в геноме указанных дрожжей по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая эктоинсинтазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора. Также в геноме указанных дрожжей по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, были удалены и/или разорваны, и/или меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, независимо находятся под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, под контролем слабого промотора и/или в дестабилизированной форме. Также в геноме указанных дрожжей по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, использующую NADH и превращающую оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора. Также предложены способ получения эктоина с использованием указанных дрожжей и применение указанных дрожжей для получения эктоина. Группа изобретений обеспечивает высокоэффективный синтез и секрецию эктоина. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 пр.

1. Рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, для получения эктоина, в геноме которых:

(A) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаткиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(B) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как никотинамидадениндинуклеотид (NAD), так и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP), сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(C) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(D) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(E) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая эктоинсинтазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(F) (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, были удалены и/или разорваны, и/или

(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, независимо находятся:

- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

- под контролем слабого промотора; и/или

- в дестабилизированной форме, и

(G) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, использующую NADH и превращающую оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

2. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаттрансаминазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

3. Рекомбинантные дрожжи по п. 1 или 2, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, использующую NADH, кодирует глутаматдегидрогеназу из Entodinium caudatum или Saccharomyces cerevisiae и еще более предпочтительно из Entodinium caudatum.

4. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-3, в геноме которых была выполнена по меньшей мере одна из следующих модификаций:

(E) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена;

(G) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:

(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или

(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, была вставлена;

(I) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая вероятный транспортер AQR1, сверхэкспрессируется; и/или

(J) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая транспортер полиамина 1, сверхэкспрессируется.

5. Рекомбинантные дрожжи по п. 4, в геноме которых были выполнены по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере три из модификаций, указанных в п. 4.

6. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, где нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу, представляет собой нуклеиновую кислоту из дрожжей, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae.

7. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, где нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, представляет собой нуклеиновую кислоту из бактерии, предпочтительно бактерии, независимо выбранной из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Streptomyces lavendulae, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumonia и Mycobacterium tuberculosis.

8. Рекомбинантные дрожжи по п. 4, где по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1 и низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, независимо представляет собой нуклеиновую кислоту из дрожжей, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae.

9. Рекомбинантные дрожжи по п. 1 или 4, где по меньшей мере одна из сверхэкспрессированных нуклеиновых кислот находится под контролем сильного промотора, предпочтительно и независимо выбранного из группы, состоящей из pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 и pGK1.

10. Рекомбинантные дрожжи по п. 1 или 4, где индуцибельный или репрессируемый промотор независимо выбран из группы, состоящей из промоторов, индуцируемых или репрессируемых медью, промоторов, индуцируемых или репрессируемых метионином, и промоторов, индуцируемых или репрессируемых треонином, предпочтительно выбран из группы, состоящей из pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 и pCHA1.

11. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, где слабый промотор независимо выбран из группы, состоящей из pURA3, pRPLA1, pNUP57 и pGAP1.

12. Рекомбинантные дрожжи по п. 1 или 4, где индуцибельный или репрессируемый промотор независимо выбран из группы, состоящей из промоторов, индуцируемых или репрессируемых медью, промоторов, индуцируемых или репрессируемых лизином, и промоторов, индуцируемых или репрессируемых метионином, предпочтительно выбран из группы, состоящей из pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 и pMLS1.

13. Способ получения эктоина, включающий стадии:

(а) культивирования рекомбинантных дрожжей по любому из пп. 1-12 в культуральной среде и

(b) выделения эктоина из указанной культуральной среды.

14. Способ по п. 13, где культуральная среда содержит по меньшей мере источник углерода, предпочтительно источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы и сахарозы.

15. Применение рекомбинантных дрожжей по любому из пп. 1-12 для получения эктоина.