Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, и ее применение Российский патент 2024 года по МПК C12N15/62 C12N15/12 C07K14/755 C12N15/86 C12N5/10 A61K35/76 A61K48/00 A61P7/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к области генетики, генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD (фактор свертывания крови VIII с делетированным В доменом) и гетерологичного сигнального пептида, экспрессионной кассете и вектору на ее основе, клетке-хозяину для получения слитого белка на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, а также к различным применениям вышеуказанного вектора.

Уровень техники

Гемофилия - это рецессивное, Х-сцепленное, врожденное нарушение, ведущее к дефициту одного из белков, участвующих во вторичном гемостазе. Гемофилия А, или классическая гемофилия, - наиболее распространенная форма гемофилии; встречается у 1 из 5000 новорожденных мальчиков (Report on the annual global survey 2019, WFH https://www.wfh.org/en/our-work-research-data/annual-global-survey) и обусловлена дефицитом белка фактора свертывания VIII. Согласно данным Всероссийского общества гемофилии, в России насчитывается более 6,5 тыс.пациентов с гемофилией A (Report on the annual global survey 2019, WFH).

Фактор свертывания VIII (FVIII) - это белок размером 280 кДа, который секретируется в кровь преимущественно из синусоидальных эпителиальных клеток печени (Fahs SA, Hille МТ, Shi Q, Weiler H, Montgomery RR. A conditional knockout mouse model reveals endothelial cells as the principal and possibly exclusive source of plasma factor VIII/ Blood. 2014 Jun 12;123(24):3706-13. doi: 10.1182/blood-2014-02-555151. Epub 2014 Apr 4. PMID: 24705491 и Everett LA, Cleuren AC, Khoriaty RN, Ginsburg D. Murine coagulation factor VIII is synthesized in endothelial cells/ Blood. 2014 Jun 12;123(24):3697-705. doi: 10.1182/blood-2014-02-554501. Epub 2014 Apr 9. PMID: 24719406). Активированный FVIII циркулирует в организме в виде гетеродимера, состоящего из тяжелой (домены A1, А2, В) и легкой (домены A3, C1, С3) цепей, связанных друг с другом за счет нековалентных металл-зависимых взаимодействий. В результате процессинга FVIII в активированной форме белка присутствуют только домены А1-А3, C1, С2. Этот факт способствовал созданию рекомбинантного FVIII с удаленным В доменом (FVIII-BDD), который не уступает по своей активности полноразмерному FVIII (Pittman DD, Alderman EM, Tomkinson KN, Wang JH, Giles AR, Kaufman RJ. Biochemical, immunological, and in vivo functional characterization of B-domain-deleted factor VIII/ Blood. 1993 Jun 1; 81(11):2925-35. PMID: 8499631). В отличии от других белков каскада свертывания крови, которые преимущественно относятся к протеазам, FVIII - гликопротеин. Однако он играет критичную роль в формировании теназного комплекса, который необходим для образования активированного фактора свертывания X (FXa), первого члена окончательного общего пути коагуляции, что в итоге приводит к образованию сшитого фибрина.

Более чем в половине случаев к тяжелой форме гемофилии А приводят инверсии в 1 или 22 интроне гена FVIII (Habart D, Kalabova D, Novotny M, Vorlova Z. Thirty-four novel mutations detected in factor VIII gene by multiplex CSGE: modeling of 13 novel amino acid substitutions/J ThrombHaemost. 2003 Apr; 1(4):773-81. doi: 10.1046/j.l538-7836.2003.00149.x. PMID: 1287141). В других случаях нарушения в последовательности FVIII связаны с различными мутациями, в том числе антисмысловыми мутациями, сдвигами рамки считывания, мутациями в сплайсинг-сайтах, делециями и инсерциями.

Склонность к кровотечениям при гемофилии А взаимосвязана с определяемой активностью FVIII и классифицируется как легкая (0,05-0,40 ME/мл), умеренная (0,01-0,05 ME/мл) или тяжелая (<0,01 ME/мл). Пациенты с легкой формой гемофилии, как правило, испытывают аномальное кровотечение только в связи с оперативным вмешательством или полученными травмами. Напротив, у пациентов с умеренной формой гемофилии наблюдаются длительные реакции кровотечения на относительно незначительные травмы, а у пациентов с тяжелой формой заболевания часто возникают спонтанные кровотечения. Тяжелая форма гемофилии А проявляется спонтанными гемартрозом, гематомами мягких тканей, забрюшинными кровотечениями, внутримозговыми кровоизлияниями и отсроченными послеоперационными кровотечениями. Со временем осложнения от рецидивирующего гемартроза и гематом мягких тканей включают тяжелую артропатию, контрактуры суставов и псевдоопухоли, приводящие к хроническим заболеваниям. Доля пациентов с легкой, средней и тяжелой формами гемофилии А точно не установлена, но, согласно последним эпидемиологическим исследованиям, предполагается, что примерно 60% пациентов с гемофилией А имеют тяжелую форму (Report on the annual global survey 2019, WFH).

На сегодняшний день стандартная схема лечения пациентов, страдающих гемофилией А, заключается в пожизненной заместительной терапии в виде инъекций рекомбинантного FVIII (Report on the annual global survey 2019, WFH). Несмотря на успех терапии гемофилии, существуют серьезные проблемы подобного подхода. Профилактическая заместительная терапия гемофилии А предполагает внутривенные инъекции рекомбинантного FVIII каждые три дня в течение всей жизни пациента с тяжелой формой заболевания. Подобный формат лечения является очень дорогостоящим и не гарантирует отсутствия осложнений, связанных в первую очередь с гемартрозом. В некоторых случаях у пациентов вырабатываются ингибирующие антитела. Ингибиторные формы гемофилии А чаще наблюдаются у пациентов с тяжелой формой заболевания и требуют применения альтернативных подходов к лечению и профилактике заболевания (Eckhardt CL, van der Bom JG, van der Naald M, Peters M, Kamphuisen PW, Fijnvandraat K. Surgery and inhibitor development in hemophilia A: a systematic review/ J Thromb Haemost. 2011 Oct; 9(10): 1948-58. doi: 10.1111/j.1538-7836.2011.04467.x. PMID: 21838755).

Генная терапия гемофилии А посредством вирусных (экспрессионных) векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV), кодирующих ген FVIII, показала впечатляющие результаты в серии доклинических и клинических исследований (Bunting S, Zhang L, Xie L, Bullens S, Mahimkar R, Fong S, Sandza K, Harmon D, Yates B, Handyside B, Sihn CR, Galicia N, Tsuruda L, O'Neill CA, Bagri A, Colosi P, Long S, Vehar G, Carter B. Gene Therapy with BMN 270 Results in Therapeutic Levels of FVIII in Mice and Primates and Normalization of Bleeding in Hemophilic Mice/ Mol Ther. 2018 Feb 7;26(2):496-509. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.12.009. Epub 2017 Dec 14.PMID: 29292164 и Peyvandi F, Garagiola I. Clinical advances in gene therapy updates on clinical trials of gene therapy in haemophilia/ Haemophilia. 2019 Sep; 25(5):738-746. doi: 10.1111/hae.13816. Epub 2019 Jul 8.PMID: 31282050). В отличие от традиционных подходов к лечению гемофилии, генная терапия с использованием AAV позволяет поддерживать уровень экспрессии привнесенного FVIII на достаточном уровне в течение нескольких лет после однократного введения препарата пациентам (Long BR, Veron Р, Kuranda К, Hardet R, Mitchell N, Hayes GM, Wong WY, Lau K, Li M, Hock MB, Zoog SJ, Vettermann C, Mingozzi F, Schweighardt B. Early Phase Clinical Immunogenicity of Valoctocogene Roxaparvovec, an AAV5-Mediated Gene Therapy for Hemophilia A/ Mol Ther. 2021 Feb 3; 29(2):597-610. doi: 10.1016/j.ymthe.2020.12.008. Epub 2020 Dec 10. PMID: 33309883).

На данный момент, в мире нет ни одного зарегистрированного генотерапевтического препарата для лечения гемофилии А.

Таким образом, является актуальным разработка генотерапевтического препарата для лечения гемофилии А, а также решений, которые позволят улучшить эффективность генотерапевтического препарата для лечения гемофилии А.

Раскрытие сущности изобретения

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что использование нуклеиновой кислоты, кодирующей

1) слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX (СП-FIX), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или

2) слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида Карра цепи иммуноглобулина G (СП-IgGK), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или

3) слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin (СП-Lactalbumin), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

приводит к увеличению уровня продукции и активности белка FVIII-BDD по сравнению с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей белок FVIII-BDD с природным сигнальным пептидом FVIII (дикий тип).

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме, в том числе в составе вируса, которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Белок (Пептид)

В настоящем описании термины «пептид», «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.

Молекулы нуклеиновых кислот

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.

Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

Вектор

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает рекомбинантную вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту.

Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.

Применение

«Генная терапия» представляет собой вставку генов в клетки и/или ткани субъекта для лечения заболевания, обычно, наследственных заболеваний, при этом дефектный мутантный аллель заменяется или дополняется функциональным аллелем.

«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов.

Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

«Терапевтически эффективным количеством» или «эффективным количеством» считается количество вводимого терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.

Подробное описание изобретения

Нуклеиновая кислота

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD (фактор свертывания крови VIII с делетированным В доменом) и гетерологичного сигнального пептида, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях.

Сигнальный пептид обеспечивает транспорт белка интереса внутри клетки до целевых органелл или способствует секреции белка интереса в межклеточное пространство.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и сигнального пептида FIX с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и сигнального пептида Карра цепи иммуноглобулина G с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и сигнального пептида Lactalbumin с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. Данный слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 включает FVIII-BDD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и сигнальный пептид FIX с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Данный слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 включает FVIII-BDD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и сигнальный пептид Карра цепи иммуноглобулина G с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Данный слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 включает FVIII-BDD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и сигнальный пептид Lactalbumin с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11. Данная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12. Данная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида Карра цепи иммуноглобулина G, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13. Данная нуклеиновая кислота кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Экспрессионная кассета. Экспрессионный вектор.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, которая включает вышеуказанную нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида.

Термин «кассета, которая экспрессирует» или «экспрессионная кассета» при использовании в данном документе, в частности, относится к фрагменту ДНК, который способен в соответствующей обстановке запускать экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, последовательность которого включена в указанную экспрессионную кассету. При введении в клетку-хозяина экспрессионная кассета помимо прочего способна задействовать клеточные механизмы для транскрипции полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, в РНК, которая затем обычно дополнительно процессируется и, наконец, транслируется в представляющий интерес полипептид. Экспрессионная кассета может содержаться в экспрессионном векторе.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению содержит в качестве элемента промотор. Термин «промотор», используемый в настоящем документе, в частности, относится к элементу ДНК, который способствует транскрипции полинуклеотида, с которым функционально связан промотор. Промотор может также составлять часть элемента «промотор/энхансер». Хотя физические границы между элементами «промотор» и «энхансер» не всегда ясны, термин «промотор» обычно относится к месту на молекуле нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или связанные с ней факторы, и с которого инициируется транскрипция. Энхансеры усиливают активность промотора во времени, а также пространственно. В данной области известно множество промоторов, которые транскрипционно активны в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть разделены на два класса: на тех, которые функционируют конститутивно, и тех, которые регулируются индукцией или снятием репрессии. Для экспрессии белка пригодны оба класса. Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе.

Согласно одному варианту осуществления изобретения промотор HLP используется в экспрессионной кассете по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

промотор;

любая из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида;

сигнал полиаденилирования;

правый (второй) ITR.

Вышеуказанные структурные элементы экспрессионной кассеты являются функционально связанными между собой.

В контексте настоящего описания термин «функционально связанный» относится к связи полинуклеотидных (или полипептидных) элементов в функциональную связь. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в условиях функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, регуляторная последовательность транскрипции функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию указанной кодирующей последовательности. Термин «функционально связанный» означает, что связанные последовательности ДНК являются, как правило, непрерывными, и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белок, являются также непрерывными и находятся в рамке считывания.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает левый (первый) ITR с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает промотор HLP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает правый (второй) ITR с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14;

промотор с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15;

любая из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида;

сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 16;

правый (второй) ITR с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, или любую из вышеуказанных экспрессионных кассет.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный (экспрессионный) вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть вставлены в вирусный геном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы» («вектор экспрессии» или «экспрессионный вектор»)).

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть вставлены в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

В некоторых вариантах экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (AAV).

В некоторых вариантах AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-1, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 или AAV.HSC16.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор или кассета может включать последовательность контроля экспрессии. Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они вставлены. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора или кассеты, включая выбор последовательностей контроля экспрессии, может зависеть от таких факторов, как выбор типа клетки-хозяина для трансформации, требуемый уровень экспрессии белка, и т.д. Последовательности контроля экспрессии включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительные последовательности контроля экспрессии для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающего включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как TTR промотор, промотор нативных иммуноглобулинов, промотор актина, а также промотор HLP (hybrid liver-speciHc promotor). Последовательности контроля экспрессии включают, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга.

В дополнение к вышеуказанным генам и последовательностям контроля экспрессии, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор или кассету.

В одном из вариантов настоящего изобретения экспрессионный вектор относится к вектору, содержащему одну или несколько интересующих полинуклеотидных последовательностей, интересующих генов или трансгенов, которые фланкированы парвовирусными или инвертированными концевыми повторяющимися последовательностями (ITR).

Ни кассета, ни вектор по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих неструктурные белки (Rep) и структурные белки (Сар) аденоассоциированного вируса.

Клетка-хозяин

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения слитого белка на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида или для получения любого из вышеуказанных экспрессионных векторов, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида.

Термин «клетка-хозяин» при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор или кассету по изобретению. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Следует понимать, что «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.

Экспрессионные векторы или кассеты по изобретению могут быть использованы для трансфекции клетки млекопитающего, клетки растения, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Трансфекция может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными (экспрессионными) векторами.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NS0 клетки, клетки SP2, HEK-293Т клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (BHK), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки, SK-HEP1, HUH7, Hep-RG и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии по изобретению вводятся в клетки-хозяева млекопитающих слитый белок продуцируется путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии слитого белка в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения слитого белка в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Слитый белок может быть выделен из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с использованием человеческих эмбрионов.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

Фармацевтическая композиция

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки, который включает любой из вышеуказанных экспрессионных векторов или кассет.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция для доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки включает любой из вышеуказанных экспрессионных векторов или кассет в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Действующее вещество в вышеуказанной композиции находится в эффективном количестве, например, в биологически эффективном количестве.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных средств, распределяющих средств или средств доставки.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики).

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции она может включать буферную композицию, тонические агенты (осмолитик или осмотический агент), стабилизаторы и/или солюбилизаторы.

«Фармацевтически приемлемым» считается материал, который не имеет биологических или других противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансфекции клетки ех vivo или для введения in vivo любого из вышеуказанных экспрессионных векторов по изобретению непосредственно субъекту.

Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.

Фармацевтическая композиция по изобретению является стабильной.

Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8°С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция представляет собой раствор для внутривенного введения.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция представляет собой концентрат для приготовления раствора для внутривенного введения.

Применение

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных экспрессионных кассет или векторов или вышеуказанной композиции для доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных экспрессионных кассет или векторов или вышеуказанной композиции для обеспечения белком FVIII-BDD субъекта, который имеет гемофилию А и/или не имеет функциональных копий гена FVIII.

Под отсутствием функциональных копий гена FVIII подразумеваются инактивирующие мутации или делеции во всех копиях гена FVIII в геноме, которые приводят к потере или дефекту функции гена FVIII.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу обеспечения белком FVIII-BDD субъекта с гемофилией А, который включает введение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных экспрессионных векторов или вышеуказанной композиции в клетки субъекта, нуждающегося в этом.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки субъекта с гемофилией А, который включает введение любого из вышеуказанных экспрессионных векторов или вышеуказанной композиции в клетки субъекта.

Под субъектом, нуждающимся в доставке гена FVIII-BDD в целевые клетки, или субъектом, нуждающимся в обеспечении белком FVIII-BDD, подразумевается субъект, который имеет гемофилию А, или субъект, который имеет дефицит фактора свертывания крови FVIII, или субъект, который имеет инактивирующие мутации или делеции в гене FVIII, которые приводят к потере или дефекту функции гена FVIII.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных экспрессионных векторов или вышеуказанной композиции для лечения гемофилии А у субъекта, который имеет гемофилию А.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения гемофилии А у субъекта, который включает ведение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных экспрессионных векторов или вышеуказанной композиции субъекту, который имеет гемофилию А.

В некоторых вариантах гемофилия А представляет собой тяжелую форму гемофилии А (активность фактора VIII <1%) или среднетяжелую форму гемофилии А (активность фактора VIII 1-5%).

Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов или вышеуказанная композиция вводится субъекту как внутривенная инфузия.

Любой из вышеуказанных экспрессионных векторов вводят в организм в эффективном количестве. Любой из вышеуказанных экспрессионных векторов предпочтительно вводят в организм в биологически эффективном количестве. «Биологически эффективное» количество экспрессионного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию клеток и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если экспрессионный вектор вводят в клетку in vivo, «биологически эффективное» количество экспрессионного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию клеток-мишеней и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени.

Дозировки любого из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению будут зависеть от способа введения конкретного вектора, и их можно определять рутинными способами.

Клетка для введения любого из вышеуказанных экспрессионных кассет или векторов по данному изобретению может быть клеткой любого типа, включая в себя без ограничения, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки кожи, дыхательных путей и кишечника), печеночные клетки, мышечные клетки, клетки селезенки, фибробласты, эндотелиальные клетки и тому подобное.

Любой из вышеуказанных экспрессионных кассет или векторов по данному изобретению не используется для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению, а также препарат на его основе применяют в формате монотерапии.

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению, а также препарат на его основе применяют в комбинации с заместительной терапией концентратами факторов свертывания, десмопрессином и/или ингибиторами фибринолиза.

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению, а также препарат на его основе применяют в комбинации с моноклональным антителом (например, эмицизумаб).

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению, а также препарат на его основе применяют в комбинации с препаратами на базе технологии РНК-интерференции (например, фитусиран).

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению, а также препарат на его основе вводят субъекту однократно.

В некоторых вариантах применения любой из вышеуказанных экспрессионных векторов по данному изобретению, а также препарат на его основе вводят субъекту многократно.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой график, который показывает увеличение уровня продукции белка FVIII-BDD в культуральную жидкость после трансфекции нуклеиновыми кислотами, кодирующими слитый белок на основе FVIII-BDD (фактор свертывания крови VIII с делетированным В доменом) и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, по сравнению с нуклеиновой кислотой, кодирующей FVIII-BDD с сигнальным пептидом FVIII дикого типа.

1 - уровень белка FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и природного сигнального пептида FVIII, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD).

2 - уровень белка FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (СП-FIX-FVIII-BDD).

3 - уровень белка FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (СП-Lactalbumin-FVIII-BDD).

4 - уровень белка FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Карра цепь иммуноглобулина G, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (СП-IgGK-FVIII-BDD).

Фигура 2 представляет собой график, который показывает увеличение уровня активности белка FVIII-BDD в культуральной жидкости после трансфекции нуклеиновыми кислотами, кодирующими слитый белок на основе FVIII-BDD (фактор свертывания крови VIII с делетированным В доменом) и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, по сравнению с нуклеиновой кислотой, кодирующей FVIII-BDD с сигнальным пептидом FVIII дикого типа.

1 - уровень активности FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и природного сигнального пептида FVIII, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD).

2 - уровень активности FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (СП-FIX-FVIII-BDD).

3 - уровень активности FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (СП-Lactalbumin-FVIII-BDD).

4 - уровень активности FVIII-BDD после трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Карра цепь иммуноглобулина G, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (СП-IgGK-FVIII-BDD).

Фигура 3 представляет собой график, который показывает увеличение уровня продукции белка FVIII-BDD при доставке in vitro нуклеиновых кислот в виде экспрессионного вектора на основе rAAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, по сравнению с экспрессионным вектором на основе rAAV, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую FVIII-BDD с сигнальным пептидом FVIII дикого типа.

1 - уровень белка FVIII-BDD после трансдукции клеток экспрессионными векторами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и природного сигнального пептида FVIII, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD).

2 - уровень белка FVIII-BDD после трансдукции клеток экспрессионными векторами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (СП-FIX-FVIII-BDD).

3 - уровень белка FVIII-BDD после трансдукции клеток экспрессионными векторами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (СП-Lactalbumin FVIII-BDD).

Фигура 4 представляет собой график, который показывает увеличение уровня активности белка FVIII-BDD при доставке in vitro нуклеиновых кислот в виде экспрессионного вектора на основе rAAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, по сравнению с экспрессионным вектором на основе rAAV, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую FVIII-BDD с сигнальным пептидом FVIII дикого типа.

1 - уровень активности FVIII-BDD после трансдукции клеток экспрессионными векторами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и природного сигнального пептида FVIII, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD).

2 - уровень активности FVIII-BDD после трансдукции клеток экспрессионными векторами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (СП-FIX-FVIII-BDD).

3 - уровень активности FVIII-BDD после трансдукции клеток экспрессионными векторами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (СП-Lactalbumin FVIII-BDD).

Фигура 5 представляет собой график, который показывает увеличение уровня белка FVIII-BDD при доставке нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, in vivo мышам линии B6.129S-F8tm1Smoc (HemA) в виде экспрессионного вектора на основе rAAV.

1 - уровень белка FVIII-BDD в плазме крови животных после инъекции контрольный раствор без AAV (негативный контроль).

2 - уровень белка FVIII-BDD в плазме крови животных после инъекции экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и сигнального пептида FIX, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (СП-FIX-FVIII-BDD).

3 - уровень белка FVIII-BDD в плазме крови животных после инъекции экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (СП-Lactalbumin FVIII-BDD).

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Материалы и общие методы

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей. Вкратце, плазмидную ДНК нарабатывали для дальнейших манипуляций в клетках Е. coli, выращиваемых под селективным давлением с антибиотиками для того, чтобы плазмиды не терялись в клеточной популяции. Плазмидную ДНК выделяли из клеток коммерческими наборами, измеряли концентрацию и использовали для клонирования с помощью обработки эндонуклеазами рестрикции или методами ПЦР-амплификации. Фрагменты ДНК лигировали между собой с помощью лигаз и трансформировали в бактериальные клетки для отбора клонов и дальнейших наработок. Все полученные генетические конструкции подтверждали по паттернам рестрикции и полным секвенированием по Сэнгеру.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные фрагменты длиной от 300 до 1000 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем ренатурации олигонуклеотидов друг на друге с последующей ПЦР-амплификацией с крайних праймеров. В результате получали смесь фрагментов, включая нужный. Фрагменты клонировали по сайтам рестрикции в промежуточные векторы, после чего последовательности ДНК субклонированных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сэнгеру. Анализ последовательностей ДНК и белков и обработку данных о последовательностях осуществляли в программе SnapGene 4.2 и выше для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.

Культивирование клеточных культур

В экспериментах были использованы клеточные линии HEK293 (Human Embryonic Kidney clone 293), HUH7 (human hepatocellular carcinoma cell lines) и HepG2 (human hepatocellular carcinoma cell lines). Суспензионные клетки HEK293, используемые для наработки AAV, культивировались в стандартных условиях при 37°С и 5% CO₂, на полной питательной среде без FBS и антибиотика. Адгезионные клетки HUH7 и HepG2, используемые для проверки эффективности препаратов AAV, культивировались в стандартных условиях при 37°С и 5% СО₂, на полной питательной среде DMEM добавлением 10% FBS, антибиотика/антимикотика. Пересев клеток HUH7 и HepG2 осуществлялся при достижении 80-90% конфлюентности. Для диссоциации клеточного монослоя использовался TrypLE Select enzyme (10х). Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью окраски Trypan Blue и одноразовых камер для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика Countess II.

Трансфекции клеточных культур

Для оценки функциональности новых вариантов слитых белков при трансфекции использовались плазмиды, содержащие экспрессионную кассету для экспрессии различных вариантов трансгенов hFVIII-BDD. Клеточную линию HepG2 заранее засевали в лунки 12-луночных планшетов с плотностью 10000 кл/см². Через сутки вносились плазмиды в одинаковой копийности в составе комплекса с Lipofectamine 3000. На 7 день после трансфекции определяли содержание белка FVIII-BDD и его активность в культуральной жидкости методом ИФА и хромогенного теста. Работы по оценке уровня и активности белка FVIII-BDD в культуральной жидкости проводились в 6 независимых экспериментах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки HepG2.

Сборка и очистка экспрессионных векторов на основе AAV

Для сборки экспрессионных векторов на основе AAV, содержащих кодон-оптимизированные варианты гена FVIII-BDD, использовали клетки-продуценты HEK293, которые трансфецировали 3-мя плазмидами:

1) плазмиды, содержащие экспрессионную кассету AAV для экспрессии различных вариантов трансгенов hFVIII-BDD;

2) плазмида для экспрессии гена Сар серотипа AAV6 и гена Rep серотипа AAV2. Каждый ген с помощью альтернативных рамок считывания кодирует несколько белковых продуктов;

3) плазмида для экспрессии генов аденовируса Ad2, необходимых для сборки и упаковки капсидов AAV.

Через 72 часа клетки лизировали и проводили очистку и концентрирование частиц с помощью методов фильтрации, хроматографии и ультрацентрифугирования. Титр частиц определяли с помощью количественной ПЦР с праймерами и пробой, специфичными к участку рекомбинантного вирусного генома, и выражали в виде количества копий вирусных геномов на 1 мл.

Трансдукция клеточных культур

Клеточную линию HUH7 заранее засевали в лунки 12-луночных планшетов с плотностью 10000 кл/см². После прикрепления клеток к адгезивной подложке, вносились препараты AAV при MOI 500000 вг/кл. На 7 день после трансдукции определяли содержание белка FVIII-BDD и его активность в культуральной жидкости методом ИФА и хромогенным тестом. Работы по оценке уровня и активности белка FVIII-BDD в культуральной жидкости проводились в 6 независимых экспериментах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.

Определение количества белка фактора свертывания крови VIII BDD методом ИФА

Оценка содержания белка фактора свертывания крови VIII-BDD в культуральной жидкости после трансфекции клеток линии HepG2 и трансдукции клеток линии HUH7, а также после инъекции животным (мыши) в плазме крови целевыми кандидатами проводилась «сэндвич»-методом неконкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Вкратце, разведенные в буфере для разведений образцы, вносились в лунки 96-луночного планшета, сенсибилизированные первичными специфическими к фактору свертывания крови VIII-BDD антителами. В этот же планшет вносились стандарты для построения калибровочной кривой, контроли. Планшет инкубировался 1 час при температуре 37°С. Производили отмывку лунок планшета отмывочным буфером перед внесением биотинилированных антител, раствора конъюгата стрептавидин-пероксидазы и ТМВ. Вносился раствор со специфическими биотинилированными детектирующими антителами к фактору VIII-BDD и планшет инкубировался 30 минут при температуре 37°С. Далее к образовавшемуся комплексу добавлялся раствор конъюгата стрептавидин-пероксидазы и планшет инкубировался 30 минут при температуре 37°С. Для визуализации ферментативной реакции вносился раствор ТМВ. По достижении нужной степени интенсивности окрашивания во все лунки добавляется стоп-раствор для остановки реакции. Далее измерялась оптическая плотность растворов в лунках планшета. Концентрация фактора свертывания крови VIII-BDD в исследуемых образцах определялась по калибровочной кривой с учетом предварительного разведения образцов.

Определение уровня активности белка фактора свертывания крови VIII BDD методом ИФА

Оценка активности белка фактора свертывания крови VIII в культуральной жидкости после трансфекции клеток линии HepG2 и трансдукции клеток линии HUH7 целевыми кандидатами проводилась при помощи хромогенного теста. Суть теста заключается в том, что в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и фактора IXa фактор X переходит в активированную форму Ха, фактор VIII действует как кофактор в этой реакции, и скорость активации фактора X линейно связана с количество фактора VIII. Вкратце, разведенные в буфере для разведений образцы культуральной жидкости, стандарты для построения калибровочной кривой и контроли вносились в лунки 96-луночного планшета. Планшет инкубировался 3 минуты при температуре 37°С. Во все лунки планшета вносили раствор Factor reagent, содержащий фактор IXa, фактор X, тромбин, CaCl₂ и фосфолипиды. Планшет инкубировался 4 минуты при температуре 37°С. Во все лунки планшета вносили раствор хромогенного субстрата S-2765+I-2581. Планшет инкубировался 7 минут при температуре 37°С. По достижению нужной степени интенсивности окрашивания во все лунки добавляли 20% раствор уксусной кислоты для остановки реакции. Далее измерялась оптическая плотность растворов в лунках планшета. Активность фактора свертывания крови VIII в исследуемых образцах определялась по калибровочной кривой с учетом предварительного разведения образцов.

Проведение in vivo исследования на лабораторных животных

Для экспериментов были использованы мыши линии B6.129S-F8tm1Smoc (HemA), дефицитные по FVIII (самцы возрастом 6-8 недель). Препараты вводили животным однократно путем внутривенного введения в хвостовую вену. Группе животных отрицательного контроля вводился буферный раствор, не содержащий AAV. Отбор плазмы крови производился в день инъекции до введения препаратов, далее - на 14 и 56 дни после введения экспрессионных векторов.

Статистический анализ данных

Результаты представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (SD), для сравнения результатов эксперимента использовали однофакторный дисперсионный анализ с поправкой на множественные попарные сравнения по методу Даннета (One-way ANOVA), и они были определены как статистически значимые.

Пример 1

С целью повышения уровня секреции белка FVIII-BDD (фактор свертывания крови VIII с делетированным В доменом) последовательность SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD) была модифицирована путем замены последовательности сигнального пептида FVIII дикого типа на сигнальный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2 (СП-FIX) или SEQ ID NO: 3 (СП-IgGK) или SEQ ID NO: 4 (СП-Lactalbumin), что привело к получению слитых белков, соответствующих аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 7 (СП-FIX-FVIII-BDD), SEQ ID NO: 8 (СП-IgGK-FVIII-BDD) и SEQ ID NO: 9 (СП-LactalbuminFVIII-BDD).

Полученные нами нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, были проверены при трансфекции клеток линии in vitro в составе экспрессионной кассеты, состоящей из левого (первого) ITR (инвертированные концевые повторы), соответствующего последовательности SEQ ID NO: 14, промотора HLP (SEQ ID NO: 15), гена интереса, сигнала полиаденилирования (SEQ ID NO: 16), правого (второго) ITR (SEQ ID NO: 17), где геном интереса является одна из последовательностей SEQ ID NO: 10-13. В качестве контроля использовалась нуклеиновая кислота, которая кодирует белок человеческого FVIII-BDD, включая природный сигнальный пептид FVIII-BDD, соответствующая последовательности SEQ ID NO 10 (СП-FVIII-FVIII-BDD).

Использование всех нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 11-13, кодирующих слитые белки на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов с последовательностями SEQ ID NO: 7-9, привело к увеличению уровня продукции (Фигура 1) и активности (Фигура 2) белка FVIII-BDD по сравнению с использованием нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 10, кодирующей белок FVIII-BDD с природным сигнальным пептидом SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD). При этом неожиданное увеличение уровня продукции белка FVIII-BDD в полученной после трансфекции культуральной жидкости по сравнению с использованием нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 10 (СП-FVIII-FVIII-BDD) в 4,3 раза показала последовательность SEQ ID NO: 11 (СП-FIX-FVIII-BDD), в 1,3 раза показала последовательность SEQ ID NO: 12 (СП-IgGK-FVIII-BDD), и в 4,9 раз показала последовательность SEQ ID NO: 13 (СП-LactalbuminFVIII-BDD). Аналогичные данные наблюдались по активности FVIII-BDD в полученной после трансфекции культуральной жидкости: наблюдалось неожиданное увеличение при сравнении нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 10 (СП-FVIII-FVIII-BDD) с нуклеиновыми кислотами SEQ ID NO: 11 (СП-FIX-FVIII-BDD) (увеличение в 8,6 раз), с SEQ ID NO: 12 (СП-IgGK-FVIII-BDD) (увеличение в 1,9 раз) и с SEQ ID NO: 13 (СП-LactalbuminFVIII-BDD) (увеличение в 7,2 раза). Наблюдаемое соответствие между результатами по продукции и активности белка FVIII-BDD говорит о том, что замена природного сигнального пептида FVIII-BDD на сигнальный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности указанной в SEQ ID NO: 2 (СП-FIX), или SEQ ID NO: 3 (СП-IgGK), или SEQ ID NO: 4 (СП-Lactalbumin) приводит к значительному увеличению продукции и активности белка FVIII-BDD, но при этом не влияет на функциональность белка FVIII-BDD.

Таким образом, полученные нами нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, способны приводить к экспрессии белка FVIII-BDD in vitro в клетке-хозяине и обладают высоким потенциалом для получения рекомбинантного белка FVIII-BDD в клетках-продуцентах для терапии Гемофилии А.

Пример 2

Были получены экспрессионные векторы на основе rAAV, содержащие нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 11-13, которые кодируют слитые белки на основе FVIII-BDD и гетерологичные сигнальные пептиды, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7-9. Указанные экспрессионные вектора были проверены при трансдукции клеток линии HUH7 in vitro. В качестве контроля использовался экспрессионные вектор на основе rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 10, которая кодирует белок человеческого FVIII-BDD, включая природный сигнальный пептид FVIII, соответствующая последовательности SEQ ID NO: 6 (СП-FVIII-FVIII-BDD).

Использование экспрессионных векторов, содержащих нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 11-13, привело к увеличению уровня продукции (Фигура 3) и активности (Фигура 4) белка FVIII-BDD по сравнению с использованием экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 10 (СП-FVIII-FVIII-BDD). При этом неожиданное увеличение уровня продукции белка FVIII-BDD в полученной после трансдукции культуральной жидкости по сравнению с использованием экспрессионного вектора с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 10 (СП-FVIII-FVIII-BDD) в 2,7 раза показал экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 11 (СП-FIX-FVIII-BDD), в 2,4 раза показал экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 13 (СП-Lactalbumin-FVIII-BDD). Аналогичные данные наблюдались по активности FVIII-BDD в полученной после трансдукции культуральной жидкости. Наблюдалось неожиданное увеличение при сравнении экспрессионного вектора с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 10 (СП-FVIII-FVIII-BDD) с экспрессионными векторами с нуклеиновыми кислотами SEQ ID NO: 11 (СП-FIX-FVIII-BDD) (увеличение в 3,9 раза) и с SEQ ID NO: 13 (СП-Lactalbumin-FVIII-BDD) (увеличение в 3,5 раза). Полученные результаты находятся в соответствии с данными, полученными при трансфекции клеток линии HepG2.

Таким образом, разработанные экспрессионные вектора на основе rAAV, кодирующие слитые белки на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, способны приводить к экспрессии белка FVIII-BDD; in vitro.

Пример 3

Для проведения in vivo исследований экспрессионных векторов на основе rAAV, содержащих нуклеиновую кислоту, выбранную из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, которые кодируют слитые белки на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9, были использованы лабораторные мыши линии В6.129S-F8tm1Smoc (HemA), дефицитные по FVIII. В исследовании использовали дозу rAAV препаратов равную 6×10¹³ вг/кг. В качестве негативного контроля был использованы контрольный раствор без AAV. Препараты вводили животным однократно путем внутривенного гидродинамического введения в хвостовую вену. Отбор плазмы крови производился в день инъекции до введения препаратов, далее - на 14 и 56 дни после введения препаратов. В образцах плазмы крови определяли уровень белка фактора свертывания крови VIII-BDD методом ИФА, как было описано выше.

В результате проведенных in vivo исследований (Фигура 5) было показано, что в случае использования обоих экспрессионных векторов на основе rAAV, содержащих нуклеиновую кислоту, выбранную из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, наблюдается достоверное увеличение количества фактора VIII-BDD в плазме крови животных на 14 и на 56 дни (Фигура 5). В случае использования экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 11, в плазме крови животных на 14 и 56 дни после инъекции наблюдалась экспрессия FVIII-BDD на уровне 296 и 504 нг/мл, соответственно. В случае использования экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 13, в плазме крови животных на 14 и 56 дни после инъекции наблюдалась экспрессия FVIII-BDD на уровне 270 и 381 нг/мл, соответственно.

Таким образом, разработанные экспрессионные вектора на основе rAAV, содержащие нуклеиновую кислоту, выбранную из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, которые кодируют слитые белки на основе FVIII-BDD и одного из гетерологичных сигнальных пептидов, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9, способны приводить к экспрессии белка FVIII-BDD in vivo и обладают высоким потенциалом для генной терапии Гемофилии А.

--->

Перечень последовательностей

<110> АО "БИОКАД"

<120> Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе

FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, и ее применение

<160> 17

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид FVIII

<400> 1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид FIX

<400> 2

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys

20 25

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид Kappa цепи иммуноглобулина G

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид Lactalbumin

<400> 4

Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala

1 5 10 15

Thr Gln Ala

<210> 5

<211> 1438

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок FVIII-BDD (фактор свёртывания крови VIII c делетированным B

доменом)

<400> 5

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His

740 745 750

Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile

755 760 765

Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp

770 775 780

Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

785 790 795 800

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly

805 810 815

Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser

820 825 830

Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser

835 840 845

Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu

850 855 860

Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr

865 870 875 880

Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile

885 890 895

Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe

900 905 910

Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His

915 920 925

Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe

930 935 940

Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro

945 950 955 960

Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln

965 970 975

Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr

980 985 990

Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro

995 1000 1005

Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe

1010 1015 1020

His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met

1025 1030 1035 1040

Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn

1045 1050 1055

Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg

1060 1065 1070

Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val

1075 1080 1085

Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val

1090 1095 1100

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe

1105 1110 1115 1120

Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly

1125 1130 1135

His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp

1140 1145 1150

Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp

1155 1160 1165

Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1170 1175 1180

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys

1205 1210 1215

Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe

1220 1225 1230

Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro

1235 1240 1245

Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile

1250 1255 1260

Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys

1265 1270 1275 1280

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile

1285 1290 1295

Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser

1300 1305 1310

Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln

1315 1320 1325

Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met

1330 1335 1340

Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser

1345 1350 1355 1360

Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln

1365 1370 1375

Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn

1380 1385 1390

Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu

1395 1400 1405

Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1410 1415 1420

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1425 1430 1435

<210> 6

<211> 1457

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок FVIII-BDD с сигнальным дикого типа (СП-FVIII-FVIII-BDD)

<400> 6

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

755 760 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

770 775 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785 790 795 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

805 810 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

900 905 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

930 935 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

965 970 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

980 985 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys

1010 1015 1020

Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn

1025 1030 1035 1040

Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly

1045 1050 1055

Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met

1060 1065 1070

Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe

1075 1080 1085

Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr

1090 1095 1100

Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile

1105 1110 1115 1120

Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser

1125 1130 1135

Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met

1140 1145 1150

Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr

1155 1160 1165

Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile

1170 1175 1180

Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln

1205 1210 1215

Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu

1220 1225 1230

Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

1235 1240 1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile

1250 1255 1260

Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His

1265 1270 1275 1280

Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu

1285 1290 1295

Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp

1300 1305 1310

Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp

1315 1320 1325

Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp

1330 1335 1340

Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln

1345 1350 1355 1360

Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu

1365 1370 1375

Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp

1380 1385 1390

Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe

1395 1400 1405

Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro

1410 1415 1420

Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His

1425 1430 1435 1440

Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu

1445 1450 1455

Tyr

<210> 7

<211> 1466

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального

пептида FIX (СП-FIX-FVIII-BDD)

<400> 7

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Ala Thr Arg Arg

20 25 30

Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp

35 40 45

Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys

50 55 60

Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val

65 70 75 80

Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp

85 90 95

Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val

100 105 110

Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala

115 120 125

Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp

130 135 140

Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala

165 170 175

Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu

180 185 190

Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg

195 200 205

Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile

210 215 220

Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr

225 230 235 240

Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp

245 250 255

Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly

260 265 270

Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met

275 280 285

Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe

290 295 300

Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr

305 310 315 320

Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu

325 330 335

Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val

340 345 350

Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn

355 360 365

Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp

370 375 380

Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg

385 390 395 400

Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala

405 410 415

Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp

420 425 430

Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly

435 440 445

Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe

450 455 460

Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu

465 470 475 480

Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln

485 490 495

Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg

500 505 510

Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp

515 520 525

Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr

530 535 540

Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr

545 550 555 560

Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile

565 570 575

Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn

580 585 590

Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp

595 600 605

Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro

610 615 620

Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn

625 630 635 640

Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser

645 650 655

Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala

660 665 670

Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His

675 680 685

Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu

690 695 700

Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys

705 710 715 720

His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val

725 730 735

Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu

740 745 750

Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg

755 760 765

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile

770 775 780

Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp

785 790 795 800

Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu

805 810 815

Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr

820 825 830

Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser

835 840 845

Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe

850 855 860

Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro

865 870 875 880

Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr

885 890 895

Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln

900 905 910

Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu

915 920 925

Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn

930 935 940

Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr

945 950 955 960

Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp

965 970 975

Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys

980 985 990

His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln

995 1000 1005

Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr

1010 1015 1020

Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln

1025 1030 1035 1040

Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn

1045 1050 1055

Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln

1060 1065 1070

Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His

1075 1080 1085

Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu

1090 1095 1100

Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val

1105 1110 1115 1120

Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile

1125 1130 1135

Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser

1140 1145 1150

Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp

1155 1160 1165

Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu

1170 1175 1180

Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu

1185 1190 1195 1200

Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His

1205 1210 1215

Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile

1220 1225 1230

Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr

1235 1240 1245

Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val

1250 1255 1260

Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala

1265 1270 1275 1280

Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu

1285 1290 1295

Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu

1300 1305 1310

Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser

1315 1320 1325

Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu

1330 1335 1340

His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro

1345 1350 1355 1360

Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly

1365 1370 1375

Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys

1380 1385 1390

Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe

1395 1400 1405

Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe

1410 1415 1420

Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu

1425 1430 1435 1440

Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu

1445 1450 1455

Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1460 1465

<210> 8

<211> 1458

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального

пептида Kappa цепь иммуноглобулина G (СП-IgGK-FVIII-BDD)

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu

20 25 30

Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala

35 40 45

Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val

50 55 60

Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn

65 70 75 80

Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile

85 90 95

Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala

100 105 110

Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu

130 135 140

Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val

145 150 155 160

Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu

180 185 190

Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys

195 200 205

Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu

210 215 220

Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg

225 230 235 240

Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly

245 250 255

Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser

260 265 270

Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser

275 280 285

Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala

290 295 300

Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu

305 310 315 320

Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln

325 330 335

His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu

340 345 350

Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp

355 360 365

Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn

370 375 380

Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys

385 390 395 400

Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala

405 410 415

Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu

420 425 430

Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe

435 440 445

Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His

450 455 460

Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr

465 470 475 480

Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr

485 490 495

Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro

500 505 510

Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile

515 520 525

Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser

530 535 540

Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu

545 550 555 560

Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys

565 570 575

Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn

580 585 590

Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr

595 600 605

Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu

610 615 620

Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr

625 630 635 640

Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr

645 650 655

Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe

660 665 670

Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu

675 680 685

Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn

690 695 700

Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg

705 710 715 720

Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly

725 730 735

Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser

740 745 750

Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val

755 760 765

Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp

770 775 780

Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys

785 790 795 800

Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser

805 810 815

Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu

820 825 830

Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala

835 840 845

Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe

850 855 860

Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu

865 870 875 880

His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn

885 890 895

Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr

900 905 910

Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro

915 920 925

Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys

930 935 940

Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala

945 950 955 960

Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly

965 970 975

Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala

980 985 990

His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile

995 1000 1005

Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn

1010 1015 1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu

1025 1030 1035 1040

Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro

1045 1050 1055

Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser

1060 1065 1070

Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val

1075 1080 1085

Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu

1090 1095 1100

Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly

1105 1110 1115 1120

Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met

1125 1130 1135

Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly

1140 1145 1150

Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln

1155 1160 1165

Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser

1170 1175 1180

Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp

1185 1190 1195 1200

Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg

1205 1210 1215

Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser

1220 1225 1230

Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr

1235 1240 1245

Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn

1250 1255 1260

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr

1265 1270 1275 1280

His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp

1285 1290 1295

Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser

1300 1305 1310

Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr

1315 1320 1325

Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala

1330 1335 1340

Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe

1345 1350 1355 1360

Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser

1365 1370 1375

Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln

1380 1385 1390

Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val

1395 1400 1405

Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp

1410 1415 1420

Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val

1425 1430 1435 1440

His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp

1445 1450 1455

Leu Tyr

<210> 9

<211> 1457

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок на основе человеческого FVIII-BDD и сигнального

пептида Lactalbumin (СП-Lactalbumin-FVIII-BDD)

<400> 9

Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala

1 5 10 15

Thr Gln Ala Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

755 760 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

770 775 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785 790 795 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

805 810 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

900 905 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

930 935 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

965 970 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

980 985 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys

1010 1015 1020

Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn

1025 1030 1035 1040

Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly

1045 1050 1055

Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met

1060 1065 1070

Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe

1075 1080 1085

Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr

1090 1095 1100

Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile

1105 1110 1115 1120

Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser

1125 1130 1135

Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met

1140 1145 1150

Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr

1155 1160 1165

Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile

1170 1175 1180

Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln

1205 1210 1215

Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu

1220 1225 1230

Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

1235 1240 1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile

1250 1255 1260

Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His

1265 1270 1275 1280

Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu

1285 1290 1295

Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp

1300 1305 1310

Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp

1315 1320 1325

Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp

1330 1335 1340

Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln

1345 1350 1355 1360

Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu

1365 1370 1375

Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp

1380 1385 1390

Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe

1395 1400 1405

Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro

1410 1415 1420

Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His

1425 1430 1435 1440

Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu

1445 1450 1455

Tyr

<210> 10

<211> 4374

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая кодирует белок FVIII-BDD с

сигнальным дикого типа (СП-FVIII-FVIII-BDD)

<400> 10

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180

acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240

gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300

gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340

cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400

gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460

cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520

catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580

caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640

ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700

agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760

cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820

ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880

gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940

ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000

tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060

gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120

tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180

caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240

attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300

tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360

tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420

gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480

cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540

tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600

ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660

ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720

cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780

aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840

tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900

atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960

tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020

agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080

aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200

cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260

tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta ctga 4374

<210> 11

<211> 4401

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе

человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида FIX

(СП-FIX-FVIII-BDD)

<400> 11

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60

ggatatctac tcagtgctga atgtgccacc agaagatact acctgggtgc agtggaactg 120

tcatgggact atatgcaaag tgatctcggt gagctgcctg tggacgcaag atttcctcct 180

agagtgccaa aatcttttcc attcaacacc tcagtcgtgt acaaaaagac tctgtttgta 240

gaattcacgg atcacctttt caacatcgct aagccaaggc caccctggat gggtctgcta 300

ggtcctacca tccaggctga ggtttatgat acagtggtca ttacacttaa gaacatggct 360

tcccatcctg tcagtcttca tgctgttggt gtatcctact ggaaagcttc tgagggagct 420

gaatatgatg atcagaccag tcaaagggag aaagaagatg ataaagtctt ccctggtgga 480

agccatacat atgtctggca ggtcctgaaa gagaatggtc caatggcctc tgacccactg 540

tgccttacct actcatatct ttctcatgtg gacctggtaa aagacttgaa ttcaggcctc 600

attggagccc tactagtatg tagagaaggg agtctggcca aggaaaagac acagaccttg 660

cacaaattta tactactttt tgctgtattt gatgaaggga aaagttggca ctcagaaaca 720

aagaactcct tgatgcagga tagggatgct gcatctgctc gggcctggcc taaaatgcac 780

acagtcaatg gttatgtaaa caggtctctg ccaggtctga ttggatgcca caggaaatca 840

gtctattggc atgtgattgg aatgggcacc actcctgaag tgcactcaat attcctcgaa 900

ggtcacacat ttcttgtgag gaaccatcgc caggcgtcct tggaaatctc gccaataact 960

ttccttactg ctcaaacact cttgatggac cttggacagt ttctactgtt ttgtcatatc 1020

tcttcccacc aacatgatgg catggaagct tatgtcaaag tagacagctg tccagaggaa 1080

ccccaactac gaatgaaaaa taatgaagaa gcggaagact atgatgatga tcttactgat 1140

tctgaaatgg atgtggtcag gtttgatgat gacaactctc cttcctttat ccaaattcgc 1200

tcagttgcca agaagcatcc taaaacttgg gtacattaca ttgctgctga agaggaggac 1260

tgggactatg ctcccttagt cctcgccccc gatgacagaa gttataaaag tcaatatttg 1320

aacaatggcc ctcagcggat tggtaggaag tacaaaaaag tccgatttat ggcatacaca 1380

gatgaaacct ttaagactcg tgaagctatt cagcatgaat caggaatctt gggaccttta 1440

ctttatgggg aagttggaga cacactgttg attatattta agaatcaagc aagcagacca 1500

tataacatct accctcacgg aatcactgat gtccgtcctt tgtattcaag gagattacca 1560

aaaggtgtaa aacatttgaa ggattttcca attctgccag gagaaatatt caaatataaa 1620

tggacagtga ctgtagaaga tgggccaact aaatcagatc ctcggtgcct gacccgctat 1680

tactctagtt tcgttaatat ggagagagat ctagcttcag gactcattgg ccctctcctc 1740

atctgctaca aagaatctgt agatcaaaga ggaaaccaga taatgtcaga caagaggaat 1800

gtcatcctgt tttctgtatt tgatgagaac cgaagctggt acctcacaga gaatatacaa 1860

cgctttctcc ccaatccagc tggagtgcag cttgaggatc cagagttcca agcctccaac 1920

atcatgcaca gcatcaatgg ctatgttttt gatagtttgc agttgtcagt ttgtttgcat 1980

gaggtggcat actggtacat tctaagcatt ggagcacaga ctgacttcct ttctgtcttc 2040

ttctctggat ataccttcaa acacaaaatg gtctatgaag acacactcac cctattccca 2100

ttctcaggag aaactgtctt catgtcgatg gaaaacccag gtctatggat tctggggtgc 2160

cacaactcag actttcggaa cagaggcatg accgccttac tgaaggtttc tagttgtgac 2220

aagaacactg gtgattatta cgaggacagt tatgaagata tttcagcata cttgctgagt 2280

aaaaacaatg ccattgaacc aagaagcttc tctcaaaacc caccagtctt gaaacgccat 2340

caacgggaaa taactcgtac tactcttcag tcagatcaag aggaaattga ctatgatgat 2400

accatatcag ttgaaatgaa gaaggaagat tttgacattt atgatgagga tgaaaatcag 2460

agcccccgca gctttcaaaa gaaaacacga cactatttta ttgctgcagt ggagaggctc 2520

tgggattatg ggatgagtag ctccccacat gttctaagaa acagggctca gagtggcagt 2580

gtccctcagt tcaagaaagt tgttttccag gaatttactg atggctcctt tactcagccc 2640

ttataccgtg gagaactaaa tgaacatttg ggactcctgg ggccatatat aagagcagaa 2700

gttgaagata atatcatggt aactttcaga aatcaggcct ctcgtcccta ttccttctat 2760

tctagcctta tttcttatga ggaagatcag aggcaaggag cagaacctag aaaaaacttt 2820

gtcaagccta atgaaaccaa aacttacttt tggaaagtgc aacatcatat ggcacccact 2880

aaagatgagt ttgactgcaa agcctgggct tatttctctg atgttgacct ggaaaaagat 2940

gtgcactcag gcctgattgg accccttctg gtctgccaca ctaacacact gaaccctgct 3000

catgggagac aagtgacagt acaggaattt gctctgtttt tcaccatctt tgatgagacc 3060

aaaagctggt acttcactga aaatatggaa agaaactgca gggctccctg caatatccag 3120

atggaagatc ccacttttaa agagaattat cgcttccatg caatcaatgg ctacataatg 3180

gatacactac ctggcttagt aatggctcag gatcaaagga ttcgatggta tctgctcagc 3240

atgggcagca atgaaaacat ccattctatt catttcagtg gacatgtgtt cactgtacga 3300

aaaaaagagg agtataaaat ggcactgtac aatctctatc caggtgtttt tgagacagtg 3360

gaaatgttac catccaaagc tggaatttgg cgggtggaat gccttattgg cgagcatcta 3420

catgctggga tgagcacact ttttctggtg tacagcaata agtgtcagac tcccctggga 3480

atggcttctg gacacattag agattttcag attacagctt caggacaata tggacagtgg 3540

gccccaaagc tggccagact tcattattcc ggatcaatca atgcctggag caccaaggag 3600

cccttttctt ggatcaaggt ggatctgttg gcaccaatga ttattcacgg catcaagacc 3660

cagggtgccc gtcagaagtt ctccagcctc tacatctctc agtttatcat catgtatagt 3720

cttgatggga agaagtggca gacttatcga ggaaattcca ctggaacctt aatggtcttc 3780

tttggcaatg tggattcatc tgggataaaa cacaatattt ttaaccctcc aattattgct 3840

cgatacatcc gtttgcaccc aactcattat agcattcgca gcactcttcg catggagttg 3900

atgggctgtg atttaaatag ttgcagcatg ccattgggaa tggagagtaa agcaatatca 3960

gatgcacaga ttactgcttc atcctacttt accaatatgt ttgccacctg gtctccttca 4020

aaagctcgac ttcacctcca agggaggagt aatgcctgga gacctcaggt gaataatcca 4080

aaagagtggc tgcaagtgga cttccagaag acaatgaaag tcacaggagt aactactcag 4140

ggagtaaaat ctctgcttac cagcatgtat gtgaaggagt tcctcatctc cagcagtcaa 4200

gatggccatc agtggactct cttttttcag aatggcaaag taaaggtttt tcagggaaat 4260

caagactcct tcacacctgt ggtgaactct ctagacccac cgttactgac tcgctacctt 4320

cgaattcacc cccagagttg ggtgcaccag attgccctga ggatggaggt tctgggctgc 4380

gaggcacagg acctctactg a 4401

<210> 12

<211> 4377

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе

человеческого FVIII-BDD и сигнального пептида Kappa цепь

иммуноглобулина G (СП-IgGK-FVIII-BDD)

<400> 12

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg gtcgaccggt 60

gccaccagaa gatactacct gggtgcagtg gaactgtcat gggactatat gcaaagtgat 120

ctcggtgagc tgcctgtgga cgcaagattt cctcctagag tgccaaaatc ttttccattc 180

aacacctcag tcgtgtacaa aaagactctg tttgtagaat tcacggatca ccttttcaac 240

atcgctaagc caaggccacc ctggatgggt ctgctaggtc ctaccatcca ggctgaggtt 300

tatgatacag tggtcattac acttaagaac atggcttccc atcctgtcag tcttcatgct 360

gttggtgtat cctactggaa agcttctgag ggagctgaat atgatgatca gaccagtcaa 420

agggagaaag aagatgataa agtcttccct ggtggaagcc atacatatgt ctggcaggtc 480

ctgaaagaga atggtccaat ggcctctgac ccactgtgcc ttacctactc atatctttct 540

catgtggacc tggtaaaaga cttgaattca ggcctcattg gagccctact agtatgtaga 600

gaagggagtc tggccaagga aaagacacag accttgcaca aatttatact actttttgct 660

gtatttgatg aagggaaaag ttggcactca gaaacaaaga actccttgat gcaggatagg 720

gatgctgcat ctgctcgggc ctggcctaaa atgcacacag tcaatggtta tgtaaacagg 780

tctctgccag gtctgattgg atgccacagg aaatcagtct attggcatgt gattggaatg 840

ggcaccactc ctgaagtgca ctcaatattc ctcgaaggtc acacatttct tgtgaggaac 900

catcgccagg cgtccttgga aatctcgcca ataactttcc ttactgctca aacactcttg 960

atggaccttg gacagtttct actgttttgt catatctctt cccaccaaca tgatggcatg 1020

gaagcttatg tcaaagtaga cagctgtcca gaggaacccc aactacgaat gaaaaataat 1080

gaagaagcgg aagactatga tgatgatctt actgattctg aaatggatgt ggtcaggttt 1140

gatgatgaca actctccttc ctttatccaa attcgctcag ttgccaagaa gcatcctaaa 1200

acttgggtac attacattgc tgctgaagag gaggactggg actatgctcc cttagtcctc 1260

gcccccgatg acagaagtta taaaagtcaa tatttgaaca atggccctca gcggattggt 1320

aggaagtaca aaaaagtccg atttatggca tacacagatg aaacctttaa gactcgtgaa 1380

gctattcagc atgaatcagg aatcttggga cctttacttt atggggaagt tggagacaca 1440

ctgttgatta tatttaagaa tcaagcaagc agaccatata acatctaccc tcacggaatc 1500

actgatgtcc gtcctttgta ttcaaggaga ttaccaaaag gtgtaaaaca tttgaaggat 1560

tttccaattc tgccaggaga aatattcaaa tataaatgga cagtgactgt agaagatggg 1620

ccaactaaat cagatcctcg gtgcctgacc cgctattact ctagtttcgt taatatggag 1680

agagatctag cttcaggact cattggccct ctcctcatct gctacaaaga atctgtagat 1740

caaagaggaa accagataat gtcagacaag aggaatgtca tcctgttttc tgtatttgat 1800

gagaaccgaa gctggtacct cacagagaat atacaacgct ttctccccaa tccagctgga 1860

gtgcagcttg aggatccaga gttccaagcc tccaacatca tgcacagcat caatggctat 1920

gtttttgata gtttgcagtt gtcagtttgt ttgcatgagg tggcatactg gtacattcta 1980

agcattggag cacagactga cttcctttct gtcttcttct ctggatatac cttcaaacac 2040

aaaatggtct atgaagacac actcacccta ttcccattct caggagaaac tgtcttcatg 2100

tcgatggaaa acccaggtct atggattctg gggtgccaca actcagactt tcggaacaga 2160

ggcatgaccg ccttactgaa ggtttctagt tgtgacaaga acactggtga ttattacgag 2220

gacagttatg aagatatttc agcatacttg ctgagtaaaa acaatgccat tgaaccaaga 2280

agcttctctc aaaacccacc agtcttgaaa cgccatcaac gggaaataac tcgtactact 2340

cttcagtcag atcaagagga aattgactat gatgatacca tatcagttga aatgaagaag 2400

gaagattttg acatttatga tgaggatgaa aatcagagcc cccgcagctt tcaaaagaaa 2460

acacgacact attttattgc tgcagtggag aggctctggg attatgggat gagtagctcc 2520

ccacatgttc taagaaacag ggctcagagt ggcagtgtcc ctcagttcaa gaaagttgtt 2580

ttccaggaat ttactgatgg ctcctttact cagcccttat accgtggaga actaaatgaa 2640

catttgggac tcctggggcc atatataaga gcagaagttg aagataatat catggtaact 2700

ttcagaaatc aggcctctcg tccctattcc ttctattcta gccttatttc ttatgaggaa 2760

gatcagaggc aaggagcaga acctagaaaa aactttgtca agcctaatga aaccaaaact 2820

tacttttgga aagtgcaaca tcatatggca cccactaaag atgagtttga ctgcaaagcc 2880

tgggcttatt tctctgatgt tgacctggaa aaagatgtgc actcaggcct gattggaccc 2940

cttctggtct gccacactaa cacactgaac cctgctcatg ggagacaagt gacagtacag 3000

gaatttgctc tgtttttcac catctttgat gagaccaaaa gctggtactt cactgaaaat 3060

atggaaagaa actgcagggc tccctgcaat atccagatgg aagatcccac ttttaaagag 3120

aattatcgct tccatgcaat caatggctac ataatggata cactacctgg cttagtaatg 3180

gctcaggatc aaaggattcg atggtatctg ctcagcatgg gcagcaatga aaacatccat 3240

tctattcatt tcagtggaca tgtgttcact gtacgaaaaa aagaggagta taaaatggca 3300

ctgtacaatc tctatccagg tgtttttgag acagtggaaa tgttaccatc caaagctgga 3360

atttggcggg tggaatgcct tattggcgag catctacatg ctgggatgag cacacttttt 3420

ctggtgtaca gcaataagtg tcagactccc ctgggaatgg cttctggaca cattagagat 3480

tttcagatta cagcttcagg acaatatgga cagtgggccc caaagctggc cagacttcat 3540

tattccggat caatcaatgc ctggagcacc aaggagccct tttcttggat caaggtggat 3600

ctgttggcac caatgattat tcacggcatc aagacccagg gtgcccgtca gaagttctcc 3660

agcctctaca tctctcagtt tatcatcatg tatagtcttg atgggaagaa gtggcagact 3720

tatcgaggaa attccactgg aaccttaatg gtcttctttg gcaatgtgga ttcatctggg 3780

ataaaacaca atatttttaa ccctccaatt attgctcgat acatccgttt gcacccaact 3840

cattatagca ttcgcagcac tcttcgcatg gagttgatgg gctgtgattt aaatagttgc 3900

agcatgccat tgggaatgga gagtaaagca atatcagatg cacagattac tgcttcatcc 3960

tactttacca atatgtttgc cacctggtct ccttcaaaag ctcgacttca cctccaaggg 4020

aggagtaatg cctggagacc tcaggtgaat aatccaaaag agtggctgca agtggacttc 4080

cagaagacaa tgaaagtcac aggagtaact actcagggag taaaatctct gcttaccagc 4140

atgtatgtga aggagttcct catctccagc agtcaagatg gccatcagtg gactctcttt 4200

tttcagaatg gcaaagtaaa ggtttttcag ggaaatcaag actccttcac acctgtggtg 4260

aactctctag acccaccgtt actgactcgc taccttcgaa ttcaccccca gagttgggtg 4320

caccagattg ccctgaggat ggaggttctg ggctgcgagg cacaggacct ctactga 4377

<210> 13

<211> 4374

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая слитый белок на основе человеческого

FVIII-BDD и сигнального пептида Lactalbumin

(СП-Lactalbumin-¬FVIII-BDD)

<400> 13

atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctgt tccatgccac ccaggccgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180

acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240

gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300

gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340

cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400

gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460

cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520

catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580

caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640

ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700

agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760

cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820

ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880

gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940

ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000

tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060

gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120

tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180

caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240

attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300

tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360

tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420

gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480

cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540

tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600

ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660

ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720

cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780

aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840

tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900

atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960

tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020

agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080

aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200

cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260

tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta ctga 4374

<210> 14

<211> 130

<212> DNA

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы)

<400> 14

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 15

<211> 252

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Промотор HLP

<400> 15

tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60

gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120

tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180

cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240

ggacagtgaa tc 252

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сигнал полиаденилирования

<400> 16

cgcgaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtgatgcagc 60

<210> 17

<211> 141

<212> DNA

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Правый ITR

<400> 17

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок на основе FVIII-BDD (фактор свёртывания крови VIII c делетированным B доменом) и гетерологичного сигнального пептида, а также предлагается экспрессионная кассета, вектор и клетка, ее содержащие. Также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая вышеуказанный вектор или кассету. Изобретение эффективно для обеспечения белком FVIII-BDD субъекта с гемофилией А, а также для лечения гемофилии А у субъекта. 11 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

1. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD (фактор свёртывания крови VIII c делетированным B доменом) и гетерологичного сигнального пептида, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9.

2. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

3. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

4. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 2, которая представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11.

5. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 3, которая представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.

6. Экспрессионная кассета, которая включает нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-5.

7. Экспрессионная кассета по п. 6, включающая следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

промотор;

нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-5;

сигнал полиаденилирования;

правый (второй) ITR.

8. Экспрессионный вектор, который включает нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-5 или экспрессионную кассету по любому из пп. 6, 7.

9. Экспрессионный вектор по п. 8, где экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (AAV).

10. Экспрессионный вектор по п. 9, где AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-l, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 или AAV.HSC16.

11. Клетка-хозяин для получения слитого белка на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-5.

12. Фармацевтическая композиция для доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки, включающая экспрессионный вектор или кассету по любому из пп. 8-10 в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

13. Применение экспрессионного вектора по любому из пп. 8-10 или композиции по п. 12 для доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки.

14. Применение экспрессионного вектора по любому из пп. 8-10 или композиции по п. 12 для обеспечения белком FVIII-BDD субъекта, который имеет гемофилию А и/или не имеет функциональных копий гена FVIII.

15. Способ обеспечения белком FVIII-BDD субъекта с гемофилией А, включающий введение терапевтически эффективного количества экспрессионного вектора по любому из пп. 8-10 или композиции по п. 12 в клетки субъекта, нуждающегося в этом.

16. Способ доставки гена FVIII-BDD в целевые клетки субъекта с гемофилией А, включающий введение экспрессионного вектора по любому из пп. 8-10 или композиции по п. 12 в клетки субъекта.

17. Применение экспрессионного вектора по любому из пп. 8-10 или композиции по п. 12 для лечения гемофилии А у субъекта, который имеет гемофилию А.

18. Способ лечения гемофилии А у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества экспрессионного вектора по любому из пп. 8-10 или композиции по п. 12 субъекту, который имеет гемофилию А.