ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ YERSINIA PESTIS EV Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред для культивирования Yersinia pestis EV и может быть использована в получении достаточного количества биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.

Известна питательная среда для накопления биомассы вакцинного штамма чумного включающая, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 100-150 мл; ферментативный гидролизат бобов сои 100-150 мл; натрий хлористый 4,0-6,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 0,3-0,5 г; натрий сернистокислый 0,0003-0.0005 г; агар микробиологический 16,0-18,0 г; дистиллированная вода остальное. (Патент RU №2241033. Опубл. 27.11.2004. Бюл. №33.).

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению относится питательная среда плотная для культивирования и сбора биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV включающая, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта 40-56 мл; натрий хлористый 4,0-6,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 г; соль Мора 0,08-0,12 г; агар микробиологический 15,0-19,0 г; питьевая вода остальное. (Патент RU №262568. Опубл. 28.07.2017. Бюл. №22.).

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Целью работы является разработка безотходной технологии производства питательных сред для культивирования и сбора биомассы Y. pestis EV из ретентанта ферментативного гидролизата патоки кукурузной (жидкой) белковая основа из растительного сырья - из отхода ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой), которая повышает накопительные свойства питательной среды.

Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит пермеат (т.е. вторичную жидкость) полученную из ретентанта (осадок) ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) и сред на его основе технологического процесса. Ретентант (осадок, оставшийся после фильтрации ферментативного гидролизата кукрузной патоки (жидкой) в количестве 20,0 кг загружают в пищеварочный котел, доводят рН до 4,5 ед добавление соляной кислоты в разведении 1:1 в количестве 0,6 л, кипятят в течение 15 минут, затем охлаждают до температуры (42±1)°С и переливают в бутыли емкостью 10 л. В остуженную жидкость баллонов добавляют 1% хлороформа, содержимое баллонов тщательно перемешивают, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 5±3°С.

Пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой, разбавленной дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 60-108 мл Натрий хлористый 4,0-6,0 г Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 г Натрий сернистокислый 0,3-0,5 г Агар микробиологический 16,0-22,0 г Дистиллированная вода до 1 л.

В качестве исходного сырья используют кукурузную патоку жидкую, содержащей в среднем 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%) как и экстракта, патока является хорошей питательной средой при производстве пенициллина и других антибиотиков и витаминов. Кроме того, она богат микроэлементами, мг/кг: цинк 22; марганец 5; медь 5; кобальт 0,02; йод 0,30, макроэлементами, в %: фосфора 0,25; натрия 0,04; кальция 0,59; калия 0,36; магния 0,12; серы 0,11; хлора 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидина 72,0; лейцина 72,0; изолейцина 89,0; фенилаланин 59,0; треонин 95,0; валин 12,7; лизина 0,96; метионина 0,56; триптофана 0,22; метионин + цистин 0,27 и витаминами, мг/кг: каротин (витамин А) 8,0; B₁ 4,0; В₂ 1,0; В₃ (пантотеновая кислота) 6,5; В₄ (холин) 400; В₅ 17; В₆ 2,9. Как известно, кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи, кукурузные белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот как изолейцина, лейцина, аргинина, фенилаланина. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с). Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.А. Газов, X.С. Морган, /США/ 1989).

Поставщиком кукурузной патоки жидкой является крахмально-паточный комбинат (Ставропольский край г. Изобильный).

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24, срок годности 12.2015. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2- замещенного 12-водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов-М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).

Натрий сернистокислый ГОСТ-195-77 ЧДА, дата поступления 19.12.17 г., партия №15, порошок белого цвета, растворим в воде. Выдерживает испытание п. 3.4. ГОСТ 197-77. Определение щелочности, %, не более 0,048. Массовая доля основного вещества, %, не менее 99,1. Дата контроля 26.01.16 г. Срок хранения 6 месяцев. Изготовитель АО «Химический завод им. Л.Я. Карпова. Натрий сернистокислый является стимулятором роста микроорганизмов, источником серы и восстановителем окислительно-восстановительного потенциала питательной среды. Сера присутствующая в натрии сернистокислом необходима для белка клеток микроорганизмов в количестве 1%. Для подавляющего числа микроорганизмов, в том числе и патогенных, благоприятной средой для роста и размножения является нейтральная реакция среды (рН 7,0±0,5), поэтому уровень рН среды до нужного значения необходимо контролировать, этот фактор доводят до нужного использованием сернистых солей или кислот. Этим фактором и является натрий сернистокислый. При добавлении натрия сернистокислого среда становится прозрачнее.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 09.2020 г. Дата изготовления: август 2017 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0.85% не ниже 80°С, температура застудневания 30-37°С, прочность студня не менее 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность.

Дистиллированная вода - ГОСТ 6709-72 отвечает всем гигиеническим требованиям. Внешний вид - прозрачная жидкость, хлориды, мг/дм³ нет, нитраты, мг/дм³ нет. Удельная электропроводимость при 20°С, См/м - 0,38, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза.

Приготовление ферментативного гидролизата из кукурузной патоки (жидкой)

Способ приготовления питательной среды для культивирования чумного микроба Yersinia pestis EV заключается в следующем: кукурузную патоку жидкую в количестве 12,0 кг помещают в варочный котел, затем добавляют 36,0 л питьевой воды кипятят в течение 15 минут, устанавливают до рН 8,2-8,5 ед 40% раствором натрия гидроокиси в количестве 529 мл, затем настой сливают в 10 л баллоны, охлаждают до 42°С. В остуженный настой добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) из расчета 100,0 на 1 л, добавляют 1,5% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 42°С в течение 10 сут. В первый день смесь перемешивают через каждые 15 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. На 10 сутки аминный азот составил 660 мг %, а сухой остаток соответственно 16,6%. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, прекращают перемешивать и подогревать. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°С.

Ретентант (или концентрат) - это осадок (часть потока при фильтрации, которая задерживается и не проходит через мембраны. (Шепелин А.П., Дятлов И.А. «Питательные среды для энтеробактерий» Оболенск. 2017 г. С.11.

Пермеат (или фильтрат) это часть потока протекаемой очищенной жидкости, которая в качестве прозрачной фрации проходит через мембраны (Шепелин А.П., Дятлов И.А. «Питательные среды для энтеробактерий» Оболенск. 2017 г. C.11.

Способ приготовления питательной среды плотной

Питательную среду на основе пермеата из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV готовят следующим способом: г/л, пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 88 мл, натрий хлористый 5,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водного 4,0 г; агар микробиологический 19,0 г; дистиллированная вода до 1 литра. Среду кипятят до полого растворения, затем устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют стимулирующую добавку натрий сернистокислый 0,4 г, разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°С, затем скашивают. Подготовка рабочей взвеси чумного микроба.

Ампулу с лиофильно высушенной культурой штамма Yersinia pestis EV вскрывают с соблюдением правил асептики, разводят ее содержимое 0,9% раствором натрия хлорида и пересевают в пробирку с бульоном Хоттингера рН 7,2±0,1 и на чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2±0,1. Посевы с Yersinia pestis EV инкубируют при температуре (28±1)°С в течение (48±1) ч. Выросшие культуры проверяют визуально на чистоту роста и пересевают на скошенный в пробирках питательный агар. В случае отсутствия роста на питательной среде для последующего пассажа используют культуру, выращенную на питательном бульоне. После инкубации посевов Yersinia pestis EV при температуре (28±1) ° в течение (24±1) ч культуры используют для контроля питательной среды.

Для посева на испытуемую среду используют культуру тест-штамма не более 3-4 пассажей на питательных средах.

Определение показателя эффективности питательной среды.

Из односуточной культуры тест-штамма готовят взвесь в 0,9% растворе натрия хлорида, рН 7,1±0,1, концентрацией 1×10⁹ м.к./мл Yersinia pestis EV соответствующую 10 ед по оптическому стандартному образцу ОСО мутности бактериальных взвесей 42-28-85 (10МЕ) 2017-2018 гг выпуска ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России. Затем разведением взвеси 1×1 из 1,0×10⁹ доводят содержания в 1 мл 500 млн. м.к. из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°С. После чего производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида из флаконов (матрацы). Смытую микробную взвесь стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл отсасывают в градуированные пробирки объемом 25 мл, после чего устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности бактериальных взвесей 42-28-85 (10МЕ) 2017-2018 гг. выпуска ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, соответствующему 10 ед., пользуясь инструкцией по применению ОСО мутности.

Питательные среды считаются пригодными для производства биомассы чумного микроба, если они обеспечивают показатель эффективности не менее 4 млрд. м.к. с 1 мл среды при показателе жизнеспособности не менее 25%.

Методика подсчета количества микробных клеток

Для подсчета количества (%) живых микробных клеток в суспензии собранной при выращивании чумного микроба и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба на матрацах с питательной средой приготовленной на основе пермеата ферментативного гидролизата патоки кукурузной жидкой (растительное сырье), необходимо брать 0,5 мл взвеси титровать в 0,9% физиологическом растворе до разведений 10-7 и 10-8 с последующем посевом по 0,1 мл в 2 чашки Петри. Учет производят через 48±2 ч путем подсчета количества выросших колоний, где вырастает не менее 150 и 25 колоний соответственно. При этом оценивается характер роста культуры на плотной среде. (Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-16).

Пример 1. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды в градуированных флаконах (матрацах) содержащей, г/л: пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) 60 мл; натрий хлористый 4,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0 г; натрий сернистокислый 0,3 г; агар микробиологический 16,0 г; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составляет 13 мл взвеси, в 1 мл, которой получают 57 млрд.м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 56,3.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды в градуированных флаконах (матрацы), содержащей, г/л: пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) 88 мл; натрий хлористый 5,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0 г; натрия сернистокислого 0.4 г; агар микробиологический 19,0 г; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 16,8 мл взвеси, в 1 мл, которой получают 75 млрд. м.к., процент живых м. к. через (48±1) ч соответственно 70,7.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды в градуированных флаконах (матрацы), содержащей, г/л; пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) 108 мл; натрий хлористый 6,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 5,0 г; натрий сернистокислый 0,5 г;, агар микробиологический 22,0 г; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 14,1 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 49 млрд. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч соответственно 55.

Таким образом, заявленная безотходная технология производства питательных сред для культивирования и сбора биомассы Y. pestis EV, приготовленная на основе пермеата - кислотный гидролизат (пример 2) обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.

Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования Yersinia pestis EV, содержащая пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12%, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, натрий сернистокислый, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет получить достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток. 3 пр.

Питательная среда для культивирования Yersinia pestis EV, включающая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замешенный 12-водный, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающая тем, что в качестве питательной основы содержит пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой, а в качестве стимулирующей добавки - натрий сернистокислый при следующем содержании ингредиентов:

Пермеат из ретентанта ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 60-108 мл Натрий хлористый 4,0-6,0 г Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 г Натрий сернистокислый 0,3-0,5 г Агар микробиологический 16,0-22,0 г Дистиллированная вода до 1 л