ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ ГЛУБИННОГО ВЫРАЩИВАНИЯ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Y. PESTIS EV Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 

Описание патента на изобретение RU2757428C1

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред жидких для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV и может быть использовано в получении питательной среды, обеспечивающей высокий процент живых микробных клеток в биомассе.

Известна питательная среда жидкая, включающая ферментативный гидролизат говяжьего мяса 170,0-190,0 мл, натрий хлористый 3,0-5,0 г, натрий сернистокислый 3,0-5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 г, стимулятор Карпузиди 0,01-0,06 г, очищенная вода до 1 л. (Патент РФ №2433170. Опубликовано: 10.11.2011 Бюл. №31).

Недостатком данной среды является высокая себестоимость сырья.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является питательная среда для культивирования чумного микроба вакцинного штамма EV, включающая в качестве питательной основы ферментативный гидролизат бобов сои 320,0-420,0 мл, натрий хлористый 4,0-6,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 г, натрий сернистокислый 0,3-0,5 г, липоевую кислоту 0,4-0,6 г, 20% раствор натрия гидроокиси 2,5-3,5 мл, дистиллированную воду до 1 л (патент РФ №2260620. Опубл. 20.09.2005. Бюл. №26).

Недостатком данной среды является ее многокомпонентность и дефицит сырьевой базы.

Целью изобретения является приготовление питательной среды жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая обеспечивает высокий процент живых микробных клеток в биомассе через 20 ч.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азота при приготовлении среды используется кислотный гидролизат кукурузной патоки, изготовленный из побочного продукта приготовления ферментативного гидролизата кукурузной патоки.

Технический результат заключается в том, что в состав питательной среды входят натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, дистиллированная вода и ростостимулирующие добавки: соль Мора (двойная сернокислая соль железа и аммония) и натрий сернистокислый.

В результате получают биомассу вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV с высоким количеством живых микробных клеток на жидкой питательной среде со следующим соотношением ингредиентов:

Кислотный гидролизат кукурузной патоки 88,0 мл Натрий хлористый 5,0 г Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г Соль Мора 0,04 г Натрий сернистокислый 0,35 г Дистиллированная вода до 1 л.

В качестве исходного сырья используют кукурузную патоку жидкую, содержащую около 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), патока является хорошей питательной средой для производства антибиотиков и витаминов. В своем составе она содержит микроэлементы (мг/кг): цинк 22,0, марганец 5,0, медь 5,0, кобальт 0,02, йод 0,30; макроэлементы (%): фосфор 0,25, натрий 0,04, кальций 0,59, калий 0,36, магний 0,12, сера 0,11, хлор 0,04; аминокислоты (%): аргинин 90,0, гистидин 72,0, лейцин 72,0, изолейцин 89,0, фенилаланин 59,0, треонин 95,0, валин 12,7, лизин 0,96, метионин 0,56, триптофан 0,22, метионин + цистин 0,27 и витамины (мг/кг): каротин (витамин А) 8,0, B1 4,0, В2 1,0, В3 (пантотеновая кислота) 6,5, В4 (холин) 400, В5 17, В6 2,9. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.).

Натрий хлористый (хч), ГОСТ 4233-77. Необходим для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала. Является катализатором химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (чда), ГОСТ 4172-76. Используется в качестве источника фосфатов при приготовлении питательных сред для обеспечения буферного действия.

Натрий сернистокислый (чда), ГОСТ 195-77. Используется в качестве стимулятора роста микроорганизмов, является источником серы. Регулирует окислительно-восстановительный потенциал среды, увеличивает ее прозрачность.

Соль Мора, ГОСТ 4208-72. Двойная сернокислая соль железа и аммония (Fe(NH4)2(SO4)2⋅6H2O), которые в совокупности повышают накопительные свойства питательных сред.

Дистиллированная вода, ГОСТ 8-51-232-98. Важнейший компонент всех питательных сред. При отсутствии воды замедляются или полностью прекращаются процессы жизнедеятельности микроорганизмов. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важную роль в их физиологических функциях - входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях.

Приготовление ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой

Кукурузную патоку жидкую (ГОСТ 5194-50) в количестве 12,0 кг помещают в варочный котел, добавляют 36,0 л питьевой воды кипятят в течение 15 минут. 40% раствором натрия гидроокиси устанавливают рН 8,2-8,5. Полученный настой охлаждают до 42°С, вносят эмульсию поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС) из расчета 100,0 г на 1 л, добавляют хлороформ до концентрации 1,5%. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 42°С в течение 10 сут. В первые 6 ч смесь перемешивают каждые 15 мин по 5 мин, в последующем - по 5 мин каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. С прекращением нарастания аминного азота - на 7-10 сутки - прекращают перемешивание и убирают в прохладное место. Дают отстояться в течение 2 суток, затем отфильтровывают, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа от объема, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре (4±2)°С.

Приготовление кислотного гидролизата кукурузной патоки из осадка

Ретентант (осадок, оставшийся после фильтрации ферментативного гидролизата кукурузной патоки) в количестве 20,0 кг загружают в варочный котел, добавляют соляную кислоту в разведении 1:1 до установления рН 4,5, кипятят в течение 15 мин. После охлаждения до температуры (42±1)°С переливают в бутыли, остужают и добавляют 1,0% хлороформа от объема. Содержимое тщательно перемешивают, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре (4±2)°С.

Приготовление питательной среды жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV

Питательную среду на основе кислотного гидролизата кукурузной патоки для глубинного выращиванияи вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV готовят следующим способом. Кислотный гидролизат разбавляют дистиллированной водой до показаний аминного азота 0,12%. Смешивают 88,0 мл гидролизата, 5,0 г натрия хлористого, 4,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, добавляют дистиллированную воду до 1 литра. Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси. Вносят стимулирующие добавки: соль Мора 0,04 г и натрий сернистокислый 0,35 г, стерилизуют при температуре (115±1)°С, давлении 1,25-1,3 bar в течение 20 мин. Среду закачивают в биореактор с соблюдением условий асептики и охлаждают до (27±1)°С.

В качестве контроля используют бульон Хоттингера рН 7,1±0,1 приготовленную по ПР 01897080-09-16.

Ампулу с производственной культурой штамма Y. pestis EV вскрывают с соблюдением правил асептики, восстанавливают 1,8 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Полученной суспензией засевают ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера рН 7,1±0,1 (культура I генерации). Посевы инкубируют при (27±1)°С в течение 48 ч. Культуру I генерации пересевают в матрацы с бульоном Хоттингера рН 7,1±0,1 (культура II генерации). Посевы инкубируют при (27±1)°С. Через 48 ч культурой II генерации засевают бутыли с бульоном Хоттингера рН 7,1±0,1. Выращивают 24 ч при температуре (27±1)°С и непрерывной аэрации в объеме 1,0-1,5 л воздуха на 1 л бульона. Полученную посевную культуру используют для засева биореактора BIOSTAT A (SARTORIUS, Германия) объемом 5 л с автоматической регулировкой мешалки. Посевная доза составляет не менее 20 млн. м.к. на 1 мл питательной среды. Культивируют 16-20 ч при (27±1)°С, непрерывной аэрации, подкормке 40% раствором глюкозы. рН поддерживают на уровне 7,0-7,4. Через 10 ч выращивания и в последующем каждые 2 ч отбирают пробы для определения количества микробных клеток. При наступлении стационарной фазы (прекращение нарастания оптической концентрации взвеси и сохранение рН на одном уровне) процесс культивирования останавливают. В полученной биомассе определяют количество микробных клеток по ОСО мутности 10 единиц соответствующего года выпуска, рН, процент живых микробных клеток.

Методика подсчета процента живых микробных клеток

Из полученной биомассы делают последовательные десятикратные разведения от 10-1 до 10-8 пипеткой вместимостью 1 мл. Из пробирок с разведениями 10-7 и 10-8 высевают по 0,1 мл взвеси на 2 чашки Петри с питательной средой для контроля жизнеспособности. Через 72 ч инкубации при температуре (27±1)°С подсчитывают количество колоний для каждого образца. За количество живых микробных клеток (БК), содержащихся в 1 мл взвеси одного образца, принимают среднее значение количества живых микробных клеток, полученное из двух разведений. Для этого количество выросших колоний умножают на степень разведения взвеси, из которого производили высев и увеличивают в 10 раз.

Методика подсчета процента живых микробных клеток

Количество живых микробных клеток в процентах (% живых м.к.) вычисляют для каждого образца отдельно по формуле:

где:

БК - количество живых м.к. в 1 мл;

ОК - общая концентрация.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Штамм выращивали в питательной среде жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащей кислотный гидролизат кукурузной патоки 68 мл, натрий хлористый - 4,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 3,0 г; дистиллированную воду - до 1 литра и ростостимуляторы - натрий сернистокислый 0,3 г, соль Мора 0,01 г.

При таком соотношении ингредиентов получена биомасса Y. pestis EV со следующими параметрами: 7,2 млрд. м.к./мл, количество живых м. к. через 20 ч 25,8%. Тогда как на контрольной среде (агаре Хоттингера) параметры биомассы Y. pestis EV составили 8,3 млрд. м.к./мл, количество живых микробных клеток через 20 ч 29,9%.

Пример 2. Штамм выращивали в питательной среде жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащей кислотный гидролизат кукурузной патоки 88 мл, натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,0 г; дистиллированную воду - до 1 литра и ростостимуляторы - натрий сернистокислый 0,35 г, соль Мора 0,04 г.

При таком соотношении ингредиентов получена биомасса Y. pestis EV со следующими параметрами: 10,3 млрд. м.к./мл, количество живых м. к. через 20 ч 38,2%. Тогда как на контрольной среде (агаре Хоттингера) параметры биомассы Y. pestis EV составили 8,3 млрд. м.к./мл, количество живых микробных клеток через 20 ч 29,9%.

Пример 3. Штамм выращивали в питательной среде жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащей кислотный гидролизат кукурузной патоки 108 мл, натрий хлористый - 6,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 5,0 г; дистиллированную воду - до 1 литра и ростостимуляторы - натрий сернистокислый 0,4 г, соль Мора 0,08 г.

При таком соотношении ингредиентов получена биомасса Y. pestis EV со следующими параметрами: 5,7 млрд. м.к./мл, количество живых м. к. через 20 ч 18,4%. Тогда как на контрольной среде (агаре Хоттингера) параметры биомассы Y. pestis EV составили 8,3 млрд. м.к./мл, количество живых микробных клеток через 20 ч 29,9%.

Таким образом, исходя из ряда проведенных экспериментов, заявленная питательная среда жидкая для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV (пример 2) обеспечивает накопительный эффект 10,3 млрд м.к./мл с высоким процентом живых микробных клеток - 38,2%.

Похожие патенты RU2757428C1

название год авторы номер документа
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ С ПОВЫШЕННЫМИ НАКОПИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ YERSINIA PESTIS EV 2022
  • Катунина Людмила Семёновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Крячок Захар Юрьевич
  • Кондратьева Юлия Викторовна
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
  • Иванова Галина Филипповна
  • Костроминов Артем Валерьевич
  • Степанищева Алина Сергеевна
  • Гридина Татьяна Михайловна
  • Богданова Юлия Викторовна
  • Красовская Татьяна Леонидовна
RU2785826C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СБОРА БИОМАССЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Y.pestis EV 2018
  • Катунина Людмила Семеновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Ковтун Юрий Сергеевич
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Гридина Татьяна Михайловна
  • Пенькова Надежда Ивановна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
RU2702174C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ YERSINIA PESTIS EV 2018
  • Катунина Людмила Семеновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Ковтун Юрий Сергеевич
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Гридина Татьяна Михайловна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
RU2708029C1
Питательная среда плотная для культивирования и сбора биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y.pestis EV 2016
  • Катунина Людмила Семеновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Будыка Дмитрий Александрович
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
  • Ковтун Юрий Сергеевич
  • Коготкова Ольга Ивановна
  • Василенко Екатерина Игоревна
  • Зуенко Анастасия Анатольевна
  • Зимин Степан Иванович
RU2626568C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ И СБРОСА БИОМАССЫ ВАКЦИОННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА YERSINIA PESTIS EV 2020
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Катунина Людмила Семеновна
  • Иванова Галина Филипповна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
  • Ростовцева Дарья Владимировна
  • Костроминов Артем Валерьевич
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Богданова Юлия Викторовна
  • Гридина Татьяна Михайловна
  • Куличенко Александр Николаевич
RU2745504C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИВЫХ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Y. PESTIS EV 2020
  • Катунина Людмила Семеновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Ковтун Юрий Сергеевич
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
  • Василенко Екатерина Игоревна
  • Богданова Юлия Викторовна
  • Красовская Татьяна Леонидовна
  • Таран Татьяна Викторовна
  • Борздова Ирина Юрьевна
RU2748492C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА ВАКЦИННОГО ШТАММА ЕВ 2010
  • Будыка Дмитрий Александрович
  • Катунина Людмила Семёновна
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Иванова Галина Филипповна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Таран Татьяна Викторовна
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Фисун Алиса Анатольевна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
RU2433170C1
СРЕДА ВЫСУШИВАНИЯ ЖИДКАЯ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ БИОМАССЫ ВТОРИЧНОГО СБОРА ЧУМНОГО МИКРОБА ВАКЦИННОГО ШТАММА EV 2013
  • Будыка Дмитрий Александрович
  • Катунина Людмила Семёновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Иванова Галина Филипповна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Фисун Алиса Анатольевна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
  • Коготкова Ольга Ивановна
RU2528069C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИОННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА 2019
  • Щуковская Татьяна Николаевна
  • Бугоркова Светлана Александровна
  • Гончарова Анастасия Юрьевна
  • Кудрявцева Ольга Михайловна
RU2727258C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА 2002
  • Смирнова Е.Б.
  • Катунина Л.С.
  • Старцева О.Л.
  • Смирнов С.Е.
  • Головнева С.И.
  • Борздова И.Ю.
  • Борздов А.А.
RU2241033C2

Реферат патента 2021 года ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ ГЛУБИННОГО ВЫРАЩИВАНИЯ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Y. PESTIS EV

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду жидкую для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащая следующие ингредиенты: кислотный гидролизат кукурузной патоки 88,0 мл, натрий хлористый 5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г, соль Мора 0,04 г, натрий сернистокислый 0,35 г, дистиллированная вода до 1 л, стимулирующих добавок сульфита натрия и соли Мора. Изобретение обеспечивает высокий процент живых микробных клеток в биомассе через 20 ч.

Формула изобретения RU 2 757 428 C1

Питательная среда жидкая для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащая следующие ингредиенты:

Кислотный гидролизат кукурузной патоки 88,0 мл Натрий хлористый 5,0 г Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г Соль Мора 0,04 г Натрий сернистокислый 0,35 г Дистиллированная вода до 1 л.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2757428C1

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА (ЖИДКАЯ) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА ВАКЦИННОГО ШТАММА ЕВ 2004
  • Катунина Л.С.
  • Старцева О.Л.
  • Малецкая О.В.
  • Головнёва С.И.
  • Смирнова Е.Б.
  • Курилова А.А.
RU2260620C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА ВАКЦИННОГО ШТАММА ЕВ 2010
  • Будыка Дмитрий Александрович
  • Катунина Людмила Семёновна
  • Абзаева Наталья Вячеславовна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Иванова Галина Филипповна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Таран Татьяна Викторовна
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Фисун Алиса Анатольевна
  • Гостищева Светлана Евгеньевна
RU2433170C1
ROCHENMACHER M., et al, The nutrition and physiology of P.pestis.l.A chemically defined culture medium for P
pestis, J.Bacteriol.-1952.-Vol.63
Приспособление для передвигания ленты в кинематографическом аппарате 1920
  • Красин(-А Г.Б.
  • Красин(-А Д.Г.
SU788A1

RU 2 757 428 C1

Авторы

Абзаева Наталья Вячеславовна

Катунина Людмила Семеновна

Гостищева Светлана Евгеньевна

Иванова Галина Филипповна

Костроминов Артем Валерьевич

Старцева Ольга Леонидовна

Курилова Анна Алексеевна

Богданова Юлия Викторовна

Гридина Татьяна Михайловна

Куличенко Александр Николаевич

Даты

2021-10-15Публикация

2021-01-21Подача