ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ ШТАММЫ PAENIBACILLUS, СОЕДИНЕНИЯ ТИПА ФУЗАРИЦИДИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2021 года по МПК C07K7/54 C12N1/20 A01N63/25 A01P3/00 C12R1/01 

Описание изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым изолированным бактериальным штаммам, которые являются членами рода Paenibacillus, изначально изолированы из почвы и демонстрируют антагонистическую активность против широкого диапазона патогенов и способны продуцировать антимикробные метаболиты. Изобретение также касается композиций микробных пестицидов, включающих по меньшей мере один из этих новых бактериальных штаммов, его цельную культуральную жидкость или бесклеточный экстракт или фракцию, или по меньшей мере один его метаболит, и/или мутант по меньшей мере одного из указанных новых бактериальных штаммов, обладающий всеми идентифицирующими характеристиками соответствующего бактериального штамма или цельную культуральную жидкость, бесклеточный экстракт, фракцию и/или метаболит такого мутанта, демонстрирующие антагонистическую активность против патогенов растений. Изобретение также относится к способу контроля или подавления патогенов растений или профилактики фитопатогенных инфекций путем применения такой композиции. Изобретение также касается новых соединений типа фузарицидина, являющихся метаболитами, вырабатываемыми штаммами согласно настоящему изобретению.

Уровень техники

В области борьбы с фитопатогенными грибами, поражающими растения или сельскохозяйственные культуры, хорошо известно применение композиций активных соединений, включающих биопестициды, например, выбранные из бактерий, таких как спорообразующие бактерии, или грибов, при этом такие биологические контролирующие агенты не наносят вреда обрабатываемому растению или сельскохозяйственной культуре, а также могут быть дополнительно скомбинированы с классическими органическими химикатами-антагонистами фитопатогенов.

По определению биопестициды - это разновидность пестицидов на основе микроорганизмов (бактерий, грибов, вирусов, нематод и т.п.) или природных продуктов (соединений или экстрактов из биологических источников) (Агентство по охране окружающей среды США: http: //www.epa.gov/pesticides/biopesticides/).

Биопестициды обычно получают путем выращивания и концентрирования природных организмов и/или продуктов их метаболизма, включая бактерии и другие микробы, грибы, вирусы, нематоды, белки и т. Они часто считаются важными составляющими программ интегрированной защиты растений (ИЗР) и привлекли значительное практическое внимание как заменители синтетических химических средств защиты растений (СЗР).

Биопестициды подразделяют на два основных класса, микробные и биохимические пестициды:

1. Микробные пестициды состоят из бактерий, грибов или вирусов (и часто включают метаболиты, производимые бактериями и грибами). Энтомопатогенных нематод также классифицируют как микробные пестициды, несмотря на то, что они являются многоклеточными организмами.

2. Биохимические пестициды представляют собой вещества природного происхождения, которые сдерживают вредителей или находят другое применение в защите сельскохозяйственных культур, как она определена ниже, но являются относительно нетоксичными для млекопитающих.

Для борьбы с фитопатогенными грибами ранее были описаны несколько микробных пестицидов, содержащих спорообразующие бактерии, такие как Bacillus subtilis, см. напр. WO 1998/050422; WO 2000/029426; WO 1998/50422 и WO 2000/58442.

В WO 2009/0126473 описаны приемлемые для сельского хозяйства водные композиции, содержащие бактериальные или грибковые споры, помещенные в водный/органический растворитель, и которые могут дополнительно содержать средства борьбы с насекомыми, пестициды, фунгициды или их комбинации. Предпочтение отдается спорам бактерий рода Bacillus.

В WO 2006/017361 описаны композиции для борьбы с патогенами растений, содержащие хотя бы одну полезную бактерию, по меньшей мере один полезный грибок, по меньшей мере одно питательное вещество и по меньшей мере одно соединение, продлевающее срок эффективности подобной композиции. Группа полезных бактерий включает бактерии Paenibacillus polymyxa и Paenibacillus durum.

ЕР-А-1168922 касается композиций для воздействия на рост растений и/или придания устойчивости к болезням, содержащих по меньшей мере два штамма Rhizobacteria, которые стимулируют рост растений, и хитиновое соединение, причем указанные штаммы выбраны из родов Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Virgibacillus, Alicyclobacillus и Aneurinibacillus. Впрочем, в поддержку заявленных комбинаций не приведено никаких конкретных примеров штаммов Paenibacillus.

В WO 1999/059412 описан штамм PKB1 Paenibacillus polymyxa (учетный номер АТСС 202127), активный против нескольких фитопатогенных грибов.

В WO 2006/016558 описаны штаммы BS-0048, BS-0074, BS-0277 Paenibacillus sp. и штамм BS-0105 P. polymyxa, а также фузарицидин А и фузарицидин В для защиты растений от грибковых инфекций. Дальнейший противогрибковый штамм Paenibacillus BRF-1 был изолирован из ризосферы сои (African J. Microbiol. Res. 4 (24), 2692-2698, 2010).

В WO 2011/069227 описан штамм P. polymyxa JB05-01-1 (учетный номер АТСС РТА-10436), проявляющий сильный эффект ингибирования патогенных бактерий, преимущественно патогенных для человека бактерий, передающихся через пищу.

Budi и др. (Appl Environ Microbiol, 1999, 65, 5148-5150) изолировали из микоризосферы Sorghum bicolor штамм В2 Paenibacillus sp., который проявляет антагонистическую активность против грибковых патогенов, передающихся через почву, таких как Phytophthora parasitica.

Штамм Paenibacillus peoriae 11.D.3, изолированный Delaporte, В. (Lab Cytol Veg, Париж, Франция) и депонированный в открытой коллекции Службы сельскохозяйственных исследований, USDA, США под учетным номером NRRL BD-62 (Int. J. Syst Bacteriol. 46 (4), 988-1003, 1996, здесь и далее также упомянут как штамм BD-62) из почвы в Кот-д'Ивуаре, показал противогрибковую активность против нескольких фитопатогенных бактерий и грибков (J. Appl. Microbiol. 95, 1143-1151, 2003). NRRL - это аббревиатура коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований, международного органа по депонированию для целей депонирования штаммов микроорганизмов согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, по адресу National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, US Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA.

О противомикробной активности многочисленных штаммов Paenibacillus, напр. штамма P. peoriae, против многочисленных бактериальных, грибковых и дрожжевых патогенов, сообщалось также в других источниках (Lett. Appl. Microbiol. 43, 541-547, 2006).

Raza и др. (Brazilian Arch. Biol. Techol. 53, 1145-1154, 2010; Eur. J. Plant Pathol. 125: 471-483, 2009) описывают штамм SQR-21 Paenibacillus polymyxa, который вырабатывает соединение типа фузарицидина и эффективен против Fusarium oxysporum.

Фузарицидины - это группа антибиотиков, выделенных из Paenibacillus spp., принадлежащих к классу циклических липодепсипептидов. Во всем их семействе сохраняются следующие общие структурные черты: макроциклическое кольцо, состоящее из 6 аминокислотных остатков, три из которых представляют собой L-Thr, D-алло-Thr и D-Ala, а также хвост 15-гуанидин-3-гидроксипентадекановой кислоты, присоединенный к N-концевому остатку L-Thr амидной связью (ChemMedChem 7, 871-882, 2012; J. Microbiol. Meth. 85, 175-182, 2011, Таблица 1 настоящего описания). Эти соединения циклизованы лактонным мостиком между гидроксильной группой N-концевого L-Thr и карбонильной группой С-концевого D-Ala. Положения аминокислотных остатков в депсипептидном цикле обычно нумеруют, начиная с вышеупомянутого L-Thr, который также несет на себе цепь ГГПД, и заканчивая С-концевым D-Ala. Неограничивающими примерами фузарицидинов, выделенных из Paenibacillus, являются обозначенные как LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 и LI-F08 (J. Antibiotics 40 (11), 1506-1514, 1987; Heterocycles 53 (7), 1533-1549, 2000; Peptides 32, 1917-1923, 2011) и фузарицидины А (также обозначаются LI-F04a), В (также обозначаются LI-F04b), С (также обозначаются LI-F03a) и D (также обозначаются LI-F03b) (J. Antibiotics 49 (2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50 (3), 220-228, 1997). Аминокислотная цепь фузарицидина не синтезируется на рибосоме, но образуется нерибосомной пептидной синтетазой. Структурные формулы известных фузарицидинов показаны в таблице 1 (Biotechnol Lett. 34, 1327-1334, 2012; Фиг. 1 в нем). Соединения, обозначенные как LI-F03a, LI-F03b и к LI-F08a и LI-F08b, здесь и далее также упоминаются как фузарицидины LI-F03a, LI-F03b и до LI-F08a и LI-F08b благодаря их структуре внутри семейства фузарицидинов (см. Таблицу 1).

где стрелка обозначает одинарную (амидную) связь либо между карбонильным остатком ГГПД и аминогруппой L-Thr (L-треонина), либо между карбонильной группой одной аминокислоты и аминогруппой соседней аминокислоты, где наконечник стрелки указывает на присоединение к аминогруппе указанной аминокислоты L-Thr или указанной соседней аминокислоты; и

где простая линия (без наконечника стрелки) обозначает одинарную (сложноэфирную) связь между карбонильной группой D-Ala (D-аланина) и гидроксильной группой L-Thr; и где ГГПД является 15-гуанидин-3-гидроксипентадекановой кислотой.

Среди выделенных фузарицидиновых антибиотиков фузарицидин А показал наиболее перспективную противомикробную активность против различных клинически значимых грибов и грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus (диапазон значений МИК: 0,78-3,12 мкг/мл) (ChemMedChem 7, 871-882, 2012). Был разработан синтез аналогов фузарицидина, содержащих 12-гуанидин-додекановую кислоту (12-ГДК) или 12-амино-додекановую кислоту (12-АДК) вместо естественной ГГПД, но замена ГГПД на 12-АДК приводила к полной потере противомикробной активности, в то время как при замене ГГПД на 12-ГДК противомикробная активность сохранялась (Tetrahedron Lett. 47, 8587-8590, 2006; ChemMedChem 7, 871-882, 2012).

О фузарицидинах А, В, С и D также сообщалось, что они способны ингибировать фитопатогенные грибы, такие как Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae и Penicillum thomii (J. Antibiotics 49 (2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50 (3), 220-228, 1997). Было обнаружено, что такие фузарицидины, как Li-F05, LI-F07 и LI-F08, обладают определенной противогрибковой активностью против различных фитопатогенных грибов, таких как Fusarium moniliforme, F. oxysporum, F. roseum, Giberella fujkuroi, Helminthosporium sesamum и Penicillium expansum (J. Antibiotics 40 (11), 1506-1514, 1987). Фузарицидины также проявляют антибактериальную активность против грамположительных бактерий, включая Staphylococcus aureus (J. Antibiotics 49, 129-135, 1996; J. Antibiotics 50, 220-228, 1997). Кроме этого, фузарицидины обладают противогрибковой активностью против Leptosphaeria maculans, вызывающей черную корневую гниль канолы (Can. J. Microbiol. 48, 159-169, 2002). Более того, было обнаружено, что фузарицидины А и В и два родственных им соединения, в которых D-алло-Thr связан через свою гидроксильную группу с дополнительным аланином путем сложноэфирной связи, производимые некоторыми штаммами Paenibacillus, индуцируют реакции резистентности в культуре клеток петрушки и ингибируют рост Fusarium oxysporum (WO 2006/016558; ЕР 1788074 A1).

В WO 2007/086645 описан фермент фузарицидинсинтетаза и ген, который его кодирует, как выделенные из штамма Е681 Paenibacillus polymyxa, и этот фермент участвует в синтезе фузарицидинов А, В, С, D, LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 и LI-F08.

На данный момент опубликован геном нескольких штаммов Paenibacillus polymyxa: inter alia для штамма М-1 (учетный номер NCBI NC_017542; J. Bacteriol. 193 (29), 5862-63, 2011; ВМС Microbiol. 13, 137, 2013), штамма CR1 (учетный номер GenBank СР006941; Genome Announcements 2 (1), 1, 2014) и штамма SC2 (учетные номера GenBank СР002213 и СР002214; учетный номер NCBI NC_014622; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011), для последующих штаммов см. легенду к Фигуре 12 настоящего описания. Штамм М-1 P. polymyxa был депонирован в Главном центре коллекций микробиологических культур Китая (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC) под учетным номером CGMCC 7581.

Montefusco и др. описывают в Int. J. Systematic Bacteriol. (43, 388-390, 1993) новый вид бактерий рода Bacillus и предлагают название Bacillus peoriae, который может быть распознан среди других штаммов Bacillus, таких как, например, Bacillus badius, В. coagulans, В. polymyxa и др. Об указанном новом штамме Bacillus сообщено, что он является спорообразующим, грамположительным и вырабатывает каталазу, но не вырабатывает оксидазу. В документе также подытожены дальнейшие биохимические характеристики. Штамм, который может быть изолирован из почвы или гнилых овощей, был обозначен BD-57 и депонирован в Службе сельскохозяйственных исследований, USD А, США как NRRL В-14750, а также в DSMZ (см. ниже) как штамм DSM 8320. На основании дальнейшего биохимического и генетического анализа указанный штамм позже был переименован как Paenibacillus peoriae (см. Int. J. Systematic Bacteriol. 46, 988-1003, 1996). Более новая оценка разнообразия Paenibacillus spp. в ризосфере кукурузы методом ПЦР-ДГГЭ была описана в J. Microbiol. Methods 54, 213-231, 2003.

Уже сложилась практика применения биопестицидов против болезней различных сельскохозяйственных культур. Например, биопестициды уже играют важную роль в борьбе с заболеванием ложной мучнистой росой. Их преимущества включают: предурожайный интервал в 0 дней и возможность применения при тяжести заболевания от средней до тяжелой.

Значимым направлением развития биопестицидов является отрасль обработки семян и улучшения почв. Обработку семян биопестицидами применяют, например, для борьбы с грибковыми патогенами, которые передаются через почву и вызывают гниль семян, "черную ножку", корневую гниль и увядание рассады. Они также могут применяться для борьбы с внутренними грибковыми патогенами, которые передаются с семенами, и грибковыми патогенами, которые находятся на поверхности семени. Многие биопестицидные продукты также проявляют способность стимулировать защитные механизмы растения-хозяина и другие физиологические процессы, которые могут сделать обработанные культуры устойчивыми к различным биотическим и абиотическим стрессам.

Однако при определенных условиях биопестициды могут иметь и недостатки, такие как высокая специфичность (что требует точной идентификации вредителя/патогена и использования многих продуктов), низкую скорость действия (что делает их непригодными, если массовое появление вредителей несет немедленную угрозу культуре), неустойчивую эффективность из-за влияния различных биотических и абиотических факторов (поскольку биопестициды являются обычно живыми организмами, борющимися с вредителями/патогенами путем размножения внутри целевого вредного насекомого/патогена), а также развитие резистентности.

Таким образом, существует потребность в дальнейших бактериальных штаммах и противомикробных метаболитах, противодействующих фитопатогенным микроорганизмам, в частности грибам, и характеризующихся широким спектром активности против всех классов фитопатогенных грибов.

Описание изобретения

Указанная проблема была неожиданно решена обеспечением новых штаммов бактерий рода Paenibacillus, которые характеризуются уникальным профилем антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов, которая распространяется и на патогены растительных листьев, например, выбранные из Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum. Указанные бактериальные штаммы были депонированы в Международном органе по депонированию: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 7 B, 38124 Braunschweig, Germany (здесь и далее DSMZ).

Более того, цельная культуральная жидкость, культуральная среда и бесклеточные экстракты этих бактериальных штаммов обнаружили ингибирующую активность по меньшей мере в отношении Alternaria spp., Botrytis cinerea и Phytophthora infestans. Фракционирование органических экстрактов по биоактивности привело к выделению двух новых соединений типа фузарицидина (соединения 1А и 1В), структура которых была прояснена путем 1D- и 2D-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Таким образом, настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, являющемуся членом семейства Paenibacillus и имеющему по меньшей мере одну идентифицирующую характеристику одного из следующих штаммов:

1. штамм Lu16774 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Lu17007 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Lu17015 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971.

Здесь и далее термин "штамм Paenibacillus sp." идентичен термину "штамм Paenibacillus".

Здесь и далее термин "изолят" обозначает чистую микробную культуру, выделенную из природного источника, и такой изолят получают культивированием отдельной микробной колонии. Изолят является чистой культурой, полученной из гетерогенной дикой популяции микроорганизмов.

Здесь и далее термин "штамм" обозначает изолят или группу изолятов, проявляющих фенотипические, физиологические, метаболические и/или генотипические признаки одинакового происхождения, отличные от таковых у других изолятов или штаммов того же вида.

Дальнейший вариант осуществления касается цельной культуральной жидкости, супернатанта или бесклеточного экстракта или фракции или по меньшей мере одного метаболита по крайней мере одного из микроорганизмов, определенных выше, которые предпочтительно проявляют антагонистическую активность в отношении по меньшей мере одного патогена растений.

Здесь и далее термин "цельная культуральная жидкость" относится к жидкой микробной культуре, содержащей вегетативные клетки и/или споры, суспендированные в культуральной среде, и необязательно метаболиты, произведенные соответствующим микроорганизмом.

Здесь и далее термин "культуральная среда" обозначает среду, получаемую путем культивирования микроорганизма в указанной среде, предпочтительно жидкий бульон, и которая остается после отбора выращенных в среде клеток, напр. супернатант, который остается после удаления выращенных в среде клеток центрифугированием, фильтрацией, седиментацией или другими известными в области методами; которая содержит, напр., метаболиты, произведенные соответствующим микроорганизмом и выделенные в культуральную среду.

"Культуральная среда", которую иногда также называют "супернатантом", может быть получена, например, центрифугированием при температуре примерно от 2 до 30°С (предпочтительно при температуре от 4 до 20°С) в течение примерно от 10 до 60 мин (предпочтительно от 15 до 30 мин) при примерно от 5000 до 20000 g (более предпочтительно при примерно 15000 g).

Здесь и далее термин "бесклеточный экстракт" обозначает экстракт вегетативных клеток, спор и/или цельной культуральной жидкости микроорганизма, содержащий клеточные метаболиты, произведенные соответствующим микроорганизмом, и полученный методами разрушения клеток, известными в данной области, такими как применение растворителей (напр. органических растворителей, таких как спирты, иногда в сочетании с подходящими солями), температуры, приложения сил сдвига, разрушения клеток ультразвуком. Желаемый экстракт может быть сконцентрирован обычными техниками концентрации, такими как сушка, упаривание, центрифугирование или им подобные. К сырому экстракту могут также быть применены определенные промывные этапы с использованием органических растворителей и/или сред на водной основе, преимущественно перед использованием.

Здесь и далее термин "метаболит" обозначает любой компонент, соединение, вещество или побочный продукт (включая, но не ограничиваясь ими, низкомолекулярные вторичные метаболиты, поликетиды, продукты синтазы жирных кислот, нерибосомные пептиды, рибосомные пептиды, белки и ферменты), производимый микроорганизмом (таким как грибы или бактерии, в том числе штаммы согласно изобретению), проявляющий любой полезный эффект, описанный в этом тексте, такой как пестицидная активность или улучшение роста растений, эффективность использования воды растением, здоровье растения, внешний вид растения или активность популяции полезных микроорганизмов в почве вокруг растения.

Здесь и далее термин "изолят" обозначает чистую микробную культуру, выделенную из природного источника, и такой изолят получают культивированием отдельной микробной колонии. Изолят является чистой культурой, полученной из гетерогенной дикой популяции микроорганизмов.

Здесь и далее термин "штамм" означает изолят или группу изолятов, проявляющих фенотипические и/или генотипические признаки одинакового происхождения, отличные от таковых у других изолятов или штаммов того же вида.

Дальнейшее вариант осуществления изобретения касается новых соединений формулы I

где

R выбран из 15-гуанидин-3-гидроксипентадекановой кислоты (ГГПД) и 12-гуанидинододекановой кислоты (12-ГДК)

X¹ представляет собой треонин;

X² представляет собой изолейцин;

X³ представляет собой тирозин;

X⁴ представляет собой треонин;

X⁵ выбран из глутамина и аспарагина;

X⁶ представляет собой аланин; и

где стрелка обозначает одинарную (амидную) связь либо между карбонильным остатком R и аминогруппой аминокислоты X¹, либо между карбонильной группой одной аминокислоты и аминогруппой соседней аминокислоты, где наконечник стрелки указывает на присоединение к аминогруппе указанной аминокислоты X¹ или указанной соседней аминокислоты; и

где простая линия (без наконечника стрелки) обозначает одинарную (сложноэфирную) связь между карбонильной группой X⁶ и гидроксильной группой X¹;

а также их приемлемых для сельского хозяйства солей и способов получения соединений формулы I согласно изобретению, которые включают культивирование штаммов согласно изобретению и выделение указанных соединений формулы I из цельной культуральной жидкости.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, изобретение также касается соединений 1А и 1В, которые соответствуют формуле I, где R представляет собой ГГПД и X⁵ представляет собой аспарагин в случае соединения 1А, и X⁵ представляет собой глутамин в случае соединения 1В:

Изобретение также касается композиций, включающих штаммы, цельную культуральную жидкость, бесклеточные экстракты, культуральную среду или соединения формулы I и их соли согласно изобретению, так же как их применения для борьбы с патогенами растений или их угнетения или предупреждения инфекции патогеном растений или для защиты материалов от заражения и разрушения вредными микроорганизмами, и соответствующих способов, включающих обработку патогенов, среды их обитания или материалов или растений, требующих защиты от поражения патогенами или почвы или материала для размножения эффективным количеством композиций, штаммов, цельной культуральной жидкости, бесклеточных экстрактов, культуральных сред или соединений формулы I и их солей согласно изобретению.

Дальнейшие варианты осуществления изобретения описаны в нижеследующем подробном описании изобретения, формуле и графических материалах.

Изобретение касается микробных штаммов

1. штамм Lu16774 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Lu17007 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Lu17015 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971.

Штаммы Lu16774, Lu 17007 и Lu17015 были изолированы из образцов почвы, взятых в различных местах Европы, включая Германию, и депонированы согласно Будапештскому договору в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) под вышеуказанными учетными номерами 20 февраля 2013 года BASF SE, Германия.

Род Paenibacillus (ранее бациллы 3 группы по рРНК) был охарактеризован (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)) следующими фенотипическими и физиологическими признаками:

- Клетки палочковидной формы грамположительной структуры,

- Слабая реакция на окрашивание по Граму, часто даже негативная окраска,

- Дифференциация до эллипсообразных эндоспор, которые выразительно раздувают спорангий (материнскую клетку),

- Факультативно анаэробный рост с хорошим ростом при отсутствии воздуха независимо от наличия нитрата,

- Расщепление различных сахаров,

- Образование кислоты и газа из разных сахаров, включая глюкозу,

- Отсутствие кислотообразования из адонита и сорбита,

- Отсутствие уреазы (за исключением P. validus),

- Отсутствие аргининдигидролазы,

- Неспособность потреблять цитрат,

- Отсутствие роста в присутствии 10% хлорида натрия,

- Выделение многочисленных внеклеточных гидролитических ферментов, разлагающих ДНК, белок, крахмал; и/или

- Содержание Г+Ц в ДНК от 40% до 54%.

Род Paenibacillus (ранее бациллы 3 группы по рРНК) был также охарактеризован анализом 16S рДНК (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)):

- Специфической 22-основной последовательностью в вариабельной области V5 16S рДНК (от 5 'к 3'): TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993), см. Таблицу 3 в этом документе) и/или

- Гибридизацией изолированной или ПЦР-амплифицированной хромосомной ДНК с зондом BG3 (5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3') (см. Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)).

Принадлежность депонированных штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015 согласно изобретению к роду Paenibacillus была определена по следующим морфологическим и физиологическим наблюдениям (см. Пример 2.3 ниже):

- Палочковидные клетки

- Эллипсовидные споры

- Разбухший спорангий

- Анаэробный рост

- Расщепление различных сахаров, включая глюкозу, арабинозу, ксилозу, манит, фруктозу, рафинозу, трегалозу и глицерин с образованием кислоты

- Образование газа из глюкозы

- Отсутствие аргининдигидролазы

- Неспособность потреблять цитрат

- Отсутствие роста в присутствии 5% или более хлорида натрия

- Выработка внеклеточных гидролитических ферментов, разлагающих крахмал, желатин, казеин и эскулин.

Кроме того, принадлежность депонированных штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015 согласно изобретению к роду Paenibacillus была также установлена анализом 16S рДНК по наличию специфической для Paenibacillus 22-основной последовательности в 16S рДНК (от 5' до 3'):

5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3'

(см. SEQ ID NO: 1 (нуклеотиды 840-861), SEQ ID NO: 2 (840-861), SEQ ID NO: 3 (844-865) и SEQ ID NO: 4 (840-861) в перечне последовательностей к данной заявке).

Более того, секвенирование полной 16S рДНК по сравнению с 24 различными штаммами Paenibacillus показало кластеризацию депонированных штаммов Lu 16774, Lu 17007 и Lu17015 с типичными штаммами Paenibacillus brasiliensis, P. kribbensis, P. jamilae, P. peoriae и P. polymyxa, преимущественно с P. peoriae, в частности со штаммом Paenibacillus peoriae BD-62 (см. Фиг. 1 и 2 к данной заявке). Известно, что последовательности 16S рДНК P. polymyxa и Р. peoriae идентичны на от 99,6 до 99,7% (J. Gen. Appl. Microbiol. 48, 281-285 (2002)).

"Идентичность в процентах" или "сходство в процентах" двух нуклеотидных последовательностей означает идентичность в процентах остатков по всей длине выровненных последовательностей и определяется сравнением двух оптимально локально выровненных последовательностей в окне сравнения, определенном длиной локального выравнивания двух последовательностей, такая как, например, идентичность, высчитанная (для достаточно подобных последовательностей) после ручного выравнивания с помощью программы АЕ2 (Alignment Editor 2). Локальное выравнивание двух последовательностей включает только те сегменты каждой из последовательностей, которые считаются достаточно подобными согласно критерию, который зависит от использованного для выравнивания алгоритма (напр. АЕ2, BLAST, вторичная структура молекулы рРНК или подобные). Идентичность в процентах рассчитывают, определяя количество положений, в которых в обеих последовательностях встречается идентичная нуклеиновая кислота, для получения количества совпадающих положений, и деля количество совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножая результат на 100.

Для определения идентичности последовательностей в процентах для двух последовательностей нуклеиновых кислот (напр., одной из нуклеотидных последовательностей Таблицы 1 и ее гомолога), последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (напр., в последовательность одной нуклеиновой кислоты могут быть введены пропуски для оптимального выравнивания с другой нуклеиновой кислотой). Затем сравнивают основания в соответствующих положениях. Когда положение в одной последовательности занято таким же основанием, как и соответствующее положение в другой последовательности, то молекулы в этом положении идентичны. Следует понимать, что для целей определения идентичности последовательностей при сравнении последовательности ДНК с последовательностью РНК тимидиновый нуклеотид эквивалентен урациловому.

Для выравнивания данные последовательностей вносили в программу АЕ2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), выравнивали вручную в соответствии с вторичной структурой получаемой молекулы рРНК и сравнивали с репрезентативными последовательностями генов 16S рРНК организмов, относящихся к Firmicutes (Nucl. Acids Res. 27 171-173, 1999). Для получения значений идентичности в % для многих последовательностей все последовательности выравнивали друг с другом (множественное выравнивание последовательностей). Кроме этого, для получения значений идентичности в % для двух последовательностей, расположенных через длинный участок выровненных последовательностей, по сравнению с множественным выравниванием осуществляли ручное попарное выравнивание последовательностей, как описано выше, с применением АЕ2 (попарное выравнивание последовательностей).

Кроме этого, выполняли стандартизированное автоматизированное риботипирование, применяя систему Qualicon RiboPrinter на штаммах Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 по сравнению с P. peoriae BD-62 с использованием рестрикционного фермента EcoRI, получив сходство всех трех новых штаммов к P. peoriae BD-62 от 0,24 до 0,5 (Пример 2.2 и Фиг. 12).

В итоге штаммы были прикреплены к следующим таксономическим группам.

Штаммы Paenibacillus Lu16774 и Lu17007 принадлежат к виду Paenibacillus polymyxa.

Поэтому изобретение касается микробных штаммов

1. штамм Lu16774 Paenibacillus polymyxa, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Lu17007 Paenibacillus polymyxa, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Lu17015 Paenibacillus sp., депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971.

Согласно результатам филогенетического анализа, представленным в этом документе (Фиг. 12-22) и неопубликованным результатам профессора Боррисса, Германия, предполагается, что гетерогенный вид Paenibacillus polymyxa нуждается в новой таксономической классификации на два подвида: 1) Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa и 2) Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum; и 3) новый вид Paenibacillus nov. spec. epiphyticus.

Типичный штамм P. polymyxa DSM 36 вместе со штаммами P. polymyxa SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 и A18 образует на каждой дендрограмме максимальной вероятности, проанализированной для пяти консервативных генов "домашнего хозяйства" (dnaN, gyrB, recA, recN и rpoA), отдельный кластер (Фиг. 17-21).

Очень похожие результаты были получены при определении средней аминокислотной идентичности (САИ), которую часто используют для определения филогенетических взаимосвязей среди бактериальных видов. Этот метод основан на расчете средней идентичности ядерного генома на уровне аминокислот (Proc. Natl. Acad. USA 102, 2567-2572, 2005). Согласно полученной САИ-матрице на Фиг. 22 P. polymyxa DSM 36 вместе со штаммом P. polymyxa SQR-21 образует подкластер, отличающийся от двух других подкластеров, показанных на этой фигуре.

Штаммы Lu16674 и Lu17007 вместе со штаммами P. polymyxa М-1, 1-43, SC2 и Sb3-1 образуют на каждой дендрограмме максимальной вероятности, проанализированной для пяти консервативных генов "домашнего хозяйства" (dnaN, gyrB, recA, recN и rpoA) второй подкластер (Фиг. 17-21). Согласно САИ-матрице на Фиг. 22 на основе анализа ядерного генома, этот второй подкластер подтвержден его репрезентативными штаммами Lu 16674 и Lu 17007 вместе со штаммами P. polymyxa М-1 и SC2.

Разница между двумя подкластерами не столь значительна, чтобы оправдать новый вид, но уровень САИ-идентичности между представителями обоих кластеров составляет примерно 97.5%, оправдывая классификацию на два разных подвида.

Поэтому предлагается определить первый подкластер в соответствии с типовым штаммом P. polymyxa DSM 36^Т как Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa. Кроме штамма DSM 36, к подвиду Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa также принадлежат штаммы P. polymyxa SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 и A18.

Кроме этого, предлагается определить второй подкластер как новый подвид Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum. Кроме штаммов Lu16674 и Lu17007, к подвиду Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum принадлежат штаммы P. polymyxa M-1, 1-43, SC2 и Sb3-1.

Штамм Lu17015 только на 94,9% идентичен (САИ) по генам ядерного генома типичному штамму Paenibacillus polymyxa DSM36 = АТСС 842 (Фиг. 22). Поэтому штамм Lu17015 не может быть отнесен ни к виду Paenibacillus polymyxa, ни к любому другому известному виду Paenibacillus. Такие же значения обнаружены у штаммов Е681 (94,7%) и CR2 (94,9%). Между собой эти штаммы идентичны по меньшей мере на 98,1% (САИ). Согласно определению вида Konstantinides и Tiedje (Proc Natl. Acad. Sci. USA. 102, 2567-2572, 2005), штамм Lu17015 и также штаммы Е681 и CR2 могут быть отнесены к новому виду. Поэтому здесь предлагается новый вид Paenibacillus spec. nov. epiphyticus. Итак, штамм Paenibacillus Lu17015 относится к Paenibacillus epiphyticus. Предлагается признать этот штамм типичным. Так же дендрограммы, построенные на основе сравнений последовательностей пяти генов "домашнего хозяйства" (Фиг. 17-21), показывают удаленность этого кластера от всех штаммов P. polymyxa. Кроме Lu17015, к Paenibacillus spec. nov. epiphyticus предлагается отнести штаммы P. polymyxa Е681, CR2 TD94, DSM 365 и WLY78.

Поэтому изобретение касается микробных штаммов

1. штамм Lu16774 Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Lu17007 Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Lu17015 Paenibacillus epiphyticus, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971.

Кроме штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015 изобретение касается любого штамма Paenibacillus, или такого, который физически происходит от оригинального депонирования любого из штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, или изолированного независимо до тех пор, пока он сохраняет по меньшей мере одну идентифицирующую характеристику депонированных штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015. Такие штаммы Paenibacillus согласно изобретению включают любого потомка любого из штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, включая мутанты этих штаммов.

Термин "мутант" обозначает микроорганизм, полученный непосредственным отбором мутантов, но также охватывает микроорганизмы, которые были подвергнуты дальнейшему мутагенезу или другим манипуляциям (напр., путем введения плазмиды). Соответственно, варианты осуществления включают мутанты, варианты и/или производные соответствующего микроорганизма, как встречающиеся в природе, так и искусственно индуцированные мутанты. Например, мутанты могут быть стимулированы обработкой микроорганизма известными мутагенами, такими как рентгеновские лучи, УФ-излучение или N-метил-нитрозогуанидин, с использованием обычных способов. После указанной обработки может быть выполнен скрининг на мутантные штаммы, демонстрирующие желаемые характеристики.

Мутантные штаммы могут быть получены любым методом, известным в данной области, таким как непосредственный отбор мутантов, химический мутагенез или генетические манипуляции (напр., путем введения плазмиды). Например, мутанты могут быть получены применением известного мутагена, такого как рентгеновские лучи, УФ-излучение или N-метил-нитрозогуанидин. После указанной обработки может быть выполнен скрининг на мутантные штаммы, демонстрирующие желаемые характеристики.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,6%, предпочтительно по меньшей мере на 99,8%, еще предпочтительно по меньшей мере на 99,9%, и в частности на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей 16S рДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из нуклеотидных последовательностей, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК на 100% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей 16S рДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из нуклеотидных последовательностей, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению является таким, чья полная последовательность 16S рДНК после оптимального выравнивания в окне выровненных последовательностей по меньшей мере на 99,6% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 или по меньшей мере на 99,8% идентична SEQ ID NO: 3; предпочтительно по меньшей мере на 99,8% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2 и SEQ ID NO: 3; еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3; даже предпочтительно по меньшей мере более чем на 99,9% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2 и SEQ ID NO: 3; в частности на 100% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2 и SEQ ID NO: 3.

Согласно дальнейшему варианту осуществления штамм Paenibacillus выбран из группы, которая включает:

а) штамм Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969;

б) штамм Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970;

в) штамм Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971; и

г) штамм, содержащий последовательность ДНК

г1) по меньшей мере на 99,6% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 9; или

г2) по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 14; или

г3) по меньшей мере на 99,9% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10; или

г4) по меньшей мере на 99,2% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 15; или

г5) по меньшей мере на 99,2% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 11; или

г6) по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 16; или

г7) по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 12; или

г8) по меньшей мере на 99,3% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 17; или

г9) на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 13; или

г10) по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 18.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК dnaN крайней мере на 99,6% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 9, или содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 14.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению является таким, чья полная последовательность dnaN ДНК после оптимального выравнивания в окне выровненных последовательностей по меньшей мере на 99,6% идентична по меньшей мере одной из последовательностей ДНК SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 9 или по меньшей мере на 99,8% идентична SEQ ID NO: 14; предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична SEQ ID NO: 14; в частности, на 100% идентична SEQ ID NO: 14.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,8%, в том числе на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей dnaN ДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из последовательностей ДНК, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 14.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК gyrB по крайней мере на 99,9% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, или содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,2% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 15.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению является таким, чья полная последовательность gyrB ДНК после оптимального выравнивания в окне выровненных последовательностей по меньшей мере на 99,9% идентична по меньшей мере одной из последовательностей ДНК SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 10 или по меньшей мере на 99,9% идентична SEQ ID NO: 15; предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична SEQ ID NO: 15; в частности, на 100% идентична SEQ ID NO: 15.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей gyrB ДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из последовательностей ДНК, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 15.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК recF по крайней мере на 99,2% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 11 или содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 16.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению является таким, чья полная последовательность recF ДНК после оптимального выравнивания в окне выровненных последовательностей по меньшей мере на 99,2% идентична по меньшей мере одной из последовательностей ДНК SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11 или по меньшей мере на 99,8% идентична SEQ ID NO: 16; предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична SEQ ID NO: 16; в частности, на 100% идентична SEQ ID NO: 16.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,8%, в том числе на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей recF ДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из последовательностей ДНК, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 16.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК recN крайней мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 12 или содержащим последовательность ДНК по меньшей мере на 99,3% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 17.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению является таким, чья полная последовательность recN ДНК после оптимального выравнивания в окне выровненных последовательностей по меньшей мере на 99,8% идентична по меньшей мере одной из последовательностей ДНК SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12 или по меньшей мере на 99,3% идентична SEQ ID NO: 17; предпочтительно по меньшей мере на 99,6% идентична SEQ ID NO: 17; в частности, на 100% идентична SEQ ID NO: 17.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,8%, в том числе на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей recN ДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из последовательностей ДНК, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 17.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК proA на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательностям ДНК SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 13 или содержит последовательность ДНК по меньшей мере на 99,8% идентичную по нуклеотидной последовательности последовательности ДНК SEQ ID NO: 18.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, штамм Paenibacillus согласно изобретению является таким, чья полная последовательность proA ДНК после оптимального выравнивания в окне выровненных последовательностей на 100,0% идентична по меньшей мере одной из последовательностей ДНК SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13 или по меньшей мере на 99,8% идентична SEQ ID NO: 18; предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична SEQ ID NO: 17; в частности на 100% идентична SEQ ID NO: 18.

Штамм Paenibacillus согласно изобретению в частности содержит последовательность ДНК на 100,0% идентичную по нуклеотидной последовательности любой из последовательностей proA ДНК штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015, то есть любой из последовательностей ДНК, изложенных в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 18.

Еще один вариант осуществления изобретения касается изолированного микроорганизма, являющегося членом семейства Paenibacillus и имеющего по меньшей мере одну идентифицирующую характеристику одного из следующих штаммов:

1. штамм Paenibacillus Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Paenibacillus Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, или

3. штамм Paenibacillus Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971.

Еще один вариант осуществления касается штамма Paenibacillus, выбранного из группы, которая включает:

1. штамм Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971,

4. штаммы, имеющие по меньшей мере одну идентифицирующую характеристику одного из указанных штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015.

Другой вариант осуществления изобретения касается изолированного микроорганизма, выбранного из штаммов:

1. штамм Paenibacillus Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Paenibacillus Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Paenibacillus Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971;

демонстрирующего антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и способного вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина; или его мутантного штамма, сохранившего указанную способность, то есть сохранившего указанную антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и сохранившего указанную способность вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина.

Еще один вариант осуществления изобретения касается микроорганизма, выбранного из:

1. штамм Paenibacillus Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Paenibacillus Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Paenibacillus Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971;

или его мутантного штамма, имеющего все идентифицирующие характеристики одного из указанных штаммов.

Идентифицирующей характеристикой депонированных штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 является то, что они способны вырабатывать по меньшей мере одно соединение формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В, которые являются метаболитами соответствующих штаммов; и их приемлемые для сельского хозяйства соли.

Таким образом, согласно одному аспекту изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению способны вырабатывать по меньшей мере одно соединение формулы I, предпочтительно вырабатывать соединения 1А или 1В, в частности производить соединения 1А и 1В; и их приемлемые для сельского хозяйства соли.

Таким образом, согласно одному из аспектов изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению способны производить по меньшей мере одно соединение формулы I, предпочтительно производить соединения 1А или 1В, в частности производить соединения 1А и 1В; и их приемлемые для сельского хозяйства соли в ростовой среде, включающей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота, как определено в данном тексте.

Таким образом, согласно одному аспекту изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению в ростовой среде, включающей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота, как определено в данном тексте, производят по меньшей мере одно соединение формулы I, предпочтительно производят соединения 1А или 1В, в частности производят соединения 1А и 1В; и их приемлемые для сельского хозяйства соли.

Другой вариант осуществления изобретения касается изолированного микроорганизма, выбранного из:

1. штамм Paenibacillus Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Paenibacillus Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Paenibacillus Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971;

демонстрирующего антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и способного вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности производить соединения 1А и 1В; или его мутантного штамма, сохранившего указанную способность, то есть сохранившего указанную антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и сохранившего указанную способность вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В.

Другой вариант осуществления изобретения касается изолированного микроорганизма, выбранного из:

1. штамм Paenibacillus Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Paenibacillus Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Paenibacillus Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971;

демонстрирующего антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и при пребывании в ростовой среде, включающей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота, как определено в данном тексте, способного вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В; или его мутантного штамма, сохранившего указанную способность, то есть сохранявшего указанную антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и сохранившего указанную способность вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В.

Другой вариант осуществления изобретения касается изолированного микроорганизма, выбранного из:

1. штамм Paenibacillus Lu16774, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26969,

2. штамм Paenibacillus Lu17007, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26970, и

3. штамм Paenibacillus Lu17015, депонирован в DSMZ под учетным номером DSM 26971;

демонстрирующего антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и вырабатывающего по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывающего соединения 1А и 1В; или его мутантного штамма, сохранившего указанную способность, то есть сохранившего указанную антагонистическую активность против хотя бы одного патогена растений и сохранившего указанную способность вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В.

Еще одной идентифицирующей характеристикой депонированных штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 или их мутантного штамма является то, что они способны вырабатывать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b дополнительно к способности вырабатывать по меньшей мере одно соединение формулы I, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В.

Поэтому согласно еще одному из аспектов изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению способны вырабатывать по меньшей мере один фузарицидин формулы I, предпочтительно выбранный из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В, как раскрыто в данном тексте, и способны вырабатывать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b.

Согласно еще одному из аспектов изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению способны вырабатывать по меньшей мере один фузарицидин формулы I, предпочтительно выбранный из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В, как раскрыто в данном тексте, и способны вырабатывать по меньшей мере три соединения, выбранные из группы, включающей фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b.

Согласно еще одному из аспектов изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению способны вырабатывать по меньшей мере один фузарицидин формулы I, предпочтительно выбранный из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В, как раскрыто в данном тексте, и способны вырабатывать по меньшей мере пять соединений, выбранных из группы, включающей фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b.

Согласно еще одному из аспектов изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению способны вырабатывать по меньшей мере один фузарицидин формулы I, предпочтительно выбранный из соединений 1А и 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В, как раскрыто в данном тексте, и способны вырабатывать фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D и LI-F08b.

Другой идентифицирующей характеристикой депонированных штаммов Paenibacillus является их противогрибковая активность. В частности, было установлено, что эти штаммы эффективны против заражения патогенами растений, включая Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum; где Alternaria spp. предпочтительно выбрана из A. solani и A. alternata, в частности A. solani.

Таким образом, согласно дальнейшему аспекту изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению обладают противогрибковой активностью, в частности против патогена растений, выбранного из группы, состоящей из Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum, где Alternaria spp. предпочтительно выбрана из A. solani и A. alternata, в частности A. solani. Более конкретно штаммы Paenibacillus согласно изобретению обладают противогрибковой активностью против по меньшей мере двух или против всех четырех указанных патогенов.

Согласно дальнейшему аспекту изобретения, штаммы Paenibacillus согласно изобретению обладают противогрибковой активностью против патогенов растений Alternaria solani, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum.

Антагонистическая активность штаммов Paenibacillus против патогенов растений может быть показана в конфронтационном тесте in-vitro с использованием желаемых фитопатогенных грибков, таких как Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum где Alternaria spp. предпочтительно выбрана из A. solani и A. alternata, в частности A. solani.

Как ростовую среду для этих фитопатогенных грибков используют среду ISP2, содержащий на литр 10 г солодового экстракта (Sigma Aldrich, 70167), 4 г дрожжевого экстракта Bacto (Becton Dickinson, 212750), 4 г глюкозы моногидрата (Sigma Aldrich, 16301), 20 г агара (Becton Dickinson, 214510), рН около 7, бидистиллированную воду. Как ростовую среду для PHYTIN используют среду V8, содержащую на литр: 200 мл овощного сока, 3 г карбоната кальция (Merck Millipore, 1020660250), 30 г агара (Becton Dickinson, 214510), рН 6,8, бидистиллированную воду.

Штаммы Paenibacillus точечно инокулируют на одной стороне чашки с агаром. Агарный блок (примерно 0,3 см²) с одним активно растущим патогеном растений помещают в центр чашки. После инкубации в течение 7-14 дней при примерно 25°С проверяли рост патогена растений, особенно на наличие зон ингибирования. Могут быть оценены следующие антагонистические эффекты: антибиоз оценивают измерением диаметра свободной от грибов зоны (зоны ингибирования). Конкуренцию оценивают сравнением диаметра роста грибкового патогена на чашках с бактериальными штаммами по сравнению с контрольными чашками. Микопаразитизм может быть зафиксирован в том случае, когда бактерия перерастает грибковый патоген и также микопаразитирует на патогенах. Это можно визуализировать микроскопией.

Другой идентифицирующей характеристикой депонированных штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 является то, что они способны вырабатывать и выделять по меньшей мере один литический фермент, предпочтительно выбранный из хитиназы, целлюлазы и амилазы (см. Пример 6), еще предпочтительно по меньшей мере хитиназы и целлюлаз; в частности, в ростовой среде, включающей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота, как определено в данном тексте.

Поэтому, согласно еще одному аспекту изобретения, штаммы Paenibacillus способны продуцировать и выделять по меньшей мере один литический фермент, предпочтительно выбранный из хитиназы, целлюлазы и амилазы, еще предпочтительно по меньшей мере хитиназы и целлюлаз; в частности, в ростовой среде, включающей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота, как определено в данном тексте.

Более конкретно настоящее изобретение касается депонированных штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015 и любого штамма Paenibacillus, имеющего одну или более из идентифицирующих характеристик депонированного штамма, при этом идентифицирующие характеристики выбраны из группы, включающей:

а) противогрибковую активность против патогена растений, выбранного из группы, состоящей из Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum, где Alternaria spp. предпочтительно выбрана из A. solani и A. alternata, в частности A. solani, как раскрыто здесь и далее;

б) способность вырабатывать по меньшей мере одно соединение типа фузарицидина формулы I и в частности соединения 1А и/или 1В, как раскрыто здесь и далее;

в) способность вырабатывать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фузарицидинов А, В, С, D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b, как раскрыто здесь и далее; и

г) способность вырабатывать по меньшей мере один литический фермент, выбранный из группы, состоящей из хитиназы, целлюлазы и амилазы, как раскрыто здесь и далее.

Предпочтительно указанный штамм Paenibacillus имеет способности, обозначены как (б), (в) и (г), в ростовой среде, включающей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота, как определено в данном тексте.

В частности, штаммы Paenibacillus согласно изобретению имеют две или более идентифицирующие характеристики депонированного штамма, при этом особое предпочтение отдается штаммам, имеющим по меньшей мере характеристики (а) и (б). Например, согласно лучшему варианту осуществления, штаммы согласно изобретению (а) обладают противогрибковой активностью против патогена растений, выбранного из группы, включающей Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum, где Alternaria spp. предпочтительно выбрана из A. solani и A. alternata, в частности A. solani и (б) способны вырабатывать по меньшей мере одно соединение формулы I, а именно соединение 1В. Согласно еще одному лучшему варианту осуществления, штаммы согласно изобретению (а) обладают противогрибковой активностью против трех или всех патогенов растений, выбранных из группы, включающей Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum, где Alternaria spp. предпочтительно выбрана из A. solani и A. alternata, в частности A. solani и (б) способны вырабатывать по меньшей мере одно соединение формулы I, предпочтительно вырабатывать соединения 1А или 1В, в частности вырабатывать соединения 1А и 1В.

Согласно варианту осуществления изобретения, штаммы согласно изобретению предоставляются в изолированной или в существенной степени очищенной форме.

Термины "изолированный" или "в существенной степени очищенный" обозначают то, что штаммы согласно изобретению были изъяты из природной среды и изолированы или отделены, и являются по меньшей мере на 60%, желательно по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% свободными от других компонентов, с которыми они были ассоциированы в природе. Изолят, полученный культивированием отдельной микробной колонии, является примером изолированного штамма согласно изобретению.

Штаммы согласно изобретению могут быть предоставлены в любом физиологическом состоянии, таком как активное или состояние покоя. Штаммы в состоянии покоя могут быть предоставлены, например, замороженными, высушенными или лиофилизированными или частично высушенными (методики изготовления частично высушенных организмов представлены в WO 2008/002371) или в виде спор.

Согласно варианту осуществления изобретения, штаммы согласно изобретению предоставляются в виде спор.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, штаммы согласно изобретению предоставляются в виде цельной культуральной жидкости, содержащей штамм согласно изобретению.

Культура является предпочтительно изолированной или в существенной степени очищенной культурой.

Термины "изолированная культура" или "в существенной степени очищенная культура" обозначают культуру штаммов согласно изобретению, которая не включает значительных количеств других материалов, обычно присутствующих в естественной среде, где растет штамм и/или из которой штамм обычно может быть получен. Следовательно, такая "изолированная культура" или "в существенной степени очищенная культура" по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% свободна от других материалов, обычно присутствующих в естественной среде, где растет штамм и/или из которой штамм обычно может быть получен. Такая "изолированная культура" или "в существенной степени очищенная культура" обычно не содержит каких-либо других микроорганизмов в количествах, достаточных для воспрепятствования воспроизведению штамма согласно изобретению. Изолированные культуры согласно изобретению, однако, могут быть скомбинированы для приготовления смешанной культуры штаммов согласно изобретению и дополнительного биопестицида, предпочтительно микробного пестицида.

Изобретение касается способов ферментационного производства антипатогенных биопестицидов, как описано в этом тексте.

Используемые согласно изобретению штаммы можно культивировать непрерывно или прерывисто в периодическом процессе или в полупериодическом (с подпиткой) или повторяющемся полупериодическом (с подпиткой) процессе. Обзор известных методов культивирования можно найти в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1. in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Среда, используемая для культивирования микроорганизма, должна удовлетворять требования конкретных штаммов должным путем. Описания сред культивирования для различных микроорганизмов представлены в справочнике "Manual of Methods for General Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).

Среды, которые могут применяться согласно изобретению, в общем содержат один или более источник углерода, источники азота, неорганические соли, витамины и/или микроэлементы. Преимущество в качестве источников углерода оказывают сахарам, таким как моно-, ди- или полисахариды. Очень хорошими источниками углерода являются, например, глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, рибоза, сорбоза, рибулоза, лактоза, мальтоза, сахароза, рафиноза, крахмал или целлюлоза. Сахара также могут быть добавлены в среду со сложными соединениями, такими как мелассы или другие побочные продукты сахароварения. Может также быть выгодно добавлять смеси различных источников углерода. Другими возможными источниками углерода являются масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или линолевая кислота, спирты, такие как глицерин, метанол или этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота или молочная кислота. Источниками азота являются обычно органические или неорганические соединения азота или материалы, содержащие такие соединения. Примеры источников азота включают аммиак в газообразной форме или соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония или нитрат аммония, нитраты, мочевина, аминокислоты или комплексные источники азота, такие как кукурузный экстракт, соевая мука, соевый белок, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и другие. Источники азота могут использоваться отдельно или в смеси. Неорганические солевые соединения, которые могут присутствовать в средах, включают хлоридные, фосфатные или сульфатные соли кальция, магния, натрия, кобальта, молибдена, калия, марганца, цинка, меди и железа. Неорганические серосодержащие соединения, например, сульфаты, сульфиты, дитиониты, тетратионаты, тиосульфаты, сульфиды, а также органические соединения серы, такие как меркаптаны и тиолы, могут быть использованы в качестве источников серы. Фосфорная кислота, дигидрофосфат калия или дикалия фосфат или соответствующие натриевые соли могут быть использованы в качестве источников фосфора. Для поддержания ионов металла в растворе к среде могут быть добавлены хелатирующие агенты. Особенно подходящие хелатирующие агенты включают дигидроксифенолы, такие как катехин или протокатехоат, или органические кислоты, такие как лимонная кислота. Среды для ферментации, используемые согласно изобретению, могут содержать и другие факторы роста, такие как витамины или стимуляторы роста, которые включают, например, биотин, рибофлавин, тиамин, фолиевую кислоту, никотиновую кислоту, пантотенат и пиридоксин. Факторы роста и соли часто происходят из комплексных составляющих среды, таких как дрожжевой экстракт, мелассы, кукурузный экстракт и т.п. Дополнительно к среде могут быть добавлены подходящие прекурсоры. Точный состав соединений в среде сильно зависит от конкретного эксперимента и должен быть определен индивидуально для каждого конкретного случая. Информацию по оптимизации сред можно найти в учебнике "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0199635773). Ростовые среды можно получить от коммерческих поставщиков, такие как Standard 1 (Merck) или BHI (среда с сердечно-мозговой вытяжкой, DIFCO) и т.д.

Ростовые среды, которым отдается предпочтение и которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, содержат один или более источников углерода, выбранных из L-арабинозы, N-ацетил-D-глюкозамина, D-галактозы, L-аспарагиновой кислоты, D-трегалозы, D -манозы, глицерина, D-глюконовой кислоты, D-ксилозы, D-маннита, D-рибозы, D-фруктозы, α-D-глюкозы, мальтозы, D-мелибиозы, тимидина, α-метил-D-галактозида, α-D-лактозы, лактулозы, сахарозы, уридина, α-гидроксиглутаровой кислоты-γ-лактона, β-метил-D-глюкозида, адонита, мальтотриозы, 2-дезоксиаденозина, аденозина, лимонной кислоты, муциновой кислоты, D-целлобиозы, инозина, L-серина, L-аланил-глицина, D-галактуроновой кислоты, α-циклодекстрина, β-циклодекстрина, декстрина, инулина, пектина, амигдалина, гентиобиозы, лактита, D-мелезитозы, α-метил-D-глюкозида, β-метил-D-галактозида, β-метил-D-ксилозида, палатинозы, D-рафинозы, стахиозы, туранозы, γ-аминомасляной кислоты, D-глюкозамина, D-молочной кислоты, L-лизина, 3-гидрокси-2-бутанона; и один или более источников азота, выбранных из аммиака, нитритов, нитратов, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, глицина, аминокислотных димеров: Ala-Asp, AlaGln, Ala-Glu, Ala-His, Gly-Gln, Gly-Glu, Gly-Met и Met-Ala; в частности нитрата. Эти среды могут быть дополнены неорганическими солями и витаминами и/или микроэлементами. В этих ростовых средах штаммы способны продуцировать соединения 1А и 1В.

Все компоненты среды стерилизуют нагреванием (20 мин при 2,0 бар и 121°С) или стерилизующей фильтрацией. Компоненты могут быть стерилизованы вместе или при необходимости отдельно. Все компоненты среды могут присутствовать в начале выращивания, или необязательно могут добавляться постоянно или подпиточными порциями.

Температура культивирования обычно составляет от 15°С до 36°С, лучше от 25°С до 33°С, и может поддерживаться на постоянном уровне или изменяться в течение эксперимента. Значение рН среды должно находиться в диапазоне от 5 до 8,5, лучше около 7,0. Значение рН для выращивания может контролироваться при выращивании добавлением основных соединений, таких как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак или аммиачная вода, или кислотных соединений, таких как фосфорная кислота или серная кислота. Для контроля пенообразования могут использоваться пеногасители, напр., полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид к среде могут добавляться подходящие вещества селективного действия, напр. антибиотики. Кислород или кислородсодержащие газовые смеси, напр., атмосферный воздух, подаются в культуру для поддержания аэробных условий. Температура культуры обычно составляет от 20°С до 45°С. Культивирование продолжают, пока не будет образовано максимальное количество желаемого продукта. Это обычно достигается в период от 10 до 160 часов.

В частности, штаммы согласно изобретению могут культивироваться в среде из ряда стандартных микробиологических сред, таких как среда Лурия-Бертани (ЛБ), триптиказо-соевая среда (ТСС), среда дрожжевой экстракт/солодовый экстракт/глюкоза (ДСГ, YMG, ISP2) при 15-36°С в течение 18-360 ч в жидкой среде или в отвержденной агаром среде на чашке Петри. Может потребоваться аэрация. Бактериальные клетки (вегетативные клетки и споры) могут быть промыты и сконцентрированы (напр., центрифугированием при температурах примерно 15-30°С в течение примерно 15 мин при 7000 g).

Изобретение также касается культуральной среды, получаемой культивированием штаммов согласно изобретению в среде и отделением среды от культуральной жидкости (то есть той, которая остается после удаления выращенных клеток из цельной культуральной жидкости), напр., супернатанта цельной культуральной жидкости, то есть жидкой среды, остающейся после удаления выращенных в ней клеток и других отходов центрифугированием, фильтрацией, седиментацией или другими средствами, хорошо известными в данной области техники. Супернатант может быть получен, например, центрифугированием при температуре примерно от 2 до 30°С (предпочтительно при температуре от 4 до 20°С) в течение примерно от 10 до 60 мин (более предпочтительно от 15 до 30 мин) при примерно от 5000 до 20000 g (более предпочтительно при примерно 15000 g).

Такая культуральная среда содержит пестицидные метаболиты, произведенные культивируемым штаммом.

Изобретение также касается бесклеточных экстрактов штаммов согласно изобретению. Для изготовления бесклеточного экстракта штаммы согласно изобретению могут культивироваться как описано выше. Клетки могут разрушать также высокочастотным ультразвуком, высоким давлением, напр., в прессе Френча, осмолизом, действием детергентов, литических ферментов или органических растворителей, в гомогенизаторах или комбинацией нескольких перечисленных методов. Экстракцию могут осуществлять желательно органическим растворителем или смесью растворителей, предпочтительно спиртом (напр. метанол, этанол, н-пропанол, 2-пропанол или подобные), более предпочтительно 2-пропанолом (напр., в отношении 1:1 к объему культуры). Разделение фаз может быть улучшено добавлением солей, таких как NaCl. Органическую фазу могут собирать, а растворитель или смесь растворителей - удалять обычной дистилляцией и/или высушиванием с последующим ресуспендированием в метаноле и фильтрацией.

Такой экстракт содержит пестицидные метаболиты, произведенные культивируемым штаммом.

Пестицидные метаболиты, которые являются специфическими для штаммов согласно изобретению, могут быть выделены из такой среды или экстракта обычными методами, в частности, когда штаммы согласно изобретению культивировались как описано выше.

Методология данного изобретения может также включать этап выделения отдельных пестицидных метаболитов.

Термин "выделение" охватывает экстрагирование, сбор, изолирование или очистку соединения из культуральной среды или бесклеточного экстракта. Выделение соединения может быть выполнено в соответствии с любой обычной методикой выделения или очистки, известной в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, обработку стандартной смолой (например, анион- или катионобменной смолой, неионной адсорбирующей смолой и т.д.), обработку стандартным адсорбентом (например, активированный уголь, кремниевая кислота, силикагель, целлюлоза, оксид алюминия и т.д.), изменение рН, экстракцию растворителем (например, со стандартным растворителем, таким как спирт, этилацетат, гексан и т.п.), дистилляцию, диализ, фильтрацию, концентрирование, кристаллизацию, перекристаллизацию, регулирование рН, лиофилизацию и тому подобное. Например, для выделения метаболитов из культуральной среды сначала могут быть удалены микроорганизмы. Оставшуюся жидкость затем пропускают через или над катионобменной смолой для удаления нежелательных катионов, а затем через или над анионобменной смолой для удаления нежелательных неорганических анионов и органических кислот.

В цельной культуральной жидкости новых штаммов Paenibacillus было обнаружено несколько метаболитов. Девять метаболитов были детально изучены и идентифицированы (см. Пример 7, Фиг. 1). Два из них были определены как новые (соединение 1А и соединение 1В). Было обнаружено, что соединения 1А и 1В производятся всеми тремя штаммами Paenibacillus согласно изобретению (см. Таблицу 17), но ни один из них не был обнаружен в цельной культуральной жидкости родственного штамма Paenibacillus peoriae NRRL BD-62.

Поэтому изобретение также касается соединений формулы I

где

R выбран из 15-гуанидин-3-гидроксипентадекановой кислоты (ГГПД) и 12-гуанидинододекановой кислоты (12-ГДК)

X¹ представляет собой треонин;

X² представляет собой изолейцин;

X³ представляет собой тирозин;

X⁴ представляет собой треонин;

X⁵ выбран из глутамина и аспарагина;

X⁶ представляет собой аланин; и

где стрелка обозначает одинарную (амидную) связь либо между карбонильным остатком R и аминогруппой аминокислоты X¹, либо между карбонильной группой одной аминокислоты и аминогруппой соседней аминокислоты, где наконечник стрелки указывает на присоединение к аминогруппе указанной соседней аминокислоты; и

где простая линия (без наконечника стрелки) обозначает одинарную (сложноэфирную) связь между карбонильной группой X⁶ и гидроксильной группой X¹;

и их приемлемых для сельского хозяйства солей.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, X¹ в формуле I предпочтительно является L-треонином.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, X² в формуле I предпочтительно является D-изолейцином или D-алло-изолейцином.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, X³ в формуле I предпочтительно является L-тирозином.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, X⁴ в формуле I предпочтительно является D-алло-треонином.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, X⁵ в формуле I предпочтительно является D-глутамином или D-аспаргином.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, R в формуле I предпочтительно является ГГПД.

Эскиз формулы I для соединений формулы I может также быть изображен следующим образом:

где

X выбран из -NH-(C=O)-CH₂-CH(OH)-(CH₂)₁₂-NH-C(=NH)NH₂ и -NH-(C=O)-(CH₂)₁₁-NH-C(=NH)NH₂;

R¹ представляет собой 1-гидроксиэтил;

R² представляет собой 1-метилпропил (втор-бутил)

R³ представляет собой 4-гидроксибензил;

R⁴ представляет собой 1-гидроксиэтил;

R⁵ выбран из карбамоилэтила и карбамоилметила;

R⁶ представляет собой метил.

Таким же образом предпочтительные варианты осуществления, основанные на этом альтернативном эскизе формулы I

являются следующими:

R¹ в этой формуле I предпочтительно представляет собой (1S, 2R)-1-гидроксиэтил.

R² в этой формуле I предпочтительно представляет собой (1R, 2R)-1-метилпропил или (1R,2S)-1-метилпропил.

R³ в этой формуле I предпочтительно представляет собой (S)-4-гидроксибензил.

R⁴ в этой формуле I предпочтительно представляет собой (1S,2R)-1-гидроксиэтил.

R⁵ в этой формуле I предпочтительно представляет собой (R)-карбамоилэтил и (R)-карбамоилметил.

X в этой формуле I предпочтительно представляет собой -NH-(C=O)-CH₂-CH(OH)-(CH₂)₁₂-NH-C(=NH)NH₂.

Согласно дальнейшему варианту осуществления, изобретение также касается соединений 1А и 1В, которые соответствуют формуле I, где R представляет собой ГГПД и X⁴ представляет собой аспарагин в случае соединения 1А, и X⁴ представляет собой глутамин в случае соединения 1В:

Пестицидные метаболиты штаммов согласно изобретению предпочтительно выбраны из соединений формулы I, где R представляет собой ГГПД, в частности выбраны из соединений 1А и 1В, которые могут быть получены экстракцией и выделением из культур, то есть цельных культуральных жидкостей, штаммов согласно изобретению.

Кроме того, соединения типа фузарицидина формулы I, включая те, где R является GHTD, могут быть синтезированы по аналогии с методами, известными в данной области (Biopolymers 80 (4), 541, 2005; J. Peptide Sci. 12S, 219, 2006; Tetrahedron Lett. 47 (48), 8587-90, 2006; Biopolymers 88 (4), 568, 2007; ChemMedChem 7, 871-882, 2012).

Изобретение также касается приемлемых для сельского хозяйства солей, в частности солей-аддуктов указанных соединений типа фузарицидина формулы I. Указанные соли могут быть получены обычными методами, хорошо известными в данной области, напр., реакцией соединений согласно изобретению с подходящей кислотой для образования соли-аддукта. Анионами полезных солей-аддуктов являются в первую очередь хлорид, бромид, фторид, йодид, гидросульфат, метилсульфат, сульфат, дигидрофосфат, гидрофосфат, нитрат, бикарбонат, карбонат, гексафторсиликат, гексафторфосфат, бензоат, а также анионы С₁-С₄-алкановых кислот, преимущественно формиат, ацетат, пропионат и бутират.

Отсюда, изобретение также касается цельной культуральной жидкости микроорганизма, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы I или приемлемую для сельского хозяйства его соль, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В или приемлемых для сельского хозяйства их солей, в частности цельная культуральная жидкость содержит соединения 1А и 1В или приемлемые для сельского хозяйства их соли.

Согласно дальнейшему варианту осуществления изобретение также касается цельной культуральной жидкости микроорганизма рода Paenibacillus, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы I или приемлемую для сельского хозяйства его соль, предпочтительно выбранную из соединений 1А и 1В или приемлемых для сельского хозяйства их солей, в частности указанная цельная культуральная жидкость содержит соединения 1А и 1В или приемлемые для сельского хозяйства их соли.

Согласно дальнейшему варианту осуществления изобретение также касается цельной культуральной жидкости по меньшей мере одного штамма Paenibacillus согласно изобретению, как он идентифицирован и определен выше, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы I или приемлемую для сельского хозяйства его соль, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В или приемлемых для сельского хозяйства их солей, в частности указанная цельная культуральная жидкость содержит соединения 1А и 1В или приемлемые для сельского хозяйства их соли.

Указанные соединения типа фузарицидина выделяются в культуральную среду соответствующего микроорганизма, способного их вырабатывать.

Отсюда, изобретение также касается культуральной среды и/или бесклеточного экстракта микроорганизма, содержащих по меньшей мере одно соединение формулы I или приемлемую для сельского хозяйства его соль, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В или приемлемых для сельского хозяйства их солей, в частности указанные культуральная среда и/или бесклеточный экстракт содержат соединения 1А и 1В или приемлемые для сельского хозяйства их соли.

Согласно дальнейшему варианту осуществления изобретение также касается культуральной среды и/или бесклеточного экстракта микроорганизма рода Paenibacillus, содержащих по меньшей мере одно соединение формулы I или приемлемую для сельского хозяйства его соль, предпочтительно выбранную из соединений 1А и 1В или приемлемых для сельского хозяйства их солей, в частности указанные культуральная среда и/или бесклеточный экстракт содержат соединения 1А и 1В или приемлемые для сельского хозяйства их соли.

Согласно дальнейшему варианту осуществления изобретение также касается культуральной среды и/или бесклеточного экстракта по меньшей мере одного штамма Paenibacillus согласно изобретению, как он идентифицирован и определен выше, содержащих по меньшей мере одно соединение формулы I или приемлемую для сельского хозяйства его соль, предпочтительно выбранное из соединений 1А и 1В или приемлемых для сельского хозяйства их солей, в частности указанные культуральная среда и/или бесклеточный экстракт содержат соединения 1А и 1В или приемлемые для сельского хозяйства их соли.

Изобретение также касается агрохимических композиций, содержащих вспомогательный ингредиент, как определено ниже, и по меньшей мере один или более из штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред и соединений формулы I согласно изобретению, соответственно.

Здесь и далее "композиция" в отношении продукта (микробного штамма, агента или состава) согласно данному изобретению означает комбинацию ингредиентов, а "составление" является процессом применения формулы, такой как рецепт, для комбинации ингредиентов и их соединения для образования состава. Такая композиция также обозначается здесь и далее как состав.

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, пригодны в качестве противогрибковых агентов или фунгицидов. Они отличаются исключительной эффективностью против широкого спектра фитопатогенных грибов, включая грибы, передающиеся через почву, особенно те, которые происходят из классов Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (син. Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes (син. Fungi imperfecti). Некоторые являются системно эффективными и могут быть использованы в защите сельскохозяйственных культур как лиственные фунгициды, фунгициды для обеззараживания семян и почвенные фунгициды. Более того, они подходят для борьбы с вредными грибами, которые inter alia встречаются в древесине или корнях растений.

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, имеют особо важное значение в борьбе со многими фитопатогенными грибами на разных культурных растениях, таких как зерновые, напр. пшеница, рожь, ячмень, тритикале, овес или рис; свекла, напр. сахарная свекла или кормовая свекла; фрукты, такие как семечковые, косточковые или мягкие фрукты, напр. яблоки, груши, сливы, персики, миндаль, вишня, клубника, малина, ежевика или крыжовник; бобовые растения, такие как чечевица, горох, люцерна или соя; масличные растения, такие как рапс, горчица, маслина, подсолнечник, кокос, какао-бобы, клещевина, масличные пальмы, арахис или соя; тыквенные, такие как тыква, огурцы или дыни; волокнистые растения, такие как хлопок, лен, конопля и джут; цитрусовые фрукты, такие как апельсины, лимоны, грейпфруты или мандарины; овощи, такие как шпинат, салат, спаржа, капуста, морковь, лук, томаты, картофель, тыква или красный перец; лавровые растения, такие как авокадо, корица или камфора; энергетические и сырьевые растения, такие как кукуруза, соя, рапс, сахарный тростник или масличные пальмы; кукуруза; табак; орехи; кофе; чай; бананы; виноград (столовый виноград и лозы для виноградного сока); хмель; дерн; сладкий лист (также называется стевия); натуральные каучуковые растения или декоративные и лесные растения, такие как цветы, кустарники, широколистные деревья и вечнозеленые растения, напр. хвойные породы; и на материале для размножения растений, таком как семена, и на урожайном материале этих растений.

Преимущественно штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, используются в борьбе со многими грибами на полевых сельскохозяйственных культурах, таких как картофель, сахарная свекла, табак, пшеница, рожь, ячмень, овес, рис, кукуруза, хлопок, соя, рапс, бобовые культуры, подсолнечник, кофе или сахарный тростник; фрукты; виноградные лозы; декоративные растения; или овощи, такие как огурцы, помидоры, бобы или кабачки.

Термин "материал для размножения растений" следует понимать как обозначающий все генеративные части растения, такие как семена и вегетативный растительный материал, такой как черенки и клубни (напр., картофель), который может использоваться для размножения растения. Это включает семена, корни, плоды, клубни, луковицы, корневища, побеги, ростки и другие части растений, в том числе саженцы и молодые растения, которые должны быть пересажены после прорастания или после появления из почвы. Такие молодые растения могут также быть защищены до пересадки общей или частичной обработкой путем погружения или обливания.

Предпочтительно обработка материала для размножения растений штаммами, цельными культуральными жидкостями, бесклеточными экстрактами, культуральной средой, соединениями формулы I и композициями согласно изобретению, соответственно, используется для борьбы со многими грибами на зерновых, таких как пшеница, рожь, ячмень и овес; рис, кукуруза, хлопок и соя.

Термин "культурные растения" следует понимать как охватывающий растения, модифицированные разведением, мутагенезом или генной инженерией, включая, но не ограничиваясь ими, продукты сельскохозяйственной биотехнологии, находящиеся на рынке или в разработке (cf. http://cera-gmc.org/, см. базу данных GM crop). Генетически модифицированными являются растения, чей генетический материал был изменен с использованием техник рекомбинантной ДНК так, что в природных условиях такое изменение не может быть просто получено скрещиванием, мутациями или естественной рекомбинацией. Обычно для совершенствования определенных свойств растения в генетический материал генетически модифицированного растения встраивают один или более генов. Такие генетические модификации также включают, но не ограничиваются ими, целевые посттрансляционные модификации белка (-ов), олиго- или полипептидов, напр. гликозилирование или добавление полимеров, таких как пренилированные, ацетилированные или фарнезилированные фрагменты или ПЭГ-фрагменты.

Растения, которые были модифицированы разведением, мутагенезом или генной инженерией, напр., получили устойчивость к применению конкретных классов гербицидов, таких как ауксингербициды, такие как дикамба или 2,4-D; обесцвечивающие гербициды, такие как ингибиторы гидроксифенилпируватдиоксигеназы (ГФПД) или ингибиторы фитоендесатуразы (ФДС); ингибиторы ацетолактатсинтазы (АЛС), такие как сульфонилмочевины или имидазолиноны; ингибиторы енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ЕПШФС), такие как глифозат; ингибиторы глутаминсинтетазы (ГС), такие как глюфозинат; ингибиторы протопорфириноген-IX оксидазы; ингибиторы биосинтеза липидов, такие как ингибиторы ацетил-КоА-карбоксилазы (АККазы) или оксиниловые (т.е. бромоксиниловые или иоксиниловые) гербициды, как результат общепринятых методов разведения или генной инженерии. Более того, растения получили устойчивость ко многим классам гербицидов путем многих генетических модификаций, таких как устойчивость к глифозату и глюфозинату или к глифозату и гербициду другого класса, такого как ингибиторы АЛС, ингибиторы ГФПД, ауксингербициды или ингибиторы АККазы. Эти технологии устойчивости к гербицидам описаны, напр., в Pest Managem. Sci. 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Sci. 57, 2009 г., 108; Austral. J. Agricult. Res. 58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1185; и процитированных в этих документах ссылках. Некоторые культурные растения получили устойчивость к гербицидам обычными методами разведения (мутагенеза), напр. летний рапс Clearfield^® (Canola, BASF SE, Германия), устойчивый к имидазолинонам, напр. имазамоксу, или подсолнечник ExpressSun^® (DuPont, США), устойчивый к сульфонилмочевинам, напр., трибенурону. Методы генной инженерии использовались для придания культурным растениям, таким как соя, хлопок, кукуруза, свекла и рапс, устойчивости к таким гербицидам, как глифозат и глюфозинат, некоторые из них доступны на рынке под торговыми марками RoundupReady^® (глифозат-устойчива, Monsanto, США), Cultivance^® (имидазолинон- устойчива, BASF SE, Германия) и LibertyLink^® (глюфозинат-устойчива, Bayer CropScience, Германия).

Кроме того, также охвачены растения, которые благодаря использованию техник рекомбинантной ДНК способны синтезировать один или более инсектицидных белков, особенно тех, которые известны из рода бактерий Bacillus, в частности, Bacillus thuringiensis, таких как δ-эндотоксины, напр. CryIA (b), CryIA (с), CryIF, CryIF (a2), CryIIA (b), CryIIIA, СryIIIВ (b1) или Cry9c; вегетативные инсектицидные белки (VIP), напр. VIP1, VIP2, VIP3 или VIP3A; инсектицидные белки бактерий, колонизирующих нематод, напр. Photorhabdus spp. или Xenorhabdus spp.; токсины, которые производят животные, такие как токсины скорпиона, токсины пауков, токсины ос или другие нейротоксины, специфичные для насекомых; токсины, которые производят грибы, такие как токсины стрептомицетов; растительные лектины, такие как лектины гороха или ячменя; агглютинины; ингибиторы протеиназы, такие как ингибиторы трипсина, ингибиторы сериновых протеаз, пататина, цистатина или папаина; рибосом-инактивирующие белки (РИБ), такие как рицин, кукуруза-РИБ, абрин, люфин, сапорин или бриодин; ферменты метаболизма стероидов, такие как 3-гидроксистероидоксидаза, экдистероид-ИДФ-гликозил-трансфераза, холестериноксидаза, ингибиторы экдизонов или HMG-CoA-редуктазы; блокаторы ионных каналов, такие как блокаторы натриевых или кальциевых каналов; эстеразы ювенильных гормонов; рецепторы мочегонных гормонов (рецепторы геликокинина); стилбенсинтаза, бибензилсинтаза, хитиназы или глюканазы. В контексте данного изобретения эти инсектицидные белки или токсины следует также понимать как претоксины, гибридные белки, обрезанные или иным образом модифицированные белки. Гибридные белки характеризуются новой комбинацией белковых доменов (см., Напр., WO 02/015701). Дальнейшие примеры таких токсинов или генетически модифицированных растений, способных синтезировать такие токсины, описаны, напр., В ЕР-А 374753, WO 93/007278, WO 95/34656, ЕР-А 427529, ЕР-А 451878, WO 03/18810 и WO 03/52073. Способы получения таких генетически модифицированных растений обычно известны специалисту в данной области и описаны, напр., в вышеупомянутых публикациях. Эти инсектицидные белки, содержащиеся в генетически модифицированных растениях, придают растениям, которые их вырабатывают, устойчивость к вредителям всех таксономических групп членистоногих, особенно жесткокрылых (Coeloptera), двукрылых насекомых (Diptera), молей (Lepidoptera) и нематод (Nematoda). Генетически модифицированные растения, способные синтезировать один или более инсектицидных белков, описаны, напр., в вышеупомянутых публикациях, а некоторые из них доступны на рынке, такие как YieldGard ^® (сорта кукурузы, вырабатывающие токсин Cry1Ab), YieldGard^® Plus (сорта кукурузы, вырабатывающие токсины Cry1Ab и Cry3Bb1), Starlink^® (сорта кукурузы, вырабатывающие токсин Cry9c), Herculex^® RW (сорта кукурузы, вырабатывающие Cry34Ab1, Cry35Ab1 и фермент фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы [ФАТ]), NuCOTN^® 33В (сорта хлопка, вырабатывающие токсин Cry1Ac), Bollgard^® I (сорта хлопка, вырабатывающие токсин Cry1Ас), Bollgard^® II (сорта хлопка, вырабатывающие токсины Cry1Ас и Cry2Ab2) VIPCOT^® (сорта хлопка, вырабатывающие токсин VIP); NewLeaf^® (сорта картофеля, вырабатывающие токсин Cry3A) Bt-Xtra^®, NatureGard^®, KnockOut^®, BiteGard^®, Protecta^®, Bt11 (напр. Agrisure^® CB) и Bt176 от Syngenta Seeds SAS, Франция, (сорта кукурузы, вырабатывающие токсин Cry1Ab и фермент ФАТ), MIR604 от Syngenta Seeds SAS, Франция (сорта кукурузы, вырабатывающие модифицированную версию токсина Cry3AA, cf WO 03/018810), MON 863 от Monsanto Europe SA, Бельгия (сорта кукурузы, вырабатывающие токсин Cry3Bb1), IPC 531 от Monsanto Europe SA, Бельгия (сорта хлопка, вырабатывающие модифицированную версию токсина Cry1Ac) и 1507 от Pioneer Overseas Corporation, Бельгия (сорта кукурузы, вырабатывающие токсин Cry1F и фермент ФАТ).

Более того, также охвачены растения, которые путем использования техник рекомбинантной ДНК способны синтезировать один или более белков для повышения устойчивости или переносимости этими растениями бактериальных, вирусных или грибковых патогенов. Примерами подобных белков являются так называемые "белки, связанные с патогенезом" (ПП-белки, см., напр., ЕР-А 392225), гены устойчивости растений к болезням (напр., сорта картофеля, экспрессирующие гены устойчивости к Phytophthora infestans, которые происходят из мексиканского дикого картофеля Solanum bulbocastanum) или Т4-лизоцим (напр., сорта картофеля, которые способны синтезировать эти белки с повышенной устойчивостью против таких бактерий, как Erwinia amylvora). Способы получения таких генетически модифицированных растений обычно известны специалисту в данной области и описаны, напр., в вышеупомянутых публикациях.

Более того, также охвачены растения, которые путем использования техник рекомбинантной ДНК способны синтезировать один или более белков для повышения производительности (напр., выработки биомассы, урожайности зерна, содержания крахмала, содержания жиров или белков), засухоустойчивости, устойчивости к осолонению или другим факторам среды, которые ограничивают рост, или устойчивости к вредителям и грибковым, бактериальным или вирусным патогенам этих растений.

Более того, также охвачены растения, которые путем использования техник рекомбинантной ДНК содержат измененное количество составных веществ или новые составные вещества специально для улучшения питания человека или животных, напр., масличные растения, производящие полезные для здоровья длинноцепочечные омега-3-жирные кислоты или ненасыщенные омега-9 жирные кислоты (напр., рапс Nexera^®, DOW Agro Sciences, Канада).

Более того, также охвачены растения, которые из-за использования техник рекомбинантной ДНК содержат измененное количество составных веществ или новые составные вещества специально для улучшения выхода сырья, напр., картофель, вырабатывающий повышенное количество амилопектина (напр., картофель Amflora^®, BASF SE, Германия).

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, являются особенно пригодными для борьбы со следующими заболеваниями растений:

Albugo spp.(белая ржавчина) на декоративных растениях, овощах (напр. А. candida) и подсолнечнике (напр. A. tragopogonis); Alternaria spp. (пятнистость листьев Alternaria) на овощах, рапсе (A. brassicola или brassicae), сахарной свекле (A. tenuis), фруктах, рисе, сое, картофеле (напр. A. solani или A. alternata), помидорах (напр., A. solani или A. alternata) и пшенице; Aphanomyces spp. на сахарной свекле и овощах; Ascochyta spp. на зерновых и овощах, напр. A. tritici (антракноз) на пшенице и A. hordei на ячмене; Bipolaris и Drechslera spp. (телеоморфы: Cochliobolus spp.), напр. южный ожог листьев (D. maydis) или северный ожог листьев (В. zeicola) на кукурузе, напр. гельминтоспориоз корней (В. sorokiniana) на зерновых и напр. В. oryzae на рисе и травах; Blumeria (ранее Erysiphe) graminis (мучнистая роса) на зерновых (напр. на пшенице или ячмене); Botrytis cinerea (телеоморфы: Botryotinia fuckeliana: серая плесень) на фруктах и ягодах (напр. клубнике), овощах (напр. салате, моркови, сельдерее и капусте), рапсе, цветах, виноградных лозах, лесных растениях и пшенице; Bremia lactucae (ложная мучнистая роса) на салате; Ceratocystis (син. Ophiostoma) spp. (гниль или увядание) на широколистных деревьях и вечнозеленых растениях, напр. С. ulmi (голландская болезнь вязов) на вязах; Cercospora spp. (пятнистость листьев Cercospora) на кукурузе (напр., серая пятнистость листьев: С. zeae-maydis), рисе, сахарной свекле (напр., С. beticola), сахарном тростнике, овощах, кофе, сое (напр. С. sojina или С. kikuchii) и рисе; Cladosporium spp. на помидорах (напр., С. fulvum: плесень листьев) и зерновых, напр. С. herbarum (черные ушки) на пшенице; Claviceps purpurea (спорынья) на зерновых; Cochliobolus (анаморф: Helminthosporium Bipolaris) spp. (пятнистость листьев) на кукурузе (С. carbonum), зерновых (напр. С. sativus, анаморф: В. sorokiniand) и рисе (напр., С. miyabeanus, анаморф: Н. oryzae); Colletotrichum (телеоморфы: Glomerella) spp. (антракноз) на хлопке (напр. С. gossypii), кукурузе (напр., С. graminicola: антракнозная гниль стебля), мягких фруктах, картофеле (напр., С. coccodes: черные точки), фасоли (напр., С. lindemuthianum) и сое (напр. С. truncatum или С. gloeosporioides); Corticium spp., напр. С. sasakii (болезнь эпидермиса) на рисе; Corynespora cassiicola (пятнистость листьев) на сое и декоративных растениях; Cycloconium spp., напр. С. oleaginum на оливковых деревьях; Cylindrocarpon spp. (напр., некроз плодовых деревьев или увядание молодых лоз, телеоморфы: Nectria или Neonectria spp.) на плодовых деревьях, виноградных лозах (напр., С. liriodendri, телеоморфы: Neonectria liriodendri: заболевание "черная ножка") и декоративных растениях; Dematophora (телеоморфы: Rosellinid) necatrix корневая и стеблевая гниль) на сое; Diaporthe spp., напр. D. phaseolorum (полегание) на сое; Drechslera (син. Helminthosporium, телеоморфы: Pyrenophora) spp. на кукурузе, зерновых, таких как ячмень (напр., D. teres, сетчатая пятнистость) и пшеница (напр., D. tritici-repentis: пиренофороз), рисе и травах; Esca (отмирание верхушек побегов, усыхание побегов) на виноградных лозах, вызванное Formitiporia (син. Phellinus) punctata, F. mediterranea, Phaeomoniella chlamydospora (ранее Phaeoacremonium chlamydosporum), Phaeoacremonium aleophilum и/или Botryosphaeria obtusa; Elsinoe spp. на семечковых фруктах (E. pyri), мягких фруктах (E. veneta: антракноз) и виноградных лозах (Е. ampelina: антракноз) Entyloma oryzae (головня листьев) на рисе; Epicoccum spp. (черная плесень) на пшенице; Erysiphe spp. (мучнистая роса) на сахарной свекле (Е. betae), овощах (напр. Е. pisi), таких как тыква (напр., Е. cichoracearum), капуста, рапс (напр., Е. cruciferarum); Eutypa lata (некроз или отмирание верхушек побегов Eutypa, анаморф: Cytosporina lata, сын. Libertella blepharis) на плодовых деревьях, виноградных лозах и декоративных деревьях; Exserohilum (син. Helminthosporium) spp. на кукурузе (напр., Е. turcicum); Fusarium (телеоморфы: Gibberella) spp. (увядание, корневая или стеблевая гниль) на разных растениях, такие как F. graminearum или F. culmorum (корневая гниль, парша или фузариоз) на зерновых (напр. пшенице или ячмене), F. oxysporum на помидорах, F. solani (ранее glycines, теперь син. F. virguliforme) и F. tucumaniae и F. brasiliense, каждый из которых вызывает синдром внезапной смерти сои и F. verticillioides на кукурузе; Gaeumannomyces graminis (выпревание) на зерновых (напр. пшенице или ячмене) и кукурузе; Gibberella spp. на зерновых (напр. G. zeae) и рисе (напр., G. fujikuroi: болезнь "пьяного риса") Glomerella cingulata на виноградных лозах, семечковых фруктах и других растениях и G. gossypii на хлопке; комплекс окрашивания зерна риса; Guignardia bidwellii (черная гниль) на виноградных лозах; Gymnosporangium spp. на розовых растениях и можжевельнике, напр. G. sabinae (ржавчина) на грушах; Helminthosporium spp. (син. Drechslera, телеоморфы: Cochliobolus) на кукурузе, зерновых и рисе; Hemileia spp., напр. Н. vastatrix (ржавчина кофейных листьев) на кофе; Isariopsis clavispora (син. Cladosporium vitis) на виноградных лозах; Macrophomina phaseolina (син. Phaseoli) (корневая и стеблевая гниль) на сое и хлопке; Microdochium (син. Fusarium) nivale (розовая снежная плесень) на зерновых (напр. пшенице или ячмене); Microsphaera diffusa (мучнистая роса) на сое; Monilinia spp., напр. М. laxa, М. fructicola и М. fructigena (усыхание ветвей и цветов, бурая гниль) на косточковых фруктах и других розовых растениях; Mycosphaerella spp. на зерновых, бананах, мягких фруктах и арахисе, такие как напр. М. graminicola (анаморф: Septoria tritici, септориозная пятнистость) на пшенице или М. fijiensis болезнь "черная сигатока") на бананах; Peronospora spp. (ложная мучнистая роса) на капусте (напр., P. brassicae), рапсе (напр., Р. parasitica), луке (напр. P. destructor), табаке (P. tabacina) и сое (напр. Р. manshurica); Phakopsora pachyrhizi и P. meibomiae (ржавчина сои) на сое; Phialophora spp. напр. на виноградных лозах (напр., P. tracheiphila и Р. tetraspora) и сое (напр. P. gregata: стеблевая гниль); Phoma lingam (корневая и стеблевая гниль) на рапсе и капусте и P. betae (корневая гниль, пятнистость листьев и полегание) на сахарной свекле; Phomopsis spp. на подсолнечнике, виноградных лозах (напр. P. viticola: лиственная пятнистость) и сои (напр. стеблевая гниль: P. phaseoli, телеоморфы: Diaporthe phaseolorum); Physoderma maydis (бурые пятна) на кукурузе; Phytophthora spp. (увядание, корневая, листовая, плодовая и стеблевая гниль) на различных растениях, таких как паприка и тыквенные (напр., P. capsici), соя (напр. P. megasperma, син. P. sojae), картофель и помидоры (напр. P. infestans: фитофтороз) и широколистные деревья (напр. Р. ramorum: внезапная гибель дуба); Plasmodiophora brassicae (кила) на капусте, рапсе, редисе и других растениях; Plasmopara spp., напр. Р. viticola (ложная мучнистая роса виноградных лоз) на виноградных лозах и Р. halstedii на подсолнечнике; Podosphaera spp. (мучнистая роса) на розовых растениях, хмеле, семечковых и мягких фруктах, напр. P. leucotricha на яблоках; Polymyxa spp., напр. на зерновых, таких как ячмень и пшеница (P. graminis) и сахарная свекла (P. betae) и вирусные болезни, которые ею передаются; Pseudocercosporella herpotrichoides (очковая пятнистость, телеоморфы: Tapesia yallundae) на зерновых, напр. пшенице или ячмене; Pseudoperonospora (ложная мучнистая роса) на разных растениях, напр. P. cubensis на тыкве или P. humili на хмеле; Pseudopezicula tracheiphila (краснуха или "rotbrenner", анаморф: Phialophora) на виноградных лозах; Puccinia spp. (ржавчина) на разных растениях, напр. P. triticina (бурая или лиственная ржавчина), P. striiformis (полосатая или желтая ржавчина), P. hordei (карликовая ржавчина), P. graminis (стеблевая или черная ржавчина) или P. recondita (бурая или лиственная ржавчина) на зерновых, как напр. пшеница, ячмень или рожь, P. kuehnii (рыжая ржавчина) на сахарном тростнике и P. asparagi на спарже; Pyrenophora (анаморф: Drechslera) tritici-repentis (пиренофороз) на пшенице или P. teres (сетчатая пятнистость) на ячмене; Pyricularia spp., напр. P. oryzae (телеоморфы: Magnaporthe grisea, пирикуляриоз риса) на рисе и P. grisea на травах и зерновых; Pythium spp. (полегание) на травах, рисе, кукурузе, пшенице, хлопке, рапсе, подсолнечнике, сое, сахарной свекле, овощах и различных других растениях (напр. P. ultimum или P. aphanidermatum); Ramularia spp., напр. R. collo-cygni (пятнистость листьев Ramularia, физиологическая пятнистость листьев) на ячмене и R. beticola на сахарной свекле; Rhizoctonia spp. на хлопке, рисе, картофеле, травах, кукурузе, рапсе, картофеле, сахарной свекле, овощах и различных других растениях, напр. R. solani (корневая и стеблевая гниль) на сое, R. solani (болезнь эпидермиса) на рисе или R. cerealis (весенняя болезнь Rhizoctonia) на пшенице или ячмене; Rhizopus stolonifer (черная плесень, мягкая гниль) на клубнике, моркови, капусте, виноградных лозах и помидорах; Rhynchosporium secalis (ожог) на ячмене, ржи и тритикале; Sarocladium oryzae и S. attenuatum (гниль эпидермиса) на рисе; Sclerotinia spp. (стеблевая гниль или белая плесень) на овощах и полевых культурах, таких как рапс, подсолнечник (напр., S. sclerotiorum) и соя (напр., S. rolfsii или S. sclerotiorum); Septoria spp. на различных растениях, напр. S. glycines (бурая пятнистость) на сое, S. tritici (септориозная пятнистость) на пшенице и S. (син. Stagonospora) nodorum (пятнистость Stagonospora) на зерновых; Uncinula (син. Erysiphe) necator (мучнистая роса, анаморф: Oidium tuckeri) на виноградных лозах; Setospaeria spp. (ожог листьев) на кукурузе (напр., S. turcicum, сын. Helminthosporium turcicum) и травах; Sphacelotheca spp. (головня) на кукурузе, (напр., S. reiliana: летучая головня), сорго и сахарном тростнике; Sphaerotheca fuliginea (мучнистая роса) на тыквах; Spongospora subterranea (мучнистая парша) на картофеле и вирусные болезни, передаваемые с ней; Stagonospora spp. на зерновых, напр. S. nodorum (пятнистость Stagonospora, телеоморфы: Leptosphaeria [син. Phaeosphaeria] nodorum) на пшенице; Synchytrium endobioticum на картофеле (рак картофеля); Taphrina spp., напр. Т. deformans (курчавость листьев) на персиках и Т. pruni (карманная болезнь слив) на сливах; Thielaviopsis spp. (черная корневая гниль) на табаке, семечковых фруктах, овощах, сое и хлопке, напр. Т. basicola (сын. Chalara elegans); Tilletia spp. (твердая головня или вонючая головня) на зерновых, такие как напр. Т. tritici (син. Т. caries, головня пшеницы) и Т. controversa (карликовая головня) на пшенице; Typhula incarnata (серая снежная плесень) на ячмене или пшенице; Urocystis spp., напр. U. occulta (стеблевая головня) на ржи; Uromyces spp. (ржавчина) на овощах, таких как фасоль (напр., U. appendiculatus, син. U. phaseoli) и сахарная свекла (напр. U. betae) Ustilago spp. (пылевая головня) на зерновых (напр. U. nuda и U. avaenae), кукурузе (напр., U. maydis: головня кукурузы) и сахарного тростника; Venturia spp. (парша) на яблоках (напр., V. inaequalis) и грушах; и Verticillium spp. (вилт) на разных растениях, таких как фрукты и декоративные растения, виноградные лозы, мягкие фрукты, овощи и полевые культуры, напр. V. dahliae на клубнике, рапсе, картофеле и помидорах.

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, также подходят для борьбы с вредными микроорганизмами, особенно грибами, при защите продуктов или урожая на хранении и защите материалов.

Термин "защита материалов" следует понимать как обозначающий защиту технических и неживых материалов, таких как адгезивы, клеи, древесина, бумага и картон, текстильные изделия, кожа, красочные дисперсии, пластмассы, охлаждающие смазки, волокна или ткани, от заражения и разрушения вредными микроорганизмами, такими как грибы и бактерии. В отношении древесины и других материалов особое внимание уделяется следующим вредным грибам: Аскомицеты, такие как Ophiostoma spp., Ceratocystis spp., Aureobasidium pullulans, Sclerophoma spp., Chaetomium spp., Humicola spp., Petriella spp., Trichurus spp.; Базидиомицеты, такие как Coniophora spp., Coriolus spp., Gloeophyllum spp., Lentinus spp., Pleurotus spp., Poria spp., Serpula spp. и Tyromyces spp., Дейтеромицеты, такие как Aspergillus spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Trichorma spp., Alternaria spp., Paecilomyces spp. и Зигомицеты, такие как Mucor spp., и дополнительно при защите продуктов и урожая на хранении внимания заслуживают следующие дрожжевые грибы: Candida spp. и Saccharomyces cerevisiae.

Способ обработки согласно изобретению может также быть использован в области защиты продуктов или урожая на хранении от поражения грибами и микроорганизмами. Согласно данного изобретения термин "продукты на хранении" следует понимать как обозначающий природные вещества растительного или животного происхождения и их переработанные формы, которые были изъяты из природного жизненного цикла и которым нужна долговременная защита. Продукты на хранении, происходящие от культурных растений, такие как растения или их части, например, стебли, листья, клубни, семена, плоды или зерно, могут получить защиту в свежесобранном состоянии или в обработанном виде, таком как предварительно высушенный, увлажненный, измельченный, молотый, прессованный или поджаренный, такие процессы также известны как послеуборочная обработка. Также под определение продукта на хранении подпадают лесоматериалы, либо в форме необработанных лесоматериалов, таких как строительный лес, опоры или барьеры линий электропередач, либо в виде завершенных изделий, таких как мебель или деревянные вещи. Продуктами на хранении животного происхождения являются шкуры, обработанная кожа, мех, шерсть и др. Комбинации согласно данному изобретению способны предупреждать нежелательные эффекты, такие как разложение, потеря цвета или плесень. Предпочтительно термин "продукты на хранении" следует понимать как обозначающий природные вещества растительного происхождения и их переработанные формы, преимущественно плоды и их переработанные формы, такие как семечковые, косточковые фрукты, мягкие фрукты и цитрусовые фрукты и их переработанные формы.

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, могут быть использованы для улучшения здоровья растения. Изобретение также относится к способу улучшения здоровья растения путем обработки растения, материала для его размножения и/или места, где растет или будет расти растение, эффективным количеством штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций.

Термин "здоровье растения" следует понимать как обозначающий состояние растения и/или его продуктов, который определяется несколькими показателями отдельно или в комбинации друг с другом, такими как урожайность (напр. повышенное количество биомассы и/или повышенное содержание ценных ингредиентов), сила растения (напр., улучшенный рост растения и/или более зеленые листья ("эффект озеленения")), качество (напр., улучшенное содержание или состав определенных ингредиентов) и устойчивость к абиотическим и/или биотическим стрессам. Вышеупомянутые показатели состояния здоровья растения могут быть взаимозависимыми или могут следовать друг из друга.

Более здоровые растения являются желанными, поскольку они среди прочего дают лучший урожай и/или лучшее качество растений или культур, конкретнее лучшее качество собранных растительных частей. Более здоровые растения также лучше переносят биотический и/или абиотический стресс. Хорошая устойчивость к биотическим стрессам в свою очередь позволяет специалисту снизить количество применяемых пестицидов и соответственно замедлить развитие резистентности к соответствующим пестицидам.

Следует отметить, что вышеперечисленные эффекты штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, то есть усиленное здоровье растения, проявляются также и когда растение не находится в состоянии биотического стресса, в частности, когда растение не находится под действием вредителей.

Например, для применений в обработке семян и почвы очевидно, что растение, которое страдает от поражения грибами или насекомыми, проявляет уменьшенную схожесть и прорастание, что приводит к худшей приживаемости и силе и, как следствие, к пониженной урожайности по сравнению с материалом для размножения растений, который подвергли лечебной или профилактической обработке от соответствующего вредителя, и который может расти без ущерба, причиненного фактором биотического стресса. Тем не менее, способы согласно изобретению приводят к улучшенному здоровью растений даже при отсутствии какого-либо биотического стресса. Это означает, что положительные эффекты штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, не могут быть объяснены исключительно пестицидной активностью штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, но вместо этого базируются на дальнейших профилях активности. Соответственно, применение штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, может быть осуществлено и при отсутствии действия вредителей.

В варианте осуществления, которому предоставляется такое же преимущество, данное изобретение касается способа улучшения здоровья растений, выращенных из указанного материала для размножения растений, где материал для размножения растений обработан эффективным количеством по меньшей мере одного из штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению.

Каждый нижеперечисленный показатель здоровья растения, который выбран из групп, состоящих из урожайности, силы растения, качества и устойчивости растения к абиотическому и/или биотическому стрессу, следует понимать как предпочтительный вариант данного изобретения, как по отдельности, так и предпочтительно в сочетании друг с другом.

Согласно данного изобретения "повышенная урожайность" растения означает, что выход продукта соответствующего растения повышен на измеримое количество по сравнению с выходом продукта растения, произведенным в тех же условиях, но без применения штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно.

Для обработки семян, напр., в виде инокулянта и/или в виде внекорневого нанесения, повышенная урожайность может характеризоваться, среди прочего, следующими улучшенными характеристиками растения: увеличенная масса растения; и/или увеличенная высота растения; и/или увеличенная биомасса, такая как повышенная общая свежая масса (СМ); и/или повышенное количество цветков на растении; и/или повышенный урожай зерна и/или плодов; и/или больше побегов или боковых отростков (ветвей); и/или большие листья; и/или лучший рост побегов; и/или повышенное содержание белков; и/или повышенное содержание жиров и/или повышенное содержание крахмала; и/или повышенное содержание пигментов и/или повышенное содержание хлорофилла (существует положительная корреляция между содержанием хлорофилла и скоростью фотосинтеза растения и, соответственно, чем выше содержание хлорофилла, тем выше урожайность растения) и/или повышенное качество растения.

"Зерно" и "плоды" следует понимать как любой растительный продукт, который используется дальше после сбора урожая, напр., собственно фрукты, овощи, орехи, зерно, семена, древесина (напр. в случае лесных растений), цветы (напр., в случае садоводческих растений, декоративных растений) и т.д., который представляет собой любую экономическую ценность, производимую растением.

Согласно данного изобретения урожайность повышается минимум на 4%. В целом повышение урожайности может быть даже большим, например, 5-10%, предпочтительно 10-20%, или даже 20-30%.

Согласно данного изобретения урожайность - при измерении при отсутствии действия вредителей - повышается минимум на 2%. В целом, повышение урожайности может быть даже больше, например, до 4-5% или даже больше.

Другим показателем состояния растения является сила растения. Сила растения проявляется в нескольких аспектах, таких как общий внешний вид.

Для внекорневого применения улучшение силы растений можно охарактеризовать, в частности, следующими улучшенными свойствами растений: улучшенная жизнеспособность растений; и/или улучшенный рост растений; и/или улучшенное развитие растений; и/или улучшенный внешний вид; и/или улучшенный растительный покров (меньше наклоненных/полегших растений и/или большая листовая пластинка, и/или больший размер, и/или увеличение высоты растений, и/или увеличение числа побегов, и/или увеличение числа боковых побегов и/или увеличение количества цветков на растении, и/или усиление роста побегов, и/или повышенная фотосинтетическая активность (напр., по повышенной проводимости устьиц и/или увеличению скорости ассимиляции CO₂)); и/или более раннее цветение; и/или более раннее плодоношение; и/или более раннее созревание зерна; и/или меньше непроизводительных побегов и/или меньше мертвых базальных листьев; и/или меньше необходимых внесений (напр., удобрений или воды); и/или более зеленые листья; и/или полное созревание в сокращенных вегетативных периодах; и/или облегчение сбора урожая; и/или более быстрое и более равномерное созревание; и/или длительный срок годности; и/или длиннее метелки; и/или задержка старения; и/или более сильные и/или более производительные побеги; и/или лучшая экстрактивность ингредиентов; и/или улучшение качества семян (для посева в следующих сезонах для производства семян) и/или уменьшение производства этилена и/или угнетение его восприятия растением.

Другим показателем состояния растения является "качество" растения и/или его продуктов. Согласно данному изобретения улучшенное качество означает, что определенные характеристики растения, такие как содержание или состав определенных ингредиентов, повышены или улучшены на измеримое или заметное количество по сравнению с тем же фактором растения, произведенным в тех же условиях, но без применения штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно. Улучшенное качество можно среди прочего охарактеризовать следующими улучшенными свойствами растения или его продукта: повышенное содержание питательных веществ; и/или повышенное содержание белка; и/или повышенное содержание жиров и/или повышенное содержание крахмала; и/или повышенное содержание жирных кислот; и/или повышенное содержание метаболитов и/или повышенное содержание каротиноидов; и/или повышенное содержание сахаров; и/или повышенное содержание незаменимых аминокислот; и/или улучшенный состав питательных веществ; и/или улучшенный состав белков; и/или улучшенный состав жирных кислот; и/или улучшенный состав метаболитов и/или улучшенный состав каротиноидов; и/или улучшенный состав сахаров; и/или улучшенный состав аминокислот; и/или улучшенный или оптимальный цвет фруктов и/или улучшенный цвет листьев; и/или повышенная способность к хранению; и/или лучшая пригодность собранных продуктов к переработке.

Другим показателем состояния растения является устойчивость или резистентность к факторам биотического и/или абиотического стресса. Биотический и абиотический стресс, особенно в долгосрочной перспективе, могут вредно влиять на растения.

Биотический стресс вызывают живые организмы, в то время как абиотический стресс вызывается, например, экстремальными условиями окружающей среды. Согласно данного изобретения "повышенная устойчивость или резистентность к факторам биотического и/или абиотического стресса" означает (1) что определенные негативные факторы, вызванные биотическим и/или абиотическим стрессом, измеримо или заметно ослабляются по сравнению с растениями, которые поддали действию тех же условий, но без обработки штаммами, цельными культуральными жидкостями, бесклеточными экстрактами, культуральной средой, соединениями формулы I и композициями согласно изобретению, соответственно, и (2) что негативные эффекты не ослабляются непосредственным действием штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, на стрессовые факторы, напр., их фунгицидным или инсектицидным действием, непосредственно уничтожающим микроорганизмы или вредителей, но скорее стимуляцией собственных защитных реакций растения против указанных стрессовых факторов.

Негативные факторы, вызванные биотическим стрессом, таким как патогены или вредители, широко известны и вызываются живыми организмами, такими как конкурирующие растения (напр., сорняки), микроорганизмы (например, фитопатогенные грибки и/или бактерии) и/или вирусы.

Негативные факторы, вызванные абиотическим стрессом, также хорошо известны и часто могут наблюдаться как пониженная сила растения (см. выше), например:

меньшая урожайность и/или меньшая сила, для обоих эффектов это могут быть среди прочего обожженные листья, меньше цветков, преждевременное созревание, позднее созревание зерна, сниженная питательная ценность.

Абиотический стресс может быть вызван, например, следующим: экстремальные температуры, такие как тепло или холод (тепловой стресс/холодовой стресс) и/или сильные колебания температуры; и/или температуры, необычные для конкретного сезона; и/или засухи (засушный стресс) и/или избыточная влажность; и/или высокая соленость (солевой стресс); и/или излучение (например, повышенное УФ-облучение из-за утончения озонового слоя); и/или повышенный уровень озона (озоновый стресс) и/или органические загрязнения (например, фитотоксическими количествами пестицидов) и/или неорганические загрязнения (например, загрязняющими тяжелыми металлами).

В результате факторов биотического и/или абиотического стресса количество и качество растений в состоянии стресса снижаются. В плане качества (как оно определено выше) обычно серьезно страдает репродуктивное развитие, с важными последствиями для плодов или семян сельскохозяйственных культур. На синтез, накопление и хранение белков в основном влияет температура; рост замедляется практически всеми типами стресса; синтез полисахаридов, как структурных, так и запасных, уменьшается или изменяется: эти эффекты приводят к снижению количества биомассы (урожая) и изменений в питательной ценности продукта.

Как было сказано выше, вышеуказанные показатели состояния здоровья растения могут быть взаимозависимыми и могут следовать друг из друга. Например, повышенная резистентность к биотическому и/или абиотическому стрессу может привести к лучшей силе растения, напр., к лучшим и большим посевам, а отсюда к повышенной урожайности. И наоборот, более развитая корневая система может дать лучшую резистентность к биотическим и/или абиотическим стрессов. Однако не все эти взаимозависимости и взаимодействия известны и полностью понятны, потому разные показатели описывают отдельно.

В одном варианте осуществления штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, достигают повышенной урожайности растения или его продукта. В другом варианте осуществления штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, достигают повышенной силы растения или его продукта. В другом варианте осуществления штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, достигают повышенного качества растения или его продукта. В еще одном варианте осуществления штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, достигают повышенной устойчивости и/или резистентности растения или его продукта к биотическим стрессам. В еще одном варианте осуществления штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, достигают повышенной устойчивости и/или резистентности растения или его продукта к абиотическим стрессам.

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды и соединения формулы I, соответственно, используются как таковые или в виде композиций путем обработки грибов или растений, материалов для размножения растений, таких как семена, почвы, поверхностей, материалов или комнат, которые должны быть защищены от поражения грибами, фунгицидно эффективным количеством действующих веществ. Применение может выполняться как до, так и после заражения растений, материалов для размножения растений, таких как семена, почвы, поверхностей, материалов или комнат грибами.

Термин "эффективное количество" обозначает количество, достаточное для борьбы с вредными грибами на культивируемых растениях или при защите материалов, и которое не наносит значительный ущерб обрабатываемым растениям. Такое количество может варьироваться в широком диапазоне и зависит от различных факторов, таких как вид грибов, с которым борются, обрабатываемое культивируемое растение или материал, климатические условия и используемые штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды и соединения формулы I или их соли согласно изобретению, соответственно.

Материалы для размножения растений могут обрабатываться штаммами, цельными культуральными жидкостями, бесклеточными экстрактами, культуральной средой, соединениями формулы I и композициями согласно изобретению, соответственно, профилактически во время или до посадки или пересадки.

Штаммы согласно изобретению могут быть составлены как инокулянт для растения. Термин "инокулянт" означает композицию, включающую изолированный штамм согласно изобретению и необязательно носитель, который может включать биологически приемлемую среду.

Подобные инокулянты и другие подходящие композиции могут быть подготовлены как композиции, содержащие кроме действующих веществ по меньшей мере одно дополнительное вещество (инертный ингредиент), привычными средствами (см. напр. HD Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998).

Для получения сухого состава бактериальные клетки, лучше споры, могут быть суспендированы в подходящем сухом носителе (напр., глине). Для получения жидкого состава клетки, лучше споры, могут быть ресуспендированы в подходящем жидком носителе (напр., на основе воды) до желаемой плотности спор. Показатель плотности спор в спорах на миллилитр может быть определен подсчетом количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на агаровой среде, напр. картофельно-декстрозном агаре, после инкубации в течение нескольких дней при температуре от около 20 до около 30°С.

Согласно одному варианту осуществления отдельные компоненты композиции согласно изобретению, такие как части набора или части двухкомпонентной или трехкомпонентной смеси, могут быть смешаны непосредственно пользователем в резервуаре опрыскивателя или сосуде любого другого типа, применяемого для нанесения (напр., барабанные протравители семян, машины для дражирования семян, ранцевый опрыскиватель), и при необходимости могут быть добавлены дальнейшие вспомогательные вещества. Когда живые микроорганизмы, такие как штаммы Paenibacillus согласно изобретению, являются частью подобного набора, следует следить за тем, чтобы выбор и количество других частей набора (напр., химических пестицидных агентов) и дополнительных вспомогательных веществ не влияли на жизнеспособность микробных пестицидов в композиции, смешанной пользователем. Совместимость с соответствующим микробным пестицидом особенно должна учитываться для бактерицидов и растворителей.

Штаммы, цельная культуральная жидкость, бесклеточные экстракты, культуральные среды и/или соединения формулы согласно изобретению могут быть переработаны в привычные виды агрохимических композиций, напр., растворы, эмульсии, суспензии, порошки, пудры, пасты, гранулы, прессованные формы, капсулы и их смеси. Примерами видов композиций являются суспензии (напр., SC, OD, FS), эмульгируемые концентраты (напр. ЕС), эмульсии (напр., EW, ЕО, ES, ME), капсулы (напр., CS, ZC), пасты, таблетки, смачиваемые порошки или пудры (напр., WP, SP, WS, DP, DS), прессованные формы (напр., BR, ТВ, DT), гранулы (напр. WG, SG, GR, FG, GG, MG), инсектицидные изделия (напр., LN), а также гелеобразные составы для обработки материалов для размножения растений, таких как семена (напр., GF). Эти и другие виды композиций определены в "Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6 ^th Ed. May 2008, CropLife International.

Композиции готовят обычным способом, таким как описано в Mollet and Grubemann, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; или Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T & F Informa, London, 2005.

Пригодными вспомогательными веществами являются растворители, жидкие носители, твердые носители или наполнители, поверхностно-активные вещества, диспергирующие агенты, эмульгаторы, смачивающие агенты, адъюванты, солюбилизаторы, агенты, которые способствуют проникновению, защитные коллоиды, адгезивные агенты, загустители, увлажнители, репелленты, аттрактанты, стимуляторы поедания, вещества, улучшающие совместимость, бактерициды, противозамерзальные агенты, пеногасители, красители, агенты, придающие липкость и связующие вещества.

Пригодными растворителями и жидкими носителями являются вода и органические растворители, такие как минеральные нефтяные фракции от средней до высокой температуры кипения, напр. керосин, дизельное топливо; жиры растительного или животного происхождения; алифатические, циклические и ароматические углеводороды, напр. толуол, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины; спирты, напр. этанол, пропанол, бутанол, бензиловый спирт, циклогексанол; гликоли; ДМСО; кетоны, напр. циклогексанон; сложные эфиры, напр. лактаты, карбонаты, сложные эфиры жирных кислот, гамма-бутиролактон; жирные кислоты; фосфонаты; амины; амиды, напр. N-метилпирролидон, диметиламиды жирных кислот; и их смеси.

Пригодными твердыми носителями или наполнителями являются минералы, напр. силикаты, силикагели, тальк, каолин, известняк, известь, мел, глины, доломит, кизельгур, бентонит, сульфат кальция, сульфат магния, оксид магния; полисахариды, напр. целлюлоза, крахмал; удобрения, напр. сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевина; продукты растительного происхождения, напр. мука из зерновых культур, мука из древесной коры, древесная мука, мука из ореховой скорлупы, а также их смеси.

Пригодными поверхностно-активными веществами являются поверхностно-активные соединения, такие как анионные, катионные, неионные и амфотерные поверхностно-активные вещества, блок-полимеры, полиэлектролиты и их смеси. Подобные поверхностно-активные вещества могут применяться как эмульгатор, диспергирующий агент, солюбилизатор, смачивающий агент, агент, который способствует проникновению, защитный коллоид или адъювант. Примеры поверхностно-активных веществ перечислены в McCutcheon's, Vol. 1: Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (международное издание или североамериканское издание).

Пригодными анионными поверхностно-активными веществами являются щелочные, щелочноземельные или аммониевые соли сульфонатов, сульфатов, фосфатов, карбоксилатов и их смесей. Примерами сульфонатов являются алкиларилсульфонаты, дифенилсульфонаты, альфа-олефинсульфонаты, лигнинсульфонаты, сульфонаты жирных кислот и жиров, сульфонаты этоксилированных алкилфенолов, сульфонаты алкоксилированных арилфенолов, сульфонаты сконденсированных нафталинов, сульфонаты додецил- и тридецилбензолов, сульфонаты нафталина и алкилнафталинов, сульфосукцинаты или сульфосукцинаматы. Примерами сульфатов являются сульфаты жирных кислот и жиров, этоксилированных алкилфенолов, спиртов, этоксилированных спиртов или сложных эфиров жирных кислот. Примерами фосфатов являются сложные фосфатные эфиры. Примерами карбоксилатов являются алкилкарбоксилаты и этоксилаты карбоксилированных спиртов или алкилфенолов.

Пригодными неионными поверхностно-активными веществами являются алкоксилаты, N-замещенные амиды жирных кислот, оксиды аминов, сложные эфиры, поверхностно-активные вещества на основе сахаров, полимерные поверхностно-активные вещества и их смеси. Примерами алкоксилатов являются такие соединения, как спирты, алкилфенолы, амины, амиды, арилфенолы, жирные кислоты или сложные эфиры жирных кислот, которые алкоксилированы 1-50 эквивалентами. Для алкоксилирования могут использоваться этиленоксид и/или пропиленоксид, предпочтительно этиленоксид. Примерами N-замещенных амидов жирных кислот являются глюкамиды жирных кислот или алканоламиды жирных кислот. Примерами сложных эфиров являются сложные эфиры жирных кислот, глицериновые эфиры или моноглицериды. Примерами поверхностно-активных веществ на основе сахаров являются сорбитаны, этоксилированные сорбитаны, сахароза и сложные эфиры глюкозы или алкилполиглюкозиды. Примерами полимерных поверхностно-активных веществ являются гомо- или сополимеры винилпирролидона, виниловые спирты или винилацетат.

Пригодными катионными поверхностно-активными веществами являются ПАВ на основе четвертичного аммония, например, четвертичные соединения аммония с одной или двумя гидрофобными группами, или соли длинноцепочечных первичных аминов. Пригодными амфотерными поверхностно-активными веществами являются алкилбетаины и имидазолины. Пригодные блок-полимеры представляют собой блок-сополимеры типа А-В или А-В-А, содержащие блоки полиэтиленоксида и полипропиленоксида, или типа А-В-С, содержащий алканолы, полиэтиленоксид и полипропиленоксид. Пригодными полиэлектролитами являются поликислоты или полиоснования. Примерами поликислот являются щелочные соли полиакриловой кислоты или поликислотные гребнеобразные полимеры. Примерами полиоснований являются поливиниламины или полиэтиленамины.

Пригодные адъюванты представляют собой соединения, которые имеют незначительную или даже не имеют собственной пестицидной активности, и которые улучшают биологическую функциональность бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита относительно мишени. Примерами являются ПАВ, минеральные или растительные масла и другие дополнительные вещества. Дальнейшие примеры перечислены в Knowles, Adjuvants and additives, Agrow Reports DS256, T & F Informa UK, 2006, раздел 5.

Пригодные загустители представляют собой полисахариды (напр., ксантановая камедь, карбоксиметилцеллюлоза), неорганические глины (органически модифицированные или немодифицированные), поликарбоксилаты и силикаты.

Пригодными бактерицидами являются бронопол и производные изотиазолинона, такие как алкилизотиазолиноны и бензизотиазолиноны. Пригодными противозамерзальными агентами являются этиленгликоль, пропиленгликоль, мочевина и глицерин. Пригодными пеногасителями являются силиконы, длинноцепочечные спирты и соли жирных кислот. Пригодными красителями (напр., красными, голубыми или зелеными) являются пигменты с низкой водорастворимостью и водорастворимые красители. Примерами могут быть неорганические красители (напр. оксид железа, оксид титана, гексацианоферрат железа) и органические красители (напр., ализарин-, азо- и фталоцианиновые красители). Пригодными агентами, придающими липкость и связующими веществами являются поливинилпирролидон, поливинилацетаты, поливиниловые спирты, полиакрилаты, биологические или синтетические воски и эфиры целлюлозы.

Когда живые микроорганизмы, такие как штаммы Paenibacillus согласно изобретению в виде клеток или спор являются частью композиций, то такие композиции могут быть изготовлены как композиции, содержащие кроме действующих веществ по меньшей мере одно вспомогательное вещество (инертный ингредиент), обычными средствами (см. Напр. HD Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Пригодными обычными типами подобных композиций являются суспензии, порошки, пудры, пасты, гранулы, прессованные формы, капсулы и их смеси. Примерами видов композиций являются суспензии (напр., SC, OD, FS), капсулы (напр., CS, ZC), пасты, таблетки, смачиваемые порошки или пудры (напр., WP, SP, WS, DP, DS), прессованные формы (напр., BR, ТВ, DT), гранулы (напр. WG, SG, GR, FG, GG, MG), инсектицидные изделия (напр., LN), а также гелеобразные составы для обработки материалов для размножения растений, таких как семена (напр., GF). Следует принять во внимание, что каждый тип состава или выбранное вспомогательные вещества не должны влиять на жизнеспособность микроорганизма при хранении композиции и во время конечного применения к почве, растению или материалу для размножения растений. Пригодные составы упомянуты, напр. в WO 2008/002371, US 6,955,912, US 5,422,107.

Примерами пригодных вспомогательных веществ являются приведенные ранее примеры, при этом следует заботиться о том, чтобы выбор и количества таких вспомогательных веществ не влияли на жизнеспособность микробных пестицидов в композиции. Совместимость с соответствующим микроорганизмом соответствующего микробного пестицида особенно должна учитываться для бактерицидов и растворителей. Дополнительно композиции микробных пестицидов могут содержать стабилизаторы или питательные вещества и УФ-протекторы. Пригодными стабилизаторами или питательными веществами являются, напр., альфа-токоферол, трегалоза, глутамат, калия сорбат, различные сахара, такие как глюкоза, сахароза, лактоза и мальтодекстрин (HD Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Пригодными УФ-протекторами являются, напр. неорганические соединения типа пигментов из диоксида титана, оксида цинка и оксида железа, или органические соединения, такие как бензофеноны, бензотриазол и фенилтриазины. Композиции могут в дополнение ко вспомогательным веществам, упомянутым для композиций соединений I, необязательно содержать 0,1-80% стабилизаторов или питательных веществ и 0,1-10% УФ-протекторов.

Агрохимические композиции обычно содержат от 0,01 до 95%, более предпочтительно от 0,1 до 90% и в частности от 0,5 до 75% по массе действующего вещества. Действующие вещества используют со степенью чистоты от 90% до 100%, более предпочтительно от 95% до 100% (согласно ЯМР-спектру).

Примерами видов композиций и их приготовления являются:

I) Водорастворимые концентраты (SL, LS)

10-60 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению и 5-15 масс. % смачивающего агента (напр. алкоксилатов спиртов) растворяют в воде и/или водорастворимом растворителе (напр., спиртах) до 100 масс. %. Действующее вещество растворяется при разведении водой.

II) Диспергируемые концентраты (DC)

5-25 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению и 1-10 масс. % диспергирующего агента (напр., поливинилпирролидона) растворяют в органическом растворителе (напр., циклогексаноне) до 100 масс. %. При разведении водой получают дисперсию.

III) Эмульгируемые концентраты (ЕС)

15-70 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению и 5-10 масс. % эмульгаторов (напр., кальция додецилбензенсульфоната и этоксилата касторового масла) растворяют в водонерастворимом органическом растворителе (напр., ароматическом углеводороде) до 100 масс. %. При разведении водой получают эмульсию.

IV) Эмульсии (EW, ЕО, ES)

5-40 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению и 1-10 масс. % эмульгаторов (напр., кальция додецилбензенсульфоната и этоксилата касторового масла) растворяют в 20-40 масс. % водонерастворимого органического растворителя (напр., ароматического углеводорода). Эту смесь вносят в воду до 100 масс. % при помощи эмульгирующей машины и перерабатывают в гомогенную эмульсию. При разведении водой получают эмульсию.

V) Суспензии (SC, OD, FS)

Во встряхиваемой шариковой мельнице измельчают 20-60 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению с добавлением 2-10 масс. % диспергирующих агентов и смачивающих агентов (напр., лигносульфоната натрия и этоксилата спирта), 0,1-2 масс. % загустителя (напр., ксантановой камеди) и водой до 100 масс. % для получения тонкодисперсной суспензии действующего вещества. При разведении водой получают стабильную суспензию действующего вещества. Для композиции типа FS добавляют до 40 масс. % связующего вещества (напр. поливинилового спирта).

VI) Диспергируемые в воде и водорастворимые гранулы (WG, SG)

50-80 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению мелко размалывают с добавлением диспергирующих и смачивающих агентов (напр., лигносульфоната натрия и этоксилата спирта) до 100 масс. % и с помощью технических приспособлений (напр., экструзии, распылительных башен, псевдоожиженного слоя) готовят в виде диспергируемых в воде или водорастворимых гранул. При разведении водой получают стабильную дисперсию или раствор действующего вещества.

VII) Диспергируемые в воде и водорастворимые порошки (WP, SP, WS)

50-80 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению размалывают в роторно-статорной мельнице с добавлением 1-5 масс. % диспергирующих агентов (напр. лигносульфоната натрия), 1-3 масс. % смачивающих агентов (напр., этоксилата спирта) и твердого носителя (напр., силикагеля) до 100 масс. %. При разведении водой получают стабильную дисперсию или раствор действующего вещества.

VIII) Гель (GW, GF)

Во встряхиваемой шариковой мельнице измельчают 5-25 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению с добавлением 3-10 масс. % диспергирующих агентов (напр. лигносульфоната натрия), 1-5 масс. % загустителя (напр., карбоксиметилцеллюлозы) и водой до 100 масс. % для получения тонкодисперсной суспензии действующего вещества. При разведении водой получают стабильную суспензию действующего вещества.

IX) Микроэмульсии (ME)

5-20 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению добавляют к 5-30 масс. % смеси органических растворителей (напр. диметиламида жирной кислоты и циклогексанона), 10-25 масс. % смеси поверхностно активных веществ (напр. этоксилата спирта и этоксилата арилфенола) и воды до 100%. Смесь перемешивают в течение 1 ч для спонтанного получения термодинамически стабильной микроэмульсии.

X) Микрокапсулы (CS)

Жировую фазу, содержащую 5-50 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению, 0-40 масс. % водонерастворимого органического растворителя (напр., ароматического углеводорода), 2-15 масс. % акриловых мономеров (напр. метилметакрилата, метакриловой кислоты и ди- или триакрилата), диспергируют в водном растворе защитного коллоида (напр., поливинилового спирта). Радикальная полимеризация, инициированная радикальным инициатором, приводит к образованию поли(мет)акрилатных микрокапсул.

Альтернативно, жировую фазу, содержащую 5-50 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению, 0-40 масс. % водонерастворимого органического растворителя (напр., ароматического углеводорода), и изоцианатных мономеров (напр., дифенилметен-4,4'-диизоцианата), диспергируют в водном растворе защитного коллоида (напр., поливинилового спирта). Добавление полиамина (напр. гексаметилендиамина) приводит к образованию полимочевинных микрокапсул. Количество мономеров составляет 1-10 масс. %. Массовые проценты указаны относительно всей композиции CS.

XI) Распыляемые порошки (DP, DS)

1-10 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению тонко размалывают и тщательно перемешивают с твердым носителем (напр., тонко измельченным каолином) до 100 масс. %.

XII) Гранулы (GR, FG)

0,5-30 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению тонко размалывают и объединяют с твердым носителем (напр., силикатом) до 100 масс. %. Грануляцию осуществляют путем экструзии, распылительной сушки или в псевдоожиженном слое.

XIII) Жидкости сверхнизкого объема (UL)

1-50 масс. % цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды или метаболита согласно изобретению растворяют в органическом растворителе (напр., ароматическом углеводороде) до 100 масс. %.

Композиции типов I)-XIII) могут необязательно включать дальнейшие дополнительные вещества, такие как 0,1-1 масс. % бактерицидов, 5-15 масс. % противозамерзальных агентов, 0,1-1 масс. % пеногасителей и 0,1-1 масс. % красителей.

Растворы для обработки семян (LS), суспоэмульсии (SE), текучие концентраты (FS), порошки для сухой обработки (DS), диспергируемые в воде порошки для обработки суспензией (WS), водорастворимые порошки (SS), эмульсии (ES), эмульгируемые концентраты (ЕС) и гели (GF) обычно используются для целей обработки материалов для размножения растений, в частности семян.

Предпочтительные примеры типов составов для обработки семян или почвенного применения для предварительно смешанных композиций принадлежат к типам WS, LS, ES, FS, WG или CS.

Обычно предварительно смешанный состав для применения при обработке семян содержит 0,5-99,9 процентов, особенно 1-95 процентов желаемых ингредиентов, и 99,5-0,1 процента, особенно 99-5 процента твердого или жидкого адъюванта (включая, например, жидкость, такую как вода), где дополнительным веществом может быть ПАВ в количестве 0-50 процентов, особенно 0,5-40 процентов, в зависимости от предварительно смешанного состава. В то время как продукты для продажи предпочтительно составлены как концентраты (напр., предварительно смешанная композиция (состав)), конечный пользователь обычно использует разведенные составы (напр., композицию баковой смеси).

Методы обработки семян для нанесения штаммов, цельной культуральной жидкости, бесклеточного экстракта, культуральной среды, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, или обработки ими материала для размножения растений, особенно семян, известны в данной области и включают методы протравливания, покрытия, пленочного покрытия, дражирования и замачивания материала для размножения. Такие методы также применимы с комбинациями согласно изобретению. В более предпочтительном варианте осуществления штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, наносят на материал для размножения растений или обрабатывают его ими таким образом, чтобы не оказывать негативного влияния на прорастание. Соответственно, примерами подходящих методов нанесения (или обработки) на материал для размножения растений, такой как семена, являются протравливание семян, покрытие семян или дражирование семян и т.п.

Предпочтительно материал для размножения растений представляет собой семя, часть семени (напр. семяножку) или семенную луковицу.

Хотя считается, что данный метод может использоваться с семенами в любом физиологическом состоянии, предпочтительно, чтобы семена находились в достаточно прочном состоянии, чтобы не поддаваться повреждениям во время процесса обработки. Обычно семенами являются семена, собранные с поля; изъятые из растения; и отделенные от любого кочана, стебля, внешней шелухи и окружающей мякоти или иного несеменного растительного материала. Предпочтительно, чтобы семена были биологически стабильными до той степени, чтобы обработка не причинила им биологического вреда. Считается, что обработку семян можно проводить в любое время между сбором семян и их посевом, или во время посевного процесса (направленные на семена применения). Семена также могут быть праймированы до или после обработки.

При обработке материала для размножения желательно равномерное распределение ингредиентов в штаммах, цельных культуральных жидкостях, бесклеточных экстрактах, культуральных средах, соединениях формулы I и композициях согласно изобретению, соответственно, и их равномерная адгезия к семенам. Обработка может различаться от тонкой пленки (протравки) состава, содержащего комбинацию, например, смесь активного ингредиента (-ов), на материале для размножений растений, таком как семена, причем начальный размер и/или форма узнаваемы до промежуточного состояния (например, покрытие) и до более толстой пленки (например, дражирование многими слоями различных материалов (таких как носители, например, глины, различные составы, такие как другие активные ингредиенты, полимеры и красители), где уже нельзя узнать начальные форму и/или размер семян.

Аспект настоящего изобретения включает применение штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, на материале для размножения растений выбранным образом, включая размещение ингредиентов комбинации на весь материал для размножения растений либо на его часть, включая только на одну сторону или часть одной стороны. Обычный специалист в области поймет эти методы применения из описания, предоставленного в документах ЕР 954213 В1 и WO 06/112700.

Штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, могут также применяться в форме "таблетки" или "гранулы" или подходящего субстрата, путем помещения или посева обработанной таблетки или субстрата рядом с материалом для размножения растений. Такие техники известны в отрасли, в частности из документов ЕР 1124414, WO 07/67042, и WO 07/67044. Применение штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, описанное здесь для материала для размножения растений, также включает защиту материала для размножения растений, обработанного комбинацией согласно настоящему изобретению, путем помещения одной или более пестицидсодержащих частиц рядом с обработанными пестицидом семенами, при этом количество пестицида таково, что обработанные пестицидом семена и пестицидсодержащие частицы вместе составляют эффективную дозу пестицида и доза пестицида, содержащаяся в обработанном пестицидом семени, меньше или равна максимальной нефитотоксической дозе пестицида. Такие техники известны в отрасли, в частности из документа WO 2005/120226.

Применение штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, на семенах также включает покрытие с контролируемым высвобождением на семенах, где ингредиенты комбинаций включены в материалы, высвобождающие ингредиенты в течение определенного времени. Примеры технологий обработки семян с контролируемым высвобождением, как правило, известны в данной области и включают полимерные пленки, воски или другие семенные покрытия, причем ингредиенты могут быть включены в материал с контролируемым высвобождением или нанесены между слоями материалов, или и то, и другое.

Семена могут быть обработаны нанесением на них штаммов, цельных культуральных жидкостей, бесклеточных экстрактов, культуральных сред, соединений формулы I и композиций согласно изобретению, соответственно, в любой желаемой последовательности или одновременно.

Обработка семян происходит на непосеянных семенах, и термин "непосеянное семя» следует понимать как охватывающий семена в любой период между сбором семян и посевом их в почву с целью прорастания и выращивания растения.

Обработка непосеянных семян не включает техники, в которых действующее вещество наносят на почву, но включает любую технику нанесения, которая направлена на семена в процессе посева.

Предпочтительно обработка происходит перед посевом семян, таким образом посеянные семена предварительно обработаны штаммами, цельными культуральными жидкостями, бесклеточными экстрактами, культуральной средой, соединениями формулы I и композициями согласно изобретению, соответственно. В частности, предпочтение отдают покрытию или дражированию семян. В результате обработки ингредиенты закреплены на семенах и таким образом готовы для борьбы с вредителями.

Обработанные семена можно хранить, работать с ними, сеять и обрабатывать так же, как и любые другие обработанные действующим веществом семена.

В частности, настоящее изобретение относится к способу защиты материала для размножения растений от вредителей и/или улучшения здоровья растений, выращенных из указанного материала для размножения растений, в котором почву, куда будет высеваться материал для размножения растений, обрабатывают эффективным количеством штамма, бесклеточного экстракта, культуральной среды, метаболита или композиции согласно изобретению, соответственно.

В частности, настоящее изобретение относится к способу защиты материала для размножения растений от вредителей, в котором почву, куда будет высеваться материал для размножения растений, обрабатывают эффективным количеством штамма, бесклеточного экстракта, культуральной среды, метаболита или композиции согласно изобретению, соответственно.

В частности, настоящее изобретение относится к способу защиты материала для размножения растений от вредных грибов, в котором почву, куда будет высеваться материал для размножения растений, обрабатывают эффективным количеством штамма, бесклеточного экстракта, культуральной среды, метаболита или композиции согласно изобретению, соответственно.

В частности, настоящее изобретение относится к способу защиты материала для размножения растений от животных-вредителей (насекомых, клещей или нематод), в котором почву, куда будет высеваться материал для размножения растений, обрабатывают эффективным количеством штамма, бесклеточного экстракта, культуральной среды, метаболита или композиции согласно изобретению, соответственно.

Пользователь наносит композиции согласно изобретению обычно из устройства предварительного дозирования, ранцевого опрыскивателя, распыляющего устройства, распыляющего самолета или оросительной системы. Обычно агрохимическую композицию дополняют водой, буфером и/или последующими вспомогательными веществами в желаемой концентрации применения, и таким образом получают готовую к применению распылительную жидкость или агрохимическую композицию согласно изобретению. Обычно на гектар полезной сельскохозяйственной площади наносят от 20 до 2000 литров, предпочтительно от 50 до 400 литров готовой к использованию распылительной жидкости.

При обработке материала для размножения растений, особенно семян, раскрытые здесь композиции дают после двух- до десятикратных разведений концентрации действующих веществ в готовых к использованию препаратах от 0,01 до 60% по массе, более предпочтительно от 0,1 до 40%. Применение могут осуществлять до или во время посева. Способы нанесения штамма, бесклеточного экстракта, культуральной среды, метаболита или композиции согласно изобретению, соответственно, на материал для размножения растений, особенно семена, включают протравливание, покрытие, дражирование, опыление, замачивание и внесение в борозду. Предпочтительно штаммы, цельные культуральные жидкости, бесклеточные экстракты, культуральные среды, соединения формулы I и композиции согласно изобретению, соответственно, наносят на материал для размножения растений таким методом, что прорастание при этом не индуцируется, напр. протравливанием, дражированием, покрытием и опылением семян.

При применении штаммов согласно изобретению для защиты растений, если штаммы наносят как внекорневую обработку или на почву, нормы внесения обычно находятся в диапазоне от примерно 1×10⁶ до 5×10¹⁵ (или более) КОЕ/га, более предпочтительно от примерно 1×10⁷ до примерно 1×10¹³ КОЕ/га, еще более предпочтительно от примерно 1×10⁹ до 5×10¹² КОЕ/га.

При применении штаммов согласно изобретению для обработки семян нормы внесения относительно материала для размножения растений обычно находятся в диапазоне от примерно 1×10¹ к 1×10¹² (или более) КОЕ/семя, более предпочтительно от примерно 1×10³ до примерно 1×10¹⁰ КОЕ/семя, еще более предпочтительно от примерно 1×10³ до примерно 1×10⁶ КОЕ/семя. Альтернативно, нормы внесения относительно материала для размножения растений преимущественно находятся в диапазоне от примерно 1×10⁷ до 1×10¹⁶ (или более) КОЕ на 100 кг семян, более предпочтительно от 1×10⁹ до примерно 1×10¹⁵ КОЕ на 100 кг семян, более предпочтительно от 1×10¹¹ до примерно 1×10¹⁵ КОЕ на 100 кг семян.

При использовании бесклеточных экстрактов, культуральных сред и/или соединений формулы I твердое вещество (сухое вещество) считают активным компонентом, напр., таким, который получают после сушки или упаривания экстракционной среды или суспензионной среды в случае жидких составов. При применении для защиты растений вносимые количества активных компонентов в зависимости от желаемого эффекта составляют от 0,001 до 2 кг на га, преимущественно от 0,005 до 2 кг на га, более предпочтительно от 0,05 до 0,9 кг на га, в том числе от 0,1 до 0,75 кг на га. Для обработки материалов для размножения растений, таких как семена, напр. опылением, покрытием или вымачиванием, обычно нужны количества активных компонентов от 0,1 до 1000 г, предпочтительно от 1 до 1000 г, более предпочтительно от 1 до 100 г и наипредпочтительно от 5 до 100 г на 100 кг материала для размножения растений (преимущественно семян). При применении для защиты материалов или продуктов на хранении количество наносимых активных компонентов зависит от вида площади нанесения и желаемого эффекта. Для защиты материалов обычно используют количества от 0,001 г до 2 кг, более предпочтительно от 0,005 г до 1 кг активных компонентов на кубический метр обрабатываемого материала.

Согласно одному варианту осуществления отдельные компоненты композиции согласно изобретению, такие как части набора или части двухкомпонентной или трехкомпонентной смеси, могут быть смешаны непосредственно пользователем в резервуаре опрыскивателя или сосуде любого другого типа, применяемом для нанесения (напр., барабанные протравители семян, машины для дражирования семян, ранцевый опрыскиватель), и при необходимости могут быть добавлены дальнейшие вспомогательные вещества.

Если живые микроорганизмы, такие как штаммы согласно изобретению, являются частью подобного набора, следует заботиться о том, чтобы выбор и количество компонентов (напр., химических пестицидных агентов) и дополнительных вспомогательных веществ не влияли на жизнеспособность микроорганизмов в композиции, смешанной пользователем. Совместимость с соответствующим микроорганизмом особенно должна учитываться для бактерицидов и растворителей.

К штаммам, бесклеточным экстрактам, культуральным средам, метаболитам, соединениям формулы I и композициям согласно изобретению, соответственно, могут быть добавлены различные типы масел, увлажняющие агенты, адъюванты, удобрения или микроэлементы, а также дополнительные пестициды (напр. гербициды, инсектициды, фунгициды, регуляторы роста, предохранители, биопестициды), как предварительная смесь или, в случае необходимости, непосредственно перед применением (баковые смеси). Эти агенты могут быть смешаны с композициями согласно изобретению в массовом соотношении от 1:100 до 100:1, более предпочтительно от 1:10 до 10:1. Предпочтительно композиция согласно изобретению содержит дополнительный биопестицид. Еще более предпочтительно композиция согласно изобретению содержит, кроме вспомогательного вещества и по меньшей мере одного соединения формулы I, микробный пестицид.

Пестицид в общем является химическим или биологическим агентом (таким как вирус, бактерия, антимикробное или дезинфицирующее средство), который своим влиянием отпугивает, парализует, убивает или иным образом противодействует вредителям. Целевые вредители могут включать насекомых, патогены растений, сорняки, моллюсков, птиц, млекопитающих, рыб, нематод (круглых червей) и микробы, которые уничтожают имущество, вызывают неприятности, распространяют болезни или являются переносчиками болезней. Термин "пестициды" включает также регуляторы роста растений, которые изменяют ожидаемый рост, цветение или скорость размножения растений; дефолианты, вызывающие опадение листьев или другой зелени с растения, как правило, для облегчения сбора урожая; осушители, которые способствуют высыханию живых тканей, таких как нежелательные верхушки растений; растительные активаторы, активирующие физиологические возможности растений для защиты от определенных вредителей; предохранители, которые уменьшают нежелательное гербицидное действие пестицидов на сельскохозяйственные растения; и активаторы роста растений, которые влияют на физиологические возможности растений для увеличения роста растений, биомассы, урожайности или любого другого параметра качества продуктов, собираемых с сельскохозяйственного растения.

Примеры

Изобретение будет описано более подробно с помощью нижеследующих примеров. Следующие примеры приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1: Изолирование новых бактериальных штаммов согласно изобретению

В различных местах Европы, включая Германию, брали образцы почвы. Применяя к этим почвам общеизвестные процедуры выделения микробов, авторы изобретения получили различные бактерии, которые были дополнительно подвергнуты обычным техникам изолирования для обеспечения чистых изолятов, как описано в этом документе.

Для изолирования каждого типа бактерий придерживались стандартной методики микробного обогащения (СА Reddy, TJ Beveridge, JA Breznak, GA Marzluf, TM Schmidt, and LR Snyder (eds.). Methods for General and Molecular Microbiology, Am. Soc. Microbiol., Washington, District of Columbia).

Были изолированы и депонированы согласно Будапештскому договору в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) 20 февраля 2013 года следующие штаммы:

а) Lu16774, при депонировании в DSMZ получил учетный номер депонирования DSM 26969

б) Lu17007, при депонировании в DSMZ получил учетный номер депонирования DSM 26970

в) Lu17015, при депонировании в DSMZ получил учетный номер депонирования DSM 26971.

Пример 2 - Характеристика новых бактериальных штаммов

Пример 2.1: Секвенирование 16S-рДНК

Последовательности генов 16S рРНК штаммов Paenibacillus определяли прямым секвенированием ПЦР-амплифицированной 16S рДНК в DSMZ, Брауншвейг, Германия.

Выделение геномной ДНК выполняли с помощью набора для очистки ДНК грамположительных бактерий MasterPure ™ от Epicentre Biotechnologies в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР-опосредованную амплификацию 16S рДНК и очистку продукта ПЦР выполняли как описано ранее (Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 1088-1092, 1996). Очищенные продукты ПЦР секвенировали с помощью набора для циклического секвенирования BigDye^® Terminator v1.1 (Applied Biosystems), согласно протоколу производителя. Реакции секвенирования подвергали электрофорезу с помощью 3500xL Genetic Analyzer от Applied Biosystems. Неоднозначности последовательностей могли возникнуть из-за существования нескольких различных последовательностей цистронов, кодирующих 16S рРНК, в одном и том же геноме (J. Bacteriol. 178 (19), 5636-5643, 1996).

Полученные данные последовательностей штаммов вносили в редактор выравнивания АЕ2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), выравнивали вручную в соответствии с вторичной структурой получаемой молекулы рРНК и сравнивали с репрезентативными последовательностями генов 16S рРНК организмов, относящихся к Firmicutes (Nucl. Acids Res. 27 171-173, 1999). Последовательности 16S рРНК для сравнения брали из баз данных EMBL и RDP.

Последовательности 16S рДНК штаммов согласно изобретению изложены в Перечне последовательностей, как указано в таблице 2.

Значение идентичности генов 16S рДНК в процентах рассчитывали попарным сравнением последовательностей в выравнивании последовательностей, которые сравниваются.

Сравнение, выполненное только для двух последовательностей на основе попарного выравнивания, здесь и далее обозначается как "бинарное значение". Другие значения основаны на множественном выравнивании всех последовательностей в выравнивании. Более высокие значения идентичности, полученные сравнением многих последовательностей, проистекают из проблемы различной длины данных сравниваемых последовательностей, что привело к более краткому выравниванию.

Идентичность в процентах, полученная путем парного сравнения полных последовательностей рДНК, между тремя новыми штаммами Lu16774, Lu17007 и Lu17015 составляла от 99,5 до 99,9% (таблица 3, бинарные значения).

Сравнение полных последовательностей 16S рРНК трех новых штаммов Lu16774, Lu17007 и Lu17015 с родственными таксонами (см. Фиг. 9) выявило высокий процент идентичности с Paenibacillus peoriae (типичный штамм DSM 8320), а именно 99,8%. Бинарные значения для парных выравниваний последовательностей P. peoriae с новыми штаммами были следующими: Lu16774: 99,5%, Lu17007: 99,5%; и Lu17015: 99,7% идентичности, соответственно.

Финальную оценку вида, к которому принадлежат новые штаммы Paenibacillus Lu16774, Lu17015 и Lu17007 на основе данных последовательностей 16S рРНК осуществить не удалось.

Секвенирование полной рДНК для Paenibacillus peoriae NRRL BD-62 выявило 100,0% идентичность с P. peoriae (типичный штамм DSM 8320), подтверждая видовую принадлежность P. peoriae этого штамма BD-62 (см. Фиг. 9).

Близкое родство всех трех новых штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17015 и Lu17007 с P. peoriae было подтверждено сравнением с последовательностью 16S рРНК штамма P. peoriae BD-62, что дало значение идентичности 99,8% (см. Фиг. 9).

Для построения филогенетической дендрограммы использовали операции пакета ARB (Nucl. Acids Res. 35, 7188-7196, 2007): на основе значений эволюционных расстояний методом присоединения соседей строили филогенетическое дерево (Jukes, ТН & Cantor CR (1969). Evolution of protein molecules. В Mammalian protein metabolism, ст. 21-132. Edited by HN Munro. New York: Academic press) с использованием поправок Jukes and Cantor (Mol. Biol. Evol. 4, 406-425, 1987). Корень дерева определяли включением в анализ последовательности гена 16S рРНК Cohnella thermotolerans. Метка масштаба под дендрограммой обозначает 1 нуклеотидное замещение на 100 нуклеотидов. Результаты показаны на Фигуре 10.

Филогенетическая дендрограмма этих последовательностей (Фиг. 10) показывает, что три новые штаммы Lu 16774, Lu 17007 и Lu 17015 ближе всего родственны друг другу, а ближайший родственник каждого из них - штамм Paenibacillus peoriae NRRL BD-62.

Пример 2.2: Анализ RiboPrint

Выполняли стандартизированное автоматизированное риботипирование, применяя систему Qualicon RiboPrinter. Система RiboPrinter сочетает стадии молекулярной обработки для риботипирования в отдельном автоматизированном приборе. Процедура включает лизис клеток, расщепление хромосомной ДНК рестрикционным ферментом EcoRI, разделение фрагментов электрофорезом, перенос фрагментов ДНК на нейлонную мембрану, гибридизацию с зондом, образованным из оперона rrnB E.coli, хемилюминесцентное выявление зонда на фрагментах, содержащих последовательности оперона rrnB, детектирование изображения и компьютерный анализ схем RiboPrint (Food Technology 50 (1), 77-81, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5229-5233, 1995; Int. Journ. Syst. Bact. 44 (3), 454-460, 1994).

Риботипирование проводилось DSMZ, Германия, для новых штаммов Paenibacillus strains Lu 16774, Lu 17007 и Lu 17015 по сравнению со штаммом P. peoriae BD-62 с использованием рестрикционного фермента EcoRI. Полученные схемы сравнивали с использованием программного обеспечения системы RiboPrinter, интегрированной Идентификационной библиотеки DuPont и BioNumerics Software (Applied Maths, Бельгия).

Сходство всех трех новых штаммов с BD-62 составляло от 0,24 до 0,5 (Фиг. 11). Три новых штамма разделяются на две группы, первая из которых включает Lu17015, тогда как вторая включает штаммы Lu16774 и Lu17007. Ни один из новых штаммов не выявил большего, чем 0,84, сходства ни с одним штаммом в Идентификационной библиотеке DuPont и поэтому не был идентифицирован автоматически.

Штамм BD-62 был идентифицирован как Paenibacillus peoriae на основании записи DUP-13142 Идентификационной библиотеки DuPont (запись сделана на основе Paenibacillus peoriae DSM 8320).

Пример 2.3: Морфологическая и физиологическая характеристика

Штаммы характеризовали в DSMZ по аналогии с методами, описанными в Gordon, RE, Haynes, WC & Pang. CH-N. (1973): The Genus Bacillus, Agriculture Handbook no. 427. Washington DC: US Department of Agriculture. Результаты представлены в Таблице 4.

* н.р. = нет роста.

Анализ клеточных жирных кислот, проведенный в DSMZ, показал, что у всех штаммов их профиль типичен для Paenibacillus spp.

С использованием имеющихся генетических, физиологических и биохимических данных показано, что штаммы Lu16774, Lu17007 и Lu17015 принадлежат к роду Paenibacillus. Поскольку штаммы Lu16774, Lu17007 и Lu17015, как и BD-62, вырабатывают газ из глюкозы, то ни один из них не относится к Paenibacillus jamilae.

Фенотипическое дифференциирование Paenibacillus peoriae и Paenibacillus polymyxa в первую очередь возможно с использованием характеристик кислотообразования на определенных субстратах (Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (2), 388-390, 1993; In. J. Syst. Bacteriol. 46 (6), 988-1003, 1996). Ни один из новых штаммов не совпал полностью с характеристиками, приведенными в таблице 4 для любого из этих двух видов, но суммарно имеющиеся генетические, физиологические и биохимические данные наиболее вероятно указывают на виды Paenibacillus peoriae и P. polymyxa, или по меньшей мере на другой вид, очень близко родственный Paenibacillus peoriae и P. polymyxa.

Из-за большого количества описанных на данный момент видов Paenibacillus невозможно определить правильный таксономический вид трех проверенных изолятов на основе физиологических и морфологических критериев Таблицы 4 (Райнер Боррисс, Университет Гумбольдта в Берлине, неопубликованные результаты).

Как бы то ни было, невозможно четко определить вид в пределах этого рода. Наиболее близкородственным видом и штаммом на основании анализа 168-рДНК был определен Paenibacillus peoriae BD-62 (см. напр. Фиг. 11).

Пример 2.4: Филогенетический анализ на основе генов, кодирующих DnaN, GyrB, RecF, RecN и RpoA

Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих DnaN, GyrB, RecF, RecN и RpoA, были выделены из полных последовательностей генома или взяты из общедоступных баз данных (Перечень последовательностей, как определено Таблицей 28).

Таблицы идентичности (Фиг. 12-16) были созданы путем подхода "все против всех", когда каждую последовательность выравнивают с каждой другой последовательностью. Выравнивание последовательностей осуществляли программной иглой (EMBOSS package 6.6.0; Trends in Genetics 16 (6), 276-277). Использовали стандартные параметры (создание промежутков 10,0, длина промежутков 0,5). Степень идентичности рассчитывали на основе выравниваний без учета каких-либо промежутков.

Для филогенетических деревьев (Фиг. 17-21) выполняли множественные выравнивания последовательностей с помощью Clustal Omega (version 1.2.0; Molecular Systems Biology 7: 539, doi: 10.1038/msb.2011.75). Филогенетические деревья рассчитывали методом максимального сходства с помощью программного обеспечения Dnaml (поставляется в Phylip 3.696 package; Felsenstein 1981, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Дендрограммы устанавливали, пользуясь моделью расстояний F84 и применяя отношение транзиций-трансверсий, равное двум (2). Деревья строили с помощью инструмента Dendroscope (http://dendroscope.org/).

Пример 2.5: Сравнение ядерного генома и САИ-матрицы

Сравнение генома выполняли, пользуясь пакетом программного обеспечения EDGAR Гиссенского университета (ВМС Bioinformatics 10 154 2009, (https://edgar.computational.bio.uni-giessen.de/cgi-bin/edgar.cgi). Определение ядерного генома, филогенетические дендрограммы на основе полных последовательностей генома и значения САИ-матриц получали с применением пакета программного обеспечения EDGAR. Результаты показаны на Фиг. 22.

Пример 3: Рост (способность к ферментации) штаммов для тестов in-vivo

Для вегетационных и полевых испытаний штаммы Paenibacillus сначала выращивали на чашках с ISP2 (готовый к использованию агар от BD [США], номер в каталоге 277010). После этого качалочные колбы с отбойными перегородками с жидкой средой ISP2 инокулировали колонией с агаровой чашки и инкубировали в течение 5-7 дней при 150 об/мин и 25°С. В зависимости от теста к растениям применяли или цельную культуральную жидкость, или центрифугированные и отмытые Н₂О клетки, или супернатант. Было возможно масштабирование до 10-литровых ферментеров.

Штаммы Paenibacillus выращивали в жидкой среде ISP2 (10 г/л солодового экстракта, 4 г/л дрожжевого экстракта Bacto, 4 г/л глюкозы моногидрата) в течение 6 дней при 22°С при 150 об/мин. В разные моменты времени измеряли ОП_600нм, как индикатор роста бактерий.

Пример 4 - In-vitro конфронтационный тест на противогрибковую активность

Антагонистическая активность штаммов Paenibacillus против патогенов растений была показана в конфронтационном тесте in-vitro. Использованными фитопатогенными грибами были Sclerotina sclerotiorum (SCLSCL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Alternaria sp. (ALTESP) и Phytophthora infestans (PHYTIN).

Как ростовую среду для BOTRCI, ALTESP, SCLSCL использовали среду ISP2, содержащую на литр 10 г солодового экстракта (Sigma Aldrich, 70167), 4 г дрожжевого экстракта Bacto (Becton Dickinson, 212750), 4 г глюкозы моногидрата (Sigma Aldrich, 16301), 20 г агара (Becton Dickinson, 214510), рН около 7, бидистиллированную воду. Как ростовую среду для PHYTIN использовали среду V8, содержащую на литр: 200 мл овощного сока, 3 г карбоната кальция (Merck Millipore, 1020660250), 30 г агара (Becton Dickinson, 214510), рН 6,8, бидистиллированную воду.

Штаммы Paenibacillus точечно инокулировали на одной стороне чашки с агаром. Агарный блок (примерно 0,3 см²) с одним активно растущим патогеном растений помещали в центр чашки. После инкубации в течение 7-14 дней при 25°С проверяли рост патогена растений, особенно на наличие зон ингибирования.

Затем чашки с агаром инкубировали при 25°С в течение примерно 7-14 дней перед оценкой. Антибиоз оценивали измерением диаметра свободной от грибов зоны (зоны ингибирования). Конкуренцию оценивали сравнением диаметра роста грибкового патогена на чашках с бактериальными штаммами по сравнению с контрольными чашками. Микопаразитизм может быть зафиксирован в том случае, когда бактерия перерастает грибковый патоген и также паразитирует на патогенах. Это можно визуализировать микроскопией.

Новые штаммы Paenibacillus показали противогрибковую активность против всех проверенных патогенов растений.

Пример 5 - Оранжерейные тесты на активность против фитопатогенных грибков

Пример применения 5.1: Активность против фитофтороза помидоров, вызванного Phytophthora infestans, при защитном нанесении

Доступную в продаже молодую рассаду помидоров ("Goldene ") использовали для описанного вегетационного испытания. На одну обработку использовали 2 повторности (горшки по одному растению в каждом). Растения выращивали в доступном на рынке субстрате (Universal, Floragard) при примерно 22°С в теплице. Влажность контролировали специальным устройством (~ 90% влажности). Растения опрыскивали до стекания необработанной/цельной культуральной жидкостью шестидневных культур соответствующего штамма Paenibacillus (в зависимости от постановки), используя распылительную камеру. Условия культивирования штаммов описаны в примере 3. Через день после применения обработанные растения инокулировали суспензией спорангиев Phytophthora infestans (PHYTIN). После инокуляции испытуемые растения немедленно переносили во влажную камеру. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции. Грибковое поражение в необработанном контроле составило 80-100% и для целей сравнения было принято за 100%.

Пример применения 5.2 Активность против серой плесени перца, вызванной Botrytis cinerea, при защитном нанесении

Доступную в продаже молодую рассаду перца ("Neusiedler Ideal") использовали для описанного вегетационного испытания. На одну обработку использовали 2 повторности (горшки по одному растению в каждом). Растения выращивали в доступном на рынке субстрате (Universal, Floragard) при примерно 22°С в теплице. Влажность контролировали специальным устройством (~90% влажности). Растения опрыскивали до стекания необработанной культуральной жидкостью шестидневных культур соответствующего штамма Paenibacillus (в зависимости от постановки), используя распылительную камеру. Условия культивирования штаммов описаны в примере 3. Через день после применения обработанные растения инокулировали суспензией спор Botrytis cinerea (BOTRCI). После инокуляции испытуемые растения немедленно переносили во влажную камеру. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции. Грибковое поражение в необработанном контроле составило 80-100% и для целей сравнения было принято за 100%.

Пример применения 5.3: Активность против альтернариоза помидоров, вызванного Alternaria solani, при защитном нанесении

Доступную в продаже молодую рассаду помидоров ("Goldene ") использовали для описанного вегетационного испытания. На одну обработку использовали 2 повторности (горшки по одному растению в каждом). Растения выращивали в доступном на рынке субстрате (Universal, Floragard) при примерно 22°С в теплице. Влажность контролировали специальным устройством (~ 90% влажности). Растения опрыскивали до стекания необработанной/цельной культуральной жидкостью шестидневных культур соответствующего штамма Paenibacillus (в зависимости от постановки), используя распылительную камеру. Условия культивирования штаммов описаны в примере 3. Через день после применения обработанные растения инокулировали суспензией спор Alternaria solani (ALTESO). После инокуляции испытуемые растения немедленно переносили во влажную камеру. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции. Грибковое поражение в необработанном контроле составило 80-100% и для целей сравнения было принято за 100%.

Пример применения 5.4: Активность против ржавчины сои, вызванной Phakopsora pachyrhizi, при защитном нанесении

Доступную в продаже молодую рассаду сои ("Mentor") использовали для описанного вегетационного испытания. На одну обработку использовали 2 повторности (горшки по одному растению в каждом). Растения выращивали в доступном на рынке субстрате (Universal, Floragard) при примерно 22°С в теплице. Влажность контролировали специальным устройством (~ 90% влажности). Растения опрыскивали до стекания необработанной культуральной жидкостью 2-6-дневных культур штамма Paenibacillus spp. (в зависимости от постановки), используя распылительную камеру. Через день после применения обработанные растения инокулировали суспензией спор Phakopsora pachyrhizi (PHAKPA). После инокуляции испытуемые растения немедленно переносили во влажную камеру. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции.

Пример применения 5.5: Активность против фузариоза пшеницы, вызванного Fusarium graminearum, при защитном нанесении

Доступные в продаже молодые ростки пшеницы использовали для описанного вегетационного испытания. На одну обработку использовали 2 повторности (горшки по одному растению в каждом). Растения выращивали в доступном на рынке субстрате (Universal, Floragard) при примерно 22°С в теплице. Влажность контролировали специальным устройством (~ 90% влажности). Растения опрыскивали до стекания необработанной культуральной жидкостью 2-6-дневных культур штамма Paenibacillus spp. (в зависимости от постановки), используя распылительную камеру. Условия культивирования описаны в примере 3. Через день после применения обработанные растения инокулировали суспензией спор Fusarium graminearum (GIBBZE). После инокуляции испытуемые растения немедленно переносили во влажную камеру. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции.

Пример применения 5.6: Активность против септориозной пятнистости листьев пшеницы, вызванной Septoria tritici, при защитном нанесении

Доступные в продаже молодые ростки пшеницы использовали для описанного вегетационного испытания. На одну обработку использовали 2 повторности (горшки по одному растению в каждом). Растения выращивали в доступном на рынке субстрате (Universal, Floragard) при примерно 22°С в теплице. Влажность контролировали специальным устройством (~ 90% влажности). Растения опрыскивали до стекания необработанной культуральной жидкостью 2-6-дневных культур штамма Paenibacillus spp. (в зависимости от постановки), используя распылительную камеру. Условия культивирования описаны в примере 3. Через день после применения обработанные растения инокулировали суспензией спор Septoria tritici (SEPTTR). После инокуляции испытуемые растения немедленно переносили во влажную камеру. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 21-28 дней после инокуляции.

Пример применения 5.7: Активность клеток Paenibacillus и супернатанта против различных патогенов при защитном нанесении

Цельную культуральную жидкость шестидневных культур штамма Paenibacillus Lu17007 получали согласно Примеру применения 3 и использовали как в постановке опытов Примеров применения 5.1-5.3. Альтернативно такую цельную культуральную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для получения культуральной среды и фракции неочищенных клеток. Фракцию неочищенных клеток могли дальше трижды промывать выходными объемами фосфатно-солевого буфера для получения отмытых клеток.

Оранжерейные тесты проводили как описано выше в примерах применения 5.1, 5.2 и 5.3 для соответствующих патогенов Phytophthora infestans, Botrytis cinerea и Alternaria solani. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции. Грибковое поражение в необработанном контроле составило 80-100% и для целей сравнения было принято за 100%.

Пример 6 - Ферментативные тесты

Пример применения 6.1: Хитиназа

Твердая среда для теста на хитиназу:

2 г/л NaNO₃, 1 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л MgSO₄, 0,5 г/л KCl, 0,2 г/л пептона, 15 г/л агара, 10 г/л хитина из крабовых панцирей (Sigma-Aldrich С7170).

Твердую тестовую среду автоклавируют и разливают в 9-сантиметровые чашки Петри. Штаммы Paenibacillus инокулируют в центре чашек и инкубируют в течение двух дней при 27°С. Затем чашки окрашивают разведенным 1:3 раствором Люголя (Carl Roth N052.2) в течение 5-10 мин. Раствор Люголя выливают, чашки фотографируют и оценивают. Рост различных штаммов составлял не более 5-10 мм. Неокрашенные зоны (коррелируют с хитиназной активностью) различались от 0 мм (отсутствие активности, "-" в таблице 11) до нескольких см («+» в таблице 11).

Пример применения 6.2: Целлюлаза

Твердая среда для теста на целлюлазу:

2 г/л NaNO₃, 1 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л MgSO₄, 0,5 г/л KCl, 0,2 г/л пептона, 15 г/л агара, карбоксиметилцеллюлозы натриевая соль (Sigma-Aldrich 419273).

Среду автоклавируют и разливают в 9-сантиметровые чашки Петри. Штаммы Paenibacillus инокулируют в центре чашек и инкубируют в течение двух дней при 27°С. После инкубации чашки окрашивают разведенным 1:3 раствором Люголя (Carl Roth N052.2) в течение 5-10 мин. Раствор Люголя выливают, чашки фотографируют.

Пример применения 6.3: Амилаза

Твердая среда для теста на амилазу:

2 г/л NaNO₃, 1 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л MgSO₄, 0,5 г/л KCl, 0,2 г/л пептона, 15 г/л агара, 10 г/л растворимого крахмала (Merck 1.01252).

Среду автоклавируют и разливают в 9-сантиметровые чашки Петри. Штаммы Paenibacillus инокулируют в центре чашек и инкубируют в течение двух дней при 27°С. После инкубации чашки окрашивают разведенным 1: 3 раствором Люголя (Carl Roth N052.2) в течение 5-10 мин. Раствор Люголя выливают, чашки фотографируют.

-, отсутствие активности, (+), низкая активность; +, обычная активность; ++, высокая активность.

Пример 7 - Метаболиты типа фузарицидина, полученные из штаммов Paenibacillus

Пример 7.1: Крупномасштабное культивирование бактериальных изолятов и экстрагирование метаболитов типа фузарицидина

а) Культивирование

Штаммы Paenibacillus культивировали на агаровых чашках со средой ГДС (10 г/л глюкозы, 4 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л солодового экстракта; рН 5,5, отрегулирован до автоклавирования) и 20 г/л агара. Культивирование проводили в течение 10-20 дней при комнатной температуре. Для поддержки использовали культуры на скошенном агаре в такой же среде, сохраняя их при 4°С.

Маломасштабные жидкие культуры (250 мл среды ГДС в колбах объемом 500 мл) инокулировали 4-5 кусочками хорошо выросшей агаровой культуры и культивировали на круговой качалке при 120 об/мин при комнатной температуре (20-23°С).

Крупномасштабные ферментации проводили в ферментерах объемом 20 л с 15 л среды ГДС (полный объем ферментера не использовали из-за образования пены), инокулированных 250 мл хорошо выросшей жидкой культуры, и ферментацию выполняли при комнатной температуре (20-23°С) с перемешиванием (120 об/мин) и аэрацией (3 л/мин) в течение 5-8 дней.

б) Экстракция

Один равный объем изопропанола добавляли к цельной культуральной жидкости (отделение биомассы от жидкой культуры не проводили). После перемешивания и инкубации в течение 2-16 часов к смеси добавляли обычную столовую соль (натрия хлорид - 100-200 г/л), пока разделение органической и водной фаз не становилось видимым.

Изопропанольную фазу концентрировали in vacuo. Полученный экстракт, который все еще содержал большое количество соли, растворяли в метаноле, центрифугировали для лучшего осаждения солевых остатков и снова концентрировали органическую фазу. Эту стадию повторяли до полного отсутствия солевого осадка.

в) Очистка

I) Хроматография на силикагеле

30 граммов экстракта растворяли в метаноле и связывали с 50 г силикагеля (Merck, K60, размер 70-230), высушивали при 40°С и наслаивали на 1 кг силикагеля (диаметр колонки 1 см, высота около 30 см).

Элюирование проводили четырьмя этапами следующим образом:

Этап 1 - 4 л этилацетата

Этап 2 - 4 л этилацетата: метанола (3:1, об./об.)

Этап 3 - 7 л этилацетата: метанола (1:1, об./об.)

Этап 4 - 4 л метанола

Третью фракцию (промежуточный продукт 1), которая содержала активные соединения, высушивали in vacuo и растворяли в 40% метанола (МеОН) в 0,1% муравьиной кислоте (МК) (концентрация 100 мг/мл). Другие фракции отбрасывали.

II) Фракционирование Chromabond HR-X

20 мл промежуточного продукта 1 загружали в предварительно откалиброванный (40% МеОН в 0,1 МК) картридж Chromabond HR-X (Macherey-Nagel, 1000 мг, номер 730941). Картридж промывали 10 мл 40% МеОН в 0,1% МК и элюировали 60 мл 70% МеОН в 0,1% МК. Этот промежуточный продукт 1-1 затем высушивали in vacuo.

III) Препаративная ВЭЖХ на колонке Sunfire С18

Промежуточный продукт 1-1 растворяли в ДМСО (концентрация 200 мг/мл), и 300 мкл промежуточного продукта 1-1 хроматографировали на колонке Sunfire С18 (19×250 мм, 5 мкм, Waters) следующим образом:

16 мин при 10 мл/мин, изократический 70% 0,2 МК; 30% ацетонитрила (АЦН),

1 мин при 14 мл/мин, градиент до 65% 0,2 МК; 35% АЦН,

5 мин при 14 мл/мин, изократический 65% 0,2 МК; 35% АЦН.

Выявляли пять фракций. Все пять полученных фракций высушивали in vacuo и растворяли в ДМСО (концентрация 125 мг/мл). Дальнейшую очистка выполняли на той же колонке и при изократических условиях (поток: 10,5 мл/мин), настраивая для каждой фракции (12,5 мг анализ).

Фракция 1: 69% 0,2 МК; 31% АЦН; выявлено два пика (1-1 и 1-2)

Фракция 2: 69% 0,2 МК; 31% АЦН; выявлено два пика (2-1 и 2-2)

Фракция 3: 69% 0,2 МК; 31% АЦН; обнаружены три пика (3-1, 3-2 и 3-3)

Фракции 4/5: 67% 0,2 МК; 33% АЦН; обнаружен один пик (4/5)

Фракция 6: 65% 0,2 МК; 35% АЦН; выявлено два пика (6-1 и 6-2)

Чистота и количество следующих образцов были достаточными для ЯМР-анализа и выяснения структуры: пики 1-2, 2-1, 3-2, 4/5 и 6-1.

Пример 7.2: Выяснение структуры новых соединений 1А и 1В

Из пика 2-1 фракции 2 была получена смесь соединений 1А и 1В (соотношение около 5:7) в виде бурого масла ([α]_D²⁵=+20,9 (с=0,6, ДМСО-d₆)).

Молекулярную формулу C₄₇H₇₈N₁₀O₁₂ основного компонента соединения 1В, вывели из спектра HR-ESI-MS, который проявил пик при m/z 975,5863 [М+Н]⁺; ESI-MS: 975,6 (100%, [М+Н]⁺), 488,4 (51%, [М+2Н]²⁺).

Кроме этого, смесь также содержала как второстепенный компонент более легкий гомолог 1А, и разность масс между двумя соединениями составляла 14 а.е.м. Это наблюдение основывалось на втором пике спектра ESI-MS при m/z 961,6.

Спектры ЯМР (Таблица 12) включали в дополнение к сигналам способных к обмену протонов между δ 6,83 и 8,58 резонансы карбонильных групп в диапазоне δ 166,0-174,5 и метиновые сигналы между δ 47,8 и 8 60,4, что указывает на пептид.

Детальный анализ данных 1D- и 2 В-ЯМР соединения 1В выявил присутствие шести аминокислот, включая тирозин (Tyr), глутамин (Gln), аланин (Ala), два треонина (Thr1 и Thr2) и изолейцин (Ile). Их последовательность определили, применяя две или три связные корреляции по амидным функциям. Так, спектры COSY, NOESY (Фиг. 2) и НМВС (Фиг. 3) показали корреляции от азот-протона Thr2 при δ 8,58 до сигнала метанового протона Thr2 при δ 3,84 и карбонила Tyr при δ 166,7 и такая же связь была замечена между азот-протоном Tyr при δ 8,52 и сигналом метиленового протона Tyr при δ 2,60 и карбонилом Ile при δ 170,4. Более того, метановый водород Ile при δ 4,16 имел сильную корреляцию с карбонильным сигналом Ile при δ 170,4 и слабый контакт с такой же группой Thr1 при δ 168,6; сигнал β-метинового протона при δ 5,30 Thr1 коррелировал с карбонильным сигналом при δ 170,4 Ala. В дополнение к вышеупомянутым корреляциям были продемонстрированы и другие от N-протона при δ 7,27 Ala к метановому протону при δ 4,20 той же аминокислоты, в то время как этот последний протон имел такое же взаимодействие с карбонилом своей аминокислоты и карбонилом Gln. Кроме того, был обнаружен кросс-пик от взаимозаменяемого протона при δ 8.20 Gln к метановому водороду при δ 3.87 Gln и карбонилу Thr2 при δ 170.6; эти данные заставляют предположить циклодепсипептидную структуру соединения 1В.

Циклодепсипептид 1В содержал конечную гуанидиновую β-гидроксижирную кислоту, присоединенную к Thr1, поскольку наблюдалась ключевая корреляция между сигналом его α-метинового протона при δ 4,39 и резонансом карбонила при δ 171,9; также кроме этого наблюдались контакты НМВС этого карбонила при δ 171,9 с α-метиленовыми протонами при δ 2,35 и β-метиновым протоном при δ 3,77 и между метиленовыми протонами при δ 3,03 и гуанидиновым углеродом при δ 157,2. В боковой цепи проследили двенадцать метиленовых групп между β-гидроксигруппой и гуанидиновой группой на основании фрагментного иона, который наблюдался в спектре APCI-MS-MS родительского иона [М+Н]⁺ при m/z 256,2. Этот спектр также дал информацию (Фиг. 4b), которая подтвердила последовательность связывания аминокислот и привела к выяснению структуры соединения 1В, как показано на Фиг. 1.

Сигналы группы СН₂ при 2,80, 2,52/36,3 в 1D- и 2D-спектрах вероятно отвечали β-СН₂-группе аспарагина (Asn) в составе 1А. Этот вывод был подтвержден известными данными (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000) в отношении фрагментов, полученных MS/MS родительского пика при m/z 961,6 (Фиг. 4а). Последние анализы также дали информацию (Фиг. 4а, 4b), которая подтвердила последовательность связывания аминокислот в обоих соединениях и привела к выяснению структуры соединений 1А и 1В, как показано на Фиг. 1.

Пример 7.3: Идентификация структур соединений 2А и 2В как фузарицидинов С и D

Из пика 1-2 фракции 1 получили смесь соединений 2А и 2В (в соотношении примерно 1:1) в виде бурого масла. Молекулярную формулу тяжелого компонента, соединения 2В, определили как C₄₆H₇₆N₁₀O₁₂ на основании масс-спектрометрии с низким разрешением. Анализ данных ЯМР (Таблица 13) позволил идентифицировать соединение 2В как фузарицидин D. Более легкий компонент смеси, соединение 2А, было таким же образом идентифицировано как фузарицидин С, в котором остаток Gln фузарицидина С заменен Asn.

Картина масс-спектрометрической фрагментации родительских ионов при m/z 961,6 и 947,6 для соединений 2В и 2А соответственно (Фиг. 5а, 5b) подтвердила, что длина замещенной боковой цепи жирной кислоты такая же, как и в соединении 1В. О фузарицидинах С и D ранее сообщали Kajimura et al. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997).

Пример 7.4: Идентификация структуры соединения 3 как LI-F08b

Из пика 6-1 фракции 6 было выделено соединение 3 в виде бурого масла, и его низкое разрешение показало пик при m/z 925,6 [М+Н]⁺, что в сочетании с данными ЯМР (таблица 14), привело к молекулярной формуле C₄₄H₈₀N₁₀O₁₁. Соединение 3 в ЯМР-спектрах проявляло такие же признаки, как и соединение 1В и соединение 2В (фузарицидин D), за исключением присутствия ароматических сигналов (таблица 14). Так, наблюдались характеристические резонансы пептида, а именно десять сигналов протонов, присоединенных к азоту, между δ 6,89 и 8,49, восемь резонансов карбонила между δ 168,1 и 174,3 шесть сигналов N-метина между δ 48,0 и 59,5. Детальный анализ спектров HMQC, COSY и TOCSY обнаружил присутствие шести аминокислот, включая Gln, две единицы Thr, две единицы Ile и Ala. Более того, эти спектры проявляли химические сдвиги, которые можно приписать такой же β-гидрокси-жирной кислоте с конечным гуанидином, как и в соединениях 1А, 1В и фузарицидинах С (2А) и D (2В). Положение этой боковой цепи определяли на основании дальней корреляции, обнаруженной на спектре НМВС между протонным сигналом N-метина при δ 4,44 Thr1 и карбонильным сигналом при δ 172,1 жирной кислоты. Последовательность аминокислот проследили по взаимодействиям NOESY и картине фрагментации (Фиг. 6).

Комбинация данных ЯМР (Таблица 14) и масс-спектрометрии привела к идентификации соединения-метаболита 3 как LI-F08b, который в этом тексте также именуется фузарицидин LI-F08b, о котором впервые сообщили Kuroda et al. (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).

Пример 7.5: Идентификация структур соединений 4А и 4В как LI-F06a и LI-F06b, а также соединений 5А и 5В как фузарицидинов А и В, соответственно

Из пика 4/5 фракции 4/5 получили смесь двух последующих метаболитов, соединений 4А и 4В (в соотношении около 1:3), которая дала два пика при m/z 897,5 (4А) и 911,6 (4В) в спектре ESI-MS, что позволяет предположить два последующих гомологичных циклодепсипептида. В их ЯМР-спектрах (Таблица 15) наблюдали резонансы, указывающие на пептиды и на β-гидрокси-жирную кислоту, заканчивающуюся гуанидиновой группой. Картины фрагментации обоих родительских ионов для соединений 4А и 4В (Фиг. 7а, 7b) позволили определить последовательность аминокислот и идентифицировать компоненты смеси как LI-F06a (4А) и LI-F06b (4В), соответственно.

Полученную из пика 3-2 фракции 3 смесь соединений 5А и 5В (в соотношении около 1:3) анализировали подобным образом. Массовый спектр ESI смеси показал два пика при m/z 883,6 (5А) и 897,5 (5В), а картины фрагментации этих родительских ионов (Фиг. 8а, 8b) вместе с данными ЯМР (Таблица 16) позволили идентифицировать компоненты как фузарицидин А (5А) и фузарицидин В (5В). Данные, полученные для 4А, 4В, 5А и 5В, совпадали с предварительно известными. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997; Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).

* Поз. = Позиция; ЖК = жирная кислота Gu = гуанидин; но = не обнаружено. Легенда также применима к таблицам 13-16.

Экспериментов по гидролизу для определения конфигурации аминокислотных составляющих не проводили.

Пример 8 - Метаболиты, вырабатываемые штаммами Paenibacillus

Пример 8.1: Продуцирование метаболитов штаммами Paenibacillus

Присутствие фузарицидинов в целом и в частности известных фузарицидинов А, В, С, D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b, как и новых соединений типа фузарицидина 1А и 1В, определяли для штаммов Paenibacillus, соблюдая описанные в примере 7.1 выше методики.

Легенда: -, соединение не обнаружено; +, соединение обнаружено; ++, соединение обнаружено в больших количествах по сравнению с +.

Цельная культуральная жидкость всех новых штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 содержала по крайней мере один из метаболитов типа фузарицидина, идентифицированных в Примере 7 (Таблица 17). Ни один из этих метаболитов не был обнаружен в цельной культуральной жидкости штамма P. peoriae BD-62.

Цельная культуральная жидкость всех новых штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 содержала новые соединения типа фузарицидина 1А и 1В. Кроме этого, цельная культуральная жидкость всех новых штаммов Paenibacillus Lu16774, Lu17007 и Lu17015 содержала фузарицидины А, В, С и D и LI-F08b. Дополнительно цельная культуральная жидкость новых штаммов Paenibacillus Lu17007 и Lu17015 содержала фузарицидины LI-F06a и LI-F06b.

Соединения 1А и 1В не были обнаружены в цельной культуральной жидкости близкородственного штамма P. peoriae BD-62. Фузарицидины А, В, С, D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b также не были обнаружены в цельной культуральной жидкости штамма P. peoriae BD-62.

Пример 9: Активность метаболитов штаммов Paenibacillus против различных грибковых патогенов

Соединения 1А и 1В, фузарицидины А, В и D получали и использовали в следующих опытах.

Тесты на рост грибов выполняли на 96-луночных планшетах с суспензией спор патогена Botrytis cinerea (BOTRCI, в YBA [10 г пептона Bacto (Becton Dickinson 211677), 10 г дрожжевого экстракта (Becton Dickinson 212750), 20 г ацетата натрия, доведено до 1000 мл бидистиллированной водой] или Alternaria solani (ALTESO, в YBG [10 г пептона Bacto (Becton Dickinson 211677), 10 г дрожжевого экстракта (Becton Dickinson 212750), 20 г глицерина 99%, доведено до 1000 мл бидистиллированной водой]). Фузарицидины и соединения 1А и 1В растворяли и разводили в ДМСО. Различные концентрации от 60 мкМ до 0,3 мкМ раскапывали в микротитровальные планшеты. Добавляли водную суспензию спор с концентрацией 10⁴ спор/мл. Планшеты инкубировали при примерно 18°С. Рост грибов определяли измерением оптической плотности при 600 нм на планшет-ридере через 3 и 7 дней после инокуляции спор и по сравнению с необработанным контролем (ДМСО). Затем определяли ИК₅₀ (концентрацию [мкМ] соответствующего метаболита, необходимую для 50% ингибирования роста грибов).

Следует отметить, что соединения 1А и 1В показали самую высокую противогрибковую эффективность со значениями ИК₅₀ 0,4-0,6 мкМ (табл. 18).

"-" означает, что ингибирование роста в тестируемом диапазоне концентраций недостаточно для определения ИК₅₀.

Дополнительно проводили оранжерейные тесты соединений 1А и 1В, как описано в примерах применения 5.1-5.5 выше для соответствующих патогенов Botrytis cinerea (BOTRCI), Alternaria solani (ALTESO), Phytophthora infestans (PHYTIN), Phakopsora pachyrhizi (PHAKPA) и Fusarium graminearum (GIBBZE). Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции.

Следует отметить, что соединения 1А и 1В были эффективными в борьбе с важными грибковыми заболеваниями сельскохозяйственных растений уже при настолько низкой дозе, как 7,2 частей на миллион, и показывали более высокую противогрибковую эффективность, чем фузарицидины А, В и D (Таблицы 19-21).

Пример 10: Сравнение активности штаммов Paenibacillus polymyxa nov. ssp. plantarum Lu16674 и Lu17007 согласно изобретению с Paenibacillus polymyxa nov. ssp. plantarum М-1 против различных патогенов в оранжерейных испытаниях

Цельную культуральную жидкость шестидневных культур штаммов Paenibacillus Lu 17007, Lu 16674 и M1 получали согласно Примеру применения 3 и использовали как в постановке опытов Примеров применения 5.1-5.5. Оранжерейные испытания проводили как описано в примерах применения 5.1-5.5 выше для соответствующих патогенов. Объем грибкового поражения листьев оценивали визуально через 5-7 дней после инокуляции.

Следует отметить, что штаммы Paenibacillus Lu16774 и Lu17007 были эффективными в борьбе с важными грибковыми заболеваниями сельскохозяйственных растений даже в сильных разведениях и показывали более высокую противогрибковую эффективность, чем родственный штамм М-1 (таблицы 22-27).

Процитированные в данном тексте документы включены в него путем ссылки.

Краткое описание фигур:

Фигура 1. Соединения 1А, 1В, 2А, 2В, 3, 4А, 4В, 5А и 5В.

Фигура 2. Ключевые корреляции NOESY и COSY соединения 1В.

Фигура 3. Корреляция НМВС соединения 1В.

Фигура 4. Картины фрагментации а) соединения 1А и b) соединения 1В.

Фигура 5. Картины фрагментации а) соединения 2А (фузарицидин С) и b) соединения 2 В (фузарицидин D).

Фигура 6. Картина фрагментации соединения 3 (LI-F08b).

Фигура 7. Картины фрагментации а) соединения 4А LI-F06a) и b) соединения 4В (LI-F06b).

Фигура 8. Картины фрагментации а) соединения 5А (фузарицидин А) и b) соединения 5В (фузарицидин В).

На Фигуре 9 показана идентичность в процентах полной последовательности 16S рДНК штаммов Paenibacillus согласно изобретению с родственными таксонами после множественного выравнивания последовательностей.

Легенда:

* Номера штаммов: 1 = Paenibacillus штамм Lu16774; 2 = Paenibacillus штамм Lu17015; 3 = Paenibacillus штамм Lu17007; 4 = Paenibacillus peoriae NRRL BD-62; 5 = Paenibacillus anaericanus MH21; 6 = Paenibacillus brasiliensis PB172; 7 = Paenibacillus campinasensis 324; 8 = Paenibacillus chibensis JCM 9905; 9 = Paenibacillus glucanolyticus DSM 5162; 10 = Paenibacillus hunanensis FeL05; 11 = Paenibacillus jamilae CECT 5266; 12 = Paenibacillus kribbensis AM49; 13 = Paenibacillus lactis MB 1871; 14 = Paenibacillus lautus JCM 9073; 15 = Paenibacillus macerans IAM 12467; 16 = Paenibacillus massiliensis 2301065; 17 = Paenibacillus pabuli HSCC 492; 18 = Paenibacillus peoriae DSM 8320 (BD-57); 19 = Paenibacillus pini S22; 20 = Paenibacillus polymyxa IAM 13419; 21 = Paenibacillus purispatii ES_MS17; 22 = Paenibacillus sediminis GT-H3; 23 = Paenibacillus terrae AM141; 24 = Paenibacillus terrigena A35; 25 = Paenibacillus timonensis 2301032; 26 = Paenibacillus turicensis MOL722; 27 = Paenibacillus uliginis N3/975; 28 = Cohnella thermotolerans CCUG 47242. Штаммы 6-28 являются типичными штаммами соответствующих видов.

Сходства новых штаммов к Paenibacillus peoriae (NRRL BD-62 и DSM 8320) отмечены жирным шрифтом.

На Фигуре 10 показана филогенетическая дендрограмма, рассчитанная исходя из идентичности в процентах последовательностей 168-рДНК штаммов Paenibacillus согласно изобретению с другими таксонами (Фиг. 9). Корень дерева определяли включением в анализ последовательности гена 16S рРНК Cohnella thermotolerans. Метка масштаба под дендрограммой обозначает 1 нуклеотидное замещение на 100 нуклеотидов.

На Фигуре 11 показана схема RiboPrint, полученная из образцов штаммов Paenibacillus согласно изобретению по сравнению с образцом близкородственного штамма P. peoriae BD-62 с использованием системы характеристики микробов RiboPrinter, и полученная из нее филогенетическая дендрограмма.

На Фигуре 12 показана идентичность в процентах последовательности ДНК гена dnaN штаммов Paenibacillus согласно изобретению с родственными штаммами Paenibacillus после множественного выравнивания последовательностей.

Легенда:

* Номера штаммов: 1 = Paenibacillus штамм Lu16774; 2 = Paenibacillus штамм Lu17007; 3 = Paenibacillus штамм Lu17015; 4 = P. peoriae DSM 8320^T = KCTC 3763^T (GenBank уч. № AGFX00000000; J. Bacteriol. 194, 1237-1238, 2012); 5 = P. polymyxa 1-43 (GenBank уч. № ASRZ01000000; № депонирования GCMCC 4965; CN 102352332 B); 6 = P. polymyxa A18 (GenBank уч. № JWJJ00000000.1; NCBI Project ID 225496); 7 = P. polymyxa ATCC 842^T = DSM 36^T = KCTC 3858^{T (GenBank уч. № AFOX00000000; J. Bacteriol. 193(18), 5026-5027, 2011); 8 = P. polymyxa CF05 (GenBank уч. № CP009909; Genome Announc 3(2):e00198-15. Doi:10.1128/genomeA.00198-15); 9 = P. polymyxa CICC 10580 (GenBank уч. № JNCB00000000; Genome Announc. 2(4):e00854-14. doi:10.1128/genomeA.00854-14); 10 = P. polymyxa DSM 365 (GenBank уч. № JMIQ00000000; J. Biotechnol. 195, 72-73, 2015); 11 = P. polymyxa E681 (GenBank уч. № CP000154; GenomeNet Ref Seq NC_014483.2; J. Bacteriol. 192(22), 6103-6104, 2010); 12 = P. polymyxa M-1 (GenBank уч. № HE577054.1; GenomeNet Ref Seq NC_017542.1); 13 = P. polymyxa NRRL B-30509 (GenBank уч. № JTHO00000000; Genome Announc. 2015 Mar-Apr; 3(2): e00372-15); 14 = P. polymyxa SC2 (GenBank уч. № CP002213; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011); 15 = P. polymyxa SQR-21 (GenBank уч. № CP006872; GenomeNet Ref Seq NZ_CP006872.1; Genome Announc. 2014 Mar-Apr; 2(2): e00281-14); 16 = P. polymyxa Sb3-1 (GenBank уч. № СР010268; Genome Announc. 2015 Mar-Apr; 3(2): e00052-15); 17 = P. polymyxa TD94 (GenBank уч. № ASSA00000000); 17 = P. polymyxa WLY78 (GenBank уч. № ALJV00000000); P. terrae HPL-003 (GenBank уч. № CP003107; NCBI Ref Seq NC_016641.1); P. polymyxa CR1 (GenBank уч. № CP006941; Genome Announc. 2014 Jan-Feb; 2(1): e01218-13).}

На Фигуре 13 показана идентичность в процентах последовательности ДНК полного гена gyrB штаммов Paenibacillus согласно изобретению с родственными штаммами Paenibacillus после множественного выравнивания последовательностей. Номера штаммов описаны в легенде к Фиг. 12.

На Фигуре 14 показана идентичность в процентах последовательности ДНК полного гена recF штаммов Paenibacillus согласно изобретению с родственными штаммами Paenibacillus после множественного выравнивания последовательностей. Номера штаммов описаны в легенде к Фиг. 12.

На Фигуре 15 показана идентичность в процентах последовательности ДНК полного гена recN штаммов Paenibacillus согласно изобретению с родственными штаммами Paenibacillus после множественного выравнивания последовательностей. Номера штаммов описаны в легенде к Фиг. 12.

На Фигуре 16 показана идентичность в процентах последовательности ДНК полного гена rpoA штаммов Paenibacillus согласно изобретению с родственными штаммами Paenibacillus после множественного выравнивания последовательностей. Номера штаммов описаны в легенде к Фиг. 12.

На Фигуре 17 показана дендрограмма наибольшего сходства на основе полной последовательности гена dnaN штаммов комплекса P. polymyxa. Указанная метка масштаба 0,01 соответствует 1% нуклеотидных обменов.

На Фигуре 18 показана дендрограмма наибольшего сходства на основе полной последовательности гена gyrB штаммов комплекса P. polymyxa. Указанная метка масштаба 0,01 соответствует 1% нуклеотидных обменов.

На Фигуре 19 показана дендрограмма наибольшего сходства на основе полной последовательности гена recF штаммов комплекса P. polymyxa. Указанная метка масштаба 0,01 соответствует 1% нуклеотидных обменов.

На Фигуре 20 показана дендрограмма наибольшего сходства на основе полной последовательности гена recN штаммов комплекса P. polymyxa. Указанная метка масштаба 0,01 соответствует 1% нуклеотидных обменов.

На Фигуре 21 показана дендрограмма наибольшего сходства на основе полной последовательности гена rpoA штаммов комплекса P. polymyxa. Указанная метка масштаба 0,01 соответствует 1% нуклеотидных обменов.

На Фигуре 22 показана матрица аминокислотного индекса (САИ) репрезентативных геномов комплекса P. polymyxa согласно Примеру 2.5. Номера штаммов описаны в легенде к Фиг. 12.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БАСФ СЕ

<120> Штаммы Paenibacillus

<130> 0000077456

<160> 3

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 1539

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1539

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="полная 16S рДНК штамма Lu16774"

/мол_тип="другая ДНК"

<220>

<221> неопределенный

<222> 37,58,60,65,82,87,89,204,263,645,1020,1264,1457

<400> 1

tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcntaa tacatgcaag tcgagcgngn 60

ttatntagaa gcttgcttct anaattncna gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa 120

cctgcccaca agacagggat aactaccgga aacggtagct aatacccgat acatcctttt 180

cctgcatggg agaaggagga aagncggagc aatctgtcac ttgtggatgg gcctgcggcg 240

cattagctag ttggtggggt aanggcctac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ccagggaaga acgtcttgta gagtaactgc tacaagagtg 480

acggtacctg agaagaaagc cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

gggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggctc tttaagtctg 600

gtgtttaatc ccgaggctca acttcgggtc gcactggaaa ctggngagct tgagtgcaga 660

agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 720

tggcgaaggc gactctctgg gctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa 780

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgctaggtg ttaggggttt 840

cgataccctt ggtgccgaag ttaacacatt aagcattccg cctggggagt acggtcgcaa 900

gactgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt 960

cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccct ctgaccggtc tagagatagn 1020

cctttccttc gggacagagg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgct tagttgccag caggtcaagc 1140

tgggcactct aagcagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtactacaat ggccggtaca acgggaagcg 1260

aagncgcgag gtggagccaa tcctagaaaa gccggtctca gttcggattg taggctgcaa 1320

ctcgcctaca tgaagtcgga attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380

ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg 1440

tgaggtaacc gcaaggngcc agccgccgaa ggtggggtag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctc 1539

<210> 2

<211> 1545

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1545

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum"

/примечание="полная 16S рДНК штамма Lu17007"

/мол_тип="другая ДНК"

<220>

<221> неопределенный

<222> 58,60,65,82,87,645,1020

<400> 2

tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgngn 60

ttatntagaa gcttgcttct anataancta gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa 120

cctgcccaca agacagggat aactaccgga aacggtagct aatacccgat acatcctttt 180

cctgcatggg agaaggagga aagacggagc aatctgtcac ttgtggatgg gcctgcggcg 240

cattagctag ttggtggggt aawggcctac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ccagggaaga acgtcttgta gagtaactgc tacaagagtg 480

acggtacctg agaagaaagc cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

gggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggctc tttaagtctg 600

gtgtttaatc ccgaggctca acttcgggtc gcactggaaa ctggngagct tgagtgcaga 660

agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 720

tggcgaaggc gactctctgg gctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa 780

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgctaggtg ttaggggttt 840

cgataccctt ggtgccgaag ttaacacatt aagcattccg cctggggagt acggtcgcaa 900

gactgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt 960

cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccct ctgaccggtc tagagatagn 1020

cctttccttc gggacagagg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgct tagttgccag caggtcaagc 1140

tgggcactct aagcagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtactacaat ggccggtaca acgggaagcg 1260

aagccgcgag gtggagccaa tcctagaaaa gccggtctca gttcggattg taggctgcaa 1320

ctcgcctaca tgaagtcgga attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380

ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg 1440

tgaggtaacc gcaaggagcc agccgccgaa ggtggggtag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttct 1545

<210> 3

<211> 1547

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1547

<223> /организм="Paenibacillus epiphyticus"

/примечание="полная 16S рДНК штамма Lu17015"

/мол_тип="другая ДНК"

<220>

<221> неопределенный

<222> 68,87,1024

<400> 3

tgagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggggttgntt agaagcttgc ttctaancaa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 120

gcaacctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc 180

ttttcctgca tgggagaagg aggaaagacg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 240

ggcgcattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360

tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420

ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctacaag 480

agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540

tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 600

tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 660

cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagatatg tggaggaaca 720

ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 780

caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 840

gtttcgatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 900

gcaagactga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt 960

aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctctgacc ggtctagaga 1020

tagncctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1140

aagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1260

agcgaaatcg cgaggtggag ccaatcctag aaaagccggt ctcagttcgg attgtaggct 1320

gcaactcgcc tacatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1380

tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag 1440

tcggtggggt aacccgcaag ggagccagcc gccgaaggtg gggtagatga ttggggtgaa 1500

gtcgtaacaa ggtagccgta tcggaaggtg cggctggatc acctcct 1547

<210> 4

<211> 1143

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1143

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="dnaN штамма Lu16774"

/мол_тип="ДНК"

<400> 4

atgaagatta gcattctgaa aaacgttttg aacgaggcca tacaacatgt atccaaagcg 60

atatccagtc gaacgacaat tccaattttg agtggtatta agctggatgt gaatcaccag 120

ggagtcacac tgaccgccag cgatacagac atctctattc aatcctttat tccgatggag 180

gatggtgacc aaacggtcgt tcagatcgaa caacccggca gtgtagtgct acccgctaaa 240

ttctttgtcg aaattatcaa aaagttgccg tctcaggaga tccgtatgga ggtaaaagac 300

caattccaaa cctttatctc atccggtgct actgaaattc agatcgttgg tttggaccct 360

gaagaatttc cggtgcttcc caacattgaa gaaaatcaag tgatctctgt gccaggtgat 420

ttgcttaaaa atatgattaa acagacggta ttctccatct ctacccatga aacgacacct 480

attttgactg gtgtattgtg gaatctggct gagggcgaat tgaaatttgt cgcaacggac 540

cgccaccgcc ttgccacccg cagcgctcat ttggagacgt ctgaaggctt gcgttttagc 600

aatgttgtca ttgcaggcaa aacgctcaat gagctgagca gaattattcc ggatcaaaat 660

atgcttgtgg atatcgtcgt agcggacaat caggtattat ttaaggtgga tcgcgtgtta 720

ttttactctc gcatcttgga cggcacctat cctgatactt ctagaattat tccgacttcc 780

tacaaaacag aactgattgt ggacacaaaa agtttgagcg agtctattga ccgtgcttat 840

ttgctgtccc gtgaggaaaa aacgaatatt gtaaaaatgc aatcgttgga aaacggtgat 900

ctagagattt cctccagctc atctgaactt ggtaaagtgc gtgaggaagt aaatgtatcc 960

aaatttgagg gagagccact caaaatctcg ttcaactcca aatatatgct cgacgtgctg 1020

aaggtaattg acagcgagca gctgacgatt gcttttaccg gcattatgag ccccattatt 1080

ttaaaaccgg cagattccag caatgcgctg tatatcatcc tgccatatcg cacaaccaac 1140

tag 1143

<210> 5

<211> 1980

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1980

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="gyrB штамма Lu16774"

/мол_тип="ДНК"

<400> 5

atggtcgaca aaatcgactt gtctgcggga gcttccggta cacagaacgg agcttcagaa 60

tatggcgcgg acgacattca agtgctcgaa gggcttgtgg cagttcgcaa acggccgggc 120

atgtacatcg ggagcaccag ttcttcggga ctgcatcatt tggtatggga aattgtagac 180

aacgcggtgg atgaacatct cgccaagttt tgctctcgca ttgatatcac aatgcataag 240

gacggttctg ttacagtatc agacaacggg cgcggtattc ctacgggaat gcacaaaatg 300

ggaattccta cgcctcaagt tgtattcacc attttgcacg ccggaggtaa gtttggcggt 360

tcgggatata aaaagtccgg gggtctgcat ggggtaggtg cgtctgtaac gaacgctctt 420

tcggaatggc ttgaagtgga aatctaccgg gacggcaaga ttcaccgtca gcggtttgaa 480

tattggcagg acaagaaggg cgtggagcat gtcggtgaac cgaccacagg ccttgaagtg 540

ctgggcaata ctaacaagac gggctcgaaa attacattta aaccggatat tcgcgttttt 600

cagtcaggaa ttcattttaa ctacgatacg ctggctgaac gccttcagga gattgctttt 660

ctgaattccg gccttcgtat tcagcttaaa gacgaacgca gcggaaagtc agatgaatat 720

ttttatgagg gtggagcaag tcagtttgtt tcttttttga atgagggtaa ggatgtactg 780

catgatgtta ttcactttaa tgccgagaaa gaagacattg aagtggagat tgccatccaa 840

tacaatgccg gctacacaga gacgattgct tcgttcgtta actccattcc gacacgtggc 900

gggggtacgc atgaaacagg cttcaaaacc gcttacactc gtatcatgaa cgactatgca 960

cgcaaaacag cgatgttgaa ggaaaaggat aaaaacctgg aaggtaacga tctgcgtgag 1020

ggtatgatgg ctgtaatcag tgtcaagatg gccgaggttg aatttgtcgg tcagacaaaa 1080

gatcagctgg gtagtgcttc ggcgcggagt acagtggatg ccatcgtatc tgaacaaatg 1140

cagcgctttt tggaggaaaa tccacagata gcgcaaacct tgatcagaaa ggcagttcaa 1200

gcatccaaag cgcgtgaagc tgcacgtaag gctcgggacg aaatgcgttc tggcaagaaa 1260

cgcagtgaaa gttctaattt gaatggcaaa ctgtcgcctg cgcagtctaa ggattttaca 1320

cgtaatgagt tatttatcgt ggaaggcgat tcggctggag gatcggccaa acaaggacgg 1380

gattccaaaa tccaggcaat tttgccgtta aagggcaagc cgatgaatcc ggaaaaatca 1440

aagttggcgg atattatgaa aaatgatgag tatcgtgcga ttacggcagc gattggcgcg 1500

ggggtaggaa ctgagttcac gctggaagac agcaattatt ccaaaatcat cattatgacc 1560

gatgcagata cagatggcgc gcacattcaa gtactgttgt tgacgttctt ttatcggtac 1620

atgaaagaac tcattgatgc aggacgcata tttattgctc agccgccatt gtataaaata 1680

acccgcaagt cgggtaagct cgaaacggtt cgttatgcct ggactgacga gcagcttgat 1740

aattacttaa aagaatttgg acgaaatttt gagcttcaac gttataaagg actcggggag 1800

atgaaccctg atcagttatg ggaaacgaca atgaatcccg agtcacgcac cctgttgcgc 1860

gttcagattg aggatgctgc caaagctgaa cgccgtgtgt ccacattgat gggtgataag 1920

gtggatccac gtaagcgctg gatcgtggaa aacgtggatt tcacggaata cgtagagtag 1980

<210> 6

<211> 1116

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1116

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="recF штамма Lu16774"

/мол_тип="ДНК"

<400> 6

gtgtttgtga acaacattgt tttgcagcag taccggaact ataaacagct ggagctgaat 60

gaattcgggc ccgttaattt gctgatcgga caaaatgcgc aaggcaaaac gaatctggtt 120

gaggcgattt ttgtattagc cttaactaaa agtcaccgaa cgtcccgtga caaggaatta 180

atttctttcg gggctacttc cacacatcta gctgctgatg tggataagaa atacgggaaa 240

atcagattgg atctctcgtt atccacacaa ggcaaaaaag caaagatcaa cgggctagag 300

cagcgaaagc tgagcgattt tatcggttcg ttaaacgtgg tcatgtttgc gcccgaggat 360

ctggaaattg tcaaaggaac accgggggtt cgccgccggt ttcttgacat ggaaattgga 420

caagttgcgc caggatattt gtatcatttg cagcaatatc agaaagtgct ggttcagcgg 480

aataacctgc tcaagcaagc ttgggggaaa gatatggcgt ccgtgcagct gatgctggag 540

gtatggaatg agcaacttgt tgagcatggt gttaaaattg taaaaaagcg gaaacaattt 600

ataacaaagc tacaaaagtg ggcccaagcc attcatgaag ggattgcagg tgggacagaa 660

gagttaaaat tagcctatgt tccctctttc ggtgagccag aggaagaaga tgaagctgtc 720

ttattggagc gatttatgat aaagttatcc caaatgaggg aacaggaaat ccgccgtggc 780

atgactttgg cgggacccca tcgtgatgat ttggcctttg ccattaacgg cagagaagtg 840

catacgtatg gctctcaggg gcagcagcgg acgacggccc tgtctttgaa gctggccgaa 900

atagaattaa ttcatgagga aattggggag tatcctatcc tgctgctgga tgatgtattg 960

tccgagctgg acccctatcg tcagactcag ctgatcgaga ctttccaaag caaggtacag 1020

acctttatca cggcaaccgg gattgagacg ttgaacgcag aacgacttaa gggtgcccat 1080

atttatcacg tccacgacgg gcatgtggaa cactaa 1116

<210> 7

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1719

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="recN штамма Lu16774"

/мол_тип="ДНК"

<400> 7

atgctggtca ctttgtctat acggaatttg gcagtcgtag aagctgtcga tgttcatttt 60

tataaaggat ttcatgtatt gagcggagaa actggtgctg gtaaatccat tattatcgac 120

gcacttgggc tgattgcggg cggcagggga tctgctgatc tagtgcgtta cggatgtgat 180

aaagccgaaa tggaagcctt gtttgaattg ccggtcaaac atcccgtttg gaatacgttg 240

gaggaacaag ggattaaggc taatccagaa gagcatttgc tgattcgtcg agaacttaca 300

gttcagggga aaagctcatc tcgaattaac ggtcagatgg ttaatttaac gatgctgcgt 360

gaggtaggtg agcaactcgt taatatccac gggcagcatg agcatcaaag cttgctgcgt 420

gcggatcgcc atcttgcgct gctggatacg ttcggtgact cggtcattgg tccagtcaaa 480

gcgctttacc gggagcgcta caatgctttt gtcaaagcgg aaaaagaagt aagagaattg 540

caaagctcca gtcaaaaggc ttatcagcta ttggacatgt atcgcttcca attggaagag 600

atcgctgcgg cggagttaaa attgggtgaa gatgaattat tggcagagga acgggtcaag 660

ctatcccata gtgagaaaat gatggatgga gtatcaggag catacgagct gttaagtggc 720

agaggtggtc tggatacggt caataacgtg ttgtccagat taaatgatgt tcagagctac 780

gacagtaaaa gccttcagcc cattgcggag cagattcaat ctgctttcta tcagttggag 840

gatgcagcgt ttcaattacg ctcttatcgt gaggatattg aatttaatcc gggcaagctg 900

catgaggtgg agcaacgttt gaatcaaatt accgggttac agcgaaaata tggtgatagt 960

atagagcaga ttttggaata ctatagccgt attgagcagg aaaccgatct gttggaaaat 1020

aaagatgagc ggctggagca gctcattgca aagcgggatg agttgctttc gaatttgctg 1080

gagattgctg aagagcttac agaggcacgt gaaatttgtg ctgaagagct tgcagagcaa 1140

gtagagcagg aattaaaaga tcttcaaatg gaaagaacgt cactcaaggt gcgtattgat 1200

ccaattgaag atccacgtgg atatgaatat aaaggtctaa aggtacgacc taccaagcaa 1260

gggatagata atgcggaatt tctgatttcg cccaatccag gtgagccact tcgcccactc 1320

ggtaaaatcg cttccggtgg tgagttatca cgtatcatgt tggcgatgaa aagtattttt 1380

gcgcgtcatg atcaaattcc ggtgctcatt tttgacgagg tggataccgg ggtaagtggt 1440

cgtgcagctc agtccatagc cgagaagctt tatcgtttgt cttccgtttg tcaggtgttt 1500

tccattactc atttgccgca ggtggcatgt atggcagatc atcagtacct gattgagaaa 1560

aatgttcatg acggacggac catgactcaa attgagggac taacggagga aggtcgtgtt 1620

aaggaattgg cacggatgct gggtggggta gaaattaccg aaaaaacatt gcatcacgca 1680

caggaaatgc tgaatttggc ggaaggaaag aaagcctga 1719

<210> 8

<211> 945

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..945

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="rpoA штамма Lu16774"

/мол_тип="ДНК"

<400> 8

gtgatagaaa tcgaaaagcc gaaaattgag acggttgacg tcaatgatga tggcacctat 60

ggaaaattcg tagtagaacc gctggaacgc ggatacggta cgacgcttgg gaactcgctt 120

cgccgtattc tgttatcctc gttaccgggg gcagcagtca catcggttca gatcgatggg 180

gttctgcacg agtttgcaac ggttcccggt gtgaaggaag acgtaacgga gatcattctg 240

aacttgaaag ctttatcgct taaaatccac tcagatgaag agaaagtact tgaaatcgat 300

gcggaaggcg aaggagttgt aacggcaggt gatatccgtg cggatagtga tgtggaaatt 360

cttaatccgg atcttcacat tgcaacgctc ggaccgggtt cgagacttca catgcgtatt 420

tttgccaatc gcggtcgcgg ttacgttaag caggatcgga ataaacgtga tgaccagccg 480

atcggcgtca ttcccgtcga ctccatctac actccgattg cacgcgtgaa ctacggcgta 540

gaaaatacgc gtgtcggcca ggttacgaat tatgacaagc tgacacttga ggtttggact 600

gacggaacta ttcgtcctga agaagctgtg agccttggag ccaaaatttt gaccgagcat 660

gtgatgctat tcgtgggtct cacggatgaa gcaaaagatg cagaaattat ggtcgaaaaa 720

gaagaagaca aaaaagaaaa agttcttgaa atgacgatcg aagagctgga tctctccgtc 780

cgttcctata actgccttaa gcgcgctggt atcaatacgg tacaagaact cacgactaaa 840

tctgaagaag atatgatgaa ggtccgtaac ttgggtcgca aatctttgga agaagtacaa 900

gagaagctcg aggaacttgg tttaggactt cgtacggaag aatag 945

<210> 9

<211> 1143

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1143

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="dnaN штамма Lu17007"

/мол_тип="ДНК"

<400> 9

atgaagatta gcattctgaa aaacgttttg aacgaggcca tacaacatgt atccaaagcg 60

atatccagtc gaacgacaat tccaattttg agtggtatta agctggatgt gaatcaccag 120

ggagtcacac tgaccgccag cgatacagac atctctattc aatcctttat tccgatggag 180

gatggtgacc aaacggtcgt tcagatcgaa caacccggca gtgtagtgct acccgctaaa 240

ttctttgtcg aaattatcaa aaagttgccg tctcaggaga tccgtatgga ggtaaaagac 300

caattccaaa cctttatctc atccggtgct actgaaattc agatcgttgg tttggaccct 360

gaagaatttc cggtgcttcc caacattgaa gaaaatcaag tgatctctgt gccaggtgat 420

ttgcttaaaa atatgattaa acagacggta ttctccatct ctacccatga aacgacacct 480

attttgactg gtgtattgtg gaatctggct gagggcgaat tgaaatttgt cgcaacggac 540

cgccaccgcc ttgccacccg cagcgctcat ttggagacgt ctgaaggctt gcgttttagc 600

aatgttgtca ttgcaggcaa aacgctcaat gagctgagca gaattattcc ggatcaaaat 660

atgcttgtgg atatcgtcgt agcggacaat caggtattat ttaaggtgga tcgcgtgtta 720

ttttactctc gcatcttgga cggcacctat cctgatactt ctagaattat tccgacttcc 780

tacaaaacag aactgattgt ggacacaaaa agtttgagcg agtctattga ccgtgcttat 840

ttgctgtccc gtgaggaaaa aacgaatatt gtaaaaatgc aatcgttgga aaacggtgat 900

ctagagattt cctccagctc atctgaactt ggtaaagtgc gtgaggaagt aaatgtatcc 960

aaatttgagg gagagccact caaaatctcg ttcaactcca aatatatgct cgacgtgctg 1020

aaggtaattg acagcgagca gctgacgatt gcttttaccg gcattatgag ccccattatt 1080

ttaaaaccgg cagattccag caatgcgctg tatatcatcc tgccatatcg cacaaccaac 1140

tag 1143

<210> 10

<211> 1980

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1980

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="gyrB штамма Lu17007"

/мол_тип="ДНК"

<400> 10

atggtcgaca aaatcgactt gtctgcggga gcttccggta cacagaacgg agcttcagaa 60

tatggcgcgg acgacattca agtgctcgaa gggcttgtgg cagttcgcaa acggccgggc 120

atgtacatcg ggagcaccag ttcttcggga ctgcatcatt tggtatggga aattgtagac 180

aacgcggtgg atgaacatct cgccaagttt tgctctcgca ttgatatcac aatgcataag 240

gacggttctg ttacagtatc agacaacggg cgcggtattc ctacgggaat gcacaaaatg 300

ggaattccta cgcctcaagt tgtattcacc attttgcacg ccggaggtaa gtttggcggt 360

tcgggatata aaaagtccgg gggtctgcat ggggtaggtg cgtctgtaac gaacgctctt 420

tcggaatggc ttgaagtgga aatctaccgg gacggcaaga ttcaccgtca gcggtttgaa 480

tattggcagg acaagaaggg cgtggagcat gtcggtgaac cgaccacagg ccttgaagtg 540

ctgggcaata ctaacaagac gggctcgaaa attacattta aaccggatat tcgcgttttt 600

cagtcaggaa ttcattttaa ctacgatacg ctggctgaac gccttcagga gattgctttt 660

ctgaattccg gccttcgtat tcagcttaaa gacgaacgca gcggaaagtc agatgaatat 720

ttttatgagg gtggagcaag tcagtttgtt tcttttttga atgagggtaa ggatgtactg 780

catgatgtta ttcactttaa tgccgagaaa gaagacattg aagtggagat tgccatccaa 840

tacaatgccg gctacacaga gacgattgct tcgttcgtta actccattcc gacacgtggc 900

gggggtacgc atgaaacagg cttcaaaacc gcttacactc gtatcatgaa cgactatgca 960

cgcaaaacag cgatgttgaa ggaaaaggat aaaaacctgg aaggtaacga tctgcgtgag 1020

ggtatgatgg ctgtaatcag tgtcaagatg gccgaggttg aatttgtcgg tcagacaaaa 1080

gatcagctgg gtagtgcttc ggcgcggagt acagtggatg ccatcgtatc tgaacaaatg 1140

cagcgctttt tggaggaaaa tccacagata gcgcaaacct tgatcagaaa ggcagttcaa 1200

gcatccaaag cgcgtgaagc tgcacgtaag gctcgggacg aaatgcgttc tggcaagaaa 1260

cgcagtgaaa gttctaattt gaatggcaaa ctgtcgcctg cgcagtctaa ggattttaca 1320

cgtaatgagt tatttatcgt ggaaggcgat tcggctggag gatcggccaa acaaggacgg 1380

gattccaaaa tccaggcaat tttgccgtta aagggcaagc cgatgaatcc ggaaaaatca 1440

aagttggcgg atattatgaa aaatgatgag tatcgtgcga ttacggcagc gattggcgcg 1500

ggggtaggaa ctgagttcac gctggaagac agcaattatt ccaaaatcat cattatgacc 1560

gatgcagata cagatggcgc gcacattcaa gtactgttgt tgacgttctt ttatcggtac 1620

atgaaagaac tcattgatgc aggacgcata tttattgctc agccgccatt gtataaaata 1680

acccgcaagt cgggtaagct cgaaacggtt cgttatgcct ggactgacga gcagcttgat 1740

aattacttaa aagaatttgg acgaaatttt gagcttcaac gttataaagg actcggggag 1800

atgaaccctg atcagttatg ggaaacgaca atgaatcccg agtcacgcac cctgttgcgc 1860

gttcagattg aggatgctgc caaagctgaa cgccgtgtgt ccacattgat gggtgataag 1920

gtggatccac gtaagcgctg gatcgtggaa aacgtggatt tcacggaata cgtagagtag 1980

<210> 11

<211> 1116

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1116

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="recF штамма Lu17007"

/мол_тип="ДНК"

<400> 11

gtgtttgtga acaacattgt tttgcagcag taccggaact ataaacagct ggagctgaat 60

gaattcgggc ccgttaattt gctgatcgga caaaatgcgc aaggcaaaac gaatctggtt 120

gaggcgattt ttgtattagc cttaactaaa agtcaccgaa cgtcccgtga caaggaatta 180

atttctttcg gggctacttc cacacatcta gctgctgatg tggataagaa atacgggaaa 240

atcagattgg atctctcgtt atccacacaa ggcaaaaaag caaagatcaa cgggctagag 300

cagcgaaagc tgagcgattt tatcggttcg ttaaacgtgg tcatgtttgc gcccgaggat 360

ctggaaattg tcaaaggaac accgggggtt cgccgccggt ttcttgacat ggaaattgga 420

caagttgcgc caggatattt gtatcatttg cagcaatatc agaaagtgct ggttcagcgg 480

aataacctgc tcaagcaagc ttgggggaaa gatatggcgt ccgtgcagct gatgctggag 540

gtatggaatg agcaacttgt tgagcatggt gttaaaattg taaaaaagcg gaaacaattt 600

ataacaaagc tacaaaagtg ggcccaagcc attcatgaag ggattgcagg tgggacagaa 660

gagttaaaat tagcctatgt tccctctttc ggtgagccag aggaagaaga tgaagctgtc 720

ttattggagc gatttatgat aaagttatcc caaatgaggg aacaggaaat ccgccgtggc 780

atgactttgg cgggacccca tcgtgatgat ttggcctttg ccattaacgg cagagaagtg 840

catacgtatg gctctcaggg gcagcagcgg acgacggccc tgtctttgaa gctggccgaa 900

atagaattaa ttcatgagga aattggggag tatcctatcc tgctgctgga tgatgtattg 960

tccgagctgg acccctatcg tcagactcag ctgatcgaga ctttccaaag caaggtacag 1020

acctttatca cggcaaccgg gattgagacg ttgaacgcag aacgacttaa gggtgcccat 1080

atttatcacg tccacgacgg gcatgtggaa cactaa 1116

<210> 12

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1719

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="recN штамма Lu17007"

/мол_тип="ДНК"

<400> 12

atgctggtca ctttgtctat acggaatttg gcagtcgtag aagctgtcga tgttcatttt 60

tataaaggat ttcatgtatt gagcggagaa actggtgctg gtaaatccat tattatcgac 120

gcacttgggc tgattgcggg cggcagggga tctgctgatc tagtgcgtta cggatgtgat 180

aaagccgaaa tggaagcctt gtttgaattg ccggtcaaac atcccgtttg gaatacgttg 240

gaggaacaag ggattaaggc taatccagaa gagcatttgc tgattcgtcg agaacttaca 300

gttcagggga aaagctcatc tcgaattaac ggtcagatgg ttaatttaac gatgctgcgt 360

gaggtaggtg agcaactcgt taatatccac gggcagcatg agcatcaaag cttgctgcgt 420

gcggatcgcc atcttgcgct gctggatacg ttcggtgact cggtcattgg tccagtcaaa 480

gcgctttacc gggagcgcta caatgctttt gtcaaagcgg aaaaagaagt aagagaattg 540

caaagctcca gtcaaaaggc ttatcagcta ttggacatgt atcgcttcca attggaagag 600

atcgctgcgg cggagttaaa attgggtgaa gatgaattat tggcagagga acgggtcaag 660

ctatcccata gtgagaaaat gatggatgga gtatcaggag catacgagct gttaagtggc 720

agaggtggtc tggatacggt caataacgtg ttgtccagat taaatgatgt tcagagctac 780

gacagtaaaa gccttcagcc cattgcggag cagattcaat ctgctttcta tcagttggag 840

gatgcagcgt ttcaattacg ctcttatcgt gaggatattg aatttaatcc gggcaagctg 900

catgaggtgg agcaacgttt gaatcaaatt accgggttac agcgaaaata tggtgatagt 960

atagagcaga ttttggaata ctatagccgt attgagcagg aaaccgatct gttggaaaat 1020

aaagatgagc ggctggagca gctcattgca aagcgggatg agttgctttc gaatttgctg 1080

gagattgctg aagagcttac agaggcacgt gaaatttgtg ctgaagagct tgcagagcaa 1140

gtagagcagg aattaaaaga tcttcaaatg gaaagaacgt cactcaaggt gcgtattgat 1200

ccaattgaag atccacgtgg atatgaatat aaaggtctaa aggtacgacc taccaagcaa 1260

gggatagata atgcggaatt tctgatttcg cccaatccag gtgagccact tcgcccactc 1320

ggtaaaatcg cttccggtgg tgagttatca cgtatcatgt tggcgatgaa aagtattttt 1380

gcgcgtcatg atcaaattcc ggtgctcatt tttgacgagg tggataccgg ggtaagtggt 1440

cgtgcagctc agtccatagc cgagaagctt tatcgtttgt cttccgtttg tcaggtgttt 1500

tccattactc atttgccgca ggtggcatgt atggcagatc atcagtacct gattgagaaa 1560

aatgttcatg acggacggac catgactcaa attgagggac taacggagga aggtcgtgtt 1620

aaggaattgg cacggatgct gggtggggta gaaattaccg aaaaaacatt gcatcacgca 1680

caggaaatgc tgaatttggc ggaaggaaag aaagcctga 1719

<210> 13

<211> 945

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..945

<223> /организм="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum"

/примечание="rpoA штамма Lu17007"

/мол_тип="ДНК"

<400> 13

gtgatagaaa tcgaaaagcc gaaaattgag acggttgacg tcaatgatga tggcacctat 60

ggaaaattcg tagtagaacc gctggaacgc ggatacggta cgacgcttgg gaactcgctt 120

cgccgtattc tgttatcctc gttaccgggg gcagcagtca catcggttca gatcgatggg 180

gttctgcacg agtttgcaac ggttcccggt gtgaaggaag acgtaacgga gatcattctg 240

aacttgaaag ctttatcgct taaaatccac tcagatgaag agaaagtact tgaaatcgat 300

gcggaaggcg aaggagttgt aacggcaggt gatatccgtg cggatagtga tgtggaaatt 360

cttaatccgg atcttcacat tgcaacgctc ggaccgggtt cgagacttca catgcgtatt 420

tttgccaatc gcggtcgcgg ttacgttaag caggatcgga ataaacgtga tgaccagccg 480

atcggcgtca ttcccgtcga ctccatctac actccgattg cacgcgtgaa ctacggcgta 540

gaaaatacgc gtgtcggcca ggttacgaat tatgacaagc tgacacttga ggtttggact 600

gacggaacta ttcgtcctga agaagctgtg agccttggag ccaaaatttt gaccgagcat 660

gtgatgctat tcgtgggtct cacggatgaa gcaaaagatg cagaaattat ggtcgaaaaa 720

gaagaagaca aaaaagaaaa agttcttgaa atgacgatcg aagagctgga tctctccgtc 780

cgttcctata actgccttaa gcgcgctggt atcaatacgg tacaagaact cacgactaaa 840

tctgaagaag atatgatgaa ggtccgtaac ttgggtcgca aatctttgga agaagtacaa 900

gagaagctcg aggaacttgg tttaggactt cgtacggaag aatag 945

<210> 14

<211> 1143

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1143

<223> /организм="Paenibacillus epiphyticus"

/примечание="dnaN штамма Lu17015"

/мол_тип="ДНК"

<400> 14

atgaagatca gcattctgaa aaacgttttg aacgaggcta tacaacatgt atccaaagcg 60

atatcaagtc ggactacgat tccaattctg agtggtatta agctggatgt gaatcaccag 120

ggagtaacgc tgaccgccag cgatacagac atctccattc aatcctttat tccgatggag 180

gatggtgacc aaactgttgt tcaggtcgaa caacccggca gtgttgtgct gcctgccaaa 240

ttctttgtcg aaattatcaa aaagttgccg tcgcaggaga tccatatgga ggtaaaagac 300

caatttcaaa cctttatctc gtctggcgca actgaaattc agattgttgg cttggaccct 360

gaagaattcc cggtgcttcc caacattgaa gaaaatcaag tcatctctgt accaggagat 420

ttacttaaaa atatgattaa acagacggta ttctccatct ccacccacga aacgacaccg 480

attttaactg gcgtgttgtg gaatctggct gagggtgaat tgaagtttgt ggcaacggac 540

cgccaccgcc ttgccacccg tagcgctcat ttggagacgt ctgaaggctt gcgttttagc 600

aatgttgtca ttgcgggcaa aacgctgaat gagctgagca gaattattcc agatcaaaat 660

atgcttgtgg atatcgtagt agcggacaat caggtattat tcaaagtaga tcgggtgcta 720

ttttattccc gcatcttgga cggcacctat cctgatactt ctagaattat tccgacctcc 780

tacaaaacag aactgattgt ggatacaaaa agtttaagtg agtcaattga ccgtgcttat 840

ttgctgtccc gtgaggaaaa aacgaatatt gtaaaaatgc agtcgctgga aaatggcggt 900

ttggagattt cctctagttc ctctgagctt ggcaaagtgc gtgaggaagt aactgtgtcc 960

aaatttgagg gagagccgct caaaatttcg ttcaactcta aatacatgct cgacgtgctg 1020

aaggtgattg acagcgagca gctgacgatt gcttttaccg gcattatgag ccccattatt 1080

ttaaaaccgg ctgattccag caatgcgctg tatatcatcc tgccatatcg cacaaccaac 1140

tga 1143

<210> 15

<211> 1980

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1980

<223> /организм="Paenibacillus epiphyticus"

/примечание="gyrB штамма Lu17015"

/мол_тип="ДНК"

<400> 15

atggtcgaca aaatcgactt gtctgcggga gtgtccggca cacaaagcgg agcttcggaa 60

tatggcgcgg acgacattca agtgctcgaa gggcttgtgg cagttcgcaa acggccgggc 120

atgtacatcg ggagcaccag ttcttcgggg ctgcatcatt tggtatggga aattgtagac 180

aacgcggtgg atgaacatct cgccaagttt tgctctcgca ttgatattac aatgcataag 240

gacggttccg ttacagtatc agacaacggg cgcggtattc ctacgggaat gcacaaaacg 300

ggaattccta cgcctcaggt tgtattcacc attttgcacg ccggaggtaa gtttggcggt 360

tcgggatata aaaaatccgg gggtctgcac ggtgtaggtg cgtctgtaac gaacgctctt 420

tcggaatggc ttgaagtaga aatttaccgg gacggcaaga ttcaccgtca gcggtttgaa 480

tattggcagg acaagaaggg cgtggagcat gtcggggaac cgaccacagg ccttgaagtg 540

ctgggcaata ctaacaagac gggctcgaaa attacattta aaccggatat tcgtgttttt 600

caggcaggca ttcattttaa ctacgatacg ttggctgagc gccttcagga aattgctttt 660

ctaaattcgg gccttcgtat tcaacttaaa gacgaacgca gcggaaagtc agatgagtat 720

ttttatgagg gtggcgcaag tcagtttgtt gcttttctga atgagggcaa ggatgtgctg 780

catgacgtta ttcactttaa tgccgagaaa gaagacattg aagtagagat tgccatccag 840

tacaatgctg gttatacaga gacgattgct tcgttcgtta actccattcc gacacgtgga 900

ggaggtacgc atgaaacggg attcaaaacc gcttacactc gtgtcatgaa cgactatgcc 960

cggaaaacgg tgatgttgaa agaaaaggat aaaaacttgg agggcaacga tctacgtgag 1020

ggcatgatgg ctgtaatcag tgtcaagatg gctgaggttg aatttgtcgg ccagacaaag 1080

gatcagctgg gaagcgcttc ggcacggagt acagtggatg ccatcgtatc tgagcagatg 1140

cagcgttttt tggaagaaaa tccgcagata gcacaaactt tgatcaagaa ggcagttcaa 1200

gcatccagag cacgtgaagc tgcacgtaaa gctcgggatg aaatgcgttc cggtaaaaag 1260

cgcagtgaaa gttccaattt gaatggtaaa ctatcgcctg cgcagtccaa ggattttaca 1320

cgtaatgagt tgtttattgt ggaaggcgat tcggctggag gatcagccaa gcagggacgg 1380

gattccaaaa ttcaggccat attgccgcta aagggcaagc cgatgaatcc ggaaaaatcc 1440

aaactggcgg atattatgaa gaatgatgag taccgtgcta ttacagcagc tattggtgcg 1500

ggagtaggaa cagagttttc gctggaagac agcaattatt ccaaaatcat cattatgacc 1560

gatgcagata cagatggtgc gcacattcaa gtgctgttgt tgacgttctt ttatcggtac 1620

atgaaagagc ttattgatgc aggacgcata tttattgctc aaccgccatt gtataaaata 1680

actcgaaagt cgggtaagct cgaaacggtg cgttatgctt ggactgacga gcagcttgat 1740

aattatttaa aagaatttgg acgaaatttt gagcttcagc gctataaagg acttggggaa 1800

atgaaccctg atcagttatg ggaaacaacg atgaatcccg attcacgcac cttgctacgc 1860

gttcagatag aggatgcagc caaggctgaa cgcagggtgt ccactttgat gggtgataag 1920

gtggatccgc gcaagcgctg gatcgtggaa aacgtagatt ttacggaata cgtagagtag 1980

<210> 16

<211> 1116

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1116

<223> /организм="Paenibacillus epiphyticus"

/примечание="recF штамма Lu17015"

/мол_тип="ДНК"

<400> 16

gtgtttgtga acaacattgt tttgcagcag taccggaact atgaacagct ggagctgaat 60

gaatttgggc ccgttaattt gctgatcgga caaaatgcgc agggcaaaac gaatctggta 120

gaggcaattt ttgtactggc tttaaccaaa agtcatcgaa cgtcccgcga caaggagtta 180

atctctttcg gggctacttc cactcaccta gctgcggatg tggataaaaa atacgggaaa 240

atcagactgg atctcgcgtt atccacacaa ggcaaaaaag caaagatcaa cggactggag 300

cagcgcaaac tgagcgattt tatcggttcg ttaaatgtgg tcatgtttgc acctgaggat 360

ctggaaattg tgaaaggaac accgggggtt cgccgccggt ttcttgacat ggaaatcgga 420

caggttgcgc caggatatct gtatcatttg cagcaatatc agaaagtatt ggttcagcga 480

aacaacctgc tcaagcaagc ttggggtaag gatatggcgt cagtgcagct gatgctggag 540

gtatggaatg agcaacttgt tgagcatggt gttaaaattg ttaaaaagcg gaaacaattt 600

ataacaaagc tacaaaagtg ggctcaggcc attcatgaag ggatcgcagg tgggacagaa 660

gagttaaaat taacctatgt tccctccttc agtgagccag aggaagaaga tgaagctgtc 720

ttattggagc gatttatgat aaagttatcc caaatgaggg aacaggaaat ccgccgtggc 780

atgactttgg cgggacccca tcgtgacgat ttggcctttg ccattaacgg cagagaagtg 840

catacgtatg gctctcaggg gcagcagcgg acgacggccc tgtccttgaa gttggccgaa 900

atagagttaa ttcatgagga aattggtgaa tatcctgtct tgctgctgga tgatgttttg 960

tccgagctgg acccctatcg tcagacccag ctgatcgaga ctttccaaag caaggtacag 1020

acctttatca cggcaaccgg ggttgagact ttgaacgcag aacgactcaa ggatgccaat 1080

atttatcacg tccacgacgg gcatgtggaa cactaa 1116

<210> 17

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..1719

<223> /организм="Paenibacillus epiphyticus"

/примечание="recN штамма Lu17015"

/мол_тип="ДНК"

<400> 17

atgctggtca ctttgtctat acggaatttg gcggtcgtag aggccgtcga tgttcatttt 60

tataaagggt ttcatgtctt gagcggggaa acaggtgctg gtaaatccat tattatcgat 120

gcgcttggcc tgattgcagg cggtaggggc tctgctgatc tagtgcgtta cggttgtgat 180

aaagcagaga tggaagcctt gtttgagctg ccggtaaaac atccagtttg gaaaacactt 240

gaggaacaag ggattaaggc caatgcggag gagcatttgc tgattcgtcg cgaacttacg 300

gttcagggga aaagctcttc tcgaattaac ggtcagatgg ttaatttaac gatgctgcgt 360

gaggtaggtg agcagctcgt caatatccac gggcaacatg agcatcaaag cctgctacgt 420

gcagatcgcc atctggcgct gctggatacg ttcggtgatt cggtgatcgg tccagtcaaa 480

acgctttacc gtgagcgtta caatgctttt gtcaaagcgg aaaaagaagt aagagaactg 540

caaagctcca gtcaaaaggc ttatcagctt ttggatatgt accgatttca attagaagag 600

atcgctgcgg cggagttgaa attgggagaa gatgaattat tggcagagga acgggtcaag 660

ctatcccata gtgagaaaat gatggatggg atatcaggag catacgaact gctaagcggc 720

agaggtgggc tggatacgat caataacgta ttgtctagat tgaacgatgt ccaaagctat 780

gacagcaaaa gccttcagcc cattgcggag cagattcagt ctgcttttta ccagttagag 840

gacgcagcat tccaattacg ttcttatcgt gaggatattg aatttaatcc aggcaagctg 900

catgaagtgg agcaacgttt gaatcaaatt accggattac agcgaaaata tggtgatagt 960

atagagcaga ttttggaata ctatagccgt attgagcagg aaaccgatct gctggaaaat 1020

aaagatgagc ggctggagca gctcattgca aaacgggatg agttgctttc cgatttgctg 1080

gagatttcag aagagcttac agaagcacgt gaaatttgtg ctgaagagct tgcagagcaa 1140

gtggagcagg agttaaaaga cctgcagatg gaaagaacgt cactcaaggt gcgcattgat 1200

ccaattgaag atccacgcgg atatgagtat aaaggtctga aggtaaggcc taccaagcaa 1260

ggaattgata atgcggaatt tcttatttca cccaatccag gtgagccact acgtccactt 1320

ggtaagatcg cttcaggcgg tgagctatca cgtatcatgt tggcgatgaa aagtattttt 1380

gcgcgtcatg atcaaattcc agtactcatt tttgacgagg tggataccgg ggtgagtggt 1440

cgtgcagctc aatccattgc cgagaagcta tatcgtttat cttccgtttg tcaggtgttt 1500

tccattactc atttgccaca ggtggcatgt atggcagatc atcagtacct tattgagaaa 1560

aatgttcatg atggacggac catgactcaa attgagggac ttacggagga cgggcgtgtc 1620

aaggaattgg cacggatgct gggcggcgtg gaaattaccg aaaaaacatt gcatcacgca 1680

caggaaatgc tgaatttggc ggaaggaaag aaagcctga 1719

<210> 18

<211> 945

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> источник

<222> 1..945

<223> /организм="Paenibacillus epiphyticus"

/примечание="rpoA штамма Lu17015"

/мол_тип="ДНК"

<400> 18

gtgatagaaa tcgaaaagcc gaaaattgag acggttgacg tcaatgatga tggcacctat 60

ggaaaattcg tagtagaacc gctggaacgc ggatacggta cgacgttggg aaactcgctt 120

cgccgtattc tgttatcctc gttaccgggg gcagcagtca catcggttca gatcgatggg 180

gttctgcacg agtttgcaac ggttcccggt gtgaaggaag acgtaacgga gatcattctg 240

aacttgaaag ctttatcgct taaaatccac tcggatgaag agaaagtact cgaaatcgat 300

gcggaaggcg aaggagttgt aacggcagga gatatccgtg cggatagtga tgtggaaatt 360

cttaatccgg atcttcacat tgctacgctc ggaccgggtt cgagacttca catgcgtatt 420

tttgccaatc gcggtcgcgg ttacgttaag caggatcgga acaaacgtga tgaccagccg 480

atcggcgtca ttcccgtcga ctccatctac actccgattg cacgcgtgaa ctacggcgta 540

gaaaatacgc gtgtcggcca ggttacgaat tacgacaagc tgacacttga ggtttggact 600

gacggaagta ttcgtcccga ggaagcagtg agccttggag ccaaaatttt gaccgagcat 660

gtgatgttgt tcgtgggtct cacggacgag gcaaaagatg ctgaaattat ggttgaaaaa 720

gaagaagaca agaaagaaaa agttcttgaa atgacgatcg aagagctgga tctctccgtc 780

cgttcctata actgccttaa gcgcgctggt atcaatacgg tacaagaact cacgactaaa 840

tctgaagaag atatgatgaa ggtccgtaac ttgggtcgca aatctttgga agaagtacaa 900

gagaagctcg aggaacttgg tttaggactt cgtacggaag aatag 945

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к двум новым соединениям типа фузарицидина. Предложены циклодепсипептид формулы I для борьбы с фитопатогенными грибами, штаммы Paenibacillus sp. DSM 26969, DSM 26970 и DSM 26971, предназначенные для получения указанного циклодепсипептида, и их применение для борьбы с фитопатогенными грибами. Также предложены композиция указанного циклодепсипептида, цельная культуральная жидкость или бесклеточный экстракт указанных штаммов, демонстрирующие антагонистическую активность против патогенных грибов растений. Изобретение также относится к способу контроля или подавления патогенов растений или профилактики фитопатогенных инфекций путем применения композиции новых соединений типа фузарицидина. 11 н. и 7 з.п. ф-лы, 22 ил., 28 табл., 10 пр.

1. Циклодепсипептид для борьбы с фитопатогенными грибами формулы I

где R - 15-гуанидин-3-гидроксипентадекановая кислота;

X¹ представляет собой треонин;

X² представляет собой изолейцин;

X³ представляет собой тирозин;

X⁴ представляет собой треонин;

X⁵ выбран из глутамина и аспарагина;

X⁶ представляет собой аланин; и

где стрелка обозначает одинарную амидную связь, либо между карбонильным остатком R и аминогруппой аминокислоты X¹, либо между карбонильной группой одной аминокислоты и аминогруппой соседней аминокислоты,

где наконечник стрелки указывает на присоединение к аминогруппе указанной аминокислоты X¹ или указанной соседней аминокислоты и

где простая линия без наконечника стрелки обозначает одинарную сложноэфирную связь между карбонильной группой X⁶ и гидроксильной группой X¹;

или его приемлемая для сельского хозяйства соль.

2. Циклодепсипептид по п. 1, выбранный из соединений 1А и 1В:

или его приемлемая для сельского хозяйства соль.

3. Способ получения циклодепсипептида или его соли по любому из пп. 1, 2, включающий культивирование штамма Paenibacillus sp. DSM 26969, или Paenibacillus sp. DSM 26970, или Paenibacillus sp. DSM 26971 и выделение указанного соединения или его соли из цельной культуральной жидкости.

4. Композиция для борьбы с фитопатогенными грибами, содержащая циклодепсипептид формулы I или его соль по любому из пп. 1, 2 в эффективном количестве.

5. Композиция по п. 4, которая дополнительно включает пестицид.

6. Композиция по п. 5, в которой пестицид является дополнительным биопестицидом.

7. Материал для размножения растений, имеющий покрытие, которое включает композицию по любому из пп. 4-6, где материал для размножения растения представляет собой семена или вегетативный растительный материал.

8. Применение композиции по любому из пп. 4-6 для борьбы с фитопатогенными грибами, или их угнетения, или предупреждения заражения растений фитопатогенными грибами, или защиты материалов растений от заражения и разрушения фитопатогенными грибами.

9. Способ борьбы с фитопатогенными грибами, или их угнетения, или предупреждения заражения фитопатогенными грибами, отличающийся тем, что фитопатогенные грибы, среду их обитания или растения, которые следует защитить от поражения фитопатогенными грибами, или почву, или семена, или вегетативный материал растения обрабатывают эффективным количеством композиции по любому из пп. 4-6.

10. Штамм Paenibacillus sp., депонированный в коллекции DSMZ под номером DSM 26969 и предназначенный для получения циклодепсипептида по любому из пп. 1, 2.

11. Штамм Paenibacillus sp., депонированный в коллекции DSMZ под номером DSM 26970 и предназначенный для получения циклодепсипептида по любому пп. 1, 2.

12. Штамм Paenibacillus sp., депонированный в коллекции DSMZ под номером DSM 26971 и предназначенный для получения циклодепсипептида по любому из пп. 1, 2.

13. Штамм Paenibacillus по любому из пп. 10-12, где указанный штамм Paenibacillus обладает противогрибковой активностью против по крайней мере двух патогенов растений, выбранных из группы, состоящей из Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Sclerotinia sclerotiorum.

14. Штамм Paenibacillus по любому из пп. 10-12, где указанный штамм Paenibacillus вырабатывает по меньшей мере одно из следующих соединений:

на питательной среде, содержащей по меньшей мере один источник углерода и один источник азота.

15. Штамм Paenibacillus по п. 14, где указанный штамм Paenibacillus способен вырабатывать по меньшей мере три соединения, выбранные из группы, которая включает фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D, LI - F06a, LI - F06b и LI-F08b.

16. Штамм Paenibacillus по пп. 10-12, где указанный штамм Paenibacillus дополнительно продуцирует по меньшей мере три соединения, выбранные из группы, которая включает фузарицидин А, фузарицидин В, фузарицидин С, фузарицидин D, LI-F06a, LI-F06b и LI-F08b.

17. Цельная культуральная жидкость для борьбы с фитопатогенными грибами, полученная культивированием штамма Paenibacillus по любому из пп. 10-16 и содержащая циклодепсипептиды по любому из пп. 1, 2.

18. Бесклеточный экстракт для борьбы с фитопатогенными грибами, полученный культивированием штамма Paenibacillus по любому из пп. 10-16 с последующей экстракцией циклодепсипептида по любому из пп. 1, 2 органическим растворителем или смесью растворителей.