КОНЪЮГИРОВАННОЕ С ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТОЙ ПРОИЗВОДНОЕ GnRH ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО Российский патент 2021 года по МПК A61K38/09 A61K47/54 C07K7/23 A61P35/00 A61P5/24 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[01] Настоящее изобретение относится к новому конъюгированному с пальмитиновой кислотой производному гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия и фармацевтической композиции, содержащей его.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[02] В целом, гонадотропин-рилизинг-гормон (GnRH) или рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона представляет собой нейрогормон гипоталамуса и является отдельным типом нейроэндокринного пептида. В частности, GnRH синтезируется в терминальных нейроваскулярных клетках гипоталамуса и действует на гонадотропные клетки передней доли гипофиза, стимулируя синтез и высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) или фолликулостимулирующего гормона (FSH), оба из которых являются гонадотропинами. Лютеинизирующие гормоны или фолликулостимулирующие гормоны, синтез и высвобождение которых контролируются GnRH, играют роль в контроле мужских и женских половых гормонов и созревании репродуктивных клеток.

[03] Известно, что, хотя при нормальных концентрациях GnRH оказывает эффект в виде стимуляции секреции гонадотропина или овуляции, при высоких концентрациях он оказывает антагонистический ингибирующий эффект, который оказывает противоположное действие. Высокая доза GnRH может применяться для лечения рака предстательной железы или рака молочной железы, которые представляют собой гормонозависимые опухоли, а также эндометриоза, фибромиомы матки, преждевременного полового созревания центрального генеза и аденомиоза и т.д. Также широко известно, что GnRH или производные GnRH можно применять при лечении различных заболеваний, зависимых от половых гормонов (Kumar P. and Sharma A, J Hum Reprod Sci, 2014; 7(3): pp. 170-174).

[04] Что касается коммерчески доступных терапевтических средств, содержащих GnRH, существуют продукты с замедленным высвобождением, рассчитанные на инъекцию каждый один или три месяца, которые находятся в форме биоразлагаемых многоядерных микрокапсул хранения (PLGA или PLA), содержащих агонист GnRH. В частности, продукт с замедленным высвобождением, содержащий производное GnRH, является коммерчески доступным под торговым названием депо-препарат Lupron®. Этот коммерческий продукт содержит микросферы из PLGA [сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты] в качестве ингредиента, обеспечивающего замедленное высвобождение, и производное GnRH, представляющее собой ацетат лейпролида, в качестве активного ингредиента. Из-за применения биоразлагаемого полимера депо-препарат Lupron® должен вводиться внутримышечно или подкожно в большой дозе. Причем это сопровождается болью или повреждением ткани в месте инъекции, и в месте инъекции в течение нескольких месяцев сохраняется уплотнение с иногда наблюдающимися случаями воспаления, поскольку биоразлагаемые полимеры не полностью всасываются даже через один месяц.

[05] Хотя для преодоления этих недостатков депо-препарата Lupron® были дополнительно разработаны другие продукты, включая Eligard®, они все еще имеют недостатки с точки зрения начального высвобождения лекарственного средства, низкой стабильности лекарственного средства в фазе смешанного раствора и т.д. Таким образом, остается потребность в разработке составов или лекарственных форм, которые обеспечат возможность поддержания высоких уровней GnRH в крови в течение продолжительного периода времени.

[06] Существующие продукты с замедленным высвобождением GnRH, которые предназначены для медленного высвобождения GnRH в кровь, содержат дополнительные ингредиенты, обеспечивающие замедленное высвобождение, для высвобождения активного ингредиента в течение продолжительного периода времени. Соответственно, общая доза продуктов увеличивается, что приводит к таким проблемам, как боль, остаточные ощущения в месте инъекции, низкая стабильность лекарственного средства и т.д. В частности, из пациентов, которые проходили лечение существующими продуктами (ацетат лейпролида), не менее 23-30% пациентов жаловались на боль в местах инъекций (Lee PA et al., J. Clin, Endocrinol Metab, 2014).

[07] В то же время, в патенте США № 9694051 раскрыто, что конъюгированный пептид адреномедуллина, где алкильный фрагмент конъюгирован с лизином (Lys) на N-концах некоторых пептидов адреномедуллина, характеризуется увеличенным периодом полужизни в крови. Хотя за счет конъюгирования алкильного фрагмента с N-концом пептида проявляется увеличение периода полужизни пептида в крови, данный пептид весьма отличается от GnRH с точки зрения функции и последовательности. Кроме того, пептид отличается от GnRH тем, что концевой аминокислотный остаток пептида, с которым конъюгирован алкильный фрагмент, представляет собой лизин.

[08] В таких обстоятельствах автор настоящего изобретения предпринял усилия для разработки состава пролонгированного действия на основе GnRH, в котором GnRH сам по себе характеризуется продолжительным периодом полужизни in vivo и повышенной биодоступностью, в отличие от существующих составов с замедленным высвобождением, которые имеют недостатки, обусловленные дополнительными ингредиентами или структурой составов для замедленного высвобождения и т.д. В частности, конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия получали путем конъюгирования пальмитиновой кислоты с производным GnRH, что предназначено для увеличения периода полужизни GnRH in vivo и превращения конъюгата в специфическую солевую форму. Было обнаружено, что конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия проявляет превосходную биодоступность и продолжительный период полужизни in vivo и поддерживается на высоком уровне в крови, что привело к настоящему изобретению.

[09] Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия согласно настоящему изобретению и фармацевтическая композиция, содержащая его, можно применять для профилактики и лечения различных заболеваний, зависимых от половых гормонов, или для контрацепции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[010] Принимая во внимание вышеупомянутые проблемы с существующими препаратами с замедленным высвобождением, целью настоящего изобретения является разработка состава пролонгированного действия на основе GnRH, характеризующегося повышенной биодоступностью GnRH и периодом полужизни in vivo, который составляет не более 2-4 минут в циркулирующей крови. Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия, характеризующееся легкостью введения и улучшенной эффективностью, и фармацевтическую композицию, содержащую его.

[011] Благодаря тщательным и интенсивным исследованиям, направленным на получение производного GnRH, характеризующегося повышенной биодоступностью и периодом полужизни in vivo GnRH самого по себе, который в своей природной форме характеризуется периодом полужизни в кровотоке не более 2-4 минут, автор настоящего изобретения разработал конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия, содержащее пальмитиновую кислоту, конъюгированную с GnRH, и фармацевтически приемлемую соль, и было обнаружено, что оно обладает улучшенными эффективностью и периодом полужизни in vivo, и, таким образом, представлено в настоящем изобретении.

[012] Используемый в данном документе термин «улучшенная эффективность» конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH пролонгированного действия означает, что оно оказывает более высокий терапевтический эффект на заболевания, связанные с половыми гормонами, при той же концентрации, что и природный GnRH. Например, это означает, что конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия оказывает более сильные цитотоксические эффекты на рак предстательной железы или рак молочной железы при введении в той же дозе, что и природный GnRH.

[013] При нормальной концентрации GnRH оказывает эффект в виде стимуляции высвобождения гонадотропинов или овуляции, в то время как при высоких концентрациях он оказывает антагонистический ингибирующий эффект, который оказывает противоположное действие. Соответственно, высокие концентрации GnRH ингибируют прогрессирование заболеваний, усугубляемых половыми гормонами, или являются эффективными для облегчения и лечения заболеваний, зависимых от половых гормонов.

[014] Далее в данном документе будет представлено подробное описание конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH пролонгированного действия, которое содержит производное GnRH; пальмитиновую кислоту, конъюгированную с производным GnRH; и фармацевтически приемлемую соль, а также фармацевтической композиции, содержащей его, согласно настоящему изобретению.

[015] ※ Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия

[016] Гонадотропин-рилизинг-гормон (GnRH) представляет собой гормон, синтезируемый в терминальных нейроваскулярных клетках гипоталамуса, и он действует на гонадотропные клетки передней доли гипофиза, стимулируя синтез и высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) или фолликулостимулирующего гормона (FSH), оба из которых являются гонадотропинами. Последовательность GnRH у разных видов может отличаться. Природный GnRH млекопитающих может иметь следующую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.

[017] [Последовательность GnRH млекопитающих]

[018] pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (SEQ ID NO: 1)

[019] Производное GnRH по настоящему изобретению по структуре аналогично GnRH, но может действовать иным образом in vivo. На ранней стадии после введения производное GnRH, в частности соответствующее агонисту GnRH, связывается с рецептором GnRH, стимулируя in vivo синтез и секрецию фолликулостимулирующего гормона (FSH) и лютеинизирующего гормона (LH) на определенном уровне. Однако продолжительное поддержание концентрации производного GnRH in vivo приводит к истощению гонадотропинов и снижению количества рецепторов GnRH, что приводит к противоположному эффекту, заключающемуся в том, что синтез и секреция FSH и LH, наоборот, подавляются. Благодаря таким эффектам производные GnRH, таким образом, могут применяться для профилактики или лечения заболеваний, зависимых от половых гормонов, и в качестве контрацептива.

[020] В одном варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH представляет собой агонист GnRH, который может быть выбран из группы, состоящей из лейпролида, гозерелина, трипторелина, нафарелина, бусерелина, гистрелина, деслорелина, метерелина, гонадорелина и их модифицированных производных.

[021] В другом варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH имеет последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологией с существующими агонистами GnRH.

[022] В частности, производное GnRH по настоящему изобретению может иметь последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологией с GnRH, лейпролидом, гозерелином, трипторелином, нафарелином, бусерелином, гистрелином, деслорелином, метерелином или гонадрелином, и, более конкретно, последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологией с GnRH (SEQ ID NO: 1) или лейпролидом (SEQ ID NO: 2).

[023] В варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH представляет собой модифицированный лейпролид, где первая аминокислота лейпролида, представляющая собой глутаминовую кислоту, замещена другой аминокислотой, более конкретно, глутамином.

[024] В варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH может иметь аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, 3 или 4.

[025] В частности, производное GnRH по настоящему изобретению может означать производное, имеющее дополнительную модификацию в существующем GnRH или производном GnRH.

[026] В частности, производное GnRH по настоящему изобретению может представлять собой конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия, содержащее: пальмитиновую кислоту, конъюгированную с производным GnRH; и фармацевтически приемлемую соль. Более конкретно, пальмитиновая кислота может быть конъюгирована с амино-концом производного GnRH.

[027] Используемый в данном документе термин «пальмитиновая кислота» представляет собой углеводородную цепь с карбоксильной группой, которая представляет собой гидрофобную полностью насыщенную жирную кислоту с 16 атомами углерода и имеет одну карбоксильную группу (-СООН).

[028] Благодаря конъюгации с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия по настоящему изобретению имеет следующие преимущества: i) увеличенные реабсорбция в почках и эффективность накопления в жире; ii) защитный эффект, обусловленный повышенным связыванием с сывороточными белками; iii) задержка почечного клиренса в результате повышенной гидрофобности серий аналогов; и iv) увеличение времени высвобождения и фармацевтической эффективности в результате прикрепления к липидным мембранам или биологическим мембранам.

[029] Эмульсия дексаметазона пальмитата, в которой пальмитиновая кислота конъюгирована с дексаметазоном, как известно, проявляет противовоспалительный эффект, в 5,6 раза превышающий таковой у дексаметазона отдельно при той же дозе (Peng et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2010: 36(12)). Примерами коммерчески доступных продуктов пролонгированного действия, которые составлены путем конъюгации с жирными кислотами, являются INVEGA TRINZA®, где с жирной кислотой конъюгирован палиперидон, и Lipotalon®, где с жирной кислотой конъюгирован дексаметазон.

[30] Известно, что когда пальмитиновую кислоту конъюгируют с гормонами или ферментами, период полужизни in vivo у гормонов или ферментов увеличивается вследствие вышеуказанного механизма. Однако их растворимость в воде может быть значительно снижена вследствие повышенной гидрофобности молекулы. Кроме того, это может быть причиной межмолекулярной агрегации в водной среде или образования внутримолекулярных гидрофобных связей в гидрофобных участках белка. Следовательно, у конъюгированных белков могут наблюдаться такие недостатки, как снижение стабильности состава, биодоступности и активности белка.

[031] В связи с этим существует необходимость в соответствующей стратегии получения составов для увеличения периода полужизни in vivo у белков путем конъюгации с пальмитиновой кислотой, при этом не снижая эффективность конкретного белка и не вызывая агрегацию белка.

[032] Предусматривается, что используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемая соль» охватывает все фармацевтически приемлемые соли, которые могут применяться с целью увеличения стабильности, растворимости в воде, биодоступности и т.д. конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH по настоящему изобретению, но не ограничивается ими.

[033] В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из неорганических кислот, органических кислот, солей аммония, солей щелочных металлов и солей щелочноземельных металлов. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из гидрохлорида, гидробромида, фосфата, метафосфата, нитрата, сульфата, ацетата, сульфоната, бензоата, цитрата, этансульфоната, фумарата, лактата, малеата, малата, сукцината, тартрата, натриевой соли, кальциевой соли, калиевой соли и магниевой соли.

[034] В одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3 или 4, где пальмитиновая кислота конъюгирована с амино-концом производного GnRH, а фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую соль или ацетат.

[035] В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, где пальмитиновая кислота конъюгирована с амино-концом производного GnRH, а фармацевтически приемлемая соль представляет собой ацетат.

[036] В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, где пальмитиновая кислота конъюгирована с амино-концом производного GnRH, а фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую соль.

[037] Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH

[038] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH по настоящему изобретению без каких-либо ограничений, обусловленных им.

[039] В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит фармацевтически эффективное количество конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH по настоящему изобретению и может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе термин «фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для обеспечения эффективности или активности конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH по настоящему изобретению.

[040] Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, представляют собой широко используемые для приготовления состава, и примеры фармацевтически приемлемого носителя включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не ограничиваются ими.

[041] В дополнение к вышеуказанным ингредиентам фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смазывающее средство, увлажнитель, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующее средство, консервант и т.п.

[042] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться перорально или парентерально. В частности, в случае инъекционных путей введения ее можно вводить в виде лекарственной формы, предназначенной либо для подкожной инъекции, либо для внутримышечной инъекции. Лекарственная форма может быть выбрана с учетом различных факторов, таких как эффект контроля концентраций in vivo.

[043] Соответственно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предпочтительно может представлять собой лекарственную форму, выбранную из инъекционного препарата, пасты, гелеобразного средства, лосьона, капсулы, таблетки, жидкого препарата, суспензии, спрея, ингаляционного препарата, глазных капель, адгезивного средства и пластыря, особенно предпочтительно инъекционный препарат.

[044] Подходящая дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьируется в зависимости от различных факторов, в том числе способа получения состава, способа введения дозы, возраста, массы тела, пола пациента и тяжесть течения заболевания, питания, времени введения, пути введения, скорость выведения и чувствительности ответа. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению обычно вводят в дозе 0,001-100 мг/кг для взрослого. Фармацевтическая композиция содержит конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH по настоящему изобретению в количестве приблизительно 0,001-30 мг/мл.

[045] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению составлена с применением фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя в соответствии со способом, который может быть легко осуществлен рядовым специалистом в данной области. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена в виде стандартной лекарственной формы или может быть помещена в многодозный контейнер. В связи с этим состав может находиться в форме раствора, суспензии, сиропа или эмульсии в масляной или водной среде или в форме экстракта, порошка, гранул, таблетки или капсулы и может дополнительно содержать диспергирующее вещество или стабилизатор.

[046] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может применяться для профилактики или лечения заболевания, зависимого от половых гормонов, или для контрацепции. Заболевание, зависимое от половых гормонов, может быть выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака яичника, эндометриоза, фибромиомы матки, поликистоза яичников, преждевременного полового созревания центрального генеза, гипертрихоза, гонадотропной аденомы гипофиза, апноэ во время сна, синдрома раздраженного кишечника, предменструального синдрома, доброкачественной гиперплазии предстательной железы и бесплодия, но не ограничивается ими.

[047] При применении в комбинации с традиционным биоразлагаемым полимером фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может демонстрировать удивительно превосходный период полужизни in vivo. Соответственно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать биоразлагаемые полимеры. В настоящем изобретении биоразлагаемый полимер обеспечивает возможность доставки лекарственного средства парентеральными путями в организме или обеспечивает возможность полимеру, содержащему производное GnRH по настоящему изобретению, локально воздействовать на конкретное место. Что касается биоразлагаемого полимера в настоящем описании, можно упомянуть Chasin M et al. («Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems», New York, Marcel Dekker, 1990) или D. Wescman et al. («Handbook of Biodegradable Polymers», Taylor & Francis, 1998), но не ограничиваться ими.

[048] Например, биоразлагаемый полимер по настоящему изобретению может представлять собой PLA (полимолочную кислоту), линейный или разветвленный PLGA (сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты), PGA (полигликолевую кислоту), гидрогель или т.п.

[049] Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способы и применение для профилактики или лечения симптома или заболевания, связанных с половыми гормонами, путем введения конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH по настоящему изобретению или композиции, содержащей его.

[050] Ожидается, что превосходная биодоступность и увеличенный период полужизни in vivo нового производного гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) по настоящему изобретению будут в значительной степени способствовать снижение частоты введения доз и дозировки. В частности, конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия могло бы преодолеть проблемы существующих лекарственных составов GnRH с замедленным высвобождением, такие как неблагоприятные эффекты в виде остаточного ощущения и боли в месте инъекции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[051] На ФИГ. 1 представлен график, показывающий жизнеспособность клеток рака предстательной железы линии DU-145 после обработки различными концентрациями GnRH или производных GnRH и контрольным лекарственным средством. 1% DMSO применяли в качестве отрицательного контроля, а 0,1% SDS в качестве положительного контроля.

[052] На ФИГ. 2 представлен график, показывающий жизнеспособность клеток рака предстательной железы линии DU-145 после обработки натриевой или ацетатной солью производных GnRH и контрольным лекарственным средством. 1% DMSO применяли в качестве отрицательного контроля, а 0,1% SDS в качестве положительного контроля.

[053] На ФИГ. 3 показаны результаты измерения растворимости конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH с различными первыми аминокислотными остатками и типами соли.

[054] На ФИГ. 4 представлен график, показывающий увеличенный период полужизни in vivo у конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH, где на график нанесена концентрация в крови в зависимости от времени после того, как каждое из контрольных лекарственных средств и производных GnRH по настоящему изобретению вводится подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг животным (крысам).

[055] На ФИГ. 5 представлен график, показывающий увеличенный период полужизни in vivo у конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH, где на график нанесена концентрация в крови в зависимости от времени после того, каждое из контрольного лекарственного средства, представляющего собой лейпролид, и производных GnRH по настоящему изобретению вводится подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг животным (крысам).

[056] На ФИГ. 6 представлен график, показывающий увеличенный период полужизни in vivo у конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH, где на график нанесена концентрация в крови в зависимости от времени после того, как каждое из контрольного лекарственного средства, представляющего собой состав на основе лейпролида ацетата в виде депо-препарата для введения в течение одного месяца, и производных GnRH по настоящему изобретению вводится подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг животным (крысам).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[057] Далее в данном документе будут описаны варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на примеры получения и примеры, которые приведены для иллюстрации настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕР ПОЛУЧЕНИЯ 1. Способ получения производного гонадотропин-рилизинг гормона (GnRH)

[058] Природный GnRH млекопитающих имеет следующую последовательность.

[059] [Последовательность GnRH млекопитающих]

[060] pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (SEQ ID NO: 1)

[061] Leuprolide®, имеющий последовательность GnRH млекопитающих с заменой D-Leu вместо Gly в положении 6 и заменой des-Gly вместо Gly в положении 10, применяли в качестве остова для производного GnRH и конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH по настоящему изобретению.

[062] [Последовательность лейпролида]

[063] pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-[D-Leu6]-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 2)

[064] Производные, в которых глутамат в положении 1 в последовательности лейпролида не содержит замены или был заменен на глутамин, получали следующим образом.

[065] (1) Способ получения пептидов производных GnRH

[066] Производные синтезировали с применением общего способа твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с помощью Fmoc/tBu, где α-аминогруппы аминокислотных остатков защищены с помощью основно-лабильной группы Fmoc (флуоренилметилоксикарбонилхлорид), в то время как боковые группы защищены кислотно-лабильной группой. В способе твердофазного пептидного синтеза, предусматривающем следующие стадии, пептидная цепь последовательно удлиняется за счет повторяющегося отщепления Fmoc и сочетания аминокислот:

[067] ① загрузить аминокислоту с Fmoc на смолу (Fmoc-Pro-тритильная смола);

[068] ② удалить защитную группу Fmoc из Fmoc-AA-смолы (20% пиперидин/DMF);

[069] ③ промыть с помощью DMF;

[070] ④ связать аминокислоту после активации (применяют DIC/HOBt);

[071] ⑤ промыть с помощью DMF;

[072] ⑥ повторить стадии с ② по ⑤ для последовательного связывания аминокислот;

[073] ⑦ удалить только смолу из синтезированного пептида (1,5% TFA/DCM);

[074] ⑧ присоединить этиламин к амино-концу полученного пептида (с применением EDC HCl/HOAt); и

[075] ⑨ произвести отщепление всех защитных групп с боковых цепей полученного пептида (92,5% TFA/2,5% TIS/2,5% EDT/2,5% H2O).

[076] Пальмитиновую кислоту конъюгировали с амино-концом полученного производного GnRH. Конъюгирование пальмитиновой кислоты с амино-концом производного выполняли таким же образом, как и конъюгацию общих аминокислот.

[077] (2) Очистка пептидов производных GnRH

[078] После расщепления с помощью TFA пептид очищали с применением колонки C18 в системе Shimadzu HPLC 10AVP в условиях HPLC (буфер A 0,05% TFA/H₂O, буфер B 0,05% TFA/ацетонитрил, расход 1 мл/мин, длина волны 230 нм). В таблице 1 производные GnRH, P1 и P3, имеют глутамат в качестве аминокислотного остатка в положении 1, тогда как производные GnRH, P2 и P4, имеют глутамин в качестве аминокислотного остатка в положении 1.

[ТАБЛИЦА 1]

[079] Пальмитиновая кислота умеренно растворима в воде, ее растворимость составляет 0,04 мг/мл, и при комнатной температуре она существует в виде твердой фазы с температурой плавления 60°C. Следовательно, поскольку конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH может быть плохо растворимым в воде, проводили дополнительное образование соли. Конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH подвергали образованию соли с натриевой солью или ацетатом с получением солей конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH, P1-P4, как показано в таблице 2 ниже.

[ТАБЛИЦА 2]

[080] Последующие эксперименты выполняли с применением полученных производных GnRH и солей конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH.

ПРИМЕР 1. Эффект конъюгирования с пальмитиновой кислотой на гибель клеток рака предстательной железы

[081] Производные GnRH применяют в клинических условиях для лечения заболеваний, включая рак молочной железы, рак предстательной железы, эндометриоз, преждевременное половое созревание центрального генеза и т.п. Клеточную линию DU-145, которая представляет собой тип клеток рака предстательной железы, культивировали во флаконах T75, содержащих соответствующее количество культуральной среды RPIM 1640 (содержащей 10% FBS, пенициллин/стрептомицин и 1% заменимых аминокислот), в стерильном инкубаторе с 5% CO₂/95% воздуха при 37°С. Анализ гибели клеток выполняли с применением набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8, производства DOJINDO). Клетки DU-154 отделяли от флаконов Т75 путем обработки трипсином и переносили в 96-луночные планшеты с плотностью 1×10⁴ клеток/лунка с последующей инкубацией в течение одного часа для прикрепления.

[082] Затем клетки обрабатывали с помощью различных концентраций GnRH или производных GnRH и контрольных реагентов. В частности, 1% DMSO применяли в качестве отрицательного контроля гибели клеток, в то время как 0,1% SDS служил в качестве положительного контроля. После 48 часов инкубации использованную среду для культивирования удаляли и в каждую лунку вносили по 100 мкл свежей среды для культивирования и 10 мкл раствора CCK-8. Опять же, после 48 часов инкубации раствор среды заменяли на 100 мкл свежей среды для культивирования и 10 мкл раствора CCK-8. Клетки инкубировали в течение 4 часов, а затем измеряли поглощение при 450 нм для оценки жизнеспособности клеток. Результаты измерений представлены в таблице 3 и на ФИГ. 1 и 2.

[ТАБЛИЦА 3]

[083] Наблюдали, что производные P2 и P3 проявляют цитотоксические эффекты, которые в приблизительно 7-7,5 раз превышают таковые у лейпролида или GnRH, которые демонстрируют показатель клеточной гибели, составляющий приблизительно 10% для клеток рака предстательной железы. Результаты позволяют предположить, что комбинации аминокислотной замены в положении 1 и образования соли приводят к неожиданным превосходным цитотоксическим эффектам в отношении клеток рака предстательной железы.

[084] Производные GnRH значимо отличаются друг от друга с точки зрения цитотоксического эффекта в отношении клеточных линий рака предстательной железы, в зависимости от типа первой аминокислоты и образованной соли.

ПРИМЕР 2. Отличия в растворимости конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH в зависимости от типа образования соли

[085] Согласно оценкам растворимость GnRH в воде составляет приблизительно 1 мг/мл в экспериментальных условиях и приблизительно 0,0588 мг/мл в реальных условиях. В то же время, как известно, ацетат повышает растворимость GnRH в приблизительно 10 или более раз до 10 мг/мл (https://www.drugbank.ca/drugs/DB00644).

[086] Понятно, что соль повышает растворимость за счет снижения рН растворителя вместе с его ионизацией. Чтобы увеличить растворимость коммерчески доступных GnRH и производных GnRH, на карбокси-конце (C-конце) GnRH и производных GnRH пробовали применять испробованы различные связи, обобщенные в таблице 4 ниже.

[ТАБЛИЦА 4]

[087] Полученные показатели растворимости в воде для солей коммерчески доступных производных GnRH показаны в таблице 5 ниже.

[ТАБЛИЦА 5]

[088] Кроме того, тесту на растворимость подвергали четыре типа конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH. Вначале пептиды в форме порошка при комнатной температуре взвешивали на микровесах и растворяли в органическом растворителе 100% DMSO при конечной концентрации 20 мМ. Как можно было наблюдать невооруженным глазом, все они растворялись очень быстро и полностью. Полученные растворы применяли в качестве исходных растворов и для проверки их растворимости разводили при различных концентрациях в буферных растворах PBS или среде для культивирования клеток.

[089] Когда исходные растворы пептидов разводили в буферных растворах PBS или среде для культивирования клеток, растворы становились мутными с образованием агрегатов. Степень агрегации различалась у каждого типа производных GnRH. Степень агрегации исследовали с помощью центрифугирования агрегатов. В результате этого обнаружили, что производные P2 и P3, которые, как было установлено, обладают превосходным цитотоксическим эффектом в отношении линии клеток рака предстательной железы, характеризуются очень высокой растворимостью (ФИГ. 3).

[090] В этих двух производных с карбоксильным концом GnRH были конъюгированы натриевая соль и ацетат соответственно, что указывает на то, что на растворимость конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH по настоящему изобретению влияет тип первого аминокислотного остатка и образование соли.

ПРИМЕР 3. Измерение скорости увеличения периода полужизни in vivo

[091] Автор настоящего изобретения проводил эксперименты на животных (самки крыс SD возрастом девять недель), чтобы исследовать увеличение периодов полужизни in vivo у полученных конъюгированных с пальмитиновой кислотой производных GnRH. Вкратце, лейпролид (n=6), состав на основе лейпролида ацетата в виде депо-препарата для введения в течение одного месяца (3,75 мг/месяц; n=7) и производное GnRH, P2 (n=6) или P4 (n=6), вводили подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг крысам каждой группы с последующим отслеживанием концентраций в крови в зависимости от времени. Перед введением и через 0,5, 1, 2 и 6 часов и в дни 1, 3, 7, 10, 14, 21 и 28 после введения из хвостовой вены крыс отбирали образцы крови и измеряли концентрации в крови лейпролида и производных GnRH с применением LC/MSMS. Если в конкретный момент времени концентрация достигала приблизительно 4 нг/мл, дальнейшие измерения в следующий момент времени не проводились.

[092] Результаты эксперимента обобщены следующим образом.

[ТАБЛИЦА 6]

[093] Результаты измерений графически изображены на ФИГ. 4-6. На основании результатов проводили фармакокинетический анализ путем расчета периода полужизни (t_1/2), скорости клиренса (CL), объема распределения (Vd), времени достижения максимальной концентрации после введения лекарственного средства (T_max), максимальной концентрации после введения лекарственного средства (C_max) и системной экспозиции лекарственного средства (AUC_t). Результаты анализа являются следующими.

[ТАБЛИЦА 7]

[094] Как можно понять из данных, конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH по настоящему изобретению значительно превосходят лейпролид с точки зрения периода полужизни in vivo, скорости клиренса, объема распределения и системной экспозиции (AUC_t). Кроме того, обнаружили, что конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH по настоящему изобретению характеризуются значениями периода полужизни, скорости клиренса и системной экспозиции (AUC_t), аналогичными значениям коммерчески доступного состава для введения в течение одного месяца, лейпролид, содержащего биоразлагаемый полимер, и, в частности, они демонстрируют превосходный объем распределения, замедленное время достижения максимальной концентрации после введения лекарственного средства и пониженную максимальную концентрацию в течение длительного периода времени по сравнению с коммерчески доступным продуктом. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH по настоящему изобретению обеспечивают возможность GnRH поддерживать свои подходящие концентрации в течение длительного периода времени in vivo.

[095] С учетом их превосходных свойств конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH по настоящему изобретению можно применять в значительно меньшем объеме по сравнению с существующими продуктами, содержащими биоразлагаемый полимер для замедленного высвобождения, и, таким образом, можно преодолевать недостаток в виде боли и исключать побочный эффект, заключающийся в том, что биоразлагаемый полимер остается in vivo в течение длительного периода времени. В частности, эти свойства являются благоприятными в отношении детей. В то же время, когда конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH по настоящему изобретению использовали в комбинации с биоразлагаемым полимером, используемым в традиционных продуктах, период полужизни значительно увеличивается по сравнению с традиционными лекарственными средствами, такими как лейпролид, и становится таким же длительным, как у лекарственных средств, применяемых в инвазивных способах (оперативном вмешательстве), например, как у имплантатов (от нескольких месяцев до одного года).

[096] Хотя техническая идея настоящего изобретения была описана с помощью примеров, описанных в некоторых вариантах осуществления и проиллюстрированных в прилагаемых графических материалах, следует отметить, что в пределах объема настоящего изобретения могут производиться различные замены, модификации и изменения, которые могут быть понятны специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, следует отметить, что подразумевается, что такие замены, модификации и изменения находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

--->

<110> ДжейПи Био Джи Инк.

<120> КОНЪЮГИРОВАННОЕ С ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТОЙ ПРОИЗВОДНОЕ GnRH

ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ,

СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО

<130> FC18097WO

<160> 6

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> homo sapiens

<220>

<221> САЙТ

<222> (1)

<223> Glu в положении 1 представляет собой pyroGlu.

<400> 1

Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог GnRH - лейпролид

<220>

<221> САЙТ

<222> (1)

<223> Glu в положении 1 представляет собой pyroGlu.

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)

<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.

<220>

<221> САЙТ

<222> (9)

<223> C-конец пептида был модифицирован в виде NHEt(des-Gly).

<400> 2

Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог GnRH

<220>

<221> САЙТ

<222> (1)

<223> Glu в положении 1 был модифицирован с помощью пальмитата.

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)

<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.

<220>

<221> САЙТ

<222> (9)

<223> C-конец пептида был модифицирован в виде NHEt(des-Gly).

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (1)..(9)

<223> Пептид был подвергнут образованию соли с помощью натриевой соли.

<400> 3

Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог GnRH

<220>

<221> САЙТ

<222> (1)

<223> Gln в положении 1 был модифицирован с помощью пальмитата.

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)

<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.

<220>

<221> САЙТ

<222> (9)

<223> C-конец пептида был модифицирован как NHEt(des-Gly).

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (1)..(9)

<223> Пептид был подвергнут образованию соли с помощью натриевой соли.

<400> 4

Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог GnRH

<220>

<221> САЙТ

<222> (1)

<223> Glu в положении 1 был модифицирован с помощью пальмитата.

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)

<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.

<220>

<221> САЙТ

<222> (9)

<223> C-конец пептида был модифицирован как NHEt(des-Gly).

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (1)..(9)

<223> Пептид был подвергнут образованию соли с помощью ацетатной соли.

<400> 5

Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аналог GnRH

<220>

<221> САЙТ

<222> (1)

<223> Gln в положении 1 был модифицирован с помощью пальмитата.

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)

<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.

<220>

<221> САЙТ

<222> (9)

<223> C-конец пептида был модифицирован как NHEt(des-Gly).

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (1)..(9)

<223> Пептид был подвергнут образованию соли с помощью ацетатной соли.

<400> 6

Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro

1 5

<---

Группа изобретений относится к новому конъюгированному с пальмитиновой кислотой производному гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия и фармацевтической композиции, содержащей его. Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия выбрано из: i) натриевой соли производного GnRH, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, ii) ацетатной соли производного GnRH, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и iii) ацетатной соли производного GnRH, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, в которых карбоксильная группа пальмитиновой кислоты конъюгирована посредством пептидной связи с амино-концом GnRH. Производные GnRH демонстрируют превосходный объем распределения, замедленное время достижения максимальной концентрации после введения лекарственного средства, обеспечивают возможность GnRH поддерживать подходящие концентрации в течение длительного периода времени in vivo, обладают превосходным цитотоксическим эффектом. Фармацевтическая композиция на основе производного GnRH применима для профилактики и лечения различных заболеваний, зависимых от половых гормонов. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл., 3 пр.

1. Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия, выбранное из группы, состоящей из

i) натриевой соли производного GnRH, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4,

ii) ацетатной соли производного GnRH, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, и

iii) ацетатной соли производного GnRH, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6,

причем карбоксильная группа пальмитиновой кислоты производного GnRH конъюгирована посредством пептидной связи с амино-концом пептидной части производного GnRH.

2. Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия по п.1, где конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4.

3. Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия по п.1, где конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.

4. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, зависимого от половых гормонов, содержащая конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия по любому из пп.1-3 в эффективном количестве, где заболевание, зависимое от половых гормонов, выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, эндометриоза и преждевременного полового созревания центрального генеза.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, дополнительно содержащая биоразлагаемый полимер, выбранный из PLA (полимолочной кислоты), линейного или разветвленного PLGA (сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты), PGA (полигликолевой кислоты) и гидрогеля.