Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 746 994

(13)

(51)

МПК

A61K38/16(2006-01-01)

A61K39/00(2006-01-01)

A61K39/395(2006-01-01)

C07K14/705(2006-01-01)

C07K16/42(2006-01-01)

C07K16/46(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2018140046, 2017-04-14

(24)

Дата начала отсчета патента

2017-04-14

(22)

дата подачи заявки

2017-04-14

(45)

опубликовано

2021-04-23

(72)

авторы

Снайдер, ЛиндаПиченик, ДовПауверс, ГордонРотстейн, ДжейМоллой, Майкл

(73)

патентообладатели

Иммьюнекст Инк.Янссен Фармасьютикалз, Инк.

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

Flies D.BUS 2013177557 A1, 11.07.2013WO 2015097536 A2, 02.07.2015Якубке Х.-Д и дрАминокислоты, пептиды, белки // М: Мир, 1985, стр.92-94.

АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО VISTA И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2021 года по МПК A61K38/16 A61K39/00 A61K39/395 C07K14/705 C07K16/42 C07K16/46

Описание патента на изобретение RU2746994C2

Родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет предварительных заявок №№ 62/323193, поданной 15 апреля, 2016 г., 62/343355, поданной 31 мая, 2016 г., 62/372362, поданной 9 августа, 2016 г., 62/385627, поданной 9 сентября, 2016 г., 62/425184, поданной 22 ноября, 2016 г., 62/363929, поданной 19 июля, 2016 г., 62/365085, поданной 21 июля, 2016 г., 62/385805, поданной 9 сентября, 2016 г., 62/363931, поданной 19 июля, 2016 г., 62/365102, поданной 21 июля, 2016 г., 62/385871, поданной 9 сентября, 2016 г., 62/363917, поданной 19 июля, 2016 г., 62/365081, поданной 21 июля, 2016 г., 62/385888, поданной 9 сентября, 2016 г., 62/364073, поданной 19 июля, 2016 г., 62/365166, поданной 21 июля, 2016 г., 62/385893, поданной 9 сентября, 2016 г., 62/363925, поданной 19 июля, 2016 г., 62/365087, поданной 21 июля, 2016 г., 62/385785, поданной 9 сентября, 2016 г., 62/406632, поданной 11 октября, 2016 г., каждая из которых все они включены в данный документ посредством ссылки. Данная заявка относится к заявке согласно PCT __________ поданной ___ апреля, 2017 г. «АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО VISTA И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ» (Поверенный № 43260.2214), которая включается посредством ссылки и чей приоритет также заявляется.

Область техники

Данное изобретение относится к идентификации новых антител и фрагментов антител против человеческого VISTA, т.е. антител и фрагментов антител против человеческого VISTA (супрессора активации Т-клеток, содержащего V-область иммуноглобулина, от англ. «V-region Immunoglobulin-containing Suppressor of T cell Activation(1)»), («VISTA»). В частности, в данной заявке предложены новые агонисты человеческого VISTA, т.е. антитела и фрагменты антител против человеческого VISTA, которые агонизируют или стимулируют супрессивный эффект человеческого VISTA на иммунитет, в частности, Т-клеточный иммунитет. Также изобретение относится к применению таких агонистов для усиления или имитации супрессивного эффекта VISTA на иммунитет, такого как его супрессивный эффект на пролиферацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, активацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺ и его супрессивный эффект на выработку иммунных цитокинов, в частности провоспалительных цитокинов. Также изобретение относится к конкретному применению этих агонистических антител и фрагментов антител в качестве профилактических или терапевтических средств, в особенности при лечении патологических состояний, при которых предотвращение или ингибирование Т-клеточного иммунитета и экспрессии провоспалительных цитокинов является терапевтически целесообразным, например, при аутоиммунности, воспалении, аллергических расстройствах, сепсисе, РТПХ, или при смягчении воспалительных побочных явлений некоторых патологических состояний, таких как рак.

Также в данной заявке предложены новые антагонисты, т.е. антитела и фрагменты антител против человеческого VISTA, которые антагонизируют или ингибируют супрессивный эффект человеческого VISTA на иммунитет, в частности, эффект VISTA на Т-клеточный иммунитет. Также данное изобретение относится к применению таких новых антагонистов для блокирования или ингибирования супрессивного эффекта VISTA на иммунитет, т.е. его супрессивного эффекта на пролиферацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, активацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺ и выработку иммунных цитокинов. Также изобретение относится к конкретному применению этих антагонистических антител и фрагментов антител в качестве профилактических или терапевтических средств, в особенности при лечении патологических состояний, при которых стимуляция Т-клеточного иммунитета является терапевтически целесообразной, например, при лечении рака и инфекционных заболеваний.

Уровень техники

Было доказано, что пути иммунных негативных регуляторов контрольных точек (NCR, от англ. «negative checkpoint regulator») являются экстраординарными клиническими мишенями при лечении заболеваний человека, связанных с иммунной системой. Блокировка двух NCR, CTLA-4 и PD-1, с помощью моноклональных антител (mAb) для того, чтобы усилить противоопухолевый иммунитет, является революционным подходом в лечении рака и позволила установить эти пути в качестве клинически подтвержденных мишеней при заболевании человека. Также растворимые версии лигандов NCR, которые инициируют пути NCR, нашли клиническое применение в виде иммуносупрессивных лекарственных препаратов для лечения аутоиммунности (т.е. AMP-110/B7-H4-Ig для лечения ревматоидного артрита).

VISTA (смотрите ссылку 1) представляет собой лиганд NCR, чьим самым близким филогенетическим родственным соединением является PD-L1. VISTA характеризуется гомологией с PD-L1, но демонстрирует уникальный профиль экспрессии, который ограничен гемопоэтическим компартментом. В частности, VISTA характеризуется конститутивной и сильной экспрессией на миелоидных клетках CD11b^выс и на более низких уровнях экспрессируется на Т-клетках CD4⁺ и CD8⁺. Как и PD-L1, VISTA представляет собой лиганд, который кардинально подавляет иммунитет (ссылка 1), и, как и в случае PD-L1, блокирование VISTA позволяет развивать терапевтический иммунитет к раку в доклинических моделях онкологии (ссылка 2). Хотя блокирование VISTA усиливает иммунитет, в частности, опосредованный Т-клетками CD8⁺и CD4⁺ иммунитет, лечение растворимым слитым белком Ig внеклеточного домена VISTA (VISTA-Ig) подавляет иммунитет, и было показано, что оно останавливает прогрессирование в некотором количестве мышиных моделей аутоиммунных заболеваний.

Однозначные научные данные показали, что VISTA представляет собой лиганд, который индуцирует кардинальную супрессию Т-клеток. О многочисленных антагонистических антителах против человеческого VISTA сообщали различные группы, включая Dartmouth College и Jannsen. Эти антитела применимы в лечении патологических состояний, при которых необходимо подавление иммуносупрессивного эффекта VISTA на Т-клеточный иммунитет, таких как рак и инфекция. Однако, насколько известно авторам изобретения, до этого времени не было идентифицировано антител или фрагментов антител против человеческого VISTA, которые агонизируют эффект человеческого VISTA. Такие агонистические антитела и фрагменты антител против человеческого VISTA были бы необходимы при лечении патологических состояний, при которых подавление иммунитета, в частности, Т-клеточного иммунитета, является необходимым, и/или патологических состояний, при которых происходит аберрантное понижение регуляции экспрессии VISTA.

Краткое описание сущности изобретения

Целью изобретения является предоставление новых антител и фрагментов антител, которые специфически связываются с человеческим VISTA и его вариантами, например, химерных, человеческих, гуманизированных или мультиспецифических антител против человеческого VISTA, которые специфически связываются с человеческим VISTA и которые стимулируют или имитируют эффект человеческого VISTA на иммунитет.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем указанные агонистическое антитело или фрагмент антитела связываются с тем же самым или перекрывающимся эпитопом, что и любое из антител против человеческого VISTA, имеющее CDR и полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 4.

Конкретной целью изобретения является предоставление выделенного антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим состоящим из V-домена Ig супрессором активации Т-клеток (человеческим VISTA), причем антитело или фрагмент антитела агонизируют или стимулируют один или более эффектов VISTA на иммунитет, например, содержат константную область человеческого IgG2 или Fc-область человеческого IgG2, при этом, необязательно, константная область или Fc-область человеческого IgG2 связывается с Fc-гамма-рецепторами, включая человеческий CD32A, и/или содержащего константную область или Fc-область человеческого IgG2, которая имеет свойство, присущее нативному человеческому IgG2, связываться с Fc-гамма-рецепторами, и/или IgG2, который связывается с FcγR, включая любой один или более из hFcγRI(CD64), FcγRIIA или hFcγRIIB, (CD32 или CD32A) и FcγRlllA (CD16A) или FcγRlllB (CD16B).

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела связываются с эпитопом VISTA, который включает в себя или перекрывается с эпитопом, связываемым любым из антител против человеческого VISTA, имеющих последовательности согласно фиг. 4.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела связываются или взаимодействуют с одним или более остатками эпитопа, содержащего остатки LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела связываются или взаимодействуют с одним или более остатками эпитопа, содержащего один или более остатков из 79EVQTCSERRPIR90, 48NVTLTCRLLGPV60, 153HHHSEHRVHGAM164, 52LTCRLLGPV60, 56LLGPVDKGHDVTFYK70, 113LAQRHGLESASDHHG127, 153HHHSEHRVHGAM164, 93TFQDLHLHHGGHQAA107, 146CLVVEIRHHHSEH158, 53TCRLLGPVDKG63, 123SDHHG127 и/или 153HHHSEHRVHGAM164.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела связываются или взаимодействуют с одним или более остатками эпитопа, содержащего один или более остатков 79EVQTCSERRPIR90.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела стимулируют или усиливают по меньшей мере один эффект человеческого VISTA на иммунитет, например, его супрессивный эффект на одно или более из Т-клеточного иммунитета, активации моноцитов, индукции пролиферации Т-клеток; индукции или супрессии экспрессии цитокинов, повышения выживаемости моноцитов, индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) в клетках, экспрессирующих VISTA; индукции антителозависимого клеточного фагоцитоза (АЗКФ) в клетках, экспрессирующих VISTA.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем антитело или фрагмент антитела, которые содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, имеющие идентичные полипептиды CDR с любым из антител против человеческого VISTA, имеющих CDR и полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержат антагонистическое антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержат такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела, которые содержат антагонистическое антитело или фрагмент против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержат такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, имеющий по меньшей мере 90% идентичности последовательности с полипептидами антитела против человеческого VISTA, выбранного из любого из VSTB49-VSTB116, причем полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей приведены на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержат антагонистическое антитело или фрагмент против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержат такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с полипептидами антитела против человеческого VISTA, выбранного из любого из VSTB49-VSTB116, причем полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей приведены на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержат антагонистическое антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержат такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, имеющий по меньшей мере 96-99% идентичности последовательности с полипептидами антитела против человеческого VISTA, выбранного из любого из VSTB49-VSTB116, причем полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей приведены на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержат антагонистическое антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержат такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем агонистическое антитело или фрагмент антитела содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, идентичный с полипептидами антитела против человеческого VISTA, выбранного из любого из VSTB49-VSTB116, причем полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей приведены на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержат антагонистическое антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержат такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, в соответствии с любым из вышеприведенного, причем фрагмент антитела содержит или представляет собой Fab-, F(ab')₂- или scFv - фрагмент антитела.

Конкретной целью изобретения является предоставление антагонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, в соответствии с любым из вышеприведенного, которые блокируют или подавляют по меньшей мере один эффект человеческого VISTA на иммунитет, например, выбранный из его супрессивного эффекта на Т-клеточный иммунитет, активацию моноцитов или пролиферацию Т-клеток; индукции или супрессии экспрессии цитокинов, повышения выживаемости моноцитов, супрессии антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) клеток, экспрессирующих VISTA; и супрессии антителозависимого клеточного фагоцитоза (АЗКФ) клеток, экспрессирующих VISTA.

(i) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 100, 101 и 102 и CDR V_L по SEQ ID NO: 103, 104 и 105;

(ii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 110, 111 и 112 и CDR V_L по SEQ ID NO: 113, 114 и 115;

(iii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 120, 121 и 122 и CDR V_L по SEQ ID NO: 123, 124 и 125;

(iv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 130, 131 и 132 и CDR V_L по SEQ ID NO: 133, 134 и 135;

(v) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 140, 141 и 142 и CDR V_L по SEQ ID NO: 143, 144 и 145;

(vi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 150, 151 и 152 и CDR V_L по SEQ ID NO: 153, 154 и 155;

(vii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 160, 161 и 162 и CDR V_L по SEQ ID NO: 163, 164 и 165;

(viii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 170, 171 и 172 и CDR V_L по SEQ ID NO: 173, 174 и 175;

(ix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 180, 181 и 182 и CDR V_L по SEQ ID NO: 183, 184 и 185;

(x) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 190, 191 и 192 и CDR V_L по SEQ ID NO: 193, 194 и 195;

(xi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 200, 201 и 202 и CDR V_L по SEQ ID NO: 203, 204 и 205;

(xii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 210, 211 и 212 и CDR V_L по SEQ ID NO: 213, 214 и 215;

(xiii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 220, 221 и 222 и CDR V_L по SEQ ID NO: 223, 224 и 225;

(xiv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 230, 231 и 232 и CDR V_L по SEQ ID NO: 233, 234 и 235;

(xv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 240, 241 и 242 и CDR V_L по SEQ ID NO: 243, 244 и 245;

(xvi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 250, 251 и 252 и CDR V_L по SEQ ID NO: 253, 254 и 255;

(xvii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 260, 261 и 262 и CDR V_L по SEQ ID NO: 263, 264 и 265;

(xviii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 270, 271 и 272 и CDR V_L по SEQ ID NO: 273, 274 и 275;

(xix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 280, 281 и 282 и CDR V_L по SEQ ID NO: 283, 284 и 285;

(xx) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 290, 291 и 292 и CDR V_L по SEQ ID NO: 293, 294 и 295;

(xxi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 300, 301 и 302 и CDR V_L по SEQ ID NO: 303, 304 и 305;

(xxii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 310, 311 и 312 и CDR V_L по SEQ ID NO: 313, 314 и 315;

(xxiii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 320, 321 и 322 и CDR V_L по SEQ ID NO: 323, 324 и 325;

(xxiv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 330, 331 и 332 и CDR V_L по SEQ ID NO: 333, 334 и 335;

(xxv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 340, 341 и 342 и CDR V_L по SEQ ID NO: 343, 344 и 345;

(xxvi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 350, 351 и 352 и CDR V_L по SEQ ID NO: 353, 354 и 355;

(xxvii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 360, 361 и 362 и CDR V_L по SEQ ID NO: 363, 364 и 365;

(xxviii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 370, 371 и 372 и CDR V_L по SEQ ID NO: 373, 374 и 375;

(xxix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 380, 381 и 382 и CDR V_L по SEQ ID NO: 383, 384 и 385;

(xxx) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 390, 391 и 392 и CDR V_L по SEQ ID NO: 393, 394 и 395;

(xxxi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 400, 401 и 402 и CDR V_L по SEQ ID NO: 403, 404 и 405;

(xxxii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 410, 411 и 412 и CDR V_L по SEQ ID NO: 413, 414 и 415;

(xxxiii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 420, 421 и 422 и CDR V_L по SEQ ID NO: 423, 424 и 425;

(xxxiv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 430, 431 и 432 и CDR V_L по SEQ ID NO: 433, 434 и 435;

(xxxv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 440, 441 и 442 и CDR V_L по SEQ ID NO: 443, 444 и 445;

(xxxvi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 450, 451 и 452 и CDR V_L по SEQ ID NO: 453, 454 и 455;

(xxxvii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 460, 461 и 462 и CDR V_L по SEQ ID NO: 463, 464 и 465;

(xxxviii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 470, 471 и 472 и CDR V_L по SEQ ID NO: 473, 474 и 475;

(xxxix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 480, 481 и 482 и CDR V_L по SEQ ID NO: 483, 484 и 485;

(xl) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 490, 491 и 492 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 493, 494 и 495;

(xli) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 500, 501 и 502 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 503, 504 и 505;

(xlii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 510, 511 и 512 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 513, 514 и 515;

(xliii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 520, 521 и 522 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 523, 524 и 525;

(xliv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 530, 531 и 532 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 533, 534 и 535;

(xlv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 540, 541 и 542 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 543, 544 и 545;

(xlvi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 550, 551 и 552 и полипептиды CDR V_L по SEQ ID NO: 553, 554 и 555;

(xlvii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 560, 561 и 562 и CDR V_L по SEQ ID NO: 563, 564 и 565;

(xlviii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 570, 571 и 572 и CDR V_L по SEQ ID NO: 573, 574 и 575;

(xlix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 580, 581 и 582 и CDR V_L по SEQ ID NO: 583, 584 и 585;

(l) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 590, 591 и 592 и CDR V_L по SEQ ID NO: 593, 594 и 595;

(li) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 600, 601 и 602 и CDR V_L по SEQ ID NO: 603, 604 и 605;

(lii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 610, 611 и 612 и CDR V_L по SEQ ID NO: 613, 614 и 615;

(liii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 620, 621 и 622 и CDR V_L по SEQ ID NO: 623, 624 и 625;

(liv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 630, 631 и 632 и CDR V_L по SEQ ID NO: 633, 634 и 635;

(lv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 640, 641 и 642 и CDR V_L по SEQ ID NO: 643, 644 и 645;

(lvi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 650, 651 и 652 и CDR V_L по SEQ ID NO: 653, 654 и 655;

(lvii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 660, 661 и 662 и CDR V_L по SEQ ID NO: 663, 664 и 665;

(lviii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 670, 671 и 672 и CDR V_L по SEQ ID NO: 673, 674 и 675;

(lix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 680, 681 и 682 и CDR V_L по SEQ ID NO: 683, 684 и 685;

(lx) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 690, 691 и 692 и CDR V_L по SEQ ID NO: 693, 694 и 695;

(lxi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 700, 701 и 702 и CDR V_L по SEQ ID NO: 703, 704 и 705;

(lxii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 710, 711 и 712 и CDR V_L по SEQ ID NO: 713, 714 и 715;

(lxiii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 720, 721 и 722 и CDR V_L по SEQ ID NO: 723, 724 и 725;

(lxiv)содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 730, 731 и 732 и CDR V_L по SEQ ID NO: 733, 734 и 735;

(lxv) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 740, 741 и 742 и CDR V_L по SEQ ID NO: 743, 744 и 745;

(lxvi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 750, 751 и 752 и CDR V_L по SEQ ID NO: 753, 754 и 755;

(lxvii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 760, 761 и 762 и CDR V_L по SEQ ID NO: 763, 764 и 765;

(lxviii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 770, 771 и 772 и CDR V_L по SEQ ID NO: 773, 774 и 775;

(lxix) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 780, 781 и 782 и CDR V_L по SEQ ID NO: 783, 784 и 785;

(lxx) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 790, 791 и 792 и CDR V_L по SEQ ID NO: 793, 794 и 795;

(lxxi) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 800, 801 и 802 и CDR V_L по SEQ ID NO: 803, 804 и 805;

(lxxii) содержат CDR V_H по SEQ ID NO: 810, 811 и 812 и CDR V_L по SEQ ID NO: 813, 814 и 815.

Целью изобретения является предоставление агониста VISTA в соответствии с любым из вышеприведенного, который:

(i) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 106 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 108;

(ii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 116 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 118;

(iii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 126 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 128;

(iv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 136 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 138;

(v) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 146 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 148;

(vi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 156 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 158;

(vii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 166 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 168;

(viii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 176 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 178;

(ix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 186 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 188;

(x) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 196 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 198;

(xi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 206 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 208;

(xii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 216 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 218;

(xiii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 226 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 228;

(xiv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 236 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 238;

(xv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 246 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 248;

(xvi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 256 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 258;

(xvii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 266 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 268;

(xviii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 276 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 278;

(xix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 286 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 288;

(xx) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 296 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 298;

(xxi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 306 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 308;

(xxii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 316 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 318;

(xxiii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 326 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 328;

(xxiv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 336 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 338;

(xxv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 346 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 348;

(xxvi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 356 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 358;

(xxvii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 366 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 368;

(xxviii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 376 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 378;

(xxix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 386 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 388;

(xxx) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 396 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 398;

(xxxi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 406 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 408;

(xxxii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 416 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 418;

(xxxiii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 426 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 428;

(xxxiv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 436 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 438;

(xxxv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 446 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 448;

(xxxvi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 456 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 458;

(xxxvii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 466 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 468;

(xxxviii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 476 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 478;

(xxxix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 486 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 488;

(xl) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 496 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 498;

(xli) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 506 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 508;

(xlii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 516 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 518;

(xliii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 526 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 528;

(xliv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 536 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 533, 534 и 535;

(xlv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 546 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 548;

(xlvi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 556 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 558;

(xlvii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 566 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 568;

(xlviii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 576 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 578;

(xlix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 586 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 588;

(l) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 596 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 598;

(li) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 606 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 608;

(lii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 616 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 618;

(liii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 626 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 628;

(liv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 636 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 638;

(lv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 646 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 648;

(lvi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 656 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 658;

(lvii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 666 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 668;

(lviii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 676 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 678;

(lix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 686 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 688;

(lx) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 696 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 698;

(lxi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 706 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 708;

(lxii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 716 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 718;

(lxiii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 726 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 728;

(lxiv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 736 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 738;

(lxv) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 746 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 748;

(lxvi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 756 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 758;

(lxvii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 766 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 768;

(lxviii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 776 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 778;

(lxix) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 786 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 788;

(lxx) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 796 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 798;

(lxxi) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 806 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 808; и

(lxxii) содержит полипептид V_H по SEQ ID NO: 816 и полипептид V_L по SEQ ID NO: 818.

Конкретной целью изобретения является предоставление агонистического антитела или фрагмента антитела, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, в соответствии с любым из вышеприведенного, которые опосредуют любой эффект или комбинацию по меньшей мере двух из следующих иммуноингибиторных эффектов: (i) снижения иммунного ответа, (ii) снижения активации Т-клеток, (iii) снижения цитотоксической активности Т-клеток, (iv) снижения активности естественных клеток-киллеров (NK), (v) снижения активности Т-клеток, (vi) снижения секреции провоспалительных цитокинов, (vii) снижения секреции IL-2; (viii) снижения выработки интерферона-γ, (ix) снижения ответа Th1, (x) снижения ответа Th2, (xi) повышения числа клеток и/или активности регуляторных Т-клеток, (xii) повышения активности регуляторных клеток и/или количества одного или более видов клеток из миелоидных супрессорных клеток (МСК), нМК, мезенхимальных стромальных клеток, TIE2-экспрессирующих моноцитов, (xiii) повышения активности регуляторных клеток и/или активности одного или более видов клеток из миелоидных супрессорных клеток (МСК), нМК, мезенхимальных стромальных клеток, TIE2-экспрессирующих моноцитов, (xiii) повышения количества макрофагов M2, (xiv) повышения активности макрофагов M2, (xv) повышения количества нейтрофилов N2, (xvi) повышения активности нейтрофилов N2, (xvii) повышения ингибирования активации Т-клеток, (xviii) повышения ингибирования активации ЦТЛ, (xix) повышения ингибирования активации NK-клеток, (xx) повышения истощения Т-клеток, (xxi) снижения ответа Т-клеток, (xxii) снижения активности цитотоксических клеток, (xxiii) снижения ответов антиген-специфической памяти, (xxiv) ингибирования апоптоза или лизиса клеток, (xxv) снижения цитотоксического или цитостатического эффекта на клетки, (xxvi) снижения прямого уничтожения клеток, (xxvii) снижения активности Thl7 и/или (xxviii) снижения комплементзависимой цитотоксичности и/или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, при условии, что указанное антитело против VISTA или его антигенсвязывающий фрагмент может вызывать эффект, противоположный одному или более из (i)-(xxviii) и, необязательно, используются для лечения аутоиммунности, аллергии, воспаления, при трансплантации или сепсисе.

Конкретной целью изобретения является предоставление фармацевтической или диагностической композиции, содержащей агонистическое антитело или фрагмент антитела, содержащее антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, в соответствии с любым из вышеприведенного.

Конкретной целью изобретения является предоставление способа лечения и/или диагностирования, или применения композиции, содержащей по меньшей мере одно антагонистическое антитело или фрагмент антитела в соответствии с любым из вышеприведенных пунктов, для диагностического или терапевтического применения, при этом способ или применение включает введение нуждающемуся в этом субъекту по меньшей мере одной дозы композиции, содержащей терапевтически или диагностически эффективное количество по меньшей мере одного антагонистического антитела или фрагмента антитела, в соответствии с любым из вышеприведенного, для лечения, например, рака или инфекционного нарушения, при этом, необязательно, рак представляет собой рак крови или твердую опухоль, например, окруженную опухолевой стромой, содержащей миелоидные клетки, Т-клетки или комбинацию миелоидных клеток и Т-клеток, или рак, выбранный из лейкоза, лимфомы, миелодиспластического синдрома или миеломы, рака легкого или их комбинаций, или лейкоза, который включает острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый миелоидный (миелогенный) лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ); волосатоклеточный лейкоз, T-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов или Т-клеточный лейкоз взрослых.

Конкретной целью изобретения является предоставление способа лечения и/или диагностирования, или применения композиции, содержащей по меньшей мере одно агонистическое антитело или фрагмент антитела в соответствии с любым из вышеприведенных пунктов, для диагностического или терапевтического применения, при этом способ или применение включает введение нуждающемуся в этом субъекту по меньшей мере одной дозы композиции, содержащей терапевтически или диагностически эффективное количество по меньшей мере одного агонистического антитела или фрагмента антитела, в соответствии с любым из вышеприведенного, или композиции в соответствии с любым из вышеприведенного.

Конкретной целью изобретения является предоставление способа применения любого агонистического антитела или фрагмента антитела в соответствии с любым из вышеприведенного для оказания любого in vitro и/или in vivo эффекта или комбинации по меньшей мере двух из следующих иммуноингибиторных эффектов: (i) снижения иммунного ответа, (ii) снижения активации Т-клеток, (iii) снижения цитотоксической активности Т-клеток, (iv) снижения активности естественных клеток-киллеров (NK), (v) снижения активности Т-клеток, (vi) снижения секреции провоспалительных цитокинов, (vii) снижения секреции IL-2; (viii) снижения выработки интерферона-γ, (ix) снижения ответа Th1, (x) снижения ответа Th2, (xi) повышения числа клеток и/или активности регуляторных Т-клеток, (xii) повышения активности регуляторных клеток и/или количества одного или более видов клеток из миелоидных супрессорных клеток (МСК), нМК, мезенхимальных стромальных клеток, TIE2-экспрессирующих моноцитов, (xiii) повышения активности регуляторных клеток и/или активности одного или более видов клеток из миелоидных супрессорных клеток (МСК), нМК, мезенхимальных стромальных клеток, TIE2-экспрессирующих моноцитов, (xiii) повышения количества макрофагов M2, (xiv) повышения активности макрофагов M2, (xv) повышения количества нейтрофилов N2, (xvi) повышения активности нейтрофилов N2, (xvii) повышения ингибирования активации Т-клеток, (xviii) повышения ингибирования активации ЦТЛ, (xix) повышения ингибирования активации NK-клеток, (xx) повышения истощения Т-клеток, (xxi) снижения ответа Т-клеток, (xxii) снижения активности цитотоксических клеток, (xxiii) снижения ответов антиген-специфической памяти, (xxiv) ингибирования апоптоза или лизиса клеток, (xxv) снижения цитотоксического или цитостатического эффекта на клетки, (xxvi) снижения прямого уничтожения клеток, (xxvii) снижения активности Thl7 и/или (xxviii) снижения комплементзависимой цитотоксичности и/или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, при условии, что указанное антитело против VISTA или его антигенсвязывающий фрагмент может вызывать эффект, противоположный одному или более из (i)-(xxviii) и, необязательно, используются для лечения аутоиммунности, аллергии, воспаления, при трансплантации или сепсисе.

Конкретной целью изобретения является предоставление способа или применения любого агонистического антитела или фрагмента антитела в соответствии с любым из вышеприведенного, для применения в лечении или предотвращении аллергии, аутоиммунности, при трансплантации, генной терапии, воспалении, раке, РТПХ или сепсисе, или для лечения или предотвращения воспалительных, аутоиммунных или аллергических побочных явлений, связанных с любым из вышеприведенного, у субъекта-человека.

Антитело против VISTA или его антигенсвязывающий фрагмент, или композиция, или способ, или применение в соответствии с любым из вышеприведенного, дополнительно включающие другое иммуномодулирующее антитело или слитый белок, которые выбраны из иммуноингибиторных антител или слитых белков, нацеленных на один или более из CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA, и/или агонистических антител или слитых белков, нацеленных на один или более из CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 или ICOS.

Способ или применение любого из вышеприведенного, который включает анализ белка VISTA в клетках индивида или в жидкостях организма до, одновременно и/или после лечения.

Способ или применение любого из вышеприведенного, который включает анализ уровней VISTA в гемопоэтических клетках.

Способ или применение любого из вышеприведенного, который включает анализ уровней VISTA в гемопоэтических клетках, выбранных из одной или более из клеток миелоидной линии дифференцировки и/или лимфоцитов, моноцитов или нейтрофилов, Т-клеток, В-клеток, естественных клеток-киллеров (NK) или естественных Т-киллеров (NKT).

Способ или применение любого из вышеприведенного, который отличается тем, что агонистическое антитело против человеческого VISTA или его фрагмент содержит такие же CDR, что и антитело, выбранное из VSTB49-VSTB116, и Fc-область человеческого IgG2, которая, необязательно, может быть мутирована, или в котором константная область или Fc-область IgG2 сохраняет его нативное свойство связывать FcR и/или способность связывать CD32A.

Антитело, композиция, способ или применение любого из вышеприведенного, которые отличаются тем, что антитело против человеческого VISTA или его фрагмент имеет аффинность или КД в отношении человеческого VISTA, составляющую 50 М или менее согласно определению методом поверхностного плазмонного резонансы при 37°C.

Антитело, композиция, способ или применение любого из вышеприведенного, которые отличаются тем, что антитело против человеческого VISTA или его фрагмент имеет аффинность или КД в отношении человеческого VISTA, составляющую 1 нМ или менее согласно определению методом поверхностного плазмонного резонансы при 37°C.

Конкретной целью изобретения является предоставление выделенных антагонистических и агонистических антител против человеческого VISTA и агонистических фрагментов антител, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем антитела или фрагменты антител содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, имеющие полипептиды CDR любого из антител против человеческого VISTA, имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержит антагонистическое антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержит такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Конкретной целью изобретения является предоставление выделенных антагонистических и агонистических антител против человеческого VISTA и агонистических фрагментов антител, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, причем антитела или фрагменты антител содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, имеющие полипептиды CDR антитела против человеческого VISTA, выбранного из VSTB49-VSTB116, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержит антагонистическое антитело против человеческого VISTA или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA не содержит такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление выделенных антагонистических и агонистических антител и фрагментов антител, содержащих CDR антитела против человеческого VISTA, выбранного из VSTB49-VSTB116, которые содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, имеющий по меньшей мере 90%, 95% или 96-99% идентичности последовательности с полипептидными последовательностями вариабельной области тяжелой и легкой цепей VSTB49-VSTB116, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержит антагонистическое антитело или фрагмент против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержит такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление выделенных антагонистических и агонистических антител или фрагментов антител, содержащих такие же CDR, что и любое из VSTB49-VSTB116, которые содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, являющийся/являющиеся идентичным/идентичными с полипептидными последовательностями вариабельной области тяжелой и легкой цепей VSTB49-VSTB116, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержит антагонистическое антитело или фрагмент против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержит такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление выделенных антагонистических или агонистических химерных, человеческих, гуманизированных, мультиспецифических (например, биспецифических) антител или фрагментов антител против человеческого VISTA, содержащих антигенсвязывающую область, которая специфически связывается с человеческим VISTA, которые содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, имеющие такие же полипептиды CDR, что и любое из антител против человеческого VISTA, имеющих CDR и полипептидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 4, с условием, что если указанное антитело или фрагмент содержит антагонистическое антитело или фрагмент антитела против человеческого VISTA, то антитело или фрагмент антитела не содержит такие же самые CDR, что и любое из VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 или VSTB60.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление новых иммуносупрессантов, т.е. антител или фрагментов антител против человеческого VISTA, например, содержащих константные домены человеческого IgG2 или Fc-области IgG2, при этом, необязательно, сохраняется или усиливается способность связывать FcR константных доменов человеческого IgG2 или Fc-областей IgG2 по сравнению с константными доменами человеческого IgG2 или Fc-областями IgG2 дикого типа, которые агонизируют, стимулируют или имитируют эффект человеческого VISTA на иммунитет, например, его супрессивный эффект на активность, дифференцировку и пролиферацию Т-клеток и его супрессивный эффект на экспрессию провоспалительных цитокинов.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление новых антагонистов, т.е. новых антител или фрагментов антител против человеческого VISTA, которые антагонизируют или блокируют эффект человеческого VISTA на иммунитет, в частности, его супрессивный эффект на активность, дифференцировку и пролиферацию Т-клеток и его супрессивный эффект на экспрессию провоспалительных цитокинов.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление новых иммуносупрессивных антител и фрагментов антител, которые усиливают или имитируют супрессивный эффект VISTA на Т-клеточный иммунитет, т.е. которые подавляют пролиферацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, активацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, и его подавление выработки иммунных цитокинов, в частности, провоспалительных цитокинов, таких как IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, TNF-α и/или GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), и его стимулирующий эффект на экспрессию хемокинов или хемоатрактантов, таких как KC (хемоатрактант кераноцитов) или MIP-2 (макрофагальный белок воспаления 2).

Другой конкретной целью изобретения является предоставление новых антител и фрагментов антител, которые блокируют или снижают супрессивный эффект VISTA на Т-клеточный иммунитет, т.е. которые усиливают пролиферацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, активацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, и его супрессивный эффект на выработку провоспалительных иммунных цитокинов, в частности, провоспалительных цитокинов, таких как IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, TNF-α и/или GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), и его стимулирующий эффект на экспрессию хемокинов или хемоатрактантов, таких как KC (хемоатрактант кераноцитов ) или MIP-2 (макрофагальный белок воспаления 2).

Другой конкретной целью изобретения является предоставление новых иммуносупрессивных или агонистических антител или фрагментов антител против человеческого VISTA, имеющих специфичность в отношении конкретного эпитопа или конкурирующих за связывание с человеческим VISTA со специфическими антителами против человеческого VISTA, которые агонизируют (усиливают, стимулируют или имитируют) супрессивный эффект VISTA на иммунитет, например, его супрессивный эффект на Т-клеточный иммунитет, т.е. пролиферацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, активацию Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺, и/или которые подавляют выработку провоспалительных иммунных цитокинов, таких как IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, TNF-α и/или GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), и его стимулирующий эффект на экспрессию хемокинов или хемоатрактантов, таких как KC (хемоатрактант кераноцитов) или MIP-2 (макрофагальный белок воспаления 2).

Также изобретение относится к конкретному применению этих агонистических антител или фрагментов антител против человеческого VISTA в качестве профилактических или терапевтических средств, в особенности при лечении патологических состояний, при которых предотвращение или ингибирование, или снижение иммунных реакций является терапевтически необходимым, и, в частности, при которых предотвращение или ингибирование, или снижение Т-клеточного иммунитета, или, конкретнее, опосредованного CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеточного иммунитета, является терапевтически целесообразным, таких как аутоиммунность, воспаление, аллергические нарушения, сепсис, РТПХ, и/или при лечении реципиентов трансплантатов или клеточной терапии, например, реципиентов CAR-T, или при смягчении побочных воспалительных явлений некоторых патологических состояний, таких как рак.

Также изобретение относится к применению новых антагонистических антител или фрагментов антител против человеческого VISTA в качестве профилактических или терапевтических средств, в особенности при лечении патологических состояний, при которых необходима стимуляция иммунитета, например, терапевтически целесообразной является стимуляция Т-клеточного иммунитета или опосредованного CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеточного иммунитета, таких как рак и инфекционные заболевания.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление агонистического или антагонистического антитела против человеческого VISTA в соответствии с изобретением, которое присоединено к выявляемой метке, линкеру или терапевтическому соединению.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление диагностической или терапевтической композиции, содержащей диагностически или терапевтически эффективное количество агонистического или антагонистического антитела против человеческого VISTA в соответствии с изобретением, например, содержащего такие же CDR, что и любое из антител, имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4, которая подходит для применения в терапии людей, такой как внутривенно, подкожно или внутримышечно вводимая композиция.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление диагностических или терапевтических способов, в которых используется агонистическое антитело в соответствии с изобретением, находящееся в ассоциации с другим иммунным агонистом, например, агонистом PD-1 или PD-L1, при этом, например, агонист PD-1 или PD-L1 выбран из анти-PD-1 антитела или фрагмента антитела, анти-PD-L1 антитела или фрагмента антитела, полипептида PD-L1 или его фрагмента, который может быть моновалентным или мультимерным, полипептида PD-1 или его фрагмента, который может быть моновалентным или мультимерным, или комплексного или слитого белка, содержащего любое из вышеприведенного.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление диагностических или терапевтических способов, в которых используется антагонистическое антитело в соответствии с изобретением, находящееся в ассоциации с другим иммунным антагонистом, например, антагонистом PD-1 или PD-L1, при этом, например, антагонист PD-1 или PD-L1 выбран из антагонистического анти-PD-1 антитела или фрагмента антитела, антагонистического анти-PD-L1 антитела или фрагмента антитела.

Другой конкретной целью изобретения является предоставление способов приведения в контакт иммунных клеток in vitro или in vivo с антагонистическим или агонистическим антителом в соответствии с изобретением, например, человеческих иммунных клеток, при этом, например, приводимые в контакт клетки инфузируют в организм субъекта-человека, такого как субъект, имеющий рак или инфекционное заболевание, или имеющий воспалительное, аллергическое или аутоиммунное патологическое состояние.

Краткое описание фигур

Фиг. 1A-D. На этой фигуре проиллюстрирован in vitro и in vivo скрининговый анализ, который можно использовать для идентификации супрессорных VISTA mAb. A) Очищенные Т-клетки высевали поверх анти-CD3 в присутствии указанных mAb в течение 72 часов. Пролиферацию измеряли путем включения H3. B) Очищенные Т-клетки DO11.10 стимулировали активированными ISQ АПК в течение 6 суток в присутствии указанного антитела. Пролиферацию измеряли, используя разведение красителя CTV. C) РТПХ индуцировали переносом клеток C57BL/6 облученным реципиентам BALB/c. Мышей В/Б инъецировали 200 мкг антитела на 0, 2 и 4 сутки после переноса и анализировали выживаемость. D) Мышей обрабатывали 10 мг/кг указанного антитела за 3 часа до введения ConA (15 мг/кг) и анализировали IL-2 в плазме на 6 с помощью Luminex.

Фиг. 2A-F. На этой фигуре проиллюстрировано, что агонистические антитела к VISTA являются иммуносупрессивными во многих моделях аутоиммунного заболевания. A) Мышей NZB/W F1 обрабатывали 3X/неделю 8G8 или Ham Ig (200 мкг), начиная за 25 недель до конца эксперимента. «X» обозначает моменты времени, когда умерщвляли всю обработанную контролем группу. B) Мышей обрабатывали 200 мкг антитела за 3 часа до введения 15 мг/кг ConA и отслеживали выживаемость в течение 80 часов. C) Мышей обрабатывали последовательно mAb к коллагену II, а затем ЛПС, и определяли степень артрита по измерению отека лап. 8G8 и Ham-Ig вводили (200 мкг) 3X через сутки. D) Имиквимод наносили на уши мышей ежесуточно. На 14 сутки вводили 8G8 или Ham-Ig (200 мкг) через сутки и штангенциркулем измеряли толщину ушей. E, F) Имиквимод наносили на спины мышей ежесуточно. На 9 сутки мышей умерщвляли и получали срезы кожи, которые окрашивали в отношении экспрессии CD3 методом ИГХ.

Фиг. 3. На этой фигуре проиллюстрирована экспрессия VISTA у ДТ и hV-KI мышей. Т-клетки CD4⁺, Т-клетки CD8⁺, Treg (CD4⁺ FoxP3⁺) и моноциты, CD11b⁺, Ly6C⁺, Ly6G^- выделяли из лимфатических узлов ДТ и VISTA KI мышей и окрашивали антителами к αVISTA против мышиного или человеческого белка соответственно.

Фиг. 4 содержит последовательности разных антител к человеческому VISTA, включая последовательности INX800, INX801 и INX900-INX919.

На фиг. 5 проиллюстрирован эффект типовых антител к человеческому VISTA, т.е. INX800 и INX801, в модели гепатита ConA, с помощью которой оценивают их эффект на экспрессию разных цитокинов, хемокинов и хемоатрактантов.

На фиг. 6 проиллюстрирован эффект типовых антител к человеческому VISTA, т.е. INX800 и INX801, в in vivo животной модели реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ).

На фиг. 7 проиллюстрирован эффект типовых агонистических антител к человеческому VISTA, т.е. INX800 и INX801, на CD3-зависимые Т-клеточные ответы.

На фиг. 8 проиллюстрирован эффект типовых агонистических антител к человеческому VISTA, т.е. INX800 и INX801, на число конкретных популяций Т-клеток или на общее число Т-клеток.

На фиг. 9 приведено сравнение эффекта типовых антител к человеческому VISTA в анализе ConA и на экспрессию выбранных провоспалительных цитокинов и маркеров воспаления, т.е. IL-2, γ-интерферона и IL-12p70.

Фиг. 10A-C иллюстрирует разные изоформы IgG2. (A) Дисульфидная перестановка приводит к получению изоформ A и B, наряду с переходом для A/B (фиг. из Zhang, A. et al., 2015). (B) Изоформы можно отличить с помощью ОФ-ВЭЖХ. (C) Наблюдаемая хроматограмма ОФ-ВЭЖХ для INX901.

Фиг. 11 иллюстрирует химическое обогащение изоформ A или B IgG2. (Черная линия, вверху) Хроматограмма демонстрирует наличие доминантного крайнего левого пика, определяющего B-форму. (Красная линия, внизу) Хроматограмма демонстрирует наличие доминантного правого пика, определяющего А-форму.

Фиг. 12: Сравнение INX901 Fc-молчащих вариантов относительно дисульфидной перестановки. (Верх) INX901 на каркасе IgG2 демонстрирует ожидаемую смесь изоформ A, A/B и B. (Середина) INX901Si на молчащем каркасе IgG1 существует в одной изоформе. (Низ) INX901HSi содержит молчащую Fc-область IgG1 с CH1/шарниром из IgG2, что делает возможным дисульфидную перестановку, эквивалентную нативному IgG2.

Фиг. 13. Биохимически измененные формы INX901 все еще могут снижать выработку цитокинов в РСКЛ. Супернатанты из двух отдельных РСКЛ анализировали в отношении выработки цитокинов в момент времени 72 часа с помощью анализа Luminex. Родительское INX901, измененная форма A и измененная форма B все снижали выработку TNFα и IL-2 дозозависимым образом.

Фиг. 14. Генетически фиксированные формы INX901 все еще могут снижать выработку цитокинов в РСКЛ, но варианты с молчащим Fc не могут. Супернатанты из каждой РСКЛ анализировали в отношении выработки цитокинов в момент времени 72 часа с помощью анализа Luminex. Родительское INX901, фиксированная форма A и фиксированная форма B все снижали выработку TNFα и IL-2 дозозависимым образом. Варианты Si и HSi, которые содержат мутации для получения молчащего Fc-домена, не подавляли систематически выработку цитокинов.

Фиг. 15. Генетически фиксированные формы INX908 все еще могут снижать выработку цитокинов в РСКЛ, но варианты с молчащим Fc не могут. Супернатанты из каждой РСКЛ анализировали в отношении выработки цитокинов в момент времени 72 часа с помощью анализа Luminex. Родительское INX908, фиксированная форма A и фиксированная форма B все снижали выработку TNFα и IL-2 дозозависимым образом. Варианты Si и HSi, которые содержат мутации для получения молчащего Fc-домена, не подавляли систематически выработку цитокинов.

Фиг. 16. На этой фигуре схематически описана технология Pepscan®, применяемая для определения линейных и прерывистых эпитопов, связываемых агонистическими антителами против человеческого VISTA.

Фиг. 17. На этой фигуре проиллюстрировано, что агонистические антитела против человеческого VISTA связываются с одной коровой последовательностью.

Фиг. 18. На этой фигуре приведен обобщенный анализ эпитопов для разных агонистических антител против человеческого VISTA согласно изобретению.

Фиг. 19. На этой фигуре проиллюстрированы эпитопы, связываемые агонистическими антителами против человеческого VISTA и дополнительно определены важные остатки, вовлеченные в связывание.

Подробное описание изобретения

Если не определено иное, все используемые в данном документе технические и научные термины имеют значения, обычно подразумеваемые специалистом в области техники, к которой относится это изобретение. Хотя при реализации или испытании данного изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, в данном документе описаны подходящие способы и материалы. Материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не подразумевают ограничения. Описанные в данном документе лабораторные процедуры и методики аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, а также употребляемая в связи с ними номенклатура, хорошо известны и традиционно используются в данной области техники. Для химического синтеза, химического анализа, фармацевтического приготовления, составления и доставки, а также для лечения пациентов можно использовать стандартные методики.

В приведенном описании и в следующей за ним формуле изобретения употребляемая форма единственного числа включает множественные отсылки, если иное четко не следует из контекста.

В контексте данного документа «активирующий рецептор» относится в широком смысле к рецепторам иммунных клеток, которые связывают антиген, антиген в комплексе (например, в контексте молекул ГКГС), Ig-слитые белки, лиганды или антитела. Активирующие рецепторы включают, но не ограничиваются этим, T-клеточные рецепторы (ТКР), B-клеточные рецепторы (ВКР), рецепторы цитокинов, рецепторы ЛПС, рецепторы комплемента и Fc-рецепторы. Например, T-клеточные рецепторы находятся на Т-клетках и ассоциированы с молекулами CD3. T-клеточные рецепторы стимулируются антигеном в контексте молекул ГКГС (а также поликлональными активирующими Т-клетки реагентами). Активация Т-клеток посредством ТКР приводит к многочисленным изменениям, например, фосфорилированию белков, изменениям в мембранных липидах, появлению потоков ионов, циклическим нуклеотидным изменениям, изменениям в транскрипции РНК, изменениям в белковом синтезе и изменениям в объеме клеток. Например, T-клеточные рецепторы находятся на Т-клетках и ассоциированы с молекулами CD3. T-клеточные рецепторы стимулируются антигеном в контексте молекул ГКГС (а также поликлональными активирующими Т-клетки реагентами). Активация Т-клеток посредством ТКР приводит к многочисленным изменениям, например, фосфорилированию белков, изменениям в мембранных липидах, появлению потоков ионов, циклическим нуклеотидным изменениям, изменениям в транскрипции РНК, изменениям в белковом синтезе и изменениям в объеме клеток.

В контексте данного документа «адъювант» относится к агенту, применяемому для стимуляции иммунной системы и повышения ответа на вакцину, но сам по себе не имеет специфического антигенного эффекта.

В данном документе «агонист» относится к молекуле, в общем случае антителу или слитым белкам, которая усиливает или имитирует эффект конкретной молекулы на иммунитет. В общем случае в данной заявке он относится к агонистическим антителам и фрагментам антител против человеческого VISTA, которые усиливают или имитируют эффект человеческого VISTA на иммунитет, в частности, супрессивный эффект VISTA на Т-клеточный иммунитет (CD4+ и/или CD8+ Т-клеточный иммунитет), экспрессию провоспалительных цитокинов, и его эффект на экспрессию специфических хемокинов и хемоатрактантов.

«Способствует диагностике» или «способствует выявлению» заболевания означает в данном документе выявление уровня экспрессии конкретного маркерного полипептида или экспрессируемой РНК, одного или вместе с одним или более другими маркерами, с целью оценить, имеет ли субъект клетки, характерные для конкретного болезненного состояния или начала конкретного болезненного состояния, или имеет ли иммунное нарушение, такое как иммуносупрессия, характеризуемая экспрессией VISTA, или аномальную иммунную повышающую регуляцию, характеризуемую наличием клеток, имеющих сниженные уровни VISTA, например, как при аутоиммунности, воспалении или аллергических реакциях, например, у индивидов с хроническими и не хроническими заболеваниями.

В контексте данного документа «аллергическое заболевание» в широком смысле относится к заболеванию, включающему аллергические реакции. Конкретнее, «аллергическое заболевание» определяется как заболевание, для которого идентифицирован аллерген, при этом наблюдается сильная корреляция между воздействием этого аллергена и началом патологического изменения, и было доказано, что патологическое изменение имеет иммунологический механизм. В данном документе иммунологический механизм означает, что лейкоциты демонстрируют иммунный ответ на стимуляцию аллергеном.

В контексте данного документа «аминокислота» в широком смысле относится к аминокислотам природного и синтетического происхождения, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогичным образом с аминокислотами природного происхождения. Аминокислоты природного происхождения представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые впоследствии проходят модификацию (например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин). Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют такую же самую базовую химическую структуру, что и аминокислота природного происхождения (т.е. углерод, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой), и R-группу (например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний). Аналоги могут иметь модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохранять такую же самую базовую химическую структуру, что и аминокислота природного происхождения. Аминокислотные миметики относятся к соединениям, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогичным образом с аминокислотой природного происхождения.

В контексте данного документа «анергия» или «толерантность», или «длительная антиген-специфическая супрессия Т-клеток» в широком смысле относится к устойчивости к опосредованной активирующими рецепторами стимуляции. Устойчивость в общем случае является антиген-специфической и продолжает присутствовать после окончания воздействия толерогенного антигена. Например, анергия в Т-клетках (как противоположность невосприимчивости) характеризуется отсутствием выработки цитокинов, например, IL-2. Анергия Т-клеток возникает при воздействии на Т-клетки антигена и получении первого сигнала (опосредованного Т-клеточным рецептором или CD-3 сигнала) в отсутствие второго сигнала (костимуляторного сигнала). В этих условиях повторное воздействие на клетки того же самого антигена (даже если повторное воздействие происходит в присутствии костимуляторной молекулы) приводит к отсутствию выработки цитокинов и, таким образом, отсутствию пролиферации. При этом анергические Т-клетки могут демонстрировать ответы на неродственные антигены и могут пролиферировать при культивировании с цитокинами (например, IL-2). Например, анергию Т-клеток также можно наблюдать по отсутствию выработки IL-2 Т-лимфоцитами при измерении методом ИФА или анализа пролиферации с применением индикаторной линии клеток. В альтернативном варианте можно использовать конструкцию с репортерным геном. Например, анергические Т-клетки не могут инициировать транскрипцию гена IL-2, индуцируемую гетерологичным промотором под управлением 5' энхансера гена IL-2 или мультимером последовательности API, которая может находиться в энхансере (Kang et al. (1992) Science 257: 1134). Модуляция костимуляторного сигнала приводит к модуляции эффекторной функции иммунной клетки.

В данном документе «антагонист» относится к молекуле, в общем случае антителу или слитым белкам, которая блокирует или снижает эффект конкретной молекулы на иммунитет. В общем случае в данной заявке он относится к антагонистическим антителам и фрагментам антител против человеческого VISTA, которые блокируют или снижают эффект человеческого VISTA на иммунитет, в частности, супрессивный эффект VISTA на Т-клеточный иммунитет (CD4+ и/или CD8+ Т-клеточный иммунитет), экспрессию провоспалительных цитокинов, и эффект VISTA на экспрессию специфических хемокинов и хемоатрактантов.

В контексте данного документа «антитело» в широком смысле относится к «антигенсвязывающей части» антитела (также взаимозаменяемо используемой с «частью антитела», «антигенсвязывающим фрагментом», «фрагментом антитела»), а также к цельным молекулам антител. В контексте данного документа термин «антигенсвязывающая часть» относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, VISTA или его конкретными частями). В контексте данного документа термин «антитело» включает цельные поликлональные и моноклональные антитела и любые их антигенсвязывающие фрагменты (т.е. «антигенсвязывающие части») или одиночные цепи, а также биспецифические и мультиспецифические антитела, например, которые связываются с некоторым количеством антигенов или некоторым количеством эпитопов антигенов. «Антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно называемой V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь состоит из по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области V_Hи V_L могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. В более широком смысле подразумевается, что термин «антитело» включает любую содержащую полипептидную цепь молекулярную структуру со специфической формой, которая подходит к эпитопу и распознает его, при этом одно или более нековалентных межмолекулярных взаимодействий стабилизируют комплекс между молекулярной структурой и эпитопом. Классическая молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, а все типы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD и т.д., из всех источников, например, людей, грызунов, кроликов, коров, овец, свиней, собак, других млекопитающих, кур, других птиц и т.д., считаются «антителами».

Антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (a) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (b) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (c) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и C_H1; (d) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (e) фрагмент dAb (Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из домена V_H; и (f) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены рекомбинантными способами с помощью синтетического ликера, что позволяет им образовывать одну белковую цепь, в которой области V_L и V_H спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv)). Смотрите, например, Bird, et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston, et al. (1988) Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; и Osbourn, et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16: 778. Также подразумевается, что одноцепочечные антитела охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Любые последовательности V_H и V_L конкретного scFv могут быть связаны с кДНК или геномными последовательностями константной области человеческого иммуноглобулина для создания экспрессионных векторов, кодирующих полные молекулы IgG или другие изотипы. V_H и V_L также можно использовать для создания Fab, Fv или других фрагментов иммуноглобулина с помощью белковой химии или технологии рекомбинантных ДНК. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых домены V_H и V_L экспрессируются в одной полипептидной цепи, но с применением линкера, который является слишком коротким, чтобы допустить спаривание между двумя доменами в одной цепи, тем самым вынуждая домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи с созданием двух антигенсвязывающих участков. Смотрите, например, Holliger, et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, et al. (1994) Structure 2: 1121-1123. Более того, антитело или его антигенсвязывающая часть (антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент антитела, часть антитела) могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образуемых посредством ковалентной или нековалентной связи между антителом или частью антитела и одним или более белками или пептидами. Примеры молекул иммуноадгезии включают применение коровой области стрептавидина для создания тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov, et al. (1995) Hum. Antibodies Hybridomas 6: 93-101) и применение остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для создания бивалентных и биотинилированных молекул scFv. Kipriyanov, et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058. Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')₂, можно получать из цельных антител, используя традиционные методики, такие как расщепление цельных антител папаином или пепсином соответственно. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать, применяя стандартные технологии рекомбинантных ДНК, описанные в данном документе. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными, ксеногенными, аллогенными, сингенными или представлять собой модифицированные формы, например, гуманизированные, химерные, биспецифические или мультиспецифические антитела.

Термины «антитело, распознающее антиген» и «антитело, специфическое к антигену» взаимозаменяемо используются в данном документе с термином «антитело, которое специфически связывается с антигеном» и относятся к иммуноглобулину или его фрагменту, который специфически связывает антиген.

В контексте данного документа «антиген» в широком смысле относится к молекуле или части молекулы, которая может связываться антителом, которая дополнительно способна индуцировать выработку у животного антитела, способного связывать эпитоп этого антигена. Антиген может иметь один эпитоп или иметь более одного эпитопа. Специфическая реакция, упоминаемая в данном документе, свидетельствует о том, что антиген будет вступать в реакцию, с высокой избирательностью, с соответствующим антителом, а не с многочисленными другими антителами, которые могут быть индуцированы другими антигенами. В случае необходимости усиленного иммунного ответа на конкретные представляющие интерес антигены, антигены включают, но не ограничиваются этим: антигены инфекционных заболеваний, в отношении которых может возникать защитный иммунный ответ, в качестве примера.

В контексте данного документа «антигенпрезентирующая клетка» в широком смысле относится к профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (например, В-лимфоцитам, моноцитам, дендритным клеткам и клеткам Лангерганса), а также к другим антигенпрезентирующим клеткам (например, кератиноцитам, эндотелиальным клеткам, астроцитам, фибробластам и олигодендроцитам).

В контексте данного документа «антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты» в широком смысле относится к нуклеотидной последовательности, которая является комплементарной «смысловой» нуклеиновой кислоте, кодирующей белок (например, комплементарной кодирующей цепи двухцепочечной молекулы кДНК), комплементарной последовательности мРНК или комплементарной кодирующей цепи гена. Соответственно, антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот могут образовывать водородные связи со смысловыми молекулами нуклеиновых кислот.

В контексте данного документа «апоптоз» в широком смысле относится к запрограммированной гибели клеток, которую можно охарактеризовать с помощью известных в данной области техники методик. Апоптотическая гибель клеток может характеризоваться сжатием клетки, пузырением мембраны и конденсацией хроматина, приводящей к фрагментации клетки. Клетки, подвергающиеся апоптозу, также демонстрируют характерный профиль межнуклеосомного расщепления ДНК.

В контексте данного документа «аутоиммунность» или «аутоиммунное заболевание или патологическое состояние» в широком смысле относится к заболеванию или нарушению, возникающему из собственных тканей индивида и направленному против них, или к их косегрегации или проявлениям, или к вытекающим из них патологическим состояниям. В данном документе аутоиммунные патологические состояния включают воспалительные или аллергические патологические состояния, например, хронические заболевания, характеризуемые иммунной реакцией организма-хозяина против собственных антигенов, связанной с разрушением тканей, такие как ревматоидный артрит.

В контексте данного документа «B-клеточный рецептор (ВКР)» в широком смысле относится к комплексу между мембранным Ig (mIg) и другими трансмембранными полипептидами (например, IgA и Ig), находящимися на B-клетках. Функция передачи сигнала mlg инициируется перекрестным связыванием рецепторных молекул олигомерными или мультимерными антигенами. В-клетки также могут активироваться антителами против иммуноглобулинов. После активации ВКР в В-клетках происходят многочисленные изменения, включая фосфорилирование тирозина.

В контексте данного документа «рак» в широком смысле относится к любому неопластическому заболеванию (инвазивному или метастатическому), характеризуемому аномальным и неконтролируемым делением клеток, вызывающим злокачественный рост или опухоль (например, нерегулируемый рост клеток). В контексте данного документа термин «рак» или «раковый» следует понимать, как включающий любое неопластическое заболевание (инвазивное или метастатическое), характеризуемое аномальным и неконтролируемым делением клеток, вызывающим злокачественный рост или опухоль, неограничивающие примеры которых описаны в данном документе. Он включает физиологическое состояние млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака приведены в рабочих примерах. Дополнительные раковые заболевания включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатокарциному и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая высокодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ) НХЛ; среднедифференцированную/фолликулярную НХЛ; среднедифференцированную диффузную НХЛ; низкодифференцированную иммунобластную НХЛ; низкодифференцированную лимфобластную НХЛ; низкодифференцированную мелкоклеточную НХЛ с нерассеченными ядрами; НХЛ с массивной лимфаденопатией; мантийноклеточную лимфому; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; множественную миелому и посттрансплантационный лимфопролиферативный синдром (ПТЛС). Другие раковые заболевания, подлежащие лечению согласно данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфоидные злокачественные образования. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичника, меланому, плоскоклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатокарциному и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая высокодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ) НХЛ; среднедифференцированную/фолликулярную НХЛ; среднедифференцированную диффузную НХЛ; низкодифференцированную иммунобластную НХЛ; низкодифференцированную лимфобластную НХЛ; низкодифференцированную мелкоклеточную НХЛ с нерассеченными ядрами; НХЛ с массивной лимфаденопатией; мантийноклеточную лимфому; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационный лимфопролиферативный синдром (ПТЛС), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, отек (например, связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса. Предпочтительно рак выбран из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, колоректального рака, рака прямой кишки, немелкоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы (НХЛ), почечно-клеточного рака, рака предстательной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, саркомы мягких тканей, саркомы Капоши, карциноидной карциномы, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы и множественной миеломы. В типовом варианте реализации изобретения рак представляет собой ранний или распространенный (включая метастатический) рак мочевого пузыря, яичника или меланому. В другом варианте реализации изобретения рак представляет собой колоректальный рак. Раковые состояния, подлежащие лечению согласно изобретению, включают раковые заболевания, которые экспрессируют или не экспрессируют VISTA, и дополнительно включают неметастатические или неинвазивные, а также инвазивные или метастатические раковые заболевания, при этом экспрессия VISTA иммунными, стромальными или пораженными заболеванием клетками подавляет противоопухолевые ответы и противоинвазивные иммунные ответы. Способ согласно данному изобретению, в частности, подходит для лечения васкуляризированных опухолей. Раковые заболевания согласно изобретению включают раковые заболевания, которые экспрессируют или не экспрессируют VISTA, и дополнительно включают неметастатические или неинвазивные, а также инвазивные или метастатические раковые заболевания, при этом экспрессия VISTA иммунными, стромальными или пораженными заболеванием клетками подавляет противоопухолевые ответы и противоинвазивные иммунные ответы, и характерные для васкуляризированных опухолей.

В контексте данного документа «химерное антитело» в широком смысле относится к молекуле антитела, в которой константная область или ее часть изменена, замещена или заменена так, чтобы антигенсвязывающий участок (вариабельная область) был связан с константной областью молекулы другого или измененного класса, эффекторной функции и/или вида, или полностью отличной молекулой, которая придает химерному антителу новые свойства, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным соединением, а вариабельная область или ее часть изменена, замещена или заменена вариабельной областью, имеющей отличную или измененную антигенную специфичность.

В контексте данного документа «кодирующая область» в широком смысле относится к областям нуклеотидной последовательности, содержащим кодоны, которые транслируются в аминокислотные остатки, при этом термин «некодирующая область» относится к областям нуклеотидной последовательности, которые не транслируются в аминокислотные остатки (например, 5' и 3' нетранслируемые области).

В контексте данного документа термин «консервативно модифицированные варианты» применим как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям, и в отношении конкретных нуклеотидных последовательностей в широком смысле относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой заданный белок. «Молчащие вариации» представляют один из видов консервативно модифицированных вариаций нуклеиновых кислот. В данном документе каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы.

В контексте данного документа «определяющая комплементарность область», «гипервариабельная область» или «CDR» в широком смысле относится к одной или более гипервариабельным или определяющим комплементарность областям (CDR), находящимся в вариабельных областях легких или тяжелых цепей антитела. Смотрите Kabat, et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health, Bethesda, Md. Эти выражения включают гипервариабельные области, определенные в Kabat, et al. (1983) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, или гипервариабельные петли в 3-мерных структурах антител. Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости каркасными областями и вместе с CDR из другой цепи обеспечивают образование антигенсвязывающего участка. В пределах CDR есть выбранные аминокислоты, которые были определены как определяющие избирательность области (SDR), которые представляют важные контактные остатки, используемые CDR во взаимодействии антитело-антиген. (Kashmiri Methods 36: 25-34 (2005)).

В контексте данного документа «контрольное количество» в широком смысле относится к количеству маркера, которое может представлять любое количество или диапазон количественных значений, для сравнения с исследуемым количеством маркера. Например, контрольное количество маркера может представлять собой количество маркера в организме пациента с конкретным заболеванием или патологическим состоянием или человека без такого заболевания или патологического состояния. Контрольное количество может представлять как абсолютное количество (например, микрограмм/мл), так и относительное количество (например, относительная интенсивность сигналов).

В контексте данного документа «костимуляторный рецептор» в широком смысле относится к рецепторам, которые передают костимуляторный сигнал иммунной клетке, например, CD28 или ICOS. В контексте данного документа термин «ингибиторные рецепторы» включает рецепторы, которые передают отрицательный сигнал иммунной клетке, например, Т-клетке или NK-клетке.

В контексте данного документа «костимулировать» в широком смысле относится к способности костимуляторной молекулы обеспечивать второй, неактивирующий, опосредованный рецептором сигнал («костимуляторный сигнал»), который индуцирует пролиферацию или эффекторную функцию. Например, костимуляторный сигнал может приводить к секреции цитокинов (например, в Т-клетке, которая получила опосредованный Т-клеточным рецептором сигнал). Иммунные клетки, которые получили опосредованные клеточным рецептором сигнал (например, через активирующий рецептор), могут называться в данном документе «активированными иммунными клетками». В отношении Т-клеток передача костимуляторного сигнала Т-клетке включает сигнальный путь, который не ингибируется циклоспорином А. Кроме того, костимуляторный сигнал может индуцировать секрецию цитокинов (например, IL-2 и/или IL-10) в Т-клетке и/или может предотвращать индукцию невосприимчивости к антигену, индукцию анергии или индукцию гибели клеток в Т-клетке.

В данном документе «костимуляторный полипептид» или «костимуляторная молекула» относится к полипептиду, который после взаимодействия с молекулой клеточной поверхности на Т-клетках модулирует Т-клеточные ответы.

В контексте данного документа «костимуляторный сигнал» представляет сигнальную активность в результате взаимодействия между костимуляторными полипептидами на антигенпрезентирующих клетках и их рецепторами на Т-клетках во время антиген-специфических Т-клеточных ответов. Не ограничиваясь единственной гипотезой, считается, что антиген-специфический Т-клеточный ответ опосредован двумя сигналами: 1) привлечение Т-клеточного рецептора (ТКР) антигенным пептидом, представленным в контексте ГКГС (сигнал 1), и 2) второй антиген-независимый сигнал, доставляемый вследствие контакта между разными парами костимуляторный рецептор/лиганд (сигнал 2). Не ограничиваясь единственной гипотезой, считается, что этот «второй сигнал» является критическим при определении типа Т-клеточного ответа (активация или ингибирование), а также силы и длительности этого ответа, и регулируется как положительными, так и отрицательными сигналами от костимуляторных молекул, таких как семейство белков B7.

В данном документе полипептид «B7» означает представителя семейства белков B7, которые костимулируют Т-клетки, включая, но не ограничиваясь этим, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H5, B7-Hl, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-S3 и их биологически активные фрагменты и/или варианты. Типовые биологически активные фрагменты включают внеклеточный домен или фрагменты внеклеточного домена, которые костимулируют Т-клетки.

В контексте данного документа «цитоплазматический домен» в широком смысле относится к части белка, которая простирается в цитоплазму клетки.

В контексте данного документа «диагностика» в широком смысле относится к определению наличия или природы патологического состояния. Способы диагностики отличаются по своей чувствительности и специфичности. «Чувствительность» диагностического анализа представляет процентное соотношение пораженных заболеванием индивидов, которые имеют положительный результат (процент «истинно положительных результатов»). Пораженные заболеванием индивиды, не выявленные в анализе, имеют «ложно положительные результаты». Субъекты, которые не поражены заболеванием и имеют отрицательный результат анализа, называются субъектами с «истинно отрицательными результатами». «Специфичность» диагностического анализа определяется как 1 минус уровень ложно положительных результатов, при этом уровень «ложно положительных результатов» определяется как доля не имеющих заболевание, которые дали положительный результат. Хотя конкретный диагностический способ может не обеспечивать определяющий диагноз патологического состояния, достаточно, чтобы способ обеспечивал положительный результат, которые помогает установить диагноз.

В контексте данного документа «диагностирование» или «способствование в постановке диагноза» в широком смысле относится к классификации заболевания или симптома и/или определению вероятности, что индивид имеет болезненное состояние (например, на основании отсутствия или наличия экспрессии VISTA и/или повышения или снижения экспрессии иммунными, стромальными и/или предположительно пораженными заболеванием клетками); определению тяжести заболевания, отслеживанию прогрессирования заболевания, прогнозированию результата заболевания и/или шансов на выздоровление. Термин «выявление» также может необязательно включать любое из вышеприведенного. На постановку диагноза заболевания в соответствии с данным изобретением может, в некоторых вариантах реализации, влиять определение уровня полинуклеотида или полипептида согласно данному изобретению в биологическом образце, полученном от субъекта, при этом определяемый уровень может коррелировать с предрасположенностью к заболеванию или с наличием или отсутствием заболевания. Следует отметить, что выражение «биологический образец, полученный от субъекта» также может необязательно включать образец, которые не был физически удален из организма субъекта.

В контексте данного документа «эффективное количество» в широком смысле относится к количеству соединения, антитела, антигена или клеток, которого при введении пациенту для лечения заболевания достаточно, чтобы обеспечить такое лечение заболевания. Эффективное количество может представлять собой количество, эффективное для профилактики, и/или количество, эффективное для предотвращения. Эффективное количество может представлять собой количество, эффективное для снижения, количество, эффективное для предотвращения появления признаков/симптомов, для снижения тяжести появления признаков/симптомов, для устранения появления признаков/симптомов, для замедления развития появления признаков/симптомов, для предотвращения развития появления признаков/симптомов и/или для обеспечения профилактики появления признаков/симптомов. «Эффективное количество» может варьироваться в зависимости от заболевания и его тяжести, а также возраста, массы, анамнеза, восприимчивости и предсуществующих патологических состояний подлежащего лечению пациента. В целях этого изобретения термин «эффективное количество» является синонимом термина «терапевтически эффективное количество».

В контексте данного документа «внеклеточный домен» или «ВКД» в широком смысле относится к части белка, которая простирается от поверхности клетки.

В контексте данного документа «экспрессионный вектор» в широком смысле относится к любой рекомбинантной экспрессионной системе для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению in vitro или in vivo, конститутивным или индуцибельным образом, в любой клетке, включая клетки прокариот, дрожжей, грибов, растений, насекомых или млекопитающих. Этот термин включает линейные или кольцевые экспрессионные системы. Этот термин включает экспрессионные системы, которые остаются эписомальными или интегрируются в геном клетки-хозяина. Экспрессионные систему могут иметь или не иметь способность к саморепликации, т.е. обуславливают только временную экспрессию в клетке. Этот термин включает рекомбинантные экспрессионные кассеты, которые содержат только минимальное количество элементов, необходимых для транскрипции рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

В контексте данного документа «семейство» в широком смысле относится к молекулам полипептидов и нуклеиновых кислот согласно изобретению и означает, что две или более молекул полипептидов и нуклеиновых кислот имеют общий структурный домен или мотив и имеют достаточную гомологию аминокислотной или нуклеотидной последовательности, как определено в данном документе. Представители семейства могут иметь природное или неприродное происхождение и могут принадлежать одному или разным видам. Например, семейство может содержать первый полипептид человеческого происхождения, а также другие, отличные полипептиды человеческого происхождения, или, в альтернативном варианте, может содержать гомологи нечеловеческого происхождения (например, обезьяньи полипептиды). Представители семейства также могут иметь общие функциональные характеристики.

В контексте данного документа «Fc-рецептор» (FcR) в широком смысле относится к рецепторам клеточной поверхности для Fc-части молекул иммуноглобулинов (Ig). Fc-рецепторы присутствуют на многих клетках, которые принимают участие в иммунных ответах. Среди человеческих FcR, которые были идентифицированы к настоящему времени, присутствуют те, которые распознают IgG (обозначаемые FcγR), IgE (FceRl), IgA (FcaR) и полимеризованный IgM/A (FcεμR). FcR присутствуют в следующих типах клеток: FceRI (тучные клетки), FceRII (многие лейкоциты), FcaR (нейтрофилы) и FcμR (железистый эпителий, гепатоциты). (Hogg Immunol. Today 9: 185-86 (1988)). Всесторонне изученные FcγR являются центральными в клеточной иммунной защите и отвечают за стимуляцию и высвобождение медиаторов воспаления и гидролитических ферментов, вовлеченных в патогенез аутоиммунных заболеваний. (Unkeless, Annu. Rev. Immunol. 6: 251-87 (1988)). FcγR обеспечивают важную связь между эффекторными клетками и лимфоцитами, которые секретируют Ig, так как FcγR макрофагов/моноцитов, полиморфноядерных лейкоцитов и естественных клеток-киллеров (NK) представляют элемент специфического распознавания, опосредованного IgG. Человеческие лейкоциты имеют по меньшей мере три разных типа FcγR для IgG: hFcγRI (CD64) (находящийся на моноцитах/макрофагах), hFcγRIIA или hFcγRIIB, (CD32 или CD32A) (находящийся на моноцитах, нейтрофилах, эозинофилах, тромбоцитах, возможно В-клетках и линии клеток K562) и FcγRlllA (CD16A) или FcγRlllB (CD16B) (находящийся на NK-клетках, нейтрофилах, эозинофилах и макрофагах).

В контексте данного документа «каркасная область» или «FR» в широком смысле относится к одной или более каркасным областям в пределах вариабельных областей легких или тяжелых цепей антитела. Смотрите Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987). Эти выражения включают области аминокислотной последовательности, расположенные между CDR в пределах вариабельных областей легкой и тяжелой цепей антитела.

В контексте данного документа «гетерологичный» в широком смысле относится к частям нуклеиновой кислоты и указывает на то, что нуклеиновая кислота содержит две или более подпоследовательности, которые не встречаются в природе в такой взаимосвязи. Например, как правило, рекомбинантным способом получают нуклеиновую кислоту, имеющую две или более последовательности из неродственных генов, расположенные так, чтобы составлять новую функциональную нуклеиновую кислоту (например, промотор из одного источника и кодирующая область из другого источника). Аналогично, выражение гетерологичный белок указывает, что белок содержит две или более подпоследовательности, которые не встречаются в природе в такой взаимосвязи (например, слитый белок).

В контексте данного документа выражение «высокая аффинность» в широком смысле относится к антителу или слитому белку, имеющему КД в отношении антигена-мишени или рецептора, составляющую по меньшей мере 10^-6 M, более предпочтительно 10^-7 M, еще предпочтительнее по меньшей мере 10^-8 M и даже предпочтительнее по меньшей мере 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M или 10^-12 M. В данном документе выражение «высокая аффинность» в отношении антитела IgG или слитого белка, относится к антителу, имеющему КД в отношении антигена-мишени или рецептора, составляющую 10^-6 M или менее, более предпочтительно 10^-7 M или менее, предпочтительно 10^-8 M или менее, более предпочтительно 10^-9 M или менее и даже предпочтительнее 10^-10 M, 10 ^-11 M или 10^-12 M или менее. Конкретно в отношении антител связывание с «высокой аффинностью» может варьироваться для разных изотипов антител. Например, связывание с «высокой аффинностью» для изотипа IgM относится к антителу, имеющему К_Д, составляющую 10^-7 M или менее, более предпочтительно 10^-8 M или менее.

В контексте данного документа «гомология» в широком смысле относится к степени сходства между последовательностью нуклеиновой кислоты и эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты или между полипептидной последовательностью и эталонной полипептидной последовательностью. Гомология может быть частичной или полной. Полная гомология указывает на то, что нуклеотидные или аминокислотные последовательности являются идентичными. Частично гомологичная нуклеотидная или аминокислотная последовательность является такой, которая не идентична эталонной нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Степень гомологии можно определить путем сравнения последовательностей, например, с помощью программного обеспечения BlastP от Национального центра биотехнологической информации (NCBI - от англ. «National Center of Biotechnology Information»), используя параметры по умолчанию. Термин «идентичность последовательности» может взаимозаменяемо использоваться с «гомологией».

В контексте данного документа «клетка-хозяин» в широком смысле относится к клетке, в которую была внесена молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, такая как рекомбинантный экспрессионный вектор согласно изобретению. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками (например, E. Coli) или эукариотическими клетками, такими как клетки дрожжей, насекомых (например, SF9), амфибий или млекопитающих, такие как CHO, HeLa, HEK-293, например, культивируемые клетки, эксплантаты и клетки in vivo. Термины «клетка-хозяин» и «рекомбинантная клетка-хозяин» взаимозаменяемо используются в данном документе. Следует понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клетке субъекта, но также к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Так как в последующих поколения могут возникать некоторые модификации вследствие мутации или влияния окружающей среды, потомство может не быть в действительности идентичным родительской клетке, но все рано включено в объем используемого в данном документе термина.

«Человеческое моноклональное антитело» относится к антителам, демонстрирующим единичную специфичность связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные области, так и CDR, получены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В одном варианте реализации изобретения человеческое моноклональные антитела вырабатываются гибридомой, которая включает в себя В-клетки, полученные от трансгенного отличного от человека животного, например, от трансгенной мыши, имеющего геном, содержащий трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитые с иммортализованной клеткой. Они включают полностью человеческое моноклональные антитела и их конъюгаты и варианты, например, которые связаны с эффекторными агентами, такими как терапевтические или диагностические агенты.

В контексте данного документа «гуманизированное антитело» в широком смысле относится к антителам, вырабатываемым нечеловеческой клеткой, имеющим вариабельные и константные области, которые были изменены так, чтобы больше походить на антитела, которые вырабатывались бы человеческой клеткой. Например, путем изменения аминокислотной последовательности нечеловеческого антитела так, чтобы оно включала в себя аминокислоты, которые встречаются в последовательностях иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Гуманизированные антитела согласно изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина человеческой зародышевой линии (например, мутации, внесенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например, в CDR. В контексте данного документа термин «гуманизированное антитело» также включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, например, мыши, были привиты в человеческие каркасные последовательности.

В контексте данного документа «гибридизация» в широком смысле относится к физическому взаимодействию комплементарных (включая частично комплементарные) полинуклеотидных цепей путем образования водородных связей между комплементарными нуклеотидами, когда цепи расположены антипараллельно друг другу.

В контексте данного документа «домен IgV» и «домен IgC» в широком смысле относятся к доменам представителей суперсемейства Ig. Эти домены соответствуют структурным единицам, которые имеют разные профили укладки, называемые Ig-укладкой. Ig-укладка состоит из «сандвича» из двух складчатых β-слоев, каждый из которых состоит из антипараллельных β-цепей из 5-10 аминокислот, с консервативной дисульфидной связью между двумя складчатыми слоями в большинстве, но не во всех доменах. IgC-домены Ig, ТКР и молекул ГКГС имеют одинаковый тип конструкции последовательности и называются CI-группой в рамках суперсемейства Ig. Другие IgC-домены относятся к другим группам. IgV-домены также имеют одинаковую конструкцию последовательности и называются доменами V-группы. IgV-домены длиннее С-доменов и образуют дополнительную пару β-цепей.

В контексте данного документа «иммунная клетка» в широком смысле относится к клеткам, которые имеют гемопоэтическое происхождение и играют роль в иммунном ответе. Иммунные клетки включают, но не ограничиваются этим, лимфоциты, такие как В-клетки и Т-клетки; естественные клетки-киллеры; дендритные клетки и миелоидные клетки, такие как моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и гранулоциты.

В контексте данного документа «иммуноанализ» в широком смысле относится к анализу, в котором используется антитело для специфического связывания антигена. Иммуноанализ может характеризоваться использованием специфических связывающих свойств конкретного антитела для выделения и/или количественной оценки антигена или нацеливания на него.

В контексте данного документа термин «иммунное заболевание (или нарушение или патологическое состояние)» следует понимать как включающий любое заболевание, нарушение или патологическое состояние, выбранное из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, аутоиммунные заболевания, воспалительные нарушения и иммунные нарушения, связанные с отторжением трансплантата, такие как острое и хроническое отторжение при трансплантации органов, трансплантации аллогенных стволовых клеток, трансплантации аутологичных стволовых клеток, трансплантации костного мозга и реакции «трансплантат против хозяина».

В контексте данного документа «иммунный ответ» в широком смысле относится к опосредованным Т-клетками и/или опосредованным В-клетками иммунным ответам, на которые влияет модуляция костимуляции Т-клеток. Типовые иммунные ответы включают В-клеточные ответы (например, выработку антител), Т-клеточные ответы (например, выработку цитокинов и клеточную цитотоксичность) и активацию восприимчивых к цитокинам клеток, например, макрофагов. В контексте данного документа термин «понижающая модуляция» в отношении иммунного ответа включает снижение одного или более иммунных ответов, тогда как термин «повышающая модуляция» в отношении иммунного ответа включает повышение одного или более иммунных ответов. Следует понимать, что повышающая модуляция одного типа иммунного ответа может приводить к соответствующей понижающей модуляции другого типа иммунного ответа. Например, повышающая модуляция выработки некоторых цитокинов (например, IL-10) может приводить к понижающей модуляции клеточных иммунных ответов.

В контексте данного документа «иммунологичный», «иммунологический» или «иммунный» ответ относится к развитию гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антиген-специфическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против пептида, у пациента-реципиента. Такой ответ может представлять собой активный ответ, индуцированный введением иммуногена, или пассивный ответ, индуцированный введением антитела или примированных Т-клеток. Не ограничиваясь единственной гипотезой, считается, что клеточный иммунный ответ вызван представлением полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами ГКГС класса I или класса II для активации антиген-специфических хелперных Т-клеток CD4⁺ и/или цитотоксических Т-клеток CD8⁺ соответственно. Ответ также может включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток, базофилов, дендритных клеток, астроцитов, клеток микроглии, эозинофилов, активацию или вовлечение нейтрофилов или других компонентов врожденного иммунитета. Наличие клеточноопосредованного иммунологического ответа можно определить с помощью анализа пролиферации (Т-клеток CD4⁺) или ЦТЛ (цитотоксических Т-лимфоцитов). Относительный вклад гуморального и клеточного ответа в защитный или терапевтический эффект иммуногена можно определить путем отдельного выделения антител и Т-клеток из организма иммунизированного сингенного животного и определения защитного или терапевтического эффекта у второго субъекта.

«Иммуногенный агент» или «иммуноген» представляет собой компонент, способный индуцировать иммунологический ответ против самого себя после введения млекопитающему, необязательно, в сочетании с адъювантом.

Взаимозаменяемо используемые в данном документе термины «воспалительные нарушения», «воспалительные патологические состояния» и/или «воспаление» в широком смысле относятся к хроническим или острым воспалительным заболеваниям и явным образом включают воспалительные аутоиммунные заболевания и воспалительные аллергические состояния. В качестве примера эти патологические состояния включают воспалительные аномалии, характеризуемые нарушением регуляции иммунного ответа на вредоносные стимулы, такие как патогены, поврежденные клетки или раздражители. Воспалительные нарушения лежат в основе множества заболеваний человека. Неиммунные заболевания с этиологическим происхождением от воспалительных процессов включают рак, атеросклероз и ишемическую болезнь сердца. Примеры нарушений, связанных с воспалением, включают: хронический простатит, гломерулонефрит, гиперчувствительность, воспалительное заболевание тазовых органов, реперфузионное повреждение, саркоидоз, васкулит, интерстициальный цистит, нормокомплементемический уртикарный васкулит, перикардит, миозит, антисинтетазный синдром, склерит, синдром активации макрофагов, синдром Бехчета, синдром PAPA, Синдром Блау, подагру, взрослую и юношескую болезнь Стилла, криропиринопатию, синдром Макла-Уэльса, наследственный индуцированных холодом аутовоспалительный синдром, мультисистемное воспалительное заболевание с началом в раннем детском возрасте, семейную средиземноморскую лихорадку, хронический младенческий неврологический кожно-артикулярный синдром, системный юношеский идиопатический артрит, синдром гиперпродукции IgD, синдром Шницлера, ассоциированный с рецепторами TNF периодический синдром (TRAPSP), гингивит, периодонтит, гепатит, цирроз, панкреатит, миокардит, васкулит, гастрит, подагру, подагрический артрит и воспалительные заболевания кожи, выбранные из группы, состоящей из псориаза, атопического дерматита, экземы, красных угрей, крапивницы и акне.

В контексте данного документа «ингибиторный сигнал» в широком смысле относится к сигналу, переносимому через ингибиторную рецепторную молекулу к иммунной клетке. Сигнал антагонизирует сигнал через активирующий рецептор (например, через ТКР, CD3, ВКР или молекулу Fc) и может приводить, например, к ингибированию: генерации второго мессенджера; пролиферации; или эффекторной функции в иммунной клетке, например, снижению фагоцитоза, выработки антител или клеточной цитотоксичности, или неспособности иммунной клетки вырабатывать медиаторы (например, цитокины (например, IL-2) и/или медиаторы аллергических ответов); или к развитию анергии.

В контексте данного документа «выделенный» в широком смысле относится к материалу, удаленному из его естественного окружения в котором он находится в природе, который, таким образом, изменен руками человека относительно его природного окружения, и включает «рекомбинантные» полипептиды. Выделенный материал может представлять собой, например, экзогенную нуклеиновую кислоту, включенную в векторную систему, экзогенную нуклеиновую кислоту, находящуюся в клетке-хозяине, или любой материал, который был удален из его естественного окружения и, таким образом, изменен руками человека (например, «выделенное антитело»). Например, в контексте данного документа «выделенный» или «очищенный» в широком смысле относится к белку, ДНК, антителу, РНК или их биологически активной части, которые по существу не содержат клеточный материал или другие примесные белки из клеточного или тканевого источника, из которого было получено биологическое вещество, или по существу не содержат химические вещества-предшественники или другие химические вещества в случае химического синтеза. В контексте данного документа термин «выделенный» относится к представляющему интерес соединению (например, полинуклеотиду или полипептиду), которое находится в окружении, отличном от того, в котором соединение встречается в природе, например, выделенному из его природной среды, например, путем концентрирования пептида до концентрации, в которой он не встречается в природе. Термин «выделенный» включает соединения, находящиеся в образцах, которые по существу обогащены в отношении представляющего интерес соединения, и/или в которых представляющее интерес соединение является частично или по существу очищенным.

Подразумевается, что в контексте данного документа «выделенное антитело» относится к антителу, которое по существу свободно от других антител, имеющих отличную антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывает VISTA, по существу свободно от антител, которые специфически связывают антигены, отличные от VISTA). Кроме того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.

В контексте данного документа «изотип» относится к классу антител (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.

В контексте данного документа «K-асс.» или «Ka» в широком смысле относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин «K-дисс.» или «Kд» относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген

Подразумевается, что в контексте данного документа термин «К_Д» относится к константе диссоциации, которую получают из соотношения Kд к Ka (т.е. Kд/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (M). Значения КД для антител можно определять способами, хорошо известным в данной области техники, такими как плазмонный резонанс (BIAcore®), ИФА и KINEXA. Предпочтительным способом определения КД антитела является метод поверхностного плазмонного резонанса, предпочтительно с применением биосенсорной системы, такой как BIAcore®, или метод ИФА. Как правило, эти методы осуществляют при температуре 25° или 37°C. Антитела для терапевтического применения в общем случае будут иметь КД по определению методом поверхностного плазмонного резонанса, составляющую 50 нМ или менее, или, как правило, 1 нМ или менее при 25° или 37°C.

В контексте данного документа «метка» или «выявляемое соединение» в широком смысле относится к композиции, выявляемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, химическими или другими физическими средствами.

В контексте данного документа условия «низкой жесткости», «средней жесткости», «высокой жесткости» или «очень высокой жесткости» в широком смысле относятся к условиям гибридизации и промывки нуклеиновых кислот. Руководство по проведению реакций гибридизации можно найти в Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology (5th Ed.) John Wiley & Sons, NY (2002). Типовые конкретные условия гибридизации включают, но не ограничиваются этим: (1) условия гибридизации низкой жесткости в 6 X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при около 45°C с последующими двумя промывками в 0,2XSSC, 0,1% ДСН при по меньшей мере 50°C. (Температуру промывки можно повышать до 55°C для условий низкой жесткости); (2) условия гибридизации средней жесткости в 6XSSC при около 45°C с последующей одной или более промывками в 0,2X SSC, 0,1% ДСН при 60°C. ; (3) условия гибридизации высокой жесткости в 6XSSC при около 45°C с последующей одной или более промывками в 0,2X SSC, 0,1% ДСН при 65°C.; и (4) условия гибридизации очень высокой жесткости представляют собой 0,5M фосфата натрия, 7% ДСН при 65°C с последующей одной или более промывками при 0,2XSSC, и 1% ДСН при 65°C.

В контексте данного документа «млекопитающее» в широком смысле относится к любым теплокровным позвоночным животным класса млекопитающих, включая человека, для которых характерен волосяной покров кожи и, в случае самок, наличие вырабатывающих молоко молочных желез для выкармливания молодняка. Примеры млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, альпака, броненосцев, капибар, кошек, верблюдов, шимпанзе, шиншилл, крупный рогатый скот, собак, коз, горилл, хомяков, лошадей, людей, лемуров, лам, мышей, отличных от человека приматов, свиней, крыс, овец, землероек, белок, тапиров и полевок. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, виды бычьих, собачьих, лошадиных, кошачьих, мышиных, овечьих, свиных, приматов и грызунов. Млекопитающие также включают любых и всех животных, перечисленных в списке видов млекопитающих мира, которые ведет Национальный музей естественной истории Смитсонианского института в округе Вашингтон.

«Мультиспецифическое антитело» относится к антителу с 2 или более антигенсвязывающими областями. Этот термин включает биспецифические антитела. Эти антигенсвязывающие области могут связываться с разными антигенами или с разными эпитопами одного антигена.

В контексте данного документа «молекула нуклеиновой кислоты природного происхождения» в широком смысле относится к молекуле РНК или ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок).

В контексте данного документа «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновой кислоты» в широком смысле относится к олигонуклеотиду дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида в одно- или двухцепочечной форме. Этот термин включает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Этот термин также включает подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическими остовами. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также явным образом включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явным образом указанную последовательность. Термин нуклеиновая кислота взаимозаменяемо используется с геном, кДНК, мРНК, олигонуклеотидом и полинуклеотидом.

В контексте данного документа «функционально связанный» в широком смысле относится к ситуации, когда два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в одной рамке считывания.

В контексте данного документа «паратоп» в широком смысле относится к части антитела, которая распознает антиген (например, антигенсвязывающему участку антитела). Паратопы могут представлять собой небольшую область (например, 15-22 аминокислоты) Fv-области антитела и могут содержать части тяжелой и легкой цепей антитела. Смотрите Goldsby, et al. Antigens (Chapter 3) Immunology (5th Ed.) New York: W. H. Freeman and Company, страницы 57-75.

Термины «пациент», или «субъект», или «реципиент», «индивид» или «проходящий лечение индивид» взаимозаменяемо используются в данном документе и в широком смысле относятся к любому животному, которое нуждается в лечении для облегчения болезненного состояния или для предотвращения появления или повторного появления болезненного состояния. Также в контексте данного документе «пациент» в широком смысле относится к любому животному, имеющему факторы риска, анамнез заболевания, восприимчивость, симптомы и признаки, у которого ранее диагностировали заболевание, которое подвержено риску или является представителем популяции пациентов в отношении заболевания. Пациент может представлять собой клинического пациента, такого как пациент-человек или ветеринарный пациент, такой как животное-компаньон, одомашненное, сельскохозяйственное, экзотическое или живущее в зоопарке животное.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и в широком смысле относятся к полимеру из аминокислотных остатков любой длины вне зависимости от модификации (например, фосфорилирования или гликозилирования). Эти термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков является аналогом или миметиком соответствующей аминокислоты природного происхождения, а также к аминокислотным полимерам природного происхождения. Эти термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков является искусственным химическим миметиком соответствующей аминокислоты природного происхождения, а также к аминокислотным полимерам природного происхождения и аминокислотным полимерам неприродного происхождения. Полипептиды могут быть модифицированы, например, путем добавления углеводных остатков для образования гликопротеинов. Термины «полипептид», «пептид» и «белок» явным образом включают гликопротеины, а также не-гликопротеины.

В контексте данного документа «промотор» в широком смысле относится к набору последовательностей нуклеиновых кислот, которые управляют транскрипцией нуклеиновой кислоты. В контексте данного документа промотор включает необходимые последовательности нуклеиновых кислот вблизи участка начала транскрипции, например, как в случае промотора полимеразы типа II, элемент TATA. Промотор также, необязательно, включает дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены более чем за несколько тысяч пар оснований от участка начала транскрипции. «Конститутивный» промотор представляет собой промотор, активный в большинстве условий внешней среды и развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, активный при наличии регуляции со стороны внешней среды и развития.

В контексте данного документа «профилактически эффективное количество» в широком смысле относится к количеству соединения, которого при введении пациенту для профилактики заболевания или предотвращения повторного появления заболевания достаточно для осуществления такой профилактики заболевания или его повторного появления. Профилактически эффективное количество может представлять собой количество, эффективное для предотвращения появления признаков и/или симптомов. «Профилактически эффективное количество» может варьироваться в зависимости от заболевания и его тяжести, а также возраста, массы, анамнеза, предрасположенности к патологическим состояниям, предсуществующих патологических состояний подлежащего лечению пациента.

«Профилактическая вакцина» и/или «профилактическая вакцинация» относятся к вакцине, применяемой для предотвращения заболевания или симптомов, связанных с заболеванием, таким как рак или инфекционное состояние.

В контексте данного документа «профилактика» в широком смысле относится к курсу терапии, когда признаки и/или симптомы отсутствуют у пациента, находятся в стадии ремиссии или присутствовали у пациента ранее. Профилактика включает предотвращение появления заболевания после лечения заболевания у пациента. Кроме того, предотвращение включает лечение пациентов, у которых потенциально может развиваться заболевание, в особенности пациентов, которые восприимчивы к заболеванию (например, представителей популяции пациентов, имеющих факторы риска или подверженных риску развития заболевания).

В контексте данного документа термин «рекомбинантный», употребляемый в широком смысле в отношении продукта, например, клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора, указывает, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы посредством внесения гетерологичных нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативных нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае экспрессируются на аномальном уровне, недоэкспрессируются или не экспрессируются вообще.

В контексте данного документа термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как (a) антитела, выделенные из организма животного (например, мыши), трансгенного или трансхромосомного в отношении генов иммуноглобулина человека, или полученной из них гибридомы (дополнительно описано ниже), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например, из трансфектомы, (c) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (d) антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека или других последовательностей ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные области, в которых каркасные области и CDR получены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В определенных вариантах реализации изобретения рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать in vitro мутагенезу (или в случае применения животного, трансгенного в отношении последовательностей Ig человека, in vivo соматическому мутагенезу) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хоть и получены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственны им, могут не существовать в природе в рамках репертуара антител человеческой зародышевой линии in vivo.

В контексте данного документа «сигнальная последовательность» или «сигнальный пептид» в широком смысле относится к пептиду, содержащему около 15 или более аминокислот, который находится в N-конце секреторных и мембраносвязанных полипептидов и который содержит большое число гидрофобных аминокислотных остатков. Например, сигнальная последовательность содержит по меньшей мере около 10-30 аминокислотных остатков, предпочтительно около 15-25 аминокислотных остатков, предпочтительнее около 18-20 аминокислотных остатков и даже предпочтительнее около 19 аминокислотных остатков, и имеет по меньшей мере около 35-65%, предпочтительно около 38-50% и предпочтительнее около 40-45% гидрофобных аминокислотных остатков (например, валин, лейцин, изолейцин или фенилаланин). «Сигнальная последовательность», также называемая в данной области техники «сигнальным пептидом», служит для направления полипептида, содержащего такую последовательность, к липидному бислою и отщепляется у секретированного полипептида.

В контексте данного документа термины «специфически (или избирательно) связывается» с антителом или «специфически (или избирательно) вступает в иммунную реакцию», или «специфически (или избирательно) взаимодействует или связывается» с белком или пептидом (или другим эпитопом) в широком смысле относятся, в некоторых вариантах реализации изобретения, к реакции связывания, которая определяет присутствие белка в гетерогенной популяции белков и других биологических компонентов. Например, в установленных условиях иммуноанализа указанные антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раз сильнее фонового связывания (неспецифического сигнала) и по существу не связываются в значительном количестве с другими белками, присутствующими в образце. Как правило, специфическая или избирательная реакция будет по меньшей мере вдвое превышать фоновый сигнал или шум и чаще в более чем около 10-100 раз превышать фон.

В контексте данного документа термины «специфически гибридизируемый» или «комплементарный» в широком смысле относятся к возможности нуклеиновой кислоты образовывать водородную (-ые) связь (-и) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты посредством традиционного Уотсон-Криковского спаривания или других нетрадиционных типов спаривания. Свободной энергии связывания молекулы нуклеиновой кислоты с ее комплементарной последовательностью достаточно, чтобы обеспечить продолжение выполнения релевантной функции нуклеиновой кислоты, например, активности РНКи. Определение свободной энергии связывания для молекул нуклеиновых кислот хорошо известно в данной области техники. (Смотрите, например, Turner, et al. CSH Symp. Quant. Biol. LII: 123-33 (1987); Frier, et al. PNAS 83: 9373-77 1986); Turner, et al. J. Am. Chem. Soc. 109:3783-85 (1987)). Процент комплементарности указывает процентное содержание смежных остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, Уотсон-Криковское спаривание оснований) со второй молекулой нуклеиновой кислоты (например, по меньшей мере около 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 являются по меньшей мере на около 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарными включительно). «Идеально комплементарный» или 100% комплементарность в широком смысле относится к образованию водородных связей между всеми смежными остатками последовательности нуклеиновой кислоты и таким же числом смежных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты.

«Существенная комплементарность» относится к полинуклеотидным цепям, демонстрирующим по меньшей мере около 90% комплементарности, за исключением областей полинуклеотидных цепей, таких как «липкие» концы, которые выбраны так, чтобы быть некомплементарными. Для специфического связывания требуется достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифического связывания олигомерного соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, в которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo анализа или терапевтического лечения или, в случае in vitro анализа, в условиях, в которых проводится анализ. Нецелевые последовательности, как правило, могут отличаться, по меньшей мере 5 нуклеотидами.

В контексте данного документа «признаки» заболевания в широком смысле относятся к любой аномалии, указывающей на наличие заболевания, обнаруживаемой при исследовании пациента; объективному показателю заболевания, в отличие от симптома, который является субъективным показателем заболевания.

В контексте данного документа «твердая подложка», «подложка» и «субстрат» в широком смысле относятся к любому материалу, который обеспечивает твердую или полутвердую структуру с возможностью присоединения другого материала, включая, но не ограничиваясь этим, гладкие подложки (например, металлические, стеклянные, пластиковые, силиконовые и керамические поверхности), а также текстурированные и пористые материалы.

В контексте данного документа «растворимый эктодомен (ЭКД)» или «эктодомен», или «растворимые белки/молекулы VISTA» VISTA означают не связанные с клеточной поверхностью молекулы VISTA или любые их части, включая, но не ограничиваясь этим: слитые белки VISTA или слитые белки ВКД VISTA-Ig, в которых внеклеточный домен VISTA или его фрагмент слит с компонентом иммуноглобулина (Ig), придающим слитой молекуле растворимость, или их фрагменты и производные, белки с внеклеточным доменом VISTA, слитым или соединенным с частью биологически активного или химически активного белка, такого как генный продукт папилломавируса E7, меланома-ассоциированный антиген p97 или оболочечный белок ВИЧ, или их фрагменты и производные; гибридные (химерные) слитые белки, такие как VISTA-Ig, или их фрагменты и производные. Такие слитые белки более подробно описаны ниже.

В данном документе «растворимые белки/молекулы VISTA» также включают молекулы VISTA с удаленными трансмембранными доменами для придания белку растворимости или их фрагменты и производные; их фрагменты, части или производные и растворимые мутантные молекулы VISTA. Растворимые молекулы VISTA, применяемые в способах в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, могут содержать или не содержать сигнальную (лидерную) последовательность.

В данном документе «субъект», «пациент» или «индивид» в контексте терапии или постановки диагноза включает любого человека или отличное от человека животное. Термин «отличное от человека животное» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не млекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д., т.е. любое существо, подходящее для лечения в соответствии с данным изобретением, включая, но не ограничиваясь этим, субъектов-птиц и субъектов-млекопитающих, и предпочтительно млекопитающих. Любой субъект-млекопитающее, нуждающийся в лечении в соответствии с данным изобретением, является подходящим. Субъектов-людей обоих полов и на любой стадии развития (т.е. новорожденных, детей грудного возраста, детей, подростков и взрослых) можно лечить в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение также можно осуществлять в отношении субъектов-животных, в частности, субъектов-млекопитающих, таких как мыши, крысы, собаки, кошки, крупный рогатый скот, козы, овцы и лошади, в ветеринарных целях, а также в целях скрининга лекарственных препаратов и разработки лекарственных препаратов. «Субъекты» взаимозаменяемо используются с «индивидами» и «пациентами».

В контексте данного документа выражение «по существу свободный от химических предшественников или других химических веществ» в широком смысле относится к препаратам белка VISTA, в которых белок отделен от химических предшественников или других химических веществ, которые участвуют в синтезе белка. В одном варианте реализации изобретения выражение «по существу свободный от химических предшественников или других химических веществ» включает препараты белка VISTA, имеющие менее чем около 30% (по сухой массе) химических предшественников или отличных от VISTA химических веществ, предпочтительнее менее чем около 20% химических предшественников или отличных от VISTA химических веществ, еще предпочтительнее менее чем около 10% химических предшественников или отличных от VISTA химических веществ и наиболее предпочтительно менее чем около 5% химических предшественников или отличных от VISTA химических веществ.

В контексте данного документа термин «симптомы» заболевания в широком смысле относится к любому болезненному явлению или отклонению от нормы в структуре, функции или ощущении, испытываемому пациентов и показательному для заболевания.

В контексте данного документа «Т-клетка» в широком смысле относится к Т-клеткам CD4+ и Т-клеткам CD8+. Термин Т-клетка также включает Т-хелперы 1 типа и Т-хелперы 2 типа.

В контексте данного документа термины «терапия», «терапевтический» или «лечение» в широком смысле относятся к лечению заболевания, прекращению или замедлению развития заболевания или его клинических симптомов и/или облегчению заболевания, что приводит к регрессии заболевания или его клинических симптомов. Терапия включает профилактику, лечение, исправление, снижение, уменьшение интенсивности и/или обеспечение облегчения заболевания, признаков и/или симптомов заболевания. Терапия включает уменьшение интенсивности признаков и/или симптомов у пациентов с имеющимися признаками и/или симптомами заболевания (например, воспалением, болью). Терапия также включает «профилактику». Термин «снижение» в контексте терапии в широком смысле относится к клинически значимому снижению в признаках и/или симптомах. Терапия включает лечение повторных или текущих признаков и/или симптомов (например, воспаления, боли). Терапия включает, но не ограничивается этим, предотвращение появления признаков и/или симптомов в любое время, а также снижение существующих признаков и/или симптомов и устранение существующих признаков и/или симптомов. Терапия включает лечение хронического заболевания («поддержка») и острого заболевания. Например, лечение включает лечение или предотвращение рецидивов или повторных появления признаков и/или симптомов (например, воспаления, боли).

В контексте данного документа «клетки Treg» (иногда также называемые супрессорными Т-клетками или индуцибельными клетками Treg или iTreg) относятся к субпопуляции Т-клеток, которые модулируют иммунную систему и поддерживают толерантность к собственным антигенам и могут подавлять аутоиммунные заболевания. Регуляторные Т-клетки Foxp3⁺ CD4⁺CD25⁺ (Treg) имеют критическое значение для поддержания периферической толерантности в нормальных условиях.

В контексте данного документа «трансмембранный домен» в широком смысле относится к аминокислотной последовательности длиной около 15 аминокислотных остатков, которая пересекает плазматическую мембрану. Предпочтительнее трансмембранный домен содержит по меньшей мере около 20, 25, 30, 35, 40 или 45 аминокислотных остатков и пересекает плазматическую мембрану. Трансмембранные домены богаты гидрофобными остатками и, как правило, имеют структуру а-спирали. В одном варианте реализации изобретения по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более аминокислот трансмембранного домена являются гидрофобными, например, лейцином, изолейцином, тирозином или триптофаном. Трансмембранные домены описаны, например, в Zagotta, et al. Annu. Rev. Neurosci. 19:235-263 (1996).

В контексте данного документа «трансгенное животное» в широком смысле относится к отличному от человека животному, предпочтительно млекопитающему, предпочтительнее к мыши, у которого одна или более клеток животного содержит «трансген». Термин «трансген» относится к экзогенной ДНК, интегрированной в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное, и которая остается в геноме зрелого животного, например, управляя экспрессией кодируемого генного продукта в одном или более типах клеток или тканей трансгенного животного.

В контексте данного документа «невосприимчивость» в широком смысле относится к устойчивости иммунных клеток к стимуляции, например, стимуляции посредством активирующего рецептора или цитокина. Невосприимчивость может возникать, например, вследствие воздействия иммуносупрессантов или высоких доз антигена.

В контексте данного документа «вариабельная область» или «VR» в широком смысле относится к доменам в рамках каждой пары легкой и тяжелой цепей в антителе, которые непосредственно вовлечены в связывание антитела с антигеном. Каждая тяжелая цепь имеет в одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует некоторое количество константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (V_L) в одном конце и константный домен в другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи.

В контексте данного документа «вектор» в широком смысле относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую молекулу нуклеиновой кислоты, с которой она была связана. Одним из типов вектора является «плазмида», которая относится к кольцевой петле двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они внесены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина после внесения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. В данном документе векторы называются «рекомбинантными экспрессионными векторами» или просто «экспрессионными векторами». В общем случае экспрессионные векторы, применимые в технологии рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В данном изобретении термины «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее часто применяемой формой вектора. При этом подразумевается, что изобретение включает другие формы экспрессионных векторов, такие как вирусные векторы (например, дефективные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Методики и процедуры в общем случае осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в общих и более специализированных литературных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данном описании. Смотрите, например, Sambrook, et al. Molec. Cloning: Lab. Manual [3rd Ed] Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Для синтеза рекомбинантных ДНК, олигонуклеотидов и тканевого культивирования, а также трансформации (например, электропорации, липофекции) можно использовать стандартные методики. Ферментативные реакции и методики очистки можно осуществлять в соответствии со спецификациями производителя или как обычно принято в данной области техники или описано в данном документе.

После определения некоторых терминов и выражений, используемых в данной заявке, антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител против VISTA, а также способы их получения и применения, которые входят в объем изобретения, дополнительно описаны ниже.

Данное изобретение относится к антителам и фрагментам антител, содержащим антигенсвязывающую область, которая связывается с содержащим V-домен Ig супрессором активации Т-клеток (VISTA). VISTA является регулятором контрольных точек, которые оказывает отрицательную супрессию на иммунные ответы. Смотрите Wang et al., "VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses," J. Exp. Med., 208(3) 577-92 (2011). Этот белок экспрессируется на подгруппах нормальных человеческих нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток. Кроме того, клетки яванских макаков экспрессируют VISTA образом, аналогичным нормальным человеческим клеткам. VISTA также экспрессируется в клетках периферической крови, например, раковых пациентов.

Связывание антагонистического антитела или фрагмента антитела против VISTA с VISTA в соответствии с изобретением будет антагонизировать по меньшей мере один эффект VISTA на иммунитет, тем самым подавляя супрессивный эффект VISTA на иммунитет, например, Т-клеточный иммунитет и/или экспрессию цитокинов. В противоположность этому, связывание агонистического антитела или фрагмента антитела против VISTA с VISTA в соответствии с изобретением будет агонизировать, инициировать или имитировать по меньшей мере один эффект VISTA на иммунитет, тем самым стимулируя по меньшей мере один супрессивный эффект VISTA на иммунитет, например, супрессию Т-клеточного иммунитета или супрессию экспрессии специфических провоспалительных цитокинов, или его стимулирующий эффект на экспрессию некоторых хемоатрактантов и хемокинов.

Как пример, такие фрагменты антител включают Fab-, F(ab')₂- и scFv-фрагменты антител. Эти антитела или фрагменты антител могут содержать константную область антитела или ее фрагмент или вариант. Такие антитела или фрагменты антител включают те, которые связываются с белками VISTA, экспрессируемыми на гемопоэтических и других клетках, например, миелоидных клетках и/или лимфоцитах, моноцитах, нейтрофилах, Т-клетках, естественных клетках-киллерах (NK), естественных Т-киллерах (NKT), опухолевых клетках и/или в опухолевом микроокружении (ОМО). Опухолевое микроокружение представляет собой клеточное окружение опухоли. Оно может включать окружающие иммунные клетки, фибробласты, кровяные сосуды, другие клетки, сигнальные молекулы и внеклеточный матрикс.

Антитела, которые блокируют или ингибируют эффект VISTA, можно использовать для усиления иммунных ответов человека, в частности, иммунных ответов на злокачественные образования и инфекцию. В противоположность этому, молекулы, которые агонизируют VISTA, такие как растворимый VISTA, например, VISTA-Ig и предложенные агонистические антитела против человеческого VISTA и их фрагменты, можно использовать для подавления нежелательных иммунных ответов человека, таких как аутоиммунные, аллергические, РТПХ, септические или нежелательные воспалительные иммунные ответы.

В представленной заявке предложены новые антагонистические и агонистические антитела против человеческого VISTA, включая содержащие такие же CDR, что и любое из антител против человеческого VISTA, имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4. Хотя до появления данного изобретения в литературе было описано большое число антагонистических антител против человеческого VISTA, об агонистических антителах или фрагментах антител против человеческого VISTA данных не было.

Как описано в экспериментальных примерах, которые приведены ниже, авторы изобретения изначально получили 2 химерных антитела против человеческого VISTA, полученные из мышиного антитела против человеческого VISTA (1E8, имеющее последовательности, приведенные на фиг. 4), которые соответственно содержат немодифицированные человеческие константные области IgG2 или константные области IgG2, в которых остаток цистеина в позиции 127 каппа цепи был заменен на остаток серина. Как показано в примерах и на фигурах, на которые ссылается данный документ, было обнаружено, что оба антитела агонизируют или имитируют эффект VISTA на иммунитет по меньшей мере на основании (i) их способности снижать экспрессию некоторых провоспалительных цитокинов, таких как IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухолей альфа (TNF-α), а также снижать экспрессию некоторых хемокинов или хемоатрактантов, таких как KC (кератиноцитарный хемокин) или MIP-2 (макрофагальный белок воспаления-2); (ii) подавлять активности Т-клеток в модели РТПХ; и (iii) подавлять CD3-зависимые Т-клеточные ответы.

Дополнительно после выделения этих 2 агонистических антител аналогичными способами было получено еще 10 химерных агонистических антител против человеческого VISTA, содержащих константные области или Fc-области человеческого IgG2. Эти антитела были получены из антител, называемых в данном документе GG8, VSTB95 (INX903), VSTB103 (INX904), VSTB53 (INX905), VSTB92 (INX908), VSTB50 (INX900), VSTB56 (INX901), VSTB63 (INX902), VSTB54 (INX906) и VSTB66 (INX907) (имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4).

В частности, эти химерные антитела против человеческого VISTA имеют вариабельные последовательности, приведенные на фиг. 4, и константные области человеческого IgG2. Как приведено в таблицах с обобщенными данными 1 и 2 ниже, при оценке с использованием сортировки антител было обнаружено, что эти антитела против человеческого VISTA связываются с 2 разными эпитопными группами, обозначенными группа 1 и группа 2. Как отмечено на фиг. 4, эпитоп, соответствующий группе 2, включает в себя остатки в 2 разных пептидах, присутствующих в человеческом VISTA, т.е. NLTLLDSGL и VQTGKDAPSNC.

Как указано в таблицах 1 и 2 ниже, было обнаружено, что эти 12 разных антител против человеческого VISTA являются иммуносупрессивными по меньшей мере в одной модели иммуносупрессии и многие в нескольких моделях иммуносупрессии. В частности, было показано, что INX905, INX908, INX901, INX902 и INX906 являются иммуносупрессивными в 2 разных аналитических форматах. Хотя все эти антитела были иммуносупрессивными и инициировали, стимулировали или агонизировали иммуносупрессивный эффект VISTA, INX901, INX902 и INX906 и INX908 оказались наиболее иммуносупрессивными.

Также другие химерные антитела против человеческого VISTA, содержащие константные домены человеческого IgG2, содержащие вариабельные последовательности других антител против VISTA, приведенные на фиг. 4, подлежат скринингу в отношении их иммуносупрессивных свойств и их способности агонизировать или имитировать иммуносупрессивное и другие эффекты человеческого VISTA. На основании полученных на сегодняшний день результатов этот скрининг должен позволить идентифицировать другие агонистические антитела против человеческого VISTA, в частности те, которые связывают тот же самый эпитоп. Кроме того, было показано, что агонистические антитела против человеческого VISTA в соответствии с изобретением являются эффективными (иммуносупрессивными) во многих животных моделях аутоиммунных и воспалительных заболеваний, включая животные модели артрита, волчанки или СКВ, РТПХ, воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) или колита, хронического или острого инфекционного заболевания или гепатотоксичности и псориаза. На основании этих данных можно предположить, что собственные агонистические антитела субъекта против человеческого VISTA должны хорошо подходить при терапевтическом и профилактическом лечении аутоиммунных, аллергических и воспалительных состояний.

Как отмечалось, было показано, что химерные антитела против человеческого VISTA на основе IgG2, имеющие последовательности, приведенные на фиг. 4, являются иммуносупрессивными в разных моделях иммуносупрессии. Кроме того, эти антитела инициируют этот иммуносупрессивный эффект специфическим иммуномодулирующим образом, а не вызывая истощение конкретных типов Т-клеток или посредством истощения Т-клеток в целом.

Как дополнительно показано в примерах, химерные агонистические антитела против человеческого VISTA на основе IgG2, содержащие мутацию в шарнирной области, инициировали по существу такой же супрессивный эффект на иммунитет, т.е. оказалось, что мутация в константной области IgG2 не вызывала повышение супрессии в экспериментальных условиях исследования. Скорее, обе формы IgG2A и IgG2B и их смеси вызывали одинаковый иммуносупрессивный эффект. Кроме того, на основании экспериментов, описанных в примерах, может оказаться, что связывание FcγR может вносить свой вклад в агонистические свойства антител субъекта против человеческого VISTA. В частности, было обнаружено, что включение молчащих константных областей IgG2 устраняло иммуносупрессивные свойства исследуемых агонистических антител. На основании этих результатов предполагается, что один или более FcγR могут влиять на агонистические свойства этих антител и, в частности, предполагается, что связывание FcγRIIA (CD32 или CD32A) или FcγRIIB (CD32B) может быть вовлечено в агонистические свойства агонистических антител субъекта.

В случае применения таких же самых способов ожидается, что можно получать другие агонистические антитела против человеческого VISTA на основе IgG2, например, получаемые из антител против человеческого VISTA, имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4. Как было сказано, на сегодняшний день было получено 12 агонистических антител против человеческого VISTA, включая те, которые имеют последовательности, приведенные на фиг. 4. На основании этих результатов предполагается, что могут быть созданы другие агонистические антитела против человеческого VISTA, которые также окажутся иммуносупрессивными. Также предполагается, что могут быть созданы другие агонистические антитела против человеческого VISTA, которые связываются с тем же самым или перекрывающимся эпитопом и/или конкурируют с любым из антител, содержащих последовательности, приведенные на фиг. 4. В типовых вариантах реализации изобретения эти антитела будут связываться с эпитопом, соответствующим антителам группы 1 или группы 2 или будут конкурировать за связывание с человеческим VISTA с такими антителами.

Способы определения специфических эпитопов, связываемых антителом, известны в данной области техники. В рабочих примерах заявители описывают выявление эпитопа, связываемого большим количеством антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением. Таким образом, в типовых вариантах реализации изобретения агонистические антитела против человеческого VISTA в соответствии с изобретением будут содержать константные области IgG2 или их фрагменты А-формы, В-формы или их смеси. В типовых вариантах реализации изобретения эти антитела будут связываться с одним или более FcγR, например, они будут связываться с теми же FcγR, что и интактная или дикого типа Fc-область человеческого IgG2. В других типовых вариантах реализации изобретения антитело будет связываться с CD32 (CD32A и/или CD32B). Это может быть осуществлено с помощью константных областей IgG2 дикого типа или модифицированных, которые связываются с CD32 (CD32A и/или CD32B). Кроме того, агонистическое антитело может быть модифицировано так, чтобы включать другой полипептид, такой как другой Fc-полипептид или антигенсвязывающая область, который связывается с FcγR, такими как CD32A и/или CD32B.

Fc-области или константные области IgG2, содержащиеся в агонистических антителах против человеческого VISTA согласно изобретению, необязательно, могут быть модифицированы, например, с целью изменения эффекторной функции, например, изменения связывания FcR, связывания FcRN, связывания комплемента, гликозилирования и тому подобное. В частности, Fc-области или константные области IgG2, содержащиеся в агонистических антителах против человеческого VISTA согласно изобретению, необязательно, могут быть модифицированы путем замещения цистеина в позиции 27 или, дополнительно и необязательно, путем замещения другого остатка цистеина или других остатков, например, в шарнирной области, другой аминокислотой, например, серином. Другие потенциальные Fc-модификации описаны ниже.

Эти агонистические антитела к VISTA можно применять в лечении или предотвращении заболеваний или патологических состояний или для лечения или снижения, облегчения патологического эффекта, связанного с ними, например, воспаления, в лечении или предотвращении патологических состояний, при которых супрессия Т-клеточного иммунитета или экспрессии провоспалительных цитокинов и/или повышение экспрессии хемокинов и хемоатрактантов являются терапевтически или профилактически целесообразными. Эти патологические состояния включают, в частности, аутоиммунность, аллергию, воспалительные нарушения, сепсис, РТПХ и для ингибирования нежелательных Т-клеточных ответов против трансплантированных клеток, тканей или органов, таких как CAR-T-клетки или конструкции для генной терапии или содержащие их клетки.

Как указано, типовые патологические состояния, которые можно терапевтически или профилактически лечить, используя агонистическое антитело против человеческого VISTA согласно изобретению, включают аутоиммунные состояния, аллергические состояния, воспалительные состояния, РТПХ, трансплантацию и сепсис. Как указано, было показано, что агонистические антитела против человеческого VISTA согласно изобретению являются терапевтически эффективными и иммуносупрессивными в многочисленных животных моделях заболеваний, включая модели артрита, воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), волчанки, РТПХ, хронической или острой инфекции/гепатотоксичности и псориаза. Следовательно, антитела согласно изобретению должны хорошо подходить для применения в лечении патологических состояний, при которых существует терапевтическая необходимость в супрессии иммунитета, в особенности Т-клеточного иммунитета.

А. Применение агонистических или антагонистических антител против человеческого vista и их фрагментов в терапии и диагностике

Композиции, содержащие агонисты в соответствии с изобретением, можно применять для ингибирования Т-клеточного иммунитета и для лечения патологических состояний, при которых это терапевтически необходимо, таких как аутоиммунные, аллергические или воспалительные состояния. Эти композиции будут содержать количество агонистического антитела или фрагмента антитела в соответствии с изобретением, эффективное для подавления активации или пролиферации Т-клеток или экспрессии цитокинов или другого эффекта VISTA у нуждающегося в этом субъекта. Такие аутоиммунные, воспалительные и аллергические состояния включают, например, артритные состояния, такие как РА, псориатический артрит, псориаз, склеродерму, множественный склероз, волчанку, ВЗК, ИТП, диабет, РТПХ, саркоидоз, аллергическую астму, связанную с гепатитом гепатотоксичность и для ингибирования нежелательных Т-клеточных ответов против трансплантированных клеток, тканей или органов, таких как CAR-T-клетки или конструкции для генной терапии или содержащие их клетки, и тому подобное.

Конкретные патологические состояния, при которых антитела согласно изобретению можно применять одни или в сочетании с другими терапевтическими средствами, в особенности с другими иммуносупрессивными молекулами, включают следующие: синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), приобретенная атрофия селезенки, острый передний увеит, острый рассеянный энцефаломиелит (ОРЭМ), острый подагрический артрит, острый некротизирующий геморрагический лейкоэнцефалит, острый или хронический синусит, острый гнойный менингит (или другие воспалительные нарушения центральной нервной системы), острое серьезное воспаление, болезнь Аддисона, адреналит, сахарный диабет зрелого возраста (диабет типа II), идиопатический гипопаратиреоз зрелого возраста (ИГЗВ), агаммаглобулинемия, агранулоцитоз, васкулиты, включая васкулит, необязательно, васкулит крупных сосудов, необязательно, ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный (Такаясу) артрит, аллергические состояния, аллергический контактный дерматит, аллергический дерматит, аллергический гранулематозный ангиит, нарушения, связанные с аллергической гиперчувствительностью, аллергический неврит, аллергическая реакция, круговая алопеция, тотальная алопеция, синдром Альпорта, альвеолит, необязательно, аллергический альвеолит или фиброзный альвеолит, болезнь Альцгеймера, амилоидоз, амиотрофический боковой склероз (АБС; болезнь Лу Герига), нарушение, связанное с эозинофилами, необязательно, эозинофилия, анафилаксия, анкилозирующий спондилит, ангиэктазия, антителоопосредованный нефрит, анти-GBM/анти-TBM нефрит, опосредованные комплексами антиген-антитело заболевания, заболевание с образованием антител к клубочковой базальной мембране, синдром антифосфолипидных антител, антифосфолипидный синдром (АФС), афты, афтозный стоматит, апластическая анемия, аритмия, артериосклероз, артериосклеротические нарушения, артрит, необязательно, ревматоидный артрит, такой как острый артрит или хронический ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит, деформирующий артрит, аскаридоз, аспергиллома, эозинофильная гранулема, аспергиллез, аспермиогенез, астма, необязательно, бронхиальная астма или аутоиммунная астма, атаксия-телеангиэктазия, атаксический склероз, атеросклероз, аутизм, аутоиммунная ангиоэдема, аутоиммунная апластическая анемия, аутоиммунный атрофический гастрит, аутоиммунный диабет, аутоиммунное заболевание семенников и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, аутоиммунные нарушения, связанные с коллагеновой болезнью, аутоиммунная вегетативная дистония, аутоиммунная болезнь уха, необязательно, аутоиммунная болезнь внутреннего уха (АБВУ), аутоиммунные эндокринные заболевания, включая тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, аутоиммунный энтеропатический синдром, аутоиммунная гонадная недостаточность, аутоиммунная потеря слуха, аутоиммунный гемолиз, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное гепатологическое нарушение, аутоиммунная гиперлипидемия, аутоиммунный иммунодефицит, аутоиммунная болезнь внутреннего уха (АБВУ), аутоиммунный миокардит, аутоиммунная нейтропения, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунные полиэндокринопатии, аутоиммунный плюригландулярный синдром типа I, аутоиммунная ретинопатия, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (АТП), аутоиммунное заболевание щитовидной железы, аутоиммунная крапивница, опосредованные аутоиммунностью заболевания желудочно-кишечного тракта, аксональные и нейрональные невропатии, болезнь Бало, болезнь Бехчета, злокачественное наследственное и ишемически-реперфузионное повреждение, злокачественный лимфоцитарный ангиит, болезнь Бергера (нефропатия IgA-типа), легкое птицеводов, слепота, болезнь Бека, облитерирующий бронхиолит (не связанный с трансплантатом) и НСИП, бронхит, бронхопневмонический аспергиллез, синдром Брутона, буллезный пемфигоид, синдром Каплана, кардиомиопатия, кардиоваскулярная ишемия, синдром Кастлемана, целиакия, целиакия-спру (глютеновая энтеропатия), мозжечковая дегенерация, ишемия головного мозга и сопутствующая заболеванию васкуляризация, болезнь Шагаса, каналопатии, необязательно, эпилепсия, каналопатии ЦНС, хориоретинит, хориоидит, аутоиммунное гематологическое нарушение, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, хронический контактный дерматит, хроническая эозинофильная пневмония, синдром хронической усталости, хронический гепатит, хронический гиперчувствительный пневмонит, хронический воспалительный артрит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП), хроническое неустранимое воспаление, хронический кожно-слизистый кандидоз, хроническая невропатия, необязательно, полиневропатии IgM или IgM-опосредованная невропатия, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, хроническое воспалительное заболевание легких, Хронический рецидивирующий множественный остеомиелит (ХРМО), хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото) или подострый тиреоидит, синдром Черджа-Стросс, рубцующийся пемфигоид/доброкачественный пемфигоид слизистой оболочки, воспалительные нарушения ЦНС, васкулит ЦНС, целиакия, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, полипозный колит, колит, такой как язвенный колит, язвенный колит, коллагенозный колит, патологические состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответы, врожденная блокада сердца, врожденная краснуха, анемия с положительным тестом Кумбса, ишемическая болезнь сердца, миокардит Коксаки, CREST-синдром (кальциноз, феномен Рейно), болезнь Крона, криоглобулинемия, синдром Кушинга, циклит, необязательно, хронический циклит, гетерохронический циклит, иридоциклит или циклит Фукса, кистозный фиброз, цитокин-индуцированная токсичность, глухота, дегенеративный артрит, демиелинизирующие заболевания, необязательно, аутоиммунные демиелинизирующие заболевания, демиелинизирующие невропатии, лихорадка денге, герпетиформный дерматит и атопический дерматит, дерматит, включая контактный дерматит, дерматомиозит, дерматозы с острыми воспалительными компонентами, болезнь Девика (оптикомиелит), диабетическое нарушение крупных артерий, диабетическая нефропатия, диабетическая ретинопатия, анемия Даймонда-Блэкфана, диффузный интерстициальный фиброз легких, дилятационная кардиомиопатия, дискоидная волчанка, заболевания, включающие диапедез лейкоцитов, синдром Дресслера, контрактура Дюпюитрена, эховирусная инфекция, экзема, включая аллергическую или атопическую экзему, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и энцефалит с поражением лимбической системы и/или стволовой энцефалит, энцефаломиелит, необязательно, аллергический энцефаломиелит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), внутриартериальная гиперплазия, эндокардит, эндокринная офтальмопатия, эндометриоз, эндомиокардиальный фиброз, факоанафилактический эндофтальмит, эндофтальмит, аллергический энтерит, синдром эозинофилии-миалгии, эозинофильный фасциит, эпидемический кератоконъюнктивит, приобретенный буллезный эпидермолиз (ПБЭ), эписклера, эписклерит, инфекция вируса Эпштейна-Барр, стойкая возвышающаяся эритема, мультиформная эритема, узловатая лепрозная эритема, нодозная эритема, эритробластоз плода, пищеводная дискинезия, первичная криоглобулинемия смешанного типа, этмоидит, синдром Эвана, экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), дефицит фактора VIII, легкое фермера, ревматическая лихорадка, синдром Фелти, фибромиалгия, фиброзирующий альвеолит, филяриатоз, фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), пищевое отравление, фронтальная желудочная атрофия, гигантоклеточный артрит (височный артрит), гигантоклеточный гепатит, гигантоклеточная полимиалгия, гломерулонефриты, гломерулонефрит (ГН) с нефротическим синдромом или без него, такой как хронический или острый гломерулонефрит (например, первичный ГН), синдром Гудпасчера, подагрический артрит, синдромы, связанные с трансфузией гранулоцитов, гранулематоз, включая лимфоматоидный гранулематоз, гранулематоз с полиангиитом (ГПА), гранулематозный увеит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, каплевидный псориаз, пароксизмальная гемоглобинурия, болезнь Хаммена-Рича, болезнь Хашимото, энцефалит Хашимото, тиреоидит Хашимото, гемохроматоз, гемолитическая анемия или аутоиммунная гемолитическая анемия, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА), гемолитическая анемия, гемофилия A, пурпура Шенлейн-Геноха, гестационный герпес, инфекция вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), гипералгезия, гипогаммаглобулинемия, гипогонадизм, гипопаратиреоз, идиопатический несахарный диабет, идиопатический паралич лицевого нерва, идиопатический гипотериоз, идиопатическая нефропатия IgA-типа, идиопатический мембранозный ГН или идиопатическая мембранозная нефропатия, идиопатический нефритический синдром, идиопатический фиброз легких, идиопатическая спру, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), нефропатия IgA-типа, IgE-опосредованные заболевания, необязательно, анафилактический и аллергический или атопический ринит, IgG4-связанное склерозирующее заболевание, регионарный илеит, нефрит иммунных комплексов, иммунные ответы, связанные с острой и отложенной гиперчувствительностью, опосредованные цитокинами и Т-лимфоцитами, иммунно-опосредованный ГН, иммунорегуляторные липопротеины, включая острый респираторный дистресс-синдром взрослых (ОРДС), миозит с включенными тельцами, инфекционный артрит, бесплодность вследствие наличия антиспермальных антител, воспаление всей или части сосудистой оболочки глаза, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), воспалительные гиперпролиферативные заболевания кожи, воспалительная миопатия, инсулинозависимый диабет (типа 1), инсулит, интерстициальный цистит, интерстициальное заболевание легких, интерстициальный фиброз легких, ирит, ишемически-реперфузионное нарушение, воспаление суставов, ювенильный артрит, ювенильный дерматомиозит, ювенильный диабет, сахарный диабет (типа I) с началом в юношеском возрасте, включая педиатрический инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД), ревматоидный артрит с началом в юношеском возрасте, синдром Кавасаки, сухой кератоконъюнктивит, трипанозомоз, синдром Ламберта-Итона, лейшманиоз, проказа, лейкопения, нарушение адгезии лейкоцитов, лейкоцитокластический васкулит, лейкопения, красный плоский лишай, склеротический лишай, деревянистый конъюнктивит, IgA-зависимый линейный дерматоз, IgA-зависимое линейное заболевание (ЛАЗ), синдром Леффлера, волчаночный гепатит, волчанка (включая нефрит, церебрит, педиатрическую, непочечную, внепочечную, дискоидную, алопецию), волчанка (СКВ), диссеминированная красная волчанка, артрит Лайма, болезнь Лайма, лимфоидный интерстициальный пневмонит, малярия, мужское и женское аутоиммунное бесплодие, максиллярный, васкулит с поражением сосудов среднего диаметра (включая болезнь Кавасаки и нодозный полиартериит), мембрано- или мембранозный пролиферативный ГН (МПГН), включая тип I и тип II, и быстро прогрессирующий ГН, мембранозный ГН (мембранозная нефропатия), болезнь Меньера, менингит, микроскопический колит, микроскопический полиангиит, мигрень, нефропатия минимальных изменений, смешанная болезнь соединительной ткани (СБСТ), инфекционный мононуклеоз, язва Мурена, болезнь Мухи-Габерманна, мультифокальная двигательная невропатия, множественная эндокринная недостаточность, синдром полиорганной недостаточности, например, вторичный после септицемии, травмы или кровоизлияния, синдром полиорганной недостаточности, множественный склероз (МС), такой как спинооптикальный МС, множественный склероз, свинка, мышечные нарушения, миастения гравис, такая как связанная с тимомой миастения гравис, миастения гравис, миокардит, миозит, нарколепсия, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит, и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника, некротизирующий, кожный или гиперчувствительный васкулит, синдром неонатальной волчанки (НВ), нефроз, нефротический синдром, неврологическое заболевание, оптиконевромиелит (болезнь Девика), оптиконевромиелит, невромиотония, нейтропения, нераковый лимфоцитоз, негранулематозный увеит, незлокачественная тимома, глазные и орбитальные воспалительные нарушения, глазной рубцующийся пемфигоид, оофорит, симпатическая офтальмия, опсо-миоклональный синдром (ОМС), опсоклонус или опсо-миоклональный синдром (ОМС), и сенсорная невропатия, неврит зрительного нерва, гранулематозный орхит, остеоартрит, палиндромный ревматизм, панкреатит, панцитопения, PANDAS (педиатрические аутоиммунные невропсихиатрические нарушения, связанные со стрептококками), паранеопластическая мозжечковая дегенерация, паранеопластический синдром, паранеопластические синдромы, включая неврологические паранеопластические синдромы, необязательно, миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Итона-Ламберта, паразитические заболевания, такие как лейшмания, пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ), синдром Парри-Ромберга, парспланит (периферический увеит), синдром Персонейджа-Тернера, инфекция парвовируса, пемфигоид, такой как буллезный пемфигоид и кожный пемфигоид, пузырчатка (включая вульгарную пузырчатку), эритематозная пузырчатка, листовидная пузырчатка, пузырчатка слизистой оболочки, пузырчатка, пептическая язва, периодический паралич, периферическая невропатия, перивенозный энцефаломиелит, пернициозная анемия (аддисонова анемия), аддисонова анемия, факоантигенный увеит, пневмоцирроз, POEMS-синдром, нодозный полиартериит, типа I, II и III, первичный хронический полиартрит, полихондрия (например, рефрактерная или рецидивирующая полихондрия), полиэндокринное аутоиммунное заболевание, полиэндокринная недостаточность, полигландулярные синдромы, необязательно, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), ревматическая полимиалгия, полимиозит, полимиозит/дерматомиозит, полиневропатии, острый полирадикулит, посткардиотомный синдром, задний увеит или аутоиммунный увеит, постинфарктный синдром, посткардиотомный синдром, постстрептококковый нефрит, поствакцинальные синдромы, пресенильная деменция, первичный билиарный цирроз, первичный гипотиреоз, первичная идиопатическая микседема, первичный лимфоцитоз, который включает моноклональный В-клеточный лимфоцитоз, необязательно, доброкачественную моноклональную гаммапатию и моноклональную гаммапатию неясного значения, МГНЗ, первичная микседема, первичный прогрессирующий МС (ППМС) и возвратно-ремитирующий МС (ВРМС), первичный склерозирующий холангит, прогестероновый дерматит, прогрессирующий системный склероз, пролиферативный артрит, псориаз, такой как бляшковидный псориаз, псориаз, псориатический артрит, легочный альвеолярный протеиноз, эозинофильный инфильтрат легкого, истинная эритроцитарная анемия или аплазия (ИЭА), истинная эритроцитарная аплазия, гнойный или негнойный синусит, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, пиелит, гангренозная пиодермия, подострый тиреоидит, феномен Рейно, реактивный артрит, привычный выкидыш, сниженная реакция кровяного давления, симпатическая рефлекторная дистрофия, рефрактерная спру, болезнь или синдром Рейтера, рецидивирующий полихондрит, реперфузионное повреждение миокарда или других тканей, реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром, синдром усталых ног, ретинальная аутоиммунность, ретроперитонеальный фиброз, синдром Рейно, ревматические заболевания, ревматическая лихорадка, ревматизм, ревматоидный артрит, ревматоидный спондилит, инфекция вируса коревой краснухи, синдром Самптера, саркоидоз, шистосомоз, синдром Шмидта, заболевания, связанные с ТКИД и вирусом Эпштейна-Барр, склера, склерит, склеродактилия, склеродермия, необязательно, системная склеродермия, склерозирующий холангит, множественный склероз, склероз, такой как системный склероз, сенсоневральная потеря слуха, сероотрицательный спондилоартрит, синдром Шихана, синдром Шульмана, силикоз, синдром Шегрена, аутоиммунность, связанная со спермой и семенниками, сфеноидальный синусит, синдром Стивенса-Джонсона, синдром скованного человека (или мышечной скованности), подострый бактериальный эндокардит (ПБЭ), подострая кожная красная волчанка, внезапная потеря слуха, синдром Сусака, хорея Сиденгама, симпатическая офтальмия, системная красная волчанка (СКВ) или системная эритематозная волчанка, кожная СКВ, системный некротизирующий васкулит, АНЦА-ассоциированный васкулит, необязательно, васкулит или синдром Черджа-Стросс (СЧС), сухотка спинного мозга, артериит Такаясу, телеангиэктазия, темпоральный артериит/гигантоклеточный артериит, облитерирующий тромбангиит, тромбоцитопения, включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП) и аутоиммунную или иммунную тромбоцитопению, такую как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), включая хроническую или острую ИТП, тромбоцитопеническая пурпура (ТТП), тиреотоксикоз, повреждение ткани, синдром Толоса-Ханта, токсический эпидермальный некролиз, синдром токсического шока, трансфузионная реакция, транзиторная гипогаммаглобулинемия новорожденных, поперечный миелит, поперечный миелит, тропическая легочная эозинофилия, туберкулез, язвенный колит, недифференцированное заболевание соединительной ткани (НЗСТ), крапивница, необязательно, хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, увеит, передний увеит, увеоретинит, вальвулит, сосудистая дисфункция, васкулит, позвоночный артрит, везикулобуллезный дерматоз, витилиго, гранулематоз Вегенера (гранулематоз с полиангиитом (ГПА)), синдром Вискотта-Олдрича или Х-сцепленный гипер-IgM синдром.

В то же время композиции, содержащие антагонистические антитела к VISTA в соответствии с изобретением, можно применять для стимуляции Т-клеточного иммунитета и для лечения патологических состояний, при которых это является терапевтически целесообразным, таких как рак и инфекционные состояния, такие как вирусные, бактериальные, дрожжевые, грибковые, протозойные и паразитарные инфекции. Эти композиции будут содержать количество антагониста в соответствии с изобретением, эффективное для стимуляции активации или пролиферации Т-клеток или экспрессии цитокинов или другого эффекта VISTA у нуждающегося в этом субъекта. Такие раковые состояния включают, например, раки крови и твердые опухоли, такие как лейкозы, лимфомы, миелодиспластический синдром, миелома, рак легкого и другие виды рака, определенные в данном документе.

Следует понимать, что определенные в данном документе болезненные состояния являются типовыми и не исчерпывающими.

Представленные агонисты и антагонисты можно комбинировать с другими терапевтическими средствами, которые можно вводить в тех же самых или в отличных композициях, в одно и то же или в разное время. Например, представленные агонисты можно вводить согласно терапевтической схеме, которая включает введение агониста PD-1 или PD-L1, CTLA4-Ig, цитокина, агониста или антагониста цитокина или другого рецепторного агониста или антагониста.

Понижение регуляции иммунных ответов

Повышение регуляции или усиление ингибиторной функции полипептида VISTA можно использовать для понижения регуляции иммунных ответов. Понижение регуляции может иметь форму ингибирования или блокирования уже происходящего иммунного ответа или может включать предотвращение индукции иммунного ответа. Функции активированных иммунных клеток можно ингибировать посредством понижения регуляции ответов иммунных клеток или посредством индукции специфической анергии в иммунных клетках, или обоими путями. Например, агонистические антитела к VISTA могут связываться с полипептидом VISTA, который экспрессируется на различных иммунных клетках, и тем самым осуществлять понижающую модуляцию иммунного ответа. Это агонистическое антитело может быть моноспецифическим или мультиспецифическим, например, оно может включать биспецифическое антитело, такое как BiTE. Например, такое антитело может содержать антигенсвязывающий компонент VISTA и другой антигенсвязывающий компонент, например, который нацелен на рецептор клеточной поверхности на иммунной клетке, например, Т-клетке, В-клетке или миелоидной клетке. Такое антитело, помимо антигенсвязывающего участка VISTA, может содержать участок связывания, который связывается с В-клеточным антигенным рецептором, Т-клеточным антигенным рецептором или Fc- или другим рецептором, для нацеливания молекулы на конкретную клеточную популяцию. Выбор этого второго антигена для биспецифического антитела обеспечивает гибкость в выборе клеточной популяции, на которую проводится нацеливание. Агонистические антитела к VISTA, которые стимулируют или имитируют активность VISTA, могут усиливать взаимодействие VISTA с его природными партнерами по связыванию. Как описано в данном документе, другие активирующие или агонистические антитела к человеческому VISTA можно идентифицировать по их способности ингибировать активность или пролиферацию Т-клеток и/или на основании их иммуносупрессивного эффекта в in vitro моделях или моделях воспалительных, аллергических или аутоиммунных заболевания.

Для измерения клеточной пролиферации или эффекторной функции (например, выработки антител, выработки цитокинов, фагоцитоза) можно использовать большое число известных в данной области техники показателей клеточной активации. Способность исследуемого антитела агонизировать или стимулировать эффект человеческого VISTA и, следовательно, блокировать эту активацию, можно без труда определять, измеряя способность агента оказывать влияние на снижение измеряемой пролиферации или эффекторной функции. Соответственно, способность исследуемого антитела быть иммуносупрессивным и блокировать иммунную активацию можно определять, измеряя выработку цитокинов и/или пролиферацию при разных концентрациях антигена.

Можно индуцировать толерантность против конкретных антигенов посредством совместного введения антигена с агонистическим антителом к VISTA в соответствии с изобретением. Например, можно индуцировать толерантность к конкретным полипептидам. Иммунные ответы на аллергены или чужеродные полипептиды, иммунный ответ на которые является нежелательным, можно ингибировать. Например, у пациентов, которые получают фактор VIII, часто вырабатываются антитела к этому фактору свертывания крови. Совместное введение агонистического антитела к VISTA в соответствии с изобретением, которое стимулирует или имитирует активность VISTA или взаимодействие с его природным партнером по связыванию, с рекомбинантным фактором VIII может подавлять этот нежелательный иммунный ответ.

Агонистическое антитело к VISTA в соответствии с изобретением можно использовать в комбинации с другим агентом, который блокирует активность костимуляторных рецепторов на иммунной клетке или который агонизирует активность другого иммуносупрессивного рецептора или лиганда, экспрессируемого на иммунных клетках, чтобы осуществлять снижение силы иммунных ответов. Типовые молекулы включают: агонисты PD-1, PDL-1, растворимые формы CTLA-4, анти-B7-1 антитела, анти-B7-2 антитела, антагонистические антитела, нацеленные на один или более из LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7H3 и т.д., и/или агонистические антитела, нацеленные на один или более из CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 или ICOS, или их комбинации. Эти компоненты можно комбинировать в одной композиции или соединении, например, биспецифическое антитело, содержащее агонистическое антитело к VISTA в соответствии с изобретением, и дополнительно содержащее другое иммунное агонистическое антитело, или оно может содержать слитый полипептид, содержащий агонистическое антитело к VISTA в соответствии с изобретением, которое слито с другим иммуносупрессивным полипептидом или другим активным агентом. В альтернативном варианте эти компоненты можно вводить в виде отдельных или дискретных форм (одновременно или последовательно) в одной или разных композициях для осуществления понижающей регуляции опосредованных иммунными клетками иммунных ответов у субъекта.

Примеры специфических иммуноингибиторных молекул, которые можно комбинировать с агонистическими антителами к VISTA в соответствии с изобретением, включают антитела, которые блокируют костимуляторный сигнал (например, против CD28 или ICOS), антитела, которые активируют ингибиторный сигнал посредством CTLA4, и/или антитела против других маркеров иммунных клеток (например, против CD40, лиганда CD40 или цитокинов), слитые белки (например, CTLA4-Fc или PD-1-Fc) и иммуносупрессивные лекарственные препараты (например, рапамицин, циклоспорин A или FK506).

В дополнительном варианте реализации изобретения биспецифические антитела, содержащие агонистические антитела к VISTA в соответствии с изобретением, применимы для нацеливания на конкретную клеточную популяцию, например, с помощью маркера, характерного только для определенного типа клетки, например, В-лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток или клеток Лангерганса. Понижение регуляции иммунных ответов посредством активации активности VISTA или взаимодействий VISTA с иммунными клетками (и, таким образом, стимуляции отрицательной сигнальной функции VISTA) применимо при понижающей модуляции иммунного ответа, например, в случае трансплантации тканей, кожи и органов, при реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) или аллергиях, или при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях, таких как системная красная волчанка, ВЗК, РА, псориаз и множественный склероз. Например, блокирование функции иммунных клеток приводит к уменьшению разрушения ткани при трансплантации ткани. Как правило, в случае тканевых трансплантатов отторжение трансплантата инициируется посредством его распознавания как чужеродного иммунными клетками, за чем следуем иммунная реакция, которая разрушает трансплантат. Введение молекулы, которая стимулирует активность VISTA или взаимодействие VISTA с его природным (-и) партнером (-ами) по связыванию на иммунных клетках, одной или в сочетании с другим оказывающим понижающую модуляцию агентом, до или во время трансплантации может ингибировать генерацию костимуляторного сигнала. Кроме того, стимуляции активности VISTA также может быть достаточно для анергизации иммунных клеток, что, таким образом, индуцирует толерантность у субъекта.

Для достижения достаточной иммуносупрессии или толерантности при некоторых заболевания или у некоторых субъектов может быть необходимо блокировать костимуляторную функцию других молекул. Например, может существовать необходимость в блокировании функции B7-1 и B7-2 путем введения растворимой формы комбинации пептидов, имеющих активность каждого из этих антигенов, или блокирующих тел против этих антигенов (отдельно или вместе в одной композиции) до или во время трансплантации. В альтернативном варианте может существовать необходимость в стимуляции ингибиторной активности VISTA и дополнительном ингибировании костимуляторной активности B7-1 и/или B7-2.

Представленные агонистические антитела против человеческого VISTA в особенности применимы при лечении аутоиммунных заболеваний. Многие аутоиммунные нарушения являются результатом несоответствующей активации иммунных клеток, которые являются реактивными в отношении собственных тканей и которые стимулируют выработку цитокинов и аутоантител, вовлеченных в патологию этих заболеваний. Предотвращение активации аутореактивных иммунных клеток может снижать или устранять симптомы заболевания. Введение представленных агонистических антител против человеческого VISTA, которые стимулируют активность VISTA или взаимодействие VISTA с его природным (-и) партнером (-ами) по связыванию, может индуцировать антиген-специфическую толерантность аутореактивных иммунных клеток, что может приводить к долгосрочному облегчению заболевания. Кроме того, совместное введение агентов, которые блокируют костимуляцию иммунных клеток путем нарушения взаимодействий рецептор-лиганд молекул B7 с костимуляторными рецепторами можно применять при ингибировании активации иммунных клеток для предотвращения выработки аутоантител или цитокинов, которые могут быть вовлечены в процесс заболевания.

Понижение регуляции иммунного ответа посредством стимуляции активности VISTA или взаимодействия VISTA с его природным (-и) партнером (-ами) по связыванию с помощью представленных агонистических антител против человеческого VISTA также можно применять при лечении аутоиммунной атаки аутологичных тканей. Таким образом, можно облегчать или улучшать патологические состояния, вызванные или усугубленные аутоиммунной атакой (например, болезнь сердца, инфаркт миокарда или атеросклероз) путем повышения активности VISTA или взаимодействия VISTA с его природным партнером по связыванию. Следовательно, в объем этого изобретения входит модуляция патологических состояний, усугубленных аутоиммунной атакой, таких как аутоиммунные нарушения (а также патологические состояния, такие как болезнь сердца, инфаркт миокарда или атеросклероз), путем стимуляции активности VISTA или взаимодействия VISTA с его противорецептором с помощью представленных агонистических антител против человеческого VISTA.

Как было указано ранее, эффективность агонистических антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением в отношении предотвращения или облегчения аутоиммунных и воспалительных нарушений можно определять, используя большое число животных моделей аутоиммунных и воспалительных заболеваний человека с хорошо известными характеристиками. Примеры включают мышиный экспериментальный аутоиммунный энцефалит, системную красную волчанку у мышей MRL/lpr/lpr или гибридных мышей NZB, мышиный аутоиммунный коллаген-индуцированный артрит, сахарный диабет у мышей NOD и крыс BB и мышиную экспериментальную миастению гравис. Смотрите Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, страницы 840-856.

Ингибирование активации иммунных клеток дополнительно можно применять в терапевтических целях при лечении аллергий и аллергических реакций, например, путем ингибирования выработки IgE. Представленные агонистические антитела против человеческого VISTA, которые стимулируют или имитируют активность VISTA или взаимодействие VISTA с его природным (-и) партнером (-ами) по связыванию, можно вводить субъекту с аллергией для ингибирования опосредованных иммунными клетками аллергических реакций у субъекта. Стимуляцию активности VISTA или взаимодействия VISTA с его природным (-и) партнером (-ами) по связыванию можно сопровождать воздействием аллергена в сочетании с соответствующими молекулами ГКГС. По природе аллергические реакции могут быть системными или локальными в зависимости от пути попадания аллергена и профиля отложения IgE в тучных клетках или базофилах. Таким образом, опосредованные иммунными клетками аллергические реакции можно ингибировать локально или системно путем введения представленных агонистических антител против человеческого VISTA.

Выбор антител против VISTA, которые связываются с одним и тем же эпитопом

В определенных вариантах реализации агонистическое антитело против VISTA в соответствии с изобретением обладает необходимыми функциональными свойствами, такими как модуляция иммунной стимуляции и подобные функции. Как проиллюстрировано на фиг. 4 и описано в рабочих примерах, проводили исследование эпитопной специфичности большого числа агонистических антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением. Так как было обнаружено, что большое число антител, которые согласно полученным данным связываются с одним и тем же эпитопом, являются иммуносупрессивными, ожидается, что можно идентифицировать другие агонистические антитела к VISTA, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом, т.е. они будут взаимодействовать с одним или более аминокислотными остатками полипептида человеческого VISTA, который связывают типовые агонистические антитела к VISTA. Также можно провести отбор других антител с такой же эпитопной специфичностью и/или тех, которые обладают способностью к перекрестной конкуренции за связывание с антигеном VISTA с необходимыми антителами. Например, эпитопную специфичность необходимого антитела можно определять, используя библиотеку перекрывающихся пептидов, составляющих полный полипептид VISTA, например, 15-меров, или библиотеку перекрывающихся пептидов, составляющих часть, составляющую необходимый эпитоп VISTA, а антитела, которые связываются с этими пептидами в из библиотеки или одним или более их остатками определяют как такие, которые связывают тот же самый линейный или конформационный эпитоп. В примерах эпитопную специфичность определяли, используя методы Pepscan®, которые можно использовать для определения линейный и конформационных эпитопов.

Модификация агонистических антител в соответствии с изобретением

В рамках дополнительного или альтернативного варианта к модификациям, осуществляемым в пределах каркасных областей или CDR, антитела в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно конструировать так, чтобы они содержали модификации в Fc-области, как правило, для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как сывороточное время полужизни, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно химически модифицировать (например, к антителу можно присоединять один или более химических компонентов) или модифицировать, чтобы изменить его гликозилирование, снова, для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Такие варианты реализации изобретения дополнительно описаны ниже. Нумерация остатков в Fc-области соответствует нумерации EU или Kabat.

В одном варианте реализации изобретения шарнирная область CH1 модифицирована так, чтобы изменить число остатков цистеина в шарнирной области, например, увеличить или уменьшить. Этот подход дополнительно описан в патенте США № 5677425 авторства Bodmer et al. Число остатков цистеина в шарнирной области CH1 изменяют, например, для того, чтобы облегчить сборку легкой и тяжелой цепей или повысить или снизить стабильность антитела.

В другом варианте реализации изобретения Fc-шарнир область антитела мутирована так, чтобы уменьшить биологическое время полужизни антитела. Конкретнее, одна или более аминокислотных мутаций внесены в область поверхности раздела домена CH2-CH3 фрагмента Fc-шарнирная область так, чтобы антитело характеризовалось недостаточным связыванием стафилококкового протеина A (SpA) по сравнению со связыванием SpA для нативного домена Fc-шарнирная область. Этот подход более подробно описан в патенте США №6165745 авторства Ward et al.

В другом варианте реализации изобретения антитело модифицировано так, чтобы увеличить его биологическое время полужизни. В данном случае возможны различные подходы. Например, можно вносить одну или более из следующих мутаций: T252L, T254S и T256F, как описано в патенте США № 6277375 авторства Ward. В альтернативном варианте, чтобы увеличить его биологическое время полужизни, можно осуществлять изменения в пределах области CH1 или CL антитела так, чтобы она содержала эпитоп связывания рецептора реутилизации, полученный из двух петель домена CH2 Fc-области IgG, как описано в патентах США № 5869046 и 6121022 авторства Presta et al.

В других вариантах реализации изобретения Fc-область изменяют путем замещения по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторных функций антитела. Например, одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, можно замещать другим аминокислотным остатком так, чтобы антитело имело отличную аффинность в отношении эффекторного лиганда, но сохраняло антигенсвязывающую способность родительского антитела. Эффекторным лигандом, в отношении которого изменяют аффинность, может быть, например, Fc-рецептор или компонент комплемента Cl. Этот подход более подробно описан в патентах США № 5624821 и 5648260, оба авторства Winter et al.

В другом примере одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно замещать другим аминокислотным остатком так, чтобы антитело имело отличные характеристики связывания C1q и/или сниженную или устраненную комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ). Этот подход более подробно описан в патенте США №6194551 авторства Idusogie et al.

В другом примере изменяют один или более аминокислотных остатков в пределах аминокислотных позиций 231 и 239, чтобы тем самым изменить способность антитела фиксировать комплемент. Этот подход дополнительно описан в публикации согласно PCT WO 94/29351 авторства Bodmer et al.

В другом примере Fc-область модифицируют так, чтобы повысить аффинность антитела в отношении Fγ-рецептора, путем модификации одной или более аминокислот в следующих позициях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот подход дополнительно описан в публикации согласно PCT WO 00/42072 авторства Presta. Более того, были картированы участки связывания человеческого IgGl в отношении FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcRn и описаны варианты с улучшенным связыванием (смотрите Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Показано, что определенные мутации в позициях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcγRIII. Кроме того, показано, сто следующие комбинированные мутации улучшают связывание FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. Более того, такие мутации, как M252Y/S254T/T256E или M428L/N434S, улучшают связывание с FcRn и увеличивают время полужизни антитела в циркуляции (смотрите Chan CA and Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10:301-316).

В другом варианте реализации изобретения антитело может быть модифицировано так, чтобы устранить in vivo обмен Fab-фрагментами. В частности, этот процесс включает обмен полумолекулами IgG4 (одна тяжелая цепь плюс одна легкая цепь) между другими IgG4-антителами, что эффективно приводит к образованию биспецифических антител, которые являются функционально моновалентными. Мутации в шарнирной области и константных доменах тяжелой цепи также могут устранять этот обмен (смотрите Aalberse, RC, Schuurman J., 2002, Immunology 105:9-19).

В другом варианте реализации изобретения модифицируют гликозилирование антитела. Например, можно создавать агликозилированное антитело (т.е. антитело с отсутствием гликозилирования). Гликозилирование можно изменять, например, для того, чтобы повысить аффинность антитела к антигену. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, изменяя один или более участков гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или более аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или более участков гликозилирования каркасной вариабельной области, чтобы тем самым устранить гликозилирование в этом участке. Такое агликозилирование может повысить аффинность антитела к антигену. Такой подход более подробно описан в патентах США №5714350 и 6350861 авторства Co et al.

В дополнительном или альтернативном варианте можно получать антитело, которое имеет измененный тип гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело, имеющее сниженное количество фукозильных остатков, или антитело, имеющее повышенное количество биссекторных структур GlcNac. Было продемонстрировано, что такие измененные профили гликозилирования повышают АЗКЦ-способность антител. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, экспрессируя антитело в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в данной области техники и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных антител в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, чтобы таким образом получить антитело с измененным гликозилированием. Например, в линиях клеток Ms704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, FUT8 (a (1,6) фукозилтрансфераза), поэтому в антителах, экспрессируемых в линиях клеток Ms704, Ms705 и Ms709, отсутствует фукоза в углеводах. Линии клеток Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8 создают путем целенаправленного разрушения гена FUT8 в клетках CHO/DG44, используя два заместительных вектора (смотрите публикацию патента США № 20040110704 авторства Yamane et al. и Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве другого примера в EP 1176195 авторства Hanai et al. описана линия клеток с функционально разрушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, поэтому антитела, экспрессируемые в такой линии клеток, демонстрируют гипофукозилирование путем снижения количества или устранения фермента, связанного с 1,6-связью. В Hanai et al. также описаны линии клеток, которые обладают низкой ферментативной активностью в отношении добавления фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с Fc-областью антитела, или не обладают этой ферментативной активностью, например, линия клеток миеломы крыс YB2/0 (ATCC CRL 1662). В публикации согласно PCT WO 03/035835 авторства Presta описана вариантная линия клеток CHO, клетки Lecl3, со сниженной способностью присоединения фукозы к Asn(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этих клетках-хозяевах (также смотрите Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации согласно PCT WO 99/54342 авторства Umana et al. описаны линии клеток, сконструированные для экспрессии гликопротеин-модифицирующих гликозилтрансфераз (например, P(l,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)), потому антитела, экспрессируемые в сконструированных линиях клеток, демонстрируют повышенное количество биссекторных структур GlcNac, что приводит к повышению АЗКЦ-активности этих антител (также смотрите Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180). В альтернативном варианте остатки фукозы антитела можно отщеплять с помощью фермента фукозидазы. Например, фукозидаза α-L-фукозидаз удаляет остатки фукозила из антител (Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Другой модификацией антител согласно данному документу, подразумеваемой в изобретении, является пэгилирование или добавление других водорастворимых компонентов, как правило, полимеров, например, для увеличения времени полужизни. Антитело можно пэгилировать, например, для того, чтобы увеличить биологическое (например, сывороточное) время полужизни антитела. Чтобы пэгилировать антитело, антитело или его фрагмент, как правило приводят в реакцию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реактивный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или более групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пэгилирование проводят посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой ПЭГ (или аналогичного реактивного водорастворимого полимера). В контексте данного документа подразумевается, что термин «полиэтиленгликоль» включает любые форму ПЭГ, которые используются для дериватизации других белков, такие как моно- (Ci-Cio), алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных вариантах реализации изобретения подлежащее пэгилированию антитело представляется собой агликозилированное антитело. Способы пэгилирования белков известны в данной области техники и могут применяться к антителам в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения. Смотрите, например, EP 0154316 авторства Nishimura et al. и EP 0401384 авторства Ishikawa et al.

Способы конструирования антител

В определенных вариантах реализации изобретения агонистическое антитело против VISTA в соответствии с изобретением, имеющее последовательности V_H и V_L, можно использовать для создания новых антител против VISTA, соответственно, путем модификации последовательностей V_H и/или V_L или соединенных с ними константных областей. Таким образом, в другом аспекте в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения структурные признаки антитела против VISTA в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения используют для создания структурно родственных антител против VISTA, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, такое как связывание с человеческим VISTA. Например, одну или более областей CDR одного антитела к VISTA или их мутаций можно рекомбинантно комбинировать с известными каркасными областями и/или другими CDR для создания дополнительных рекомбинантно сконструированных антител против VISTA в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, как обсуждалось выше. Другие виды модификаций включают описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом в способе конструирования являются одна или более предложенных в данном документе последовательностей V_H и/или V_L или одна или более их областей CDR. Чтобы создать сконструированное антитело, необязательно в действительности получать (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или более предложенных в данном документе последовательностей V_H и/или V_L или одну или более их областей CDR. Скорее, информацию, содержащуюся в последовательностях, используют в качестве исходного материала для создания последовательностей «второго поколения», полученных из оригинальных последовательностей, а затем получают последовательности «второго поколения» и экспрессируют в виде белка.

Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно использовать стандартные методики молекулярной биологии. Предпочтительно антитело против VISTA, кодируемое измененными последовательностями антитела, сохраняет одну, некоторые или все функциональные свойства антител против VISTA, соответственно, полученных описанными в данном документе способами и имеющих описанные в данном документе последовательности, при этом функциональные свойства включают связывание с антигеном VISTA при определенном уровне КД или менее и/или модуляцию иммунных ответов, и/или избирательное связывание с необходимыми клетками-мишенями, такими как, например, экспрессирующие антиген VISTA.

Функциональные свойства измененных антител можно оценивать, используя стандартные методы анализа, доступные в данной области техники и/или описанные в данном документе. В определенных вариантах реализации способов конструирования антител в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения мутации можно вносить случайным или избирательным образом вдоль всей или части кодирующей последовательности антитела против VISTA, и проводить скрининг получаемых в результате модифицированных антител против VISTA в отношении активности связывания и/или других необходимых функциональных свойств.

Способы внесения мутаций описаны в данной области техники. Например, в публикации согласно PCT WO 02/092780 авторства Short описаны способы создания и скрининга мутированных антител с применением насыщающего мутагенеза, искусственной сборки с лигированием или их комбинации. В альтернативном варианте в публикации согласно PCT WO 03/074679 авторства Lazar et al. описаны способы применения методом компьютерного скрининга для оптимизации физиохимических свойств антител.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела

В изобретении дополнительно предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитело против VISTA в соответствии с изобретением или его фрагмент или конъюгат. Нуклеиновые кислоты могут находиться в цельных клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является «выделенной» или «или представленной в по существу чистой форме» при очистке от других компонентов или других загрязняющих веществ, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие хорошо известные в данной области техники методы. Смотрите F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения может представлять собой, например, ДНК или РНК, и может содержать или не содержать интронные последовательности. В предпочтительном варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.

Нуклеиновые кислоты в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии. В случае антител, экспрессирумых гибридомами (например, гибридомами, полученными из трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина, как дополнительно описано ниже), кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, вырабатываемого гибридомой, можно получать стандартными методами ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. В случае антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулина (например, с помощью метода фагового дисплея), нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно выделять из библиотеки.

После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты V_H и V_L, эти фрагменты ДНК можно дополнительно обрабатывать с помощью стандартных технологий рекомбинантных ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены цепей полноразмерного антитела, в гены фрагмента Fab или в ген scFv. При таких манипуляциях кодирующий V_H или V_L фрагмент ДНК функционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Согласно приведенному ранее определению «функционально связанный» означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в одной рамке считывания.

Выделенную ДНК, кодирующую область V_H, можно преобразовать в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания V_H-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов человеческой константной области тяжелой цепи известны в данной области техники (смотрите, например, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикация NIH № 91-3242), а фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получать путем стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно представляет собой константную область IgGl, IgG2 или IgG4. В случае гена фрагмента Fab тяжелой цепи VH-кодирующая ДНК может быть функционально связаны с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область тяжелой цепи C_H1.

Выделенную ДНК, кодирующую область V_L, можно преобразовать в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген Fab легкой цепи) путем функционального связывания V_L-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, C_L. Последовательности генов человеческой константной области легкой цепи известны в данной области техники (смотрите, например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикация NIH №91-3242), а фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получать путем стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой каппа (κ) или лямбда (λ)константную область, но наиболее предпочтительно представляет собой κ константную область.

Для создания гена scFv V_H- и V_L-кодирующие фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так, чтобы последовательности V_H и V_L можно было экспрессировать в виде непрерывного одноцепочечного белка с соединенными гибким линкером областями V_Lи V_H (смотрите, например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Получение моноклональных антител против VISTA

Моноклональные антитела (mAb) против VISTA и их антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с данным изобретением можно получать разными методами, включая традиционные методики получения моноклональных антител, например, стандартный метод гибридизации соматических клеток согласно Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, можно применять другие методы получения моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов.

Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышиная система. Получение гибридом в мышином организме является хорошо отработанной процедурой. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области техники. Также известны партнеры по слиянию (например, клетки миеломы мышей) и процедуры слияния. Химерные или гуманизированные антитела согласно данному изобретению можно получать на основании последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующую тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, можно получать из представляющей интерес мышиной гибридомы и конструировать так, чтобы она содержала немышиные (например, человеческие) последовательности иммуноглобулина, используя стандартные методы молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела можно связывать мышиные вариабельные области с человеческими константными областями, используя известные в данной области техники методы (смотрите, например, патент США №4816567 авторства Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела мышиные области CDR можно вставлять в человеческие каркасные области, используя известные в данной области техники методы (смотрите, например, патент США № 5225539 авторства Winter и патенты США №5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 авторства Queen et al.).

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения антитела представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, направленные против VISTA, можно создавать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, а не мышиной системы. Эти трансгенные или трансхромосомные мыши включаю мышей, называемых в данном документе мышью HuMAb Mouse™ и мышью KM Mouse™, соответственно, и вместе называются в данном документе «мышами с человеческим Ig». HuMAb Mouse™ (Medarex Inc.) содержит минилокусы генов человеческого иммуноглобулина, которые кодируют неперестроенные последовательности тяжелой цепи μ и γ и легкой цепи κ иммуноглобулина, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы цепей μ и κ (смотрите, например, Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Соответственно, мыши демонстрируют сниженную экспрессию мышиного IgM или κ и в ответ на иммунизацию внесенные трансгены человеческих тяжелой и легкой цепей претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с созданием высокоаффинного человеческого IgG κ моноклонального антитела (Lonberg, N. et al. (1994), выше; обзор в Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Получение и применение HuMab Mouse®, а также геномные модификации, которые несут такие мыши, дополнительно описаны в Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591; и Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, содержание которых в полном объеме специальным образом включено в данный документ посредством ссылки. Дополнительно смотрите патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все авторства Lonberg and Kay; патент США № 5545807 авторства Surani et al.; публикации согласно PCT № WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все авторства Lonberg and Kay; и публикацию согласно PCT № WO 01/14424 авторства Korman et al.

В другом варианте реализации изобретения человеческие антитела в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно получать, используя мышь, которая несет последовательности или трансгены или трансхромосомы человеческого иммуноглобулина, такую как мышь, которая несет трансген человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи. Такие мыши, называемые в данном документе мышами «KM mice™», подробно описаны в заявке согласно PCT WO 02/43478 авторства Ishida et al.

Кроме того, в данной области техники доступны альтернативные системы на основе трансгенных животных, экспрессирующие гены человеческого иммуноглобулина, которые можно использовать для получения антител против VISTA в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения. Например, можно использовать альтернативную трансгенную систему, называемую Xenomouse (Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например, в патентах США №5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 авторства Kucherlapati et al.

Более того, в данной области техники доступны альтернативные системы на основе трансхромосомных животных, экспрессирующих гены человеческого иммуноглобулина, которые можно использовать для получения антител против VISTA в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи, называемых «мышами TC»; такие мыши описаны в Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA 97:722-727. Кроме того, в данной области техники были описаны коровы, несущие трансхромосомы человеческой тяжелой и легкой цепи (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), которых можно использовать для получения антител против VISTA в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения.

Человеческие моноклональные антитела в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения также можно получать, используя методы фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческого иммуноглобулина. Такие методы фагового дисплея для выделения человеческих антител известны в данной области техники. Смотрите, например, патенты США №5223409; 5403484; и 5571698 авторства Ladner et al.; патенты США №5427908 и 5580717 авторства Dower et al.; патенты США №5969108 и 6172197 авторства McCafferty et al.; и патенты США №5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 авторства Griffiths et al.

Человеческие моноклональные антитела в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения также можно получать, используя мышей SCID, в которых были повторно восстановлены человеческие иммунные клетки так, чтобы после иммунизации могла происходить генерация ответа человеческих антител. Такие мыши описаны, например, в патентах США №5476996 и 5698767 авторства Wilson et al.

Иммунизация мышей с человеческим Ig

В некоторых вариантах реализации изобретения мышей с человеческим Ig используют для получения антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением, например, путем иммунизации таких мышей очищенным или обогащенным препаратом антигена VISTA и/или рекомбинантного VISTA, или слитого белка VISTA, как описано в Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; и публикациях согласно PCT WO 98/24884 и WO 01/14424. Предпочтительно возраст мышей составляет 6-16 недель после первой инфузии. Например, можно использовать очищенный или рекомбинантный препарат (доза в диапазоне 0,5-500 мкг) антигена VISTA для внутрибрюшинной иммунизации мышей с человеческим Ig.

В целом, трансгенные мыши демонстрируют ответ после исходной внутрибрюшинной (В/Б) иммунизации антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующими В/Б иммунизациями через неделю (всего до 6) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Однако было обнаружено, что адъюванты, отличные от адъюванта Фрейнда, также являются эффективными. Дополнительно было обнаружено, что цельные клетки в отсутствие адъюванта являются высокоиммуногенными. Иммунный ответ можно отслеживать в течение курса осуществления протокола иммунизации, получая образцы плазмы путем ретроорбитального забора крови. Скрининг плазмы можно проводить методом ИФА (как описано ниже), а мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина против VISTA можно использовать для слияний. Мышам можно проводить внутривенную бустерную инъекцию антигена за 3 суток перед умерщвлением и удалением селезенки. Ожидается, что в случае каждой иммунизации может понадобиться проведение 2-3 слияний. Между 6 и 24 мышей, как правило, иммунизируют в отношении каждого антигена. Обычно используют оба штамма, HCo7 и HCo12. Кроме того, оба трансгена, HCo7 и HCo12, можно совместить в одной мыши, имеющей два разных трансгена человеческой тяжелой цепи (HCo7/HCo12). В альтернативном или дополнительном варианте можно использовать штамм KM Mouse™. В типовом варианте реализации изобретения этих мышей создают для избирательной выработки человеческих антител IgG2.

Создание гибридом, вырабатывающих человеческие моноклональные антитела

В определенных вариантах реализации изобретения можно создавать гибридомы, вырабатывающие человеческое моноклональное антитело против VISTA в соответствии с изобретением, используя спленоциты и/или клетки лимфатических узлов от иммунизированных мышей, выделенные и слитые с соответствующей иммортализованной линией клеток, такой как линия клеток мышиной миеломы. Полученные в результате гибридомы можно исследовать в отношении выработки антиген-специфических антител. Например, содержащие одиночные клетки суспензии селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей можно сливать с одной шестой количества несекретирующих клеток мышиной миеломы P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) с 50% ПЭГ. Клетки высевают приблизительно при 2X105 в микротитровальный планшет с плоским дном с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей 20% сыворотки FetalClone, 18% кондиционированной среды «653», 5% Origen (IGEN), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 5 мМ ГЭПЭС, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и IX HAT (Sigma; HAT добавляют через 24 часа после слияния). Приблизительно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой HAT замещают HT. Затем можно проводить скрининг отдельных лунок методом ИФА в отношении человеческих моноклональных антител IgM и IgG. После того, как начинается интенсивный рост гибридомы, наблюдение среды можно проводить, обычно, через 10-14 суток. Секретирующие антитела гибридомы можно пересевать, снова проводить скрининг и, если они все еще являются положительными в отношении человеческого IgG, моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды методом предельных разведений. Затем стабильные субклоны можно культивировать in vitro для создания небольших количеств антитела в тканевой культуральной среде для определения характеристик.

Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед проведением аффинной хроматографии с белком А-сефарозы (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Проверку элюированного IgG можно проводить с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для подтверждения чистоты. Буферный раствор можно заменить на ФСБ, а концентрацию можно определять по ОП280, используя коэффициент экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80°C.

Создание трансфектом, вырабатывающих моноклональные антитела

В определенных вариантах реализации антитело против VISTA в соответствии с изобретением можно получать в клетке-хозяине-трансфектоме, используя, например, комбинацию технологии рекомбинантных ДНК и методов генной трансфекции, как хорошо известно в данной области техники (например, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). Например, для экспрессии антител или фрагментов антител можно получать ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, стандартными методами молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификации или клонирования кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует представляющее интерес антитело) и вставлять ДНК в экспрессионные векторы так, чтобы гены были функционально связаны с последовательностями, регулирующими транскрипцию и трансляцию. В этом контексте подразумевается, что термин «функционально связанный» означает, что ген антитела лигирован в вектор так, чтобы последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, в векторе выполняли свою подразумеваемую функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и экспрессионные регуляторные последовательности выбирают так, чтобы они были совместимы с применяемой экспрессионной клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно вставлять в отдельный вектор или, чаще, оба гена вставляют в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела вставляют в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигирования комплементарных рестрикционных участков в генном фрагменте антитела и векторе или лигирования тупых концов в случае отсутствия рестрикционных участков). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей описанных в данном документе антител можно использовать для создания генов полноразмерного антитела или любого изотипа антитела путем их вставки в экспрессионные векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и легкой цепи необходимого изотипа, так, чтобы сегмент V_H был функционально связан с сегментами C_H в векторе, а сегмент V_L был функционально связан с сегментом C_L в векторе. В дополнительном или альтернативном варианте рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор так, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из отличного от иммуноглобулина белка).

Определение характеристик связывания антитела с антигеном

В определенных вариантах реализации изобретения специфичность связывания агонистического антитела против VISTA в соответствии с изобретением определяют известными методами анализа связывания антител, таким как ИФА. В типовом ИФА микротитровальные планшеты покрывают очищенным антигеном, в данном случае – VISTA, при 0,25 мкг/мл в ФСБ, а затем блокируют 5% бычьим сывороточным альбумином в ФСБ. Разведения антитела (например, разведения плазмы от иммунизированных мышей) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1-2 часов при 37°C. Планшеты промывают ФСБ/Твин, а затем инкубируют со вторичным реагентом (например, в случае человеческих антител, козьим, направленным против человеческого IgG, Fc-специфическим поликлональным реагентом), конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 часов при 37°C. После промывки планшеты обрабатывают субстратом pNPP (1 мг/мл) и анализируют при ОП 405-650. Предпочтительно, для слияния используют мышей, у которых развились наивысшие титры.

Описанный выше анализ ИФА также можно использовать для скрининга в отношении гибридом, которые демонстрируют положительную реактивность с иммуногеном VISTA. Гибридомы, которые связываются с высокой авидностью с VISTA, субклонируют и получают их дополнительные характеристики. Можно отобрать по одному клону из каждой гибридомы, которые сохраняют реактивность родительских клеток (по данным ИФА), для создания банка клеток из 5-10 флаконов, хранимых при -140°C, и для очистки антител.

Для очистки антител против VISTA отобранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед проведением аффинной хроматографии с белком А-сефарозы (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Проверку элюированного IgG можно проводить с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для подтверждения чистоты. Буферный раствор можно заменить на ФСБ, а концентрацию можно определять по ОП280, используя коэффициент экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80°C.

Чтобы определить, связываются ли отобранные моноклональные антитела против VISTA с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать, используя коммерчески доступные реагенты (Pierce, Rockford, Il.). Исследования конкуренции с применением немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно проводить, используя покрытые VISTA планшеты ИФА, как описано выше. Связывание биотинилированного mAb можно выявлять с помощью зонда на основе стрептавидина и щелочной фосфатазы.

Чтобы определить изотип очищенных антител можно проводить изотипический ИФА, используя реагенты, специфические в отношении антител конкретного изотипа, например, IgG2. Например, чтобы определить изотип человеческого моноклонального антитела, лунки микротитровальных планшетов можно покрывать мкг/мл античеловеческого иммуноглобулина в течение ночи при 4°C. После блокирования 1% БСА планшеты приводят в реакцию с 1 мкг/мл или менее исследуемых моноклональных антител или очищенных изотипических контрольных антител при температуре окружающей среды в течение одного-двух часов. Затем лунки модно приводить в реакцию со специфическими к человеческому IgG1 или человеческому IgM зондами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Планшеты обрабатывают и анализируют, как описано выше.

Человеческие IgG против VISTA можно дополнительно исследовать в отношении реактивности с антигеном VISTA, соответственно, методом вестерн-блоттинга. Вкратце, можно получать антиген VISTA и подвергать его электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза отделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 10% фетальной телячьей сывороткой и зондируют подлежащими исследованию моноклональными антителами. Связывание человеческого IgG можно выявлять, используя щелочную фосфатазу против человеческого IgG и обрабатывать таблетками субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

В другом аспекте данное изобретение относится к конъюгатам антитело-лекарственный препарат (ADC, от англ. «antibody-drug conjugate»), состоящим из антитела (или фрагмента антитела, такого как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)), связанного с нагрузочным лекарственным препаратом (часто цитотоксическим). Антитело заставляет ADC связываться с раковыми клетками-мишенями. Часто ADC затем интернализируется клеткой, а лекарственный препарат высвобождается в клетку. Благодаря нацеливанию побочные явления уменьшаются и дают более широкое терапевтическое окно. Гидрофильные линкеры (например, PEG4Mal) помогают предотвратить выталкивание лекарственного препарата из резистентных раковых клеток посредством переносчиков МЛР (множественной лекарственной резистентности).

В другом аспекте данное изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело против VISTA или его фрагмент, конъюгированное к терапевтическому агенту, такому как цитотоксин, лекарственный препарат (например, иммуносупрессор) или радиотоксин. Такие конъюгаты называются в данном документе «иммуноконъюгатами». Иммуноконъюгаты, которые включают в себя один или более цитотоксинов, называются «имунотоксинами». Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредоносным для клеток (например, уничтожает их). Примеры включают таксол, цитохалазин B, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, диоксиантрацендион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги и гомологи. Терапевтические агенты также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фтороурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепу, хлорамбуцил, мефалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платину (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (раньше - дауномицин) и доксорубицин), антибиотика (например, дактиномицин (ранее - активномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (AMC)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).

Другие примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с антителом в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, включают дуокармицины, калихеамицин, майтанзины и ауристатины, а также их производные. Пример конъюгата антитела с калихеамицином является коммерчески доступным (Mylotarg™ Wyeth).

Цитотоксины можно конъюгировать с антителами в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, используя доступную в данной области техники технологию линкеров. Примеры типов линкеров, которые использовались для конъюгации цитотоксина к антителу, включают, но не ограничиваются этим, гидразоны, тиоэфиры, дисульфиды и пептид-содержащие линкеры. Можно выбрать линкер, который будет, например, восприимчивым к расщеплению при низком pH в лизосомальном компартменте или восприимчивым к расщеплению протеазами, такими как протеазы, экспрессируемые преимущественно в опухолевой ткани, такие как катепсины (например, катепсины B, C, D). Дополнительное обсуждение типов цитотоксинов, линкеров и способов конъюгации терапевтических агентов к антителам смотрите также в Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R.J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Антитела согласно данному изобретению также можно конъюгировать к радиоактивному изотопу для создания цитотоксический радиофармацевтических препаратов, также называемых радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые можно конъюгировать к антителам для диагностического или терапевтического применения, включают, но не ограничиваются этим, йод 131, индий 111, иттрий 90 и лютеций 177. Способы получения радиоиммуноконъюгатов известны в данной области техники. Радиоиммуноконъюгаты являются коммерчески доступными, включая зевалин® (BiogenlDEC) и Бексар® (Corixa Pharmaceuticals), и аналогичные способы можно использовать для получения радиоиммуноконъюгатов с применением антител в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения.

Агонистические антитела и против человеческого VISTA и содержащие их конъюгаты в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно использовать для модификации заданного биологического ответа, а лекарственный компонент не следует воспринимать как ограниченный классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственный компонент может представлять собой белок или полипептид, обладающий необходимой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин A, экзотоксин синегнойной палочки или токсин дифтерии; белок, такой как фактор некроза опухолей или интерферон-γ; или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 («IL-1»), интерлейкин-2 («IL-2»), интерлейкин-6 («IL-6»), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор («GM-CSF»), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («G-CSF») или другие факторы роста.

Методики конъюгации таких терапевтических компонентов к антителам хорошо известны, смотрите, например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), и Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Биспецифические молекулы

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретение также включает мультиспецифические агонистические антитела против VISTA. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных участков. В другом аспекте данное изобретение относится к биспецифическим молекулам, содержащим антитело против VISTA или его фрагмент в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения. Антитело в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения или его антигенсвязывающие части можно дериватизировать или связывать с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом для рецептора), для создания биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя разными участками связывания или молекулами-мишенями. Антитело в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения в действительности может быть дериватизировано или связано с более чем одной другой функциональной молекулой для создания мультиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя разными участками связывания и/или молекулами-мишенями; в контексте данного документе подразумевается, что такие мультиспецифические также охватываются термином «биспецифическая молекула». Для создания биспецифической молекулы в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения антитело можно функционально связывать (например, посредством химического сопряжения, генетического слияния, нековалентной ассоциации или каким-либо другим образом) с одной или более другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, так, чтобы в результате получить биспецифическую молекулу. В определенных вариантах реализации изобретения биспецифические антитела имеют одну специфичность связывания в отношении VISTA, а другую - в отношении любого другого антигена. В определенных вариантах реализации изобретения биспецифические антитела могут связывать два разных эпитопа VISTA. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют VISTA. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Биспецифическое антитело в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения представляет собой антитело, которое может одновременно связываться с двумя мишенями, которые имеют разную структуру. Биспецифические антитела (bsAb) и фрагменты биспецифических антител (bsFab) в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения имеют по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывается с В-клеточным антигеном или эпитопом, и по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывает нацеливаемый конъюгат.

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретение также включает слитый белок антитела, который представляет собой полученную рекомбинантным образом антигенсвязывающую молекулу, в которой связаны два или более разных одноцепочечных сегментов антитела или фрагмента антитела с одинаковой или разной специфичностью. С помощью молекулярной инженерии можно получать множество биспецифических слитых белков антител. В одной форме биспецифический слитый белок антитела является моновалентным, состоящим, например, из компонента с одним связывающим участком в отношении одного антигена и фрагмента Fab с одним связывающим участком в отношении второго антигена. В другой форме биспецифический слитый белок антитела является двухвалентным, состоящим, например, из IgG с двумя связывающими участками в отношении одного антигена и двух scFv с двумя связывающими участками в отношении второго антигена.

Изобретение дополнительно включает сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими участками, включая «антитела-осьминоги» (смотрите, например, US 2006/0025576 A1), и антитела «FAb двойного действия» или «DAF», содержащие антигенсвязывающий участок, который связывается с VISTA, а также с другим, отличным антигеном (смотрите, например, US 2008/0069820). Соответственно, данное изобретение включает биспецифические молекулы, имеющие по меньшей мере первую специфичность связывания в отношении VISTA и вторую специфичность связывания в отношении второго эпитопа-мишени. В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения второй эпитоп-мишень представляет собой Fc-рецептор, например, рецептор человеческого FcγRI (CD64) или человеческого FcαR (CD89). Следовательно, изобретение включает биспецифические молекулы, способные связываться с экспрессирующими FcγR, FcαR или FcsR эффекторными клетками (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарными клетками (ПМН)) и с клетками-мишенями, экспрессирующими VISTA, соответственно. Эти биспецифические молекулы направляют экспрессирующие VISTA клетки к эффекторным клеткам и запускают опосредованную Fc-рецептором активность эффекторных клеток, такую как фагоцитоз экспрессирующих VISTA клеток, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ), высвобождение цитокинов или генерация супероксид-аниона.

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, в которых биспецифическая молекула является мультиспецифической, молекула может дополнительно иметь третью специфичность связывания кроме анти-Fc специфичности связывания. В одном варианте реализации изобретения третья специфичность связывания представлена частью против фактора усиления (ФУ), например, молекулой, которая связывается с поверхностным белком, вовлеченным в цитотоксическую активность, и тем самым повышает иммунный ответ против клетки-мишени.

«Часть против фактора усиления» может представлять собой антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с заданной молекулой, например, антигеном или рецептором, и тем самым приводит к усилению эффекта детерминант связывания для Fc-рецептора или антигена клетки-мишени. «Часть против фактора усиления» может связывать Fc-рецептор или антиген клетки-мишени. В альтернативном варианте часть против фактора усиления может связываться с компонентом, отличным от компонента, с которым связываются элементы первой и второй специфичности связывания. Например, часть против фактора усиления может связывать цитотоксическую Т-клетку (например, посредством CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 или другой иммунной клетки, что приводит к повышению иммунного ответа против клетки-мишени).

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения биспецифические молекулы содержат в качестве элемента специфичности связывания по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Антитело также может представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи или любой их минимальный фрагмент, такой как Fv или одноцепочечная конструкция, как описано в Ladner et al., патент США №4946778, содержание которого явным образом включено посредством ссылки.

В одном варианте реализации изобретения специфичность связывания в отношении Fcγ-рецептора обеспечена моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). В контексте данного документа термин «рецептор IgG» относится к любому из восьми генов γ-цепи, находящихся в хромосоме 1. Эти гены кодируют в целом двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые можно сгруппировать в три класса Fcγ-рецепторов: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32) и FcγRIII (CD16). В одном предпочтительном варианте реализации изобретения Fcγ-рецептор представляет собой человеческий высокоаффинный FcγRI. Человеческий FcγRI представляет собой 72 кДа молекулу, которая демонстрирует высокую аффинность в отношении мономерного IgG. Получение и характеристики некоторых предпочтительных анти-Fcγ моноклональных антител описаны Fanger et al. в публикации согласно PCT WO 88/00052 и в патенте США №4954617, принципы которого в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. Эти антитела связываются с эпитопом FcγRI, FcγRII или FcγRIII в участке, отличном от участка связывания Fcγ-рецептора и, таким образом, их связывание по существу не блокируется физиологическими уровнями IgG. Известные анти-FcγRI антитела включают mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 и mAb 197. Гибридома, вырабатывающая mAb 32, доступна от Американской коллекции типовых культур, ATCC, номер доступа HB9469. В других вариантах реализации изобретения антитело против Fcγ-рецептора представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела 22 (H22). Получение и характеристики антитела H22 описаны в Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 и публикации согласно PCT WO 94/10332. Линия клеток, вырабатывающая антитело H22, находится в Американской коллекции типовых культур под обозначением HA022CLI и имеет номер доступа CRL 11177.

В других вариантах реализации изобретения специфичность связывания в отношении Fc-рецептора обеспечена антителом, которое связывается с рецептором человеческого IgA, например, Fc-α-рецептором (Fc αRI(CD89)), связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином A (IgA). Подразумевается, что термин «рецептор IgA» включает генный продукт одного а-гена (FcαRI), находящегося в хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько трансмембранных изоформ с альтернативным сплайсингом от 55 до 10 кДа. FcαRI (CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяциях эффекторных клеток. Fc αRI имеет среднюю аффинность (приблизительно 5X10^-7 M^-1) в отношении как IgA1, так и IgA2, которая повышается после воздействия цитокинов, таких как G-CSF или GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Были описаны четыре FcαRI-специфических моноклоальных антитела, определяемых как A3, A59, A62 и A77, которые связывают FcαRI за пределами связывающего лиганд IgA домена (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).

Хотя человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другие антитела, которые можно применять в биспецифических молекулах в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, представляют собой мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела. Биспецифические молекулы согласно данному изобретению можно получать путем конъюгации составляющих элементов специфичности связывания, например, анти-FcR и анти-VISTA специфичности связывания, используя способы, известные в данной области техники. Например, элемент специфичности связывания каждой биспецифической молекулы можно создавать отдельно, а потом конъюгировать их друг к другу. Когда элементы специфичности связывания являются белками или пептидами, для ковалентной конъюгации можно использовать множество соединительных или перекрестно-связывающих агентов. Примеры перекрестно-связывающих агентов включают протеин A, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), o-фенилендималеимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридил дитиопропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (смотрите, например, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие способы включают описанные в Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83) и Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются SATA и сульфо-SMCC, доступные от Pierce Chemical Co. (Rockford, Il.). Когда связывающие компоненты являются антителами, они могут быть конъюгированы посредством образования сульфгидрильных связей в шарнирных областях С-конца двух тяжелых цепей. В особенно предпочтительном варианте реализации изобретения перед конъюгацией шарнирную область модифицируют так, чтобы она содержала нечетное число сульфгидрильных остатков, предпочтительно один.

В альтернативном варианте оба элемента специфичности связывания могут кодироваться одним вектором и экспрессироваться и проходить сборку в одной клетке-хозяине. Этот способ в особенности применим, когда биспецифическая молекула представляет собой слитый белок mAbXmAb, mAbXFab, FabXF(ab')2 или лигандXFab. Биспецифическая молекула в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения может представлять собой одноцепочечную молекулу, содержащую одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, содержащую две детерминанты связывания. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США №5260203; патенте США №5455030; патенте США №4881175; патенте США №5132405; патенте США №5091513; патенте США №5476786; патенте США №5013653; патенте США №5258498; и патенте США №5482858.

Методики создания мультиспецифических антител включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, имеющих разную специфичность (смотрите Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и конструирование по типу «выступ-во-впадину» (смотрите, например, патент США № 5731168). Мультиспецифические антитела также можно создавать путем конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004 A1); контролируемого обмена Fab-фрагментами (смотрите Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110(13):5145-50 (2013)); перекрестного связывания двух антител или фрагментов (смотрите, например, патент США №4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (смотрите, например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); применения технологии «диател» для создания биспецифических фрагментов антител (смотрите, например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); и применения одноцепочечных димеров Fv (sFv) (смотрите, например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтверждать, например, с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ИФА), радиоиммуноанализа (РИА), анализа FACS, биоанализа (например, ингибирования роста) или анализа методом вестерн-блоттинга. Каждый из этих методов анализа в общем случае позволяет выявить наличие представляющих особый интерес комплексов белок-антитело посредством применения метящего реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса. Например, комплексы FcR-антитело можно выявлять, используя, например, связанное с ферментом антитело или фрагмент антитела, которое распознает и специфически связывает комплексы FcR-антитело. В альтернативном варианте комплексы можно выявлять, используя любой из множества других методов иммуноанализа. Например, можно радиоактивно метить антитело и использовать его в радиоиммуноанализе (РИА) (смотрите, например, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, которая включена в данный документ посредством ссылки). Радиоактивный изотоп можно выявлять такими средствами, как γ-счетчик или сцинцилляционный счетчик, или методом ауторадиографии.

Применение антагонистических антител и содержащих их фармацевтических композиций

Иммунотерапия рака

В отличие от направленных на опухоль вариантов терапии, которые нацелены на ингибирование молекулярных путей, являющихся критическими для роста и развития опухоли, и/или снижение количества опухолевых клеток, иммунотерапия рака нацелена на стимуляцию собственной иммунной системы пациента для элиминации раковых клеток, обеспечивая долгосрочное разрушение опухоли. В иммунотерапии рака можно использовать различные подходы, среди которых терапевтические противораковые вакцины для индукции опухолеспецифических Т-клеточных ответов и иммуностимуляторные антитела (т.е. антагонисты ингибиторных рецепторов = иммунные контрольные точки) для устранения иммуносупрессивных путей.

Клинические ответы при применении направленной терапии или традиционной противораковой терапии имеют временную тенденцию, так как раковые клетки развивают резистентность и происходит повторное появление опухоли. Однако клиническое применение иммунотерапии рака в последние несколько лет показало, что этот тип терапии может иметь продолжительные клинические ответы, демонстрируя сильное влияние на долгосрочную выживаемость. Однако, хотя ответы являются долгосрочными, их демонстрирует только небольшое количество пациентов (в противоположность традиционной или направленной терапии, когда большое число пациентов демонстрирует ответ, но ответы являются временными).

К тому времени, когда опухоль выявляется клинически, она успевает обойти иммунную защиту путем приобретения иммунорезистентных и иммуносупрессорных свойств и создания иммуносупрессивного опухолевого микроокружения посредством различных механизмов и различных иммунных клеток. Таким образом, в случае иммунотерапии рака становится все более понятно, что для клинической эффективности необходима комбинация разных вариантов терапии.

Необходимы комбинированные подходы, которые, как ожидается, увеличат число пациентов, которым иммунотерапия приносит пользу, и расширят число и типы восприимчивых онкологических заболеваний, расширяя потенциальные раковые показания для нацеленных на контрольные точки агентов далеко за пределы исходных показаний, которые на данный момент демонстрируют эффективность блокирования иммунных контрольных точек в виде монотерапии. Комбинация иммуномодуляторных подходов означает максимизацию результатов и преодоление механизмов резистентности большинства опухолей к одному подходу. Таким образом, опухоли, традиционно считающиеся неиммуногенными, вероятно могут стать иммуногенными и восприимчивыми к иммунотерапии посредством совместного применения вариантов проиммуногенной терапии, разработанных для повышения противоопухолевых иммунных ответов пациента. Потенциальные примирующие агенты подробно описаны ниже.

Лежащее в основе научное обоснование резкого повышения эффективности комбинированной терапии состоит в том, что блокирование иммунных контрольных точек в виде монотерапии будет индуцировать регрессию опухолей только в случае наличия предсуществующего сильного противоопухолевого иммунного ответа, который будет «освобожден» при блокировании пути. В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения VISTA-специфические антитела, фрагменты антител, содержащие их конъюгаты и композиции используются для лечения всех типов рака в иммунотерапии рака в комбинированной терапии.

В контексте данного документа термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, что в этом примере относится к лечению воспалительных побочных явлений, связанных с раком; однако, как также описано ниже, применение антител и фармацевтических композиций также предложено для лечения инфекционного заболевания, сепсиса и/или аутоиммунных состояний, и/или для ингибирования нежелательной иммунной активации после генной терапии. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет рак, а также тех, у кого необходимо предотвратить появление рака. Следовательно, подлежащее лечению млекопитающее согласно данному документу может быть диагностировано, как имеющее рак, или может быть предрасположено или восприимчиво к раку. В контексте данного документа термин «лечение» относится предотвращению, замедлению начала, излечению, обращению, ослаблению, облегчению, минимизации, подавлению, приостановке вредоносного эффекта или стабилизации видимых симптомов вышеописанных раковых заболеваний, нарушений или патологических состояний. Также оно включает контроль заболевания, как описано выше. Под «контролем» подразумевается снижение тяжести заболевания, снижение частоты приступов заболевания, снижение продолжительности таких приступов, снижение тяжести таких приступов, замедление/снижение роста или пролиферации раковых клеток, замедление прогрессирования по меньшей мере одного симптома, улучшение по меньшей мере одного физикального параметра и тому подобное. Например, иммуностимуляторные антитела против VISTA должны стимулировать Т-клеточный, NK-клеточный или цитокиновый иммунитет против клеток-мишеней, например, раковых, инфицированных или патогенных клеток, и тем самым лечить раковые или инфекционные заболевания путем снижения количества клеток, вовлеченных в болезненное состояние. Агонистические антитела против VISTA должны снижать активность Т-клеток или NK-клеток и/или секрецию провоспалительных цитокинов, которые вовлечены в патологию заболевания при некоторых иммунных заболеваниях, таких как аутоиммунные, воспалительные или аллергические состояния, и тем самым лечить или уменьшать интенсивность патологии заболевания и разрушения тканей, которое может быть связано с такими состояниями (например, разрушение суставов, связанное с ревматоидным артритом).

«Млекопитающее» в контексте лечения относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных из зоопарков, спортивных животных или домашних любимцев, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее является человеком. Предпочтительно млекопитающее является человеком, у которого было диагностировано одно из заболеваний, нарушений или патологических состояний, описанных выше, или, в альтернативном варианте, который предрасположен по меньшей мере к одному типу рака.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству агента в соответствии с данным изобретением, эффективному для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. Терапевтические агенты согласно данному изобретению можно вводить субъекту одни или в виде части фармацевтической композиции, в которой они смешаны с фармацевтически приемлемым носителем.

Описанное в данном документе антитело против VISTA, его фрагмент, конъюгат и/или содержащую его фармацевтическую композицию в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения также можно вводить в рамках комбинированной терапии, т.е. в комбинации с другими потенцирующими агентами и/или другими вариантами терапии. В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения антитело против VISTA можно применять в комбинации с любым известным в данной области техники стандартным вариантом лечения рака (которые можно найти, например, по ссылке http://www.cancer.gov/cancertopics).

Например, комбинированная терапия может включать применение антитела против VISTA, его фрагмента, конъюгата и/или содержащей его фармацевтической композиции в комбинации по меньшей мере с одним другим терапевтическим или иммуномодуляторным агентом, другими соединениями или вариантами иммунотерапии или иммуностимуляторной стратегии, описанными в данном документе.

Антагонистические антитела против VISTA можно применять в комбинации с агонистическими антителами, нацеленными на иммунные контрольные точки, включая анти-CTLA4 mAb, такие как ипилимумаб, тремелимумаб; анти-PD-1, такое как ниволумаб BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538, AMP224, CT-011, MK-3475, анти-PDL-1 антагонисты, такие как BMS-936559/MDX-1105, MEDI4736, RG-7446/MPDL3280A; анти-LAG-3, такое как IMP-321, анти-TIM-3, анти-BTLA, анти-B7-H4, анти-B7-H3; агонистические антитела, нацеленные на иммуностимуляторные белки, включая анти-CD40 mAb, такие как CP-870,893, лукатумумаб, дацетузумаб; анти-CD137 mAb, такие как BMS-663513 урелумаб, PF-05082566; анти-OX40 mAb, такие как анти-OX40; анти-GITR mAb, такие как TRX518; анти-CD27 mAb, такие как CDX-1127; и анти-ICOS mAb.

Цитокины являются молекулярными мессенджерами, которые позволяют клеткам иммунной системы взаимодействовать друг с другом для генерации координированного, сильного, но самоограниченного ответа на антиген-мишень. Варианты терапии на основании цитокинов воплощают попытку прямой стимуляции собственной иммунной системы пациента для отторжения рака. В течение последних двух десятилетий возрастающий интерес к привлечению иммунной системы к устранению рака сопровождался усиленными попытками характеризовать цитокины и использовать их обширные сети сигнализации для разработки противоракового лечения. Цитокины напрямую стимулируют иммунные эффекторные клетки и стромальные клетки в участке опухоли и повышают распознавание опухолевых клеток цитотоксическими эффекторными клетками. Многочисленные исследования животных моделей опухолей продемонстрировали, что цитокины обладают широким спектром противоопухолевой активности, что было использовано в некотором числе подходов для терапии рака на основании цитокинов (Lee and Margolin 2011, Cancers 3(4):3856-93). Некоторое число цитокинов находятся на доклинической или клинической стадии разработки в качестве агентов, потенциирующих противоопухолевые иммунные ответы, для иммунотерапии рака, включая, помимо прочего: IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18 и IL-21, IL-23, IL-27, GM-CSF, IFNα (интерферон α), IFNβ и IFNγ.

Антагонистические антитела против VISTA и содержащие их фармацевтические композиции также можно применять в сочетании с другими соединениями или вариантами иммунотерапии. Например, комбинированная терапия может включать применение соединения согласно данному изобретению в комбинации по меньшей мере с одним терапевтическим или иммуномодуляторным агентом, или иммуностимуляторной стратегией, включая, но не ограничиваясь этим, противоопухолевые вакцины, адоптивную Т-клеточную терапию, снижение количества Treg, антитела (например, бевацизумаб, эрбитукс), пептиды, пептитела, небольшие молекулы, химиотерапевтические агенты, такие как цитотоксические и цитостатические агенты (например, паклитаксел, цисплатин, винорелбин, доцетаксел, гемцитабин, темозоломид, иринотекан, 5FU, карбоплатин), иммунологические модификаторы, такие как интерфероны и интерлейкины, иммуностимуляторные антитела, гормоны роста или другие цитокины, фолиевую кислоту, витамины, минералы, ингибиторы ароматазы, РНКи, ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы протеасом и т.д.

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения иммунные клетки, предпочтительно Т-клетки, можно приводить в контакт in vivo или ex vivo с представленными терапевтическими агентами для модуляции иммунных ответов. Т-клетки, приводимые в контакт с терапевтическими агентами, могут представлять собой любые клетки, которые экспрессируют Т-клеточные рецепторы, включая α/β и γ/δ Т-клеточные рецепторы. Т-клетки включают все клетки, которые экспрессируют CD3, включая подгруппы Т-клеток, которые также экспрессируют CD4 и CD8. Т-клетки включают как наивные клетки, так и клетки памяти и эффекторные клетки, такие как ЦТЛ. Т-клетки также включают такие клетки, как Th1, Tel, Th2, Th2, Th3, Thl7, Th22, Treg и Trl-клетки. Т-клетки также включают NKT-клетки и схожие уникальные классы Т-клеточной линии дифференцировки.

Применение агонистических антител против vista и содержащих их фармацевтических композиций для лечения аутоиммунных заболеваний

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения описанные в данном документе антитела против VISTA, их фрагменты, конъюгаты или содержащие их фармацевтические композиции, которые функционируют как стимулирующие VISTA терапевтические агенты, можно применять для лечения заболеваний, связанных с иммунной системой.

Необязательно, связанное с иммунной системой состояние включает связанное с иммунностью состояние, аутоиммунные заболевания, перечисленные в данном документе, отторжение трансплантата и реакция «трансплантат против хозяина», и/или блокирование или активацию иммунной стимуляции, опосредованной VISTA, связанные с иммунностью заболевания, перечисленные в данном документе, и/или иммунотерапию (активацию или ингибирование иммунной стимуляции).

Необязательно, иммунное состояние выбрано из аутоиммунного заболевания, отторжения трансплантата, воспалительного заболевания, аллергического состояния или реакции «трансплантат против хозяина». Необязательно, лечение комбинируют с применением другого компонента, используемого для лечения связанного с иммунностью состояния.

Таким образом, лечение множественного склероза с помощью агентов в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения множественного склероза, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение ревматоидного артрита или другого артритического состояния с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения ревматоидного артрита, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение ВЗК с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения ВЗК, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение псориаза с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения псориаза, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение диабета типа 1 с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения диабета типа 1, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение увеита с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения увеита, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение синдрома Шегрена с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения синдрома Шегрена, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение системной красной волчанки с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения системной красной волчанки, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение РТПХ с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения РТПХ, необязательно, как описано в данном документе.

Таким образом, лечение хронической или острой инфекции и/или ассоциированной с ней гепатотоксичности, например, гепатита, с помощью представленных агонистических антител можно комбинировать, например, с применением любого известного терапевтического агента или способа лечения хронической или острой инфекции и/или ассоциированной с ней гепатотоксичности, необязательно, как описано в данном документе.

В случае вышеописанных вариантов терапии субъекту с одним из вышеуказанных или других аутоиммунных или воспалительных состояний будут вводить описанное в данном документе иммуноингибиторное антитело против VISTA или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением, при этом антитело имитирует или агонизирует по меньшей мере один опосредованный VISTA эффект на иммунитет, например, оно подавляет активность цитотоксических Т-клеток или NK-клеток и/или выработку провоспалительных цитокинов, которые вовлечены в патологию заболевания, тем самым предотвращая или облегчая симптомы заболевания и потенциально приводя к продолжительной ремиссии, например, вследствие индукции Treg, которые вызывают Т-клеточную толерантность или продолжительную иммуносупрессию.

Перечисленные в данном документе терапевтические агенты и/или содержащую их фармацевтическую композицию в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно вводить в качестве единственного активного ингредиента или вместе с другими лекарственными препаратами в рамках иммуномодулирующих схем или другими противовоспалительными агентами, например, для лечения или предотвращения острого или хронического отторжения алло- или ксенотрансплантата, или воспалительных или аутоиммунных нарушений, или для индукции толерантности.

Применение агонистических антител против vista и содержащих их фармацевтических композиций для лечения сепсиса

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения описанные в данном документе антитела против VISTA, их фрагменты, конъюгаты и/или содержащие их фармацевтические композиции можно применять для лечения сепсиса. Сепсис представляет собой потенциально опасное для жизни осложнение инфекции. Сепсис представляет комплексный клинический синдром, который развивается, когда начинается нецелесообразное усиление или нарушение регуляции начального ответа организма-хозяина на инфекцию, несущее вред для организма-хозяина. За начальной гипервоспалительной фазой («цитокиновым штормом») сепсиса следует состояние иммуносупрессии (Hotchkiss et al 2013 Lancet Infect. Dis. 13:260-268). Эта последняя фаза нарушения иммунитета, также называемая «иммунопараличом», проявляется в неспособности выведения первичной инфекции, повторной активации вирусов, таких как ВПГ и цитомегаловирус, и развитии новых, вторичных инфекций, часто с организмами, которые не являются особенно вирулентными для иммунокомпетентного пациента. На сегодняшний день подавляющее большинство пациентов с сепсисом переживают начальный гипервоспалительный удар только для того, чтобы закончить свои дни в палате интенсивной терапии с индуцированной сепсисом полиорганной недостаточностью в течение следующих дней или недель. Растет понимание того, что индуцированная сепсисом иммуносупрессия является преобладающей иммунной недостаточностью у этих уязвимых пациентов. Нарушение выведения патогена после первичной инфекции и/или восприимчивость ко вторичным инфекциям вносят свой вклад в высокие уровни заболеваемости и смертности, связанные с сепсисом.

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения предложено применение комбинации перечисленных в данном документе терапевтических агентов и/или содержащей их фармацевтической композиции и известного терапевтического агента, эффективного для лечения сепсиса.

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения предложено применение комбинации перечисленных в данном документе терапевтических агентов и/или содержащей их фармацевтической композиции со стандартными или новыми вариантами лечения сепсиса, с вариантами терапии, которые блокируют цитокиновый шторм во время начальной гипервоспалительной фазы сепсиса, и/или с вариантами терапии, которые оказывают иммуностимуляторный эффект, с целью преодоления индуцированной сепсисом фазы иммуносупрессии.

Комбинация со стандартными вариантами лечения сепсиса, рекомендуемыми «International Guidelines for Management of Severe Sepsis and Septic Shock» («Международное руководство по контролю тяжелого сепсиса и септического шока») (Dellinger et al 2013 Intensive Care Med 39: 165-228), некоторые из которых описаны ниже.

1. Антибиотики широкого спектра действия, имеющие активность против всех вероятных патогенов (бактериальных и/или грибковых - лечение начинается, когда сепсис уже диагностирован, но конкретный патоген еще не определен), например, цефотаксим (Клафоран®), тикарциллин и клавуланат (Тиментин®), пиперациллин и тазобактам (Зосин®), имипенем и циластатин (Примаксин®), меропенем (Меррем®), клиндамицин (Клеоцин), метронидазол (Флагил®), цефтриаксон (Роцефин®), ципрофлоксацин (Ципро®), цефепим (Максипим®), левофлоксацин (Леваквин®), ванкомицин или любая комбинация перечисленных лекарственных препаратов.

2. Вазопрессоры, например, норэпинефрин, допамин, эпинефрин, вазопрессин.

3. Стероиды, например, гидрокортизон, дексаметазон или флудрокортизон, внутривенная или какая-либо другая инотропная терапия, например, добутамин для септических пациентов с дисфункцией миокарда.

4. Рекомбинантный человеческий активированный протеин C (rhAPC), такой как дротрекогин альфа (активированный) (DrotAA).

5. β-блокаторы дополнительно снижают местное и системное воспаление.

6. Метаболические вмешательства, такие как замещение пируватом, сукцинатом или высокими дозами инсулина.

Применение антител против vista и содержащих их фармацевтических композиций для снижения нежелательной иммунной активации после генной или клеточной терапии или трансплантации

В контексте данного документа термин «генная терапия» включает любой тип генной терапии, опосредованной векторами генной терапии, переноса генов, опосредованного вирусами переноса генов и дополнительно включает некоторые виды клеточной терапии, например, клеточной терапии клетками CAR T и CAR NK. В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения описанные в данном документе агонистические антитела против VISTA, их фрагменты, конъюгаты и/или фармацевтические композиции, которые нацелены на VISTA и имеют ингибиторную активность в отношении иммунных ответов, можно применять в качестве терапевтических агентов для снижения нежелательной иммунной активации после генной или клеточной терапии, применяемой для лечения различных генетических заболеваний. Не ограничиваясь единственной гипотезой, считается, что такие антитела имеют VISTA-подобную ингибиторную активность в отношении иммунных ответов и/или усиливают иммунную ингибиторную активность VISTA, необязательно, путем ингибирования патогенных Т-клеток и/или NK-клеток.

Многие продукты для генной терапии для лечения генетических заболеваний находятся на данный момент на этапе клинических исследований. В недавних исследованиях был задокументирован терапевтический успех в случае лечения нескольких генетических заболеваний с помощью векторов генной терапии. Стратегии генной терапии характеризуются 3 критическими элементами: геном, предназначенным для переноса, целевой тканью, в которую будут вносить ген, и вектором (средством доставки гена), используемым для облегчения попадания гена в целевую ткань. В подавляющем большинстве клинических исследований по генной терапии использовались вирусные векторы как очень эффективные средства доставки, включая ретровирусы, лентивирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, псевдотипированные вирусы и вирусы простого герпеса. Однако взаимодействия между человеческой иммунной системой и всеми компонентами векторов генной терапии представляют одно из основных ограничений для долгосрочной терапевтической эффективности. Исследования на людях показали, что вероятность иммунного ответа хозяина на вирусный вектор является высокой. Такие иммунные ответы на вирус или сам трансгенный продукт, приводящие к образованию нейтрализующих антител и/или разрушению трансдуцированных клеток цитотоксическими клетками, могут создавать большие помехи для терапевтической эффективности (Seregin and Amalfitano 2010 Viruses 2:2013; Mingozzi and High 2013 Blood 122:23; Masat et al 2013 Discov Med. 15:379). Следовательно, разработка стратегий для обхождения иммунных ответов и облегчения долгосрочной экспрессии трансгенных терапевтических белков является одной из основных задач для успеха генной терапии в клинических условиях.

Факторы, влияющие на иммунный ответ против трансгенных белков, кодируемых вирусными векторами, включают путь введения, дозу вектора, иммуногенность трансгенного белка, воспалительных статус организма-хозяина и серотип капсида. Считается, что эти факторы влияют на иммуногенность посредством инициации врожденного иммунитета, выработки цитокинов, созревания АПК, презентации антигенов и, в итоге, примирования наивных Т-лимфоцитов до функциональных эффекторных клеток (Mingozzi and High 2013 Blood 122:23). Следовательно, вполне логично возникла идея подавления иммунной активации путем создания помех для этих конкретных механизмов с целью индукции краткосрочной иммуносупрессии, избежания раннего иммунного примирования, которое следует за введением вектора, и стимуляции долгосрочной толерантности.

В качестве стратегии ингибирования нежелательной иммунной активации после генной терапии, в частности, после некоторого числа инъекций, иммуномодулирующее лечение посредством нацеливания на две неизбыточные контрольные точки иммунного ответа во время доставки вектора исследовали в животных моделях. Исследования вектор-опосредованных иммунных ответов после прививания аденовирусного вектора в легкие мышей или обезьян показало, что временная обработка анти-CD40L антителом приводит к супрессии индуцированных аденовирусом иммунных ответов; следовательно, животным можно было повторно вводить аденовирусный вектор. Краткосрочная обработка этим Ab приводила к долгосрочному эффекту на иммунные функции и продолжительному ингибированию аденовирус-специфического гуморального ответа в течение времени, намного превышающего время, когда эффект Ab уже не был существенным, что указывает на терапевтический потенциал блокирования этого костимуляторного пути в качестве иммуномодулирующей схемы для возможности введения векторов для переноса генов (Scaria et al. 1997 Gene Ther. 4: 611; Chirmule et al 2000 J. Virol. 74: 3345). Другие исследования показали, что совместное введение CTLA4-Ig и анти-CD40L Ab приблизительно во время первичного введения вектора снижало иммунные ответы на вектор, продлевало долгосрочную аденовирус-опосредованную генную экспрессию и делало возможным аденовирус-опосредованный перенос генов даже после окончания иммуносупрессивного эффекта этих агентов, что указывает на возможность получения персистенции, а также осуществления вторичного аденовирус-опосредованного переноса генов с временной иммуносупрессивной терапией (Kay et al 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:4686). В другом исследовании аналогичное введение CTLA4-Ig и анти-CD40L Ab устраняло образование нейтрализующих Ab против вектора и делало возможной экспрессию переноса генов при условии, что обработку проводили во время каждой инъекции для переноса генов (Lorain et al 2008 Molecular Therapy 16:541). Кроме того, введение CTLA4-Ig мышам, даже в случае одного введения, приводило к подавлению иммунных ответов и продлевало экспрессию трансгена в ранние моменты времени (Adriouch et al 2011 Front. Microbiol. 2: 199). Однако одного CTLA4-Ig было недостаточно для постоянного устранения иммунных ответов против трансгенного продукта. Комбинированная обработка с нацеливанием на две иммунные контрольные точки CTLA4-Ig и PD-L1 или PDL-2 приводила к синергетическому улучшению трансгенной толерантности в более поздние моменты времени, возможно, посредством нацеливания на два неизбыточных механизма иммуномодуляции, что приводило к долгосрочной персистенции и экспрессии трансгена (Adriouch et al 2011 Front. Microbiol. 2: 199).

В соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения представленные агонисты можно использовать для преодоления ограничения, связанного с иммунными ответами на генную терапию, для снижения нежелательной иммунной активации после генной терапии, одни или с другими средствами. Имеющиеся в настоящее время подходы включают исключение пациентов с антителами к вектору для доставки, введение высоких доз вектора, применения пустых капсидов для адсорбции антител против вектора, что обеспечивает последующую трансдукцию вектора, повторение циклов замещения плазмы (плазмафереза) для адсорбции иммуноглобулинов и снижения титров антител против вектора.

Новые подходы в попытках преодолеть эти ограничения можно поделить на две широкие категории: избирательная модуляция самого аденовирусного вектора и предварительная иммунная модуляция организма-хозяина (Seregin and Amalfitano 2010 Viruses 2:2013). Первая категория включает несколько инновационных стратегий, в том числе: (1) дисплей аденовирусного капсида специфических ингибиторов или лигандов; (2) ковалентные модификации всего капсидного компонента аденовирусного вектора; (3) применение тканеспецифических промоторов и местных путей введения; (4) применение аденовирусов с модифицированным геномом; и (5) разработку аденовирусов с химерным или альтернативным серотипом.

Вторая категория способов включает применение иммуносупрессивных лекарственных препаратов или специфических соединений для блокирования важных иммунных путей, которые индуцируются вирусными векторами. Иммуносупрессивные агенты исследовали в доклинических исследованиях, в которых была продемонстрирована их эффективность в предотвращении или устранении иммунных ответов на вектор переноса и трансгенный продукт. Они включали общие иммуносупрессивные агенты, такие как циклоспорин A; циклофосфамид; FK506; глюкокортикоиды или стероиды, такие как дексаметазон; блокаторы TLR9, такие как антагонистический к TLR9 олигонуклеотид ODN-2088; блокаторы TNF-a с анти-TNF-a антителами или антитело TNFR-Ig, ингибиторы Erk и другие ингибиторы сигнализации, такие как U0126. В клинических условиях введение глюкокортикоидов успешно использовали для притупления Т-клеточных ответов, направленных против вирусного капсида после переноса генов с помощью вектора на основе аденоассоциированного вируса (ААВ), экспрессирующего трансген человеческого фактора IX, в печень пациентов с тяжелой гемофилией В (Nathwani et al 2011 N. Engl. J. Med. 365:2357).

В противоположность предыдущим подходам, в которых применяли лекарственные препараты, имеющие тенденцию к «глобальной» и неспецифической иммуносупрессии организма-хозяина, были разработаны более избирательные иммуносупрессирующие подходы. Они включают применение агентов, которые обеспечивают блокирование положительных костимуляторных взаимодействий, например, между CD40 и CD154, ICOS и ICOSL, CD28 и CD80 или CD86 (включая CTLA4-Ig), NKG2D и лигандами NKG2D, LFA-1 и ICAM, LFA-3 и CD2, 4-1BB и 4-1BBL, OX40 и OX40L, GITR и GITRL, и агентов, которые стимулируют отрицательные костимуляторные рецепторы, такие как CTLA-4, PD-1, BTLA, LAG-3, TIM-1, TEVI-3, KIR, и рецепторы для B7-H4 и B7-H3. Некоторые из них применяли в доклинических или клинических трансплантационных исследованиях (Pilat et al 2011 Sem. Immunol. 23:293).

В вышеописанных вариантах генной или клеточной терапии или в лечении показаний, связанных с трансплантацией, предпочтительно субъекту, который получил или должен получать клеточную или генную терапию или трансплантат ткани или органа, будут вводить описанное в данном документе иммуноингибиторное антитело против VISTA или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением, при этом антитело усиливает, агонизирует или имитирует по меньшей мере один опосредованный VISTA эффект на иммунитет, например, его ингибиторный эффект на активность цитотоксических Т-клеток или NK-клеток и/или его ингибиторный эффект на выработку провоспалительных цитокинов, или его стимуляторный эффект на Treg, таким образом предотвращая или снижая иммунные ответы организма-хозяина против клетки или гена, применяемых в терапии, или нежелательный иммунный ответ против трансплантированный клеток, органа или ткани. Предпочтительно лечение будет вызывать продолжительную иммунную толерантность к трансплантированным или инфузированным клеткам, ткани или органу. В некоторых случаях, например, в случае, когда трансплантированные клетки, ткани или органы содержат иммунные клетки, описанное в данном документе иммуноингибиторное антитело против VISTA или его антигенсвязывающий фрагмент можно приводить в контакт с клетками, тканью или органом до инфузии или трансплантации и/или потенциально иммунными клетками реципиента трансплантата, чтобы придать иммунным клеткам толерантность и потенциально предотвратить нежелательный иммунный ответ или иммунную реакцию РТПХ.

Фармацевтические композиции

В другом аспекте в данном изобретении предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением и, необязательно, другой иммуносупрессивный или другой активный агент. Таким образом, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антител против человеческого VISTA в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения. В частности, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное [иммуносупрессивное] количество по меньшей мере одного агонистического антитела или фрагмента антитела против человеческого VISTA в соответствии с данным изобретением.

Фармацевтическую композицию в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения [т.е. в случае антагонистических антител к VISTA, описанных в данном документе] можно применять для лечения рака, причем рак является неметастатическим, инвазивным или метастатическим, и/или для лечения связанных с иммунной системой нарушений, аутоиммунности, аллергии, РТПХ, воспаления или гепатотоксичности, связанной с инфекционным нарушением и/или сепсисом [т.е. в случае агонистических антител к VISTA, описанных в данном документе]. «Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет нарушение, а также тех, у кого необходимо предотвратить нарушение. Следовательно, подлежащее лечению млекопитающее согласно данному документу может быть диагностировано, как имеющее нарушение, или может быть предрасположено или восприимчиво к нарушению. «Млекопитающее» в контексте лечения относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных из зоопарков, спортивных животных или домашних любимцев, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее является человеком.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству агента в соответствии с данным изобретением, эффективному для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. Терапевтические агенты согласно данному изобретению можно вводить субъекту одни или в виде части фармацевтической композиции, в которой они смешаны с фармацевтически приемлемым носителем. Во многих случаях агонистические или антагонистические антитела против VISTA в соответствии с изобретением применяют в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами или другими терапевтическими агентами, применимыми в лечении конкретного патологического состояния.

Говорят, что композиция является «фармацевтически приемлемым носителем», если пациент-реципиент может переносить ее введение. В контексте данного документа «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые агенты, агенты, придающие изотоничность и замедляющие всасывание, и т.д., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии).

Такие композиции включают стерильную воду, забуференный солевой раствор (например, Трис-HCl, ацетат, фосфат), модуляторы pH и ионной силы и, необязательно, добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, полисорбат 20, полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт) и объемообразующие вещества (например, лактоза, маннит). Также можно использовать неводные растворители или базовые растворы, как подробно описано ниже.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, применяя материалы для покрытия, такие как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсий и используя поверхностно-активные вещества. В зависимости от пути введения, активное соединение, т.е. моноклональные или поликлональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты и содержащие их конъюгаты и/или альтернативные остовы, которые специфически связывают любой из белков VISTA, или биспецифическую молекулу можно покрывать материалом, чтобы защитить соединение от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Фармацевтические композиции в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения могут содержать одну или более фармацевтически приемлемых солей. «Фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет необходимую биологическую активность родительского соединения и не оказывает нежелательного токсикологического эффекта (смотрите, например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислот и соли присоединения оснований. Соли присоединения кислот включают соли, полученные из нетоксических неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфористая и тому подобные, а также из нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Соли присоединения оснований включают соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобные, а также из нетоксических органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобные.

Фармацевтические композиции в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения также могут содержать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (БГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), лецитин, пропилгаллат, a-токоферол, и тому подобные; и (3) металлохелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобные.

Эти композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульсифицирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно гарантировать как посредством процедур стерилизации, выше, так и посредством включения различных антибактериальных и антигрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и тому подобного. Может существовать необходимость во включении в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобное. Кроме того, продолжительное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно обеспечивать путем включения агентов, которые замедляют всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какие-либо традиционные среды или агенты несовместимы с активным соединением, подразумевается их применение в фармацевтических композициях в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения. Также в композиции могут быть включены дополняющие активные соединения.

Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно готовить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, применяя покрытие, такое как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсий и используя поверхностно-активные вещества. Во многих случаях будет предпочтительно включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Замедленное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить путем включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например, моностеаратных солей и желатина. Стерильные инъекционные растворы можно готовить путем внесения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. В общем случае дисперсии готовят путем внесения активного соединения в стерильный базовый раствор, который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые позволяют получать порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из предварительно стерильно-профильтрованного раствора.

Стерильные инъекционные растворы можно готовить путем внесения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. В общем случае дисперсии готовят путем внесения активного соединения в стерильный базовый раствор, который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые позволяют получать порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из предварительно стерильно-профильтрованного раствора.

Композицию согласно данному изобретению можно вводить одним или более путями введения, используя один или более из множества известных в данной области техники способов. Как понятно специалисту в данной области техники, путь и/или режим введения будет варьироваться в зависимости от необходимых результатов. Предпочтительные пути введения для терапевтических агентов в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения включают внутрисосудистое введение (например, инъекцию или инфузию), внутривенное, внутримышечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, подкожное, спинальное, пероральное, энтеральное, ректальное, легочное (например, ингаляцию), назальное, местное (включая трансдермальное, буккальное или подъязычное), интравезикальное, интравитреальное, внутрибрюшинное, вагинальное, мозговое введение (например, интрацеребровентрикулярное, интрацеребральное и усиленную конвекцией диффузию), введение в ЦНС (например, интратекальное, периспинальное и интраспинальное) или парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное), трансмукозальное (например, подъязычное введение) введение или введение посредством имплантата, или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии, и/или другие пути доставки и/или формы введения, известные в данной области техники. В контексте данного документа выражение «парентеральное введение» означает режимы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию. В конкретном варианте реализации изобретения белок, терапевтический агент или фармацевтическую композицию в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения можно вводить внутрибрюшинно или внутривенно.

В альтернативном варианте VISTA-специфическое антитело в соответствии с изобретение можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальные или мукозальный путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, подъязычно или местно.

Активные соединения можно готовить с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, например, как в случае формы с контролируемым высвобождением, включая трансплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких форм запатентованы или в целом известны специалистам в данной области техники. Смотрите, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области техники. Например, в предпочтительном варианте реализации терапевтическую композицию в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения можно вводить с помощью безыгольного гиподермического устройства для инъекций, такого как устройства, описанные в патентах США №5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, применимых в данном изобретении, включают: патент США № 4487603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для распределения препарата с контролируемой скоростью; патент США №4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения медикаментов через кожу; патент США №4447233, в котором описан инфузионный насос для введения препарата с точно определенной скоростью инфузии; патент США №4447224, в котором описан имплантируемый инфузионный аппарат с переменным потоком для непрерывного введения лекарственного препарата; патент США №4439196, в котором описана осмотическая система введения лекарственного препарата, имеющая многокамерные компартменты; и патент США №4475196, в котором описана осмотическая система введения лекарственного препарата. Эти патенты включены в данный документ посредством ссылки. Специалистам в данной области техники известно множество других подобных имплантатов, систем введения и модулей.

В определенных вариантах реализации изобретения антитела против VISTA можно готовить так, чтобы гарантировать надлежащее распределение in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) задерживает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы гарантировать, что терапевтические соединения в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения проходят через ГЭБ (в случае необходимости), их можно готовить, например, в липосомах. Способы получения липосом смотрите, например, в патентах США №4522811; 5374548; и 5399331. Липосомы могут содержать один или более компонентов, которые избирательным образом транспортируются в конкретные ткани или органы, таким образом усиливая направленную доставку лекарственного препарата (смотрите, например, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Типовые нацеливающие молекулы включают фолат или биотин (смотрите, например, патент США №5416016 авторства Low et al.); маннозиды (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); антитела (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); рецептор поверхностно-активного протеина А (Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); также смотрите K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; и I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

В другом варианте реализации изобретения иммуноконъюгаты согласно изобретению можно использовать для нацеливания соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммуносупрессантов и т.д.) на клетки, имеющие рецепторы VISTA на клеточной поверхности, путем связывания таких соединений с описанным в данном документе антителом. Таким образом, в изобретении также предложены способы локализации ex vivo или in vivo клеток, экспрессирующих VISTA (например, с помощью выявляемой метки, такой как радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента). В альтернативном варианте иммуноконъюгаты можно использовать для уничтожения клеток, имеющих рецепторы VISTA на клеточной поверхности, путем нацеливания цитотоксинов или радиотоксинов на антиген VISTA.

В контексте данного документа «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые агенты, агенты, придающие изотоничность и замедляющие всасывание, и т.д., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения, активное соединение, т.е. растворимый полипептидный конъюгат, содержащий эктодомен антигена VISTA, антитело, иммуноконъюгат, альтернативные остовы и/или биспецифическую молекулу можно покрывать материалом, чтобы защитить соединение от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Фармацевтические соединения в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения могут содержать одну или более фармацевтически приемлемых солей. «Фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет необходимую биологическую активность родительского соединения и не оказывает нежелательного токсикологического эффекта (смотрите, например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислот и соли присоединения оснований. Соли присоединения кислот включают соли, полученные из нетоксических неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфористая и тому подобные, а также из нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Соли присоединения оснований включают соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобные, а также из нетоксических органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобные.

Фармацевтическая композиция в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации изобретения также может содержать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (БГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), лецитин, пропилгаллат, a-токоферол, и тому подобные; и (3) металлохелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобные. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, применяя материалы для покрытия, такие как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсий и используя поверхностно-активные вещества.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какие-либо традиционные среды или агенты несовместимы с активным соединением, подразумевается их применение в фармацевтических композициях в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения. Также в композиции могут быть включены дополняющие активные соединения.

Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно готовить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, применяя покрытие, такое как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсий и используя поверхностно-активные вещества. Во многих случаях будет предпочтительно включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Замедленное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить путем включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например, моностеаратных солей и желатина. Стерильные инъекционные растворы можно готовить путем внесения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости c последующей стерилизацией путем микрофильтрации. В общем случае дисперсии готовят путем внесения активного соединения в стерильный базовый раствор, который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые позволяют получать порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из предварительно стерильно-профильтрованного раствора.

Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, будет варьироваться в зависимости от подлежащего лечению субъекта и конкретного режима введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, в общем случае будет таким количеством композиции, которое приводит к терапевтическому эффекту. В общем случае из ста процентов это количество будет находиться в диапазоне от около 0,01 процента до около девяноста девяти процентов активного ингредиента, предпочтительно от около 0,1 процента до около 70 процентов, наиболее предпочтительно от около 1 процента до около 30 процентов активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Схемы дозирования корректируют так, чтобы обеспечить оптимальный необходимый ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить одну болюсную дозу, можно вводить несколько разделенных доз в течение некоторого времени или дозу можно пропорционально снижать или повышать в зависимости от требований терапевтической ситуации. В особенности предпочтительно готовить парентеральные композиции в единичной дозированной форме для облегчения введения и однородности дозировки. В контексте данного документа единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для подлежащих лечению субъектов; каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное так, чтобы оказывать необходимое терапевтический эффект, вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификации для единичных дозированных форм в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения продиктованы и напрямую зависят от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного предполагаемо достигаемого терапевтического эффекта, и (b) ограничений, свойственных области составления соединений, таких как активное соединение для лечения чувствительности у индивидов.

Для введения описанного в данном документе антитела к VISTA дозировка находится в диапазоне от около 0,0001 до 100 мг/кг, и чаще, от 0,01 до 5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг. Типовая схема лечения включает введение один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в каждые 3 месяца или один раз в каждые три-шесть месяцев. Предпочтительные режимы дозирования для описанного в данном документе антитела в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами реализации данного изобретения включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела путем внутривенного введения, при этом описанное в данном документе антитело вводят, используя одну из следующих схем дозирования: (i) каждые четыре недели для трех доз, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела, затем 1 мг/кг массы тела каждые три недели.

В некоторых способах два или более моноклональных антител с разной специфичностью связывания вводят одновременно, в случае чего дозировка каждого описанного в данном документе антитела соответствует указанным диапазонам. Описанное в данном документе антитело обычно вводят неоднократно. Интервалы между введением единичных доз могут составлять, например, сутки, неделю, месяц, каждые три месяца или год. Интервалы также могут быть нерегулярными согласно показаниям измерений уровней антитела относительно целевого антигена в крови пациентов. В некоторых способах дозировку корректируют для достижения плазменной концентрации антитела, составляющей около 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - около 25-300 микрограмм/мл.

В альтернативном варианте терапевтический агент можно вводить в виде формы с замедленным высвобождением, в случае чего необходимо менее частое введение. Дозировка и частота введения варьируются в зависимости от времени полужизни терапевтического агента в организме пациента. В общем случае человеческие антитела демонстрируют наибольшее время полужизни, за ними следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Время полужизни для слитых белков может сильно варьироваться. Дозировка и частота введения могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактических применениях вводят относительно низкую дозу через относительно нечастые интервалы в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей оставшейся жизни. При терапевтических применениях иногда необходимо вводить относительно высокую дозу через относительно короткие интервалы до снижения или прекращения прогрессирования заболевания и, предпочтительно, до тек пор, пока пациент не продемонстрирует частичное или полное снижение интенсивности симптомов заболевания. После этого введение можно продолжать в профилактическом режиме.

Действительные уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтических композициях согласно данному изобретению можно варьировать так, чтобы получать количество активного ингредиента, эффективное для достижения необходимого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и режима введения без проявления токсичности для пациента. Выбранный уровень дозирования будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций согласно данному изобретению или их сложных эфиров, солей или амидов, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраста, пола, массы, патологического состояния, общего состояния здоровья и анамнеза подлежащего лечению пациента, и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

После описания изобретения приведены следующие примеры, чтобы дополнительно проиллюстрировать изобретение и присущие ему преимущества.

Примеры

Пример 1. Применение методов анализа для скрининга иммуносупрессивных антител против мышиного VISTA

Авторы данного изобретения разработали различные методы анализа для скрининга предполагаемых агонистических антител против мышиного VISTA. Как показано на фиг. 1, in vitro и in vivo скрининговый анализ использовали для идентификации иммуносупрессивных анти-VISTA mAb. В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 1A, очищенные Т-клетки высевали поверх анти-CD3 в присутствии указанных mAb в течение 72 часов. Пролиферацию измеряли путем включения H3. В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 1B, очищенные Т-клетки DO11.10 стимулировали активированными ISQ АПК в течение 6 суток в присутствии указанного антитела. Пролиферацию измеряли, используя разведение красителя CTV. В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 1С, РТПХ индуцировали переносом клеток C57BL/6 облученным реципиентам BALB/c. Мышей В/Б инъецировали 200 мкг антитела на 0, 2 и 4 сутки после переноса и анализировали выживаемость. В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 1D, мышей обрабатывали 10 мг/кг указанного антитела за 3 часа до введения ConA (15 мг/кг) и анализировали IL-2 в плазме на 6 с помощью Luminex.

В частности, в первом анализе выделяли Т-клетки CD4⁺ и инкубировали с Ab1, Ab2 или Ab3 перед добавлением в покрытые анти-CD3 планшеты. Через 3 суток в культуре Т-клетки обрабатывали меченым тритием тимидином, который поглощается пролиферирующими клетками. Следует отметить, что Ab1 и Ab2 индуцировали существенное снижение скорости пролиферации Т-клеток, тогда как Ab3 не оказывало никакого эффекта (фиг. 1). В аналогичном анализе, в котором трансгенные Т-клетки вместо этого стимулировали обработанными антигеном АПК, активацию Т-клеток измеряли по разведению пролиферативного красителя. Как и в анализе с анти-CD3, Ab1 подавляло антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток на ~50% (фиг. 1B). Эти данные указывают, что Ab3 mAb блокирует функцию mVISTA (т.е. усиливает иммунные ответы), тогда как Ab1 и Ab3 стимулируют функцию mVISTA и оказывают понижающую регуляцию на ключевые иммунные ответы.

Также мы определили, можно ли различать Ab3 и Ab1, используя in vivo животные модели, в частности, модели РТПХ и гепатита ConA. Мыши с РТПХ, обработанные контрольным антителом (Ham Ig), имели прогрессирующее заболевание и их необходимо было умерщвлять через 4 недели посте трансплантации, как и ожидалось (фиг. 1C). Обработанные Ab3 также были восприимчивы к РТПХ и, по факту, большинство мышей погибли раньше обработанной контролем группы, что указывает на то, что Ab3 может обострять заболевание. В противоположность этому, все обработанные Ab1 мыши не демонстрировали очевидных симптомов РТПХ и практически все были здоровы в течение по меньшей мере 40 суток. В частности, в этих экспериментах мыши с РТПХ, обработанные контрольным антителом (Ham Ig), имели прогрессирующее заболевание и их необходимо было умерщвлять через 4 недели посте трансплантации, как и ожидалось (фиг. 1C). Обработанные Ab3 также были восприимчивы к РТПХ и, по факту, большинство мышей погибли раньше обработанной контролем группы, что указывает на то, что Ab3 может обострять заболевание. В противоположность этому, все обработанные Ab1 мыши не демонстрировали очевидных симптомов РТПХ и практически все были здоровы в течение по меньшей мере 40 суток.

В модели ConA авторы изобретения исследовали, будет антитело к VISTA влиять на хорошо изученный Т-клеточный цитокиновый ответ на ConA. Следует отметить, что Ab1, но не Ab3, индуцировало сниженные плазменные уровни цитокина IL-2 (фиг. 1D). В частности, в модели ConA авторы изобретения дополнительно исследовали, будет каждое антитело к VISTA влиять на хорошо изученный Т-клеточный цитокиновый ответ на ConA. Следует отметить, что Ab1, но не Ab3, индуцировало сниженные плазменные уровни цитокина IL-2 (фиг. 1D).

Соответственно, эти результаты демонстрируют, что оба анти-VISTA mAb (Ab1 и Ab2) являются иммуносупрессивными, и также было показано, что такие иммуносупрессивные антитела против мышиного VISTA можно отличить от воспалительных иммуносупрессивных антител против мышиного VISTA (Ab3). Как проиллюстрировано на фиг. 1, Ab1 является эффективным (иммуносупрессивным) во многих воспалительных моделях, включая РТПХ, подобный волчанке гломерулонефрит NZB/W F1, индуцированный конканавалином A (ConA) гепатит, индуцированный антителами к коллагену артрит (CAIA) и индуцированный имиквимодом псориаз. При каждом из этих заболеваний введение Ab1 во время прогрессирования заболевания сильно снижало патологию и/или смертность. В каждой из перечисленных моделей существуют уникальные требования в отношении Т-клеток для прогрессирования заболевания. Как РТПХ, так и ConA зависят от ответов Т-клеток Th1.

Пример 2. Идентификация антител против VISTA, которые подавляют аутоиммунность в разных моделях аутоиммунных заболеваний

В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 2A-F, снова проводили сравнение эффекта разных антител против мышиного VISTA в разных моделях заболевания. В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 2A, мышей NZB/W F1 обрабатывали 3X/неделю Ab1 или Ham Ig (200 мкг), начиная за 25 недель до конца эксперимента. «X» обозначает моменты времени, когда умерщвляли всю обработанную контролем группу. В эксперименте, проиллюстрированном на фиг. 2B, мышей обрабатывали 200 мкг антитела за 3 часа до введения 15 мг/кг ConA и отслеживали выживаемость в течение 80 часов. В эксперименте, проиллюстрированном на фиг. 2С, мышей обрабатывали последовательно mAb к коллагену II, а затем ЛПС, и определяли степень артрита по измерению отека лап. В экспериментах Ab1 и Ham-Ig вводили (200 мкг) 3X через сутки. В эксперименте, проиллюстрированном на фиг. 2D, имиквимод наносили на уши мышей ежесуточно. На 14 сутки вводили Ab1 или Ham-Ig (200 мкг) через сутки и штангенциркулем измеряли толщину ушей. В эксперименте, проиллюстрированном на тех же фиг. 2E-F, имиквимод наносили на спины мышей ежесуточно. На 9 сутки мышей умерщвляли и получали срезы кожи, которые окрашивали в отношении экспрессии CD3 методом ИГХ.

Как проиллюстрировано фиг. 2А-F, в каждой из этих экспериментальных моделей введение Ab1 во время прогрессирования заболевания сильно снижало патологию и/или смертность. В каждой из перечисленных моделей существуют уникальные требования в отношении Т-клеток для прогрессирования заболевания. Как РТПХ, так и ConA зависят от ответов Т-клеток Th1.

Индуцированный имиквимодом псориаз представляет собой IL-17/23-зависимое заболевание, при котором Т-клетки привлекаются в дермальный слой кожи. Ab1 резко снижало число клеток CD3⁺ в дерме (фиг. 2E и F), но не влияло на популяции Т-клеток селезенки (данные не показаны), что указывает на то, что эти антитело против мышиного VISTA преимущественно подавляет иммунитет в месте воспалительного поражения.

Волчанка NZB/W F1 представляет собой многофакторное заболевание, вклад в которое вносят В-клетки, Т-клетки и миелоидные клетки. В этой модели терапевтическое введение Ab1 снижало уровни белка в моче, что указывает на снижение повреждения почек. И наконец, CAIA не включает адаптивный иммунитет, а регулируется макрофагами и гранулоцитами. В этой модели супрессия со стороны анти-VISTA указывает на то, что антитело также может влиять на миелоидный компартмент. Следовательно, супрессивные VISTA mAb опосредуют эффект как на компартменты Т-клеток, так и врожденного иммунитета.

Таким образом, как проиллюстрировано на фиг. 1 и фиг. 2, оба моноклональных хомячьих антитела против мышиного VISTA, Ab1 и AB2, индуцировали существенное снижение скорости пролиферации Т-клеток, тогда как Ab3 не оказывало никакого эффекта (фиг. 1). В аналогичном анализе, в котором трансгенные Т-клетки стимулировали обработанными антигеном АПК, активацию Т-клеток измеряли по разведению пролиферативного красителя. Как и в анализе с анти-CD3, Ab1 подавляло антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток на ~50% (фиг. 1B). Эти данные позволяют предположить, что Ab1 и Ab2 стимулируют функцию VISTA и, таким образом, оказывают понижающую регуляцию ключевых иммунных ответов.

В частности, Ab1, хомячье антитело против мышиного VISTA, было эффективным во многих воспалительных моделях, включая РТПХ, подобный волчанке гломерулонефрит NZB/W F1, индуцированный конканавалином A (ConA) гепатит, индуцированный антителами к коллагену артрит (CAIA) и индуцированный имиквимодом псориаз (фиг. 1 и 2). При каждом из этих заболеваний введение Ab1 во время прогрессирования заболевания сильно снижало патологию и/или смертность. В каждой из перечисленных моделей существуют уникальные требования в отношении Т-клеток для прогрессирования заболевания. Как РТПХ, так и ConA зависят от ответов Т-клеток Th1. Как было указано выше, индуцированный имиквимодом псориаз представляет собой IL-17/23-зависимое заболевание, при котором Т-клетки привлекаются в дермальный слой кожи. Следовательно, супрессия со стороны Ab1 в этой конкретной аутоиммунной модели указывает на то, что это антитело также может влиять на миелоидный компартмент. Следовательно, иммуносупрессивные mAb против мышиного VISTA опосредуют эффект как на компартменты Т-клеток, так и врожденного иммунитета.

Пример 3. Получение мышей с нокином человеческого VISTA для применения в скрининге в отношении агонистических антител против человеческого VISTA

Предыдущие примеры относились к выделению и изучению характеристик агонистических антител против мышиного VISTA. До этого в литературе не было никаких данных относительно агонистических антител против человеческого VISTA. И это несмотря на тот факт, что заявителем данного изобретения и другими группами было идентифицировано очень много антагонистических антител против человеческого VISTA. Соответственно, до появления этого изобретения не было уверенности в возможности идентификации агонистических антител против человеческого VISTA.

Такие антитела были бы очень полезными, так как в настоящее время не существует утвержденных человеческих терапевтических средств, в которых используется природная функция ПЦР для подавления иммунного ответа. Хотя оренсия (CTLA4-Ig) является эффективным препаратом, его действие состоит только в блокировании взаимодействия и пути CD28-B7, но не в стимуляции пути понижающей регуляции. Как проиллюстрировано эффективным иммуносупрессивным эффектом 3 разных агонистических анти-VISTA mAb, описанным в нижеприведенных примерах, привлечение этого пути может оказаться революционным для контроля различных аутоиммунных заболеваний человека. Кроме того, иммуносупрессивное влияние анти-VISTA на адаптивные и врожденные аутоиммунные эффекторные механизмы отличает их от многих других противовоспалительных агентов.

В связи с вышесказанным предположили, что желаемым и необходимым элементом при скрининге в отношении антител против человеческого VISTA является мышь с нокином человеческого VISTA. Заявителем данного изобретения была создана мышь с нокином человеческого VISTA («мышь hV-KI»). Эти мыши hV-KI экспрессируют человеческий VISTA вместо мышиного VISTA. В частности, как показано на фиг. 3, Т-клетки CD4⁺, Т-клетки CD8⁺, Treg (CD4⁺ FoxP3⁺) и моноциты, CD11b⁺, Ly6C⁺, Ly6G^- выделяли из лимфатических узлов ДТ и VISTA KI мышей и окрашивали антителами к αVISTA против мышиного или человеческого белка соответственно. Профиль экспрессии hV-KI идентичен наблюдаемому у мышей ДТ, так как Т-клетки CD4⁺ и CD8⁺, регуляторные Т-клетки и моноциты все экспрессируют сопоставимые количества поверхностного белка в обоих штаммах (смотрите фиг. 3).

Кроме того, у мышей hV-KI не развиваются никакие признаки воспалительного заболевания, которые наблюдаются у мышей VISTA KO, что указывает на то, что hVISTA является полностью функциональным в мышиной иммунной системе (данные не показаны). Соответственно, эту мышиную модель можно использовать в разных видах анализа для проведения скрининга в отношении иммуносупрессивных mAb.

Пример 4. Синтез предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA

Последовательности разных антител против человеческого VISTA приведены на фиг. 4. Эти антитела специфически связываются с человеческим VISTA, например, VSTB49-VSTB116, и обладают антагонистическими свойствами VISTA, т.е. эти антитела ингибируют супрессивный эффект VISTA на иммунитет, когда они представлены в формате IgG1, например, когда антитело содержит Fc-область IgG1 дикого типа, т.е. немодифицированную.

Среди антител, приведенных на фиг. 4, есть 1E8. Это мышиное антитело против человеческого VISTA содержит полипептиды вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные ниже, и было преобразовано авторами изобретения в две человеческие химерные формы. Первое химерное антитело, называемое в данном документе INX800, было получено путем присоединения полипептидов константной области тяжелой и легкой цепи человеческого IgG2 к полипептидам вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 1E8. В этом первом химерном антителе ни один из аминокислотных остатков в пределах константных областей IgG2 не был модифицирован.

Второе химерное антитело, называемое в данном документе INX801, было получено аналогично, путем присоединения полипептидов константной области тяжелой и легкой цепи человеческого IgG2 к полипептидам вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 1E8. В этом втором химерном антителе остаток цистеина в позиции 127 в каппа цепи человеческого IgG2 был преобразован в серин. В прочих случаях ни один из аминокислотных остатков в пределах константных областей IgG2 не был модифицирован.

Полипептид V_H IE8

EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEVYPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALYYCARGRGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 57)

Полипептид V_L IE8

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLSWYHQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQNFWSTPFTFGSGTKLEIKR. (SEQ ID NO: 58)

Пример 5. Оценка предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA в животной модели ConA

Эффект обоих химерных антител IgG2 и контрольных антител сравнивали в модели индуцированного конканавалином А гепатита. В этой in vivo модели разных животных предварительно дозировали 10 мг/кг химерного антитела IgG2 (INX800 или INX801) или контрольным антителом за 3 часа до введения конканавалина А. Через 3 часа после введения антитела мышей дозировали ConA при 12 мг/кг. Затем у этих животных и контрольных животных брали кровь путем пункции сердца через 6 часов после дозирования ConA. Все мыши выглядели хорошо без очевидных признаков заболеваемости или смертности.

Затем кровь анализировали в отношении экспрессии цитокинов. В частности, проводили 32-канальный эксперимент, используя плазму, полученную из собранных образцов крови, используя традиционные методы и набор для исследования цитокинов, традиционно применяемый в анализе цитокинов. Как проиллюстрировано на фиг. 5, экспрессия нескольких провоспалительных цитокинов была существенно подавлена у животных, которым вводили антитела INX800 или INX801, по сравнению с контрольными животными. В частности, уровни GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17 и TNF-α были существенно ниже у животных, обработанных INX800 или INX801, по сравнению с контрольными. Сниженная экспрессия этих цитокинов была по существу идентичной у животных, обработанных INX800 или INX801.

Также экспрессия некоторых хемокинов (кератиноцитарных хемокинов или «KC») и макрофагального воспалительного белка 2 (MIP-2) была существенно повышена у обработанных INX800 или INX801 животных по сравнению с контрольными. Снова, повышенная экспрессия этих белков была по существу идентичной у животных, обработанных INX800 или INX801. На основании этих результатов оба антитела, INX800 и INX801, оказались эффективными агонистами VISTA, так как они вызывали иммуносупрессивный эффект, аналогичный тому, который вызывает VISTA в отношении экспрессии различных воспалительных цитокинов.

Пример 6. Оценка предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA в животной модели реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ)

Эффект тех же самых предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA, INX800 и INX801, также сравнивали в животной модели реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) в сравнении с необработанными животными или контрольными животными, обработанными нерелевантным антителом. В этой животной модели Т-клетки адоптивно переносили облученным животным-хозяевам и измеряли массу тела как показатель заболевания. На основании прогрессирования болезни РТПХ всех контрольных мышей (8/8) пришлось умерщвлять. Результаты исследований на этих животных приведены на фиг. 6. Как проиллюстрировано, ни одну из обработанных INX800 или INX801 [0/8] мышей не пришлось умерщвлять, так как РТПХ значительно подавлялась в результате обработки антителом INX800 или INX801. На основании этих результатов оба антитела, INX800 и INX801, оказались эффективными агонистами VISTA, так как они эффективно подавляли иммунные ответы РТПХ.

Пример 7. Эффект предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA на CD3-зависимые Т-клеточные иммунные ответы

Эффект тех же самых агонистических антител против человеческого VISTA, INX800 и INX801, также сравнивали в отношении их потенциала в подавлении CD3-зависимого Т-клеточного иммунного ответа. В этих экспериментах планшеты покрывали OKT3 (2,5 мкг/мл). Т-клетки предварительно инкубировали с антителом в течение 30 минут. Затем обработанные антителом Т-клетки добавляли в покрытые OKT3 планшеты и культивировали Т-клетки в этих планшетах в течение 72 часов. В качестве показателя потенциального эффекта антител на CD3-зависимые Т-клеточные иммунные ответы определяли пролиферацию Т-клеток, используя способ включения трития, общепринятый способ выявления пролиферации Т-клеток. Как проиллюстрировано на фиг. 7, пролиферация Т-клеток была значительно снижена в культивируемых Т-клетках, которые были обработаны антителами INX800 и INX801, по сравнению с культурами контрольных Т-клеток.

Пример 8. Эффект предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA на число Т-клеток из специфических популяций и общее число Т-клеток

Также проводили эксперименты с целью сравнения возможного эффекта тех же самых антител против человеческого VISTA, INX800 и INX801, на число специфических Т-клеток, а также на общее число Т-клеток. Эти эксперименты проводили, чтобы оценить, может ли наблюдаемый эффект представленных антител против человеческого VISTA на цитокины и Т-клетки объясняться истощением клеток (неспецифический эффект), а не инициацией этими антителами иммуносупрессивного эффекта на основании стимуляции ими специфического VISTA-опосредованного иммуносупрессивного эффекта на иммунитет.

Оба агонистических антитела против человеческого VISTA, INX800 и INX801, не оказывали существенного эффекта на число Т-клеток из специфических популяций или на общее число Т-клеток. Кроме того, результаты для обоих антител, INX800 и INX801, были по существу одинаковыми. Результаты типовых экспериментов приведены на фиг. 8.

На их основании наблюдаемый агонистический эффект INX800 и INX801 не объясняется истощением клеток. Скорее оба этих антитела вызывают иммуносупрессивный эффект на активацию/пролиферацию Т-клеток, иммунные ответы РТПХ и экспрессию провоспалительных цитокинов на основании стимуляции ими специфического VISTA-опосредованного иммуносупрессивного эффекта на иммунитет.

Пример 9. Обобщенные данные по эффекту разных агонистических антител против человеческого VISTA в разных иммунных моделях

Как показано в таблице 1 и 2 ниже, оценивали агонистический или иммуносупрессивный эффект разных антител против человеческого VISTA, имеющих последовательности, проиллюстрированные на фиг. 4. К настоящему времени было продемонстрировано, что иммуносупрессивными являются 12 химерных антител против человеческого VISTA. Некоторые из результатов, полученных к настоящему времени, обобщены в таблицах. Все антитела из группы 1 конкурируют за связывание с человеческим VISTA, но не конкурируют за связывание VISTA с антителами из группы 2. В противоположность этому, все антитела против человеческого VISTA из группы 2 конкурируют за связывание с человеческим VISTA друг с другом, но не с антителами из группы 1.

Антитело из таблицы 2, помеченное как «неоднозначное», вызывало разные эффекты, включая иммуносупрессивный эффект, в одном анализе или давало неоднозначные результаты по другим причинам. Как показано в таблице 1 и 2, всего было выделено 12 антител против человеческого VISTA, которые являются иммуносупрессивными в анализе РСКЛ или анализе ConA и/или других in vitro и in vivo видах анализа, или в моделях аутоиммунных, воспалительных заболеваний или РТПХ, и которые имитируют или агонизируют иммуносупрессивный эффект человеческого VISTA. На основании этих результатов ожидается, что аналогичными способами можно будет получить другие антитела против человеческого VISTA, включая антитела, имеющие такую же или отличную эпитопную специфичность.

Также в экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 9, сравнивают эффект разных антител к человеческому VISTA в анализе ConA и на экспрессию выбранных провоспалительных цитокинов и маркеров воспаления, т.е. IL-2, γ-интерферона и IL-12p70.

Таблица 2 (мышиные антитела против человеческого VISTA)

Антитело Группа Супрессивное? Пролиф. РСКЛ Kд, M 1E8* 1 Да ++ НИ GG8 1 Да ++ НИ GA1 2 Неоднозначный _ НИ

* Продемонстрирована иммуносупрессия в 2 разных формах IgG2.

Пример 10. Определение эпитопов антител к человеческому VISTA с помощью картирования эпитопов В-клеток

Эпитопную специфичность некоторых предполагаемых агонистических антител к человеческому VISTA определяли, используя специальные пептидные матрицы с применением фрагментов человеческого VISTA, используя соответствующие методы [ProArray Ultra™]. Фактически определение связывания пептид-антитело проводили путем инкубации образцов антител с пептидной микроматрицей ProArray Ultra™ с последующей инкубацией с флуоресцентно меченным вторичным антителом. После нескольких этапов промывки матрицы ProArray Ultra™ сушили и сканировали, используя микроматричное флуоресцентное сканирование с высоким разрешением.

Все пептиды (перечисленные ниже) синтезировали отдельно, а затем связывали с поверхностью слайда ProArray Ultra™, используя соответствующую методику ProImmune. Этот оптимизированный процесс гарантирует, что пептиды присутствуют в матрице таким образом, чтобы близко имитировать свойства соответствующей области белка, обходя естественные физиохимические вариации самих свободных пептидов и получая совместимую, комбинированную платформу на основе пептидной и белковой матрицы. Исследуемые аналиты (пептиды и белки) распределяют по слайду ProArray Ultra™ в дискретных точках, а соответствующие gal-файлы обеспечивают точное выравнивание компонентов результирующей матрицы против нанесенного аналита.

Связывание пептид-антитело определяют путем инкубации образцов антител (обеспечиваемых клиентом) со слайдами ProArray Ultra™ с последующей инкубацией с флуоресцентно меченным вторичным антителом. После конечной инкубации и этапов промывки микроматрицы сушат и сканируют в системе для микроматричного сканирования с высоким разрешением.

После сканирования флуоресцентно меченых слайдов ProArray Ultra™ сканер записывает изображение, которое оценивают, используя программное обеспечение для анализа изображений, что делает возможной интерпретацию и количественную оценку уровней флуоресценции, связанных с каждой флуоресцентной точкой на просканированном микроматричном слайде. Пептидная микроматрица была составлена на основании библиотеки перекрывающихся пептидов, синтезированных из полипептидной последовательности человеческого VISTA. На основании последовательности были сгенерированы 15-мерные микроматричные пептиды, перекрывающиеся в 12 аминокислотах, с применением технологии ProArray Ultra™ от ProImmune. Подробные данные по синтезированным пептидам приведены в ТАБЛИЦЕ 3 (ниже). «Позиция» относится к начальной и конечной аминокислоте в пределах полипептидной последовательности, из которой был получен пептид. Синтезированные пептиды иммобилизовали на слайдах ProArray Ultra™ в 24 идентичных суб-матрицах, каждая из которых содержала исследуемые пептиды и контрольные образцы в шести повторностях. Все пептиды приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3. Подробные данные по пептидам ProArray Ultra™

ID пептида Позиция Последовательность 1 1-15 FKVATPYSLYVCPEG (SEQ ID NO: 7) 2 4-18 ATPYSLYVCPEGQNV (SEQ ID NO: 8) 3 7-21 YSLYVCPEGQNVTLT (SEQ ID NO: 9) 4 10-24 YVCPEGQNVTLTCRL (SEQ ID NO: 10) 5 13-27 PEGQNVTLTCRLLGP (SEQ ID NO: 11) 6 16-30 QNVTLTCRLLGPVDK (SEQ ID NO: 12) 7 19-33 TLTCRLLGPVDKGHD (SEQ ID NO: 13) 8 22-36 CRLLGPVDKGHDVTF (SEQ ID NO: 14) 9 25-39 LGPVDKGHDVTFYKT (SEQ ID NO: 15) 10 28-42 VDKGHDVTFYKTWYR (SEQ ID NO: 16) 11 31-45 GHDVTFYKTWYRSSR (SEQ ID NO: 17) 12 34-48 VTFYKTWYRSSRGEV (SEQ ID NO: 18) 13 37-51 YKTWYRSSRGEVQTC (SEQ ID NO: 19) 14 40-54 WYRSSRGEVQTCSER (SEQ ID NO: 20) 15 43-57 SSRGEVQTCSERRPI (SEQ ID NO: 21) 16 46-60 GEVQTCSERRPIRNL (SEQ ID NO: 22) 17 49-63 QTCSERRPIRNLTFQ (SEQ ID NO: 23) 18 52-66 SERRPIRNLTFQDLH (SEQ ID NO: 24) 19 55-69 RPIRNLTFQDLHLHH (SEQ ID NO: 25) 20 58-72 RNLTFQDLHLHHGGH (SEQ ID NO: 26) 21 61-75 TFQDLHLHHGGHQAA (SEQ ID NO: 27) 22 64-78 DLHLHHGGHQAANTS (SEQ ID NO: 28) 23 67-81 LHHGGHQAANTSHDL (SEQ ID NO: 29) 24 70-84 GGHQAANTSHDLAQR (SEQ ID NO: 30) 25 73-87 QAANTSHDLAQRHGL (SEQ ID NO: 31) 26 76-90 NTSHDLAQRHGLESA (SEQ ID NO: 32) 27 79-93 HDLAQRHGLESASDH (SEQ ID NO: 33) 28 82-96 AQRHGLESASDHHGN (SEQ ID NO: 34) 29 85-99 HGLESASDHHGNFSI (SEQ ID NO: 35) 30 88-102 ESASDHHGNFSITMR (SEQ ID NO: 36) 31 91-105 SDHHGNFSITMRNLT (SEQ ID NO: 37) 32 94-108 HGNFSITMRNLTLLD (SEQ ID NO: 38) 33 97-111 FSITMRNLTLLDSGL (SEQ ID NO: 39) 34 100-114 TMRNLTLLDSGLYCC (SEQ ID NO: 40) 35 103-117 NLTLLDSGLYCCLVV (SEQ ID NO: 41) 36 106-120 LLDSGLYCCLVVEIR (SEQ ID NO: 42) 37 109-123 SGLYCCLVVEIRHHH (SEQ ID NO: 43) 38 112-126 YCCLVVEIRHHHSEH (SEQ ID NO: 44) 39 115-129 LVVEIRHHHSEHRVH (SEQ ID NO: 45) 40 118-132 EIRHHHSEHRVHGAM (SEQ ID NO: 46) 41 121-135 HHHSEHRVHGAMELQ (SEQ ID NO: 47) 42 124-138 SEHRVHGAMELQVQT (SEQ ID NO: 48) 43 127-141 RVHGAMELQVQTGKD (SEQ ID NO: 49) 44 130-144 GAMELQVQTGKDAPS (SEQ ID NO: 50) 45 133-147 ELQVQTGKDAPSNCV (SEQ ID NO: 51) 46 136-150 VQTGKDAPSNCVVYP (SEQ ID NO: 52) 47 139-153 GKDAPSNCVVYPSSS (SEQ ID NO: 53) 48 142-156 APSNCVVYPSSSQDS (SEQ ID NO: 54) 49 145-159 NCVVYPSSSQDSENI (SEQ ID NO: 55) 50 148-162 VYPSSSQDSENITAA (SEQ ID NO: 56)

Результаты этого анализа эпитопов с конкретными антителами против человеческого VISTA обобщены на фиг. 4.

Пример 11. Анализ методом эпитоп-специфической сортировки

Дополнительно определяли характеристики связывания эпитопов некоторых антител против человеческого VISTA, имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4, путем помещения этих антител в разные эпитопные «группы» на основании их характеристик связывания, как описано ниже.

Методы: Систему ProteOn XPR36 (BioRad) использовали для проведения эпитоп-специфической сортировки. Чипы ProteOn GLC (BioRad, кат. №176-5011) покрывали двумя наборами из 6 моноклональных антител (mAb) согласно инструкциям производителя по химии аминного сопряжения (BioRad, кат. №176-2410). Конкурирующие mAb предварительно инкубировали в избытке (конечная концентрация 250 нМ) с человеческим VISTA (конечная концентрация 25 нМ) в течение 4 часов при комнатной температуре и по 6 за один раз проводили через чип, покрытый панелями покрывающих mAb со временем ассоциации 4 минуты с последующей диссоциацией в течение 5 минут. После каждого эксперимента чипы восстанавливали с помощью 100 пН фосфорной кислоты.

Анализ данных включал группировку всех сенсограмм по лиганду и применение модуля выравнивания, который автоматически проводит выравнивание по оси X и Y и удаление артефактов. Затем к данным применяли корректировку между точками.

Неконкурирующее mAb определяли как имеющее сигнал связывания, равный или > сигнала Al (связывание только с человеческим VISTA). Конкурирующее mAb определяли как имеющее сигнал связывания < сигнала Al (т.е. связывание только с человеческим VISTA). Например, VSTB49 и VSTB51 в комплексе с VISTA не связывались с покрывающим чип VSTB85 и, следовательно, были классифицированы как конкурирующие за один участок связывания на VISTA с VSTB85. Результаты этого анализа сортировки с конкретными антителами против человеческого VISTA обобщены на фиг. 4.

Пример 12. Картирование эпитопов антител против VISTA с помощью исследования водородно-дейтериевого (H D) обмена

Эпитопы для антител против VISTA можно идентифицировать различными способами, такими как аланиновое сканирование и водородно-дейтериевый (H D) обмен, а также с помощью матриц перекрывающихся пептидов, как писано в предыдущем примере. Другие типовые средства для идентификации эпитопов предполагаемых агонистических антител против человеческого VISTA описаны ниже.

Чтобы идентифицировать эпитопы для VSTB50, 60, 95 и 112 на человеческом VISTA, проводили масс-спектрометрию водородно-дейтериевого обмена в растворе (HDX-MS), используя соответствующие Fab. В случае H/D процедуры, применяемые для анализа пертурбаций Fab, были аналогичными описанным ранее (Hamuro et al, J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn et al, Biochemistry 45:8488-8498, 2006) с некоторыми модификациями. Fab получали из IgG с помощью расщепления папаином и захвата протеином А, используя набор для получения Fab от Pierce (Thermo Scientific, кат. №44985). Белковая последовательность человеческого VISTA содержит шесть участков N-связанного гликозилирования. Для улучшения покрытия последовательности белок дегликозилировали с помощью ПНГазы F. Дегликозилированный белок VISTA инкубировали в дейтерированном водном растворе в течение заданного времени, что приводило к включению дейтерия в атомы с возможностью водородного обмена. Дейтерированный белок VISTA находился в комплексе с Fab VSTB50, VSTB60, VSTB95 или VSTB112 в 46 оксиде дейтерия (D20) при 4°C в течение 30 с, 2 мин, 10 мин и 60 мин. Реакцию обмена гасили путем снижения pH и расщепляли белки пепсином. Уровни дейтерия в идентифицированных пептидах отслеживали по сдвигу массы с помощью ЖХ-МС. В качестве эталонного контроля белок VISTA обрабатывали аналогичным образом, за исключением того, что он не находился в комплексе с молекулами Fab. Области, связанные с Fab, по логичному предположению являлись участками, относительно защищенными от обмена и, следовательно, содержащими большую долю дейтерия, чем эталонный белок VISTA. Около 94% белка можно картировать на специфические пептиды.

Были составлены карты пертурбаций VISTA с VSTB50/VSTB60 и VSTB95/VSTB112 в растворе HDX-MS и идентифицированы две группы эпитопов. Анти-VISTA VSTB50 распознает тот же эпитоп, что и VSTB60; VSTB95 связывается с другой эпитопной областью на VISTA по сравнению с VSTB112. Анти-VISTA VSTB50 и 60 имеют один эпитоп, который содержит сегменты 103NLTLLDSGL111 (SEQ ID NO: 59) и 136VQTGKDAPSNC146 (SEQ ID NO: 60). Анти-VISTA VSTB95 и VSTB112 оказались нацелены на аналогичные эпитопы, содержащие 27PVDKGHDVTF36 (SEQ ID NO: 61) и 54RRPIRDLTFQDL65 (SEQ ID NO: 62). Эти результаты HDX-MS обеспечивают информацию об эпитопах на пептидном уровне для типовых антител против VISTA, имеющих последовательности, приведенные на фиг. 4. Для этих двух эпитопных групп не было перекрывающихся эпитопных областей. Эти результаты согласуются с предыдущими конкурентными данными по сортировке в отношении того, что они не конкурируют друг с другом. Снова, результаты анализа эпитопов для различных проанализированных антител против человеческого VISTA, описанных в данном документе, обобщены на фиг. 4.

Пример 13. Анализ для идентификации агонистических антител против человеческого VISTA

Как описано в данном документе, мы идентифицировали дюжину агонистических антител против человеческого VISTA и должны получить другие после проведения подтверждающих экспериментов в вышеописанных иммунных моделях или их повтора с другими антителами. Антитела, идентифицированные на фиг. 4 под обозначениями «VSTB», представляют собой полностью человеческие, высокоаффинные, перекрестно реактивными с яванскими макаками антитела против VISTA (библиотечный диапазон аффинности 298-24 пМ в отношении человека и 443-26 пМ в отношении яванского макака), которые, с учетом успешного выделения многочисленных агонистических античеловеческих антител, описанных в данном документе, должны поспособствовать идентификации других агонистических антител против человеческого VISTA, которые связываются с эпитопом из группы 1 или 2. Эти способы описаны ниже.

Функциональный скрининг in vitro

Прямой, опосредованный CD4: В этом подходе Т-клетки CD4⁺ выделяют путем отрицательной селекции из спленоцитов hV-KI. Затем 1x105 Т-клеток будут инкубировать с каждым из 50 VISTA mAb (20 мкг/мл) или изотипическим контролем в течение 30 минут на льду. Затем Т-клетки и антитело поместят на покрытые анти-CD3 96-луночные планшеты с плоским дном и будут культивировать в течение 72 часов. В момент времени, соответствующий 72 часам, в культуру будут добавлять меченный тритием тимидин в течение 8 часов, чтобы измерить пролиферацию по включению H3. С помощью этого анализа мы можем провести скрининг всех 50 mAb в одном эксперименте в трех технических репликах. Каждое антитело будут исследовать в трех независимых экспериментах для подтверждения активности. mAb, которые снижают пролиферацию до статистически значимого уровня по сравнению с изотипическим контролем, будут определять как «супрессивные». Все супрессивные mAb, определенные в начальном скрининге, затем будут повторно исследовать в том же анализе, чтобы построить кривую доза-ответ. Каждое антитело будут исследовать при полулогарифмических разведениях (30 мкг/мл → 0,01 мкг/мл) и рассчитывать значения IC50 для пролиферации. Все антитела, определенные как супрессивные в анализе hV-KI, будут подтверждать на первичных человеческих Т-клетках и упорядочивать по значениям IC50 для пролиферации.

Анализ перекрестной активности с ОЧП: В этом анализе мы будем проводить скрининг в отношении функциональной активности у релевантных токсикологических видов, Macaca fascicularis (далее называемых в данном документе отличными от человека приматами или «ОЧП»), с помощью идентичного анализа CD3-опосредованной пролиферации, описанного для мышей и человека, используя клон CD3 SP34, который инициирует сильную пролиферацию Т-клеток. Цельную кровь от ОЧП будут получать от World Wide Primates (Florida, USA), а Т-клетки будут выделять посредством магнитного разделения. Т-клетки будут инкубировать с антителом и культивировать на покрытых CD3 планшетах в течение 72 часов. Пролиферацию будут измерять по включению трития и получать значения IC50 для каждого антитела.

Функциональный скрининг с использованием in vivo животных моделей

1. Исследование агонистических антител к VISTA в соответствии с изобретением в животной модели индуцированного конканавалином а гепатита

Аутоиммунный гепатит (АИГ) представляет собой хроническое воспалительное заболевание печени, характеризуемое потерей аутотолерантности, приводящей к В- и Т-клеточным ответам против печени. Модель ConA представляет наиболее изученную систему для понимания патогенеза АИГ. ConA представляет собой лектин, который связывается со специфическими сахарными компонентами, которыми богата печень. Модификация этих сахарных остатков ConA приводит к быстрой активации Т-клеток CD4⁺ посредством взаимодействия с модифицированными структурами ГКГС, экспрессируемыми макрофагами печени. Происходит интенсивная, но временная выработка цитокинов с участием наиболее каноничных Т-клеточных цитокинов (IL-2, IL-3, IFNγ и TNFα), достигающая пиковых плазменных уровней в течение 4-6 часов. Следует отметить, что индуцированное ConA воспаление можно блокировать путем снижения количества Т-клеток CD4+. Модель ConA с мышами hV-KI можно использовать для подтверждения супрессивной активности агонистических анти-VISTA mAb в соответствии с изобретением. Мышей взвешивают и обрабатывают 10 мг/кг анти-VISTA антитела или соответствующего изотипического контроля за 3 часа до инъекции 15 мг/кг ConA. Анти-VISTA mAb вводят В/Б, тогда как ConA инъецируют через хвостовую вену этих мышей. Через 6 часов после введения ConA мышей умерщвляют и собирают кровь. Затем плазменную фракцию анализируют в отношении плазменных цитокинов с помощью многоканального анализа для 32 цитокинов. Каждое антитело исследуют в трех независимых экспериментах для подтверждения активности. Для каждого цитокина в 32-х каналах будут проводить однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с применением апостериорного критерия Даннетта, чтобы сравнить каждое анти-VISTA антитело с изотипическим контролем. Исследуемые анти-VISTA антитела упорядочивают на основании эффективности супрессии цитокинов (какое количество цитокинов было супрессировано) и вариабельности (как супрессия согласуется с каждым экспериментом и между экспериментами). Дополнительный акцент делается на mAb, которое супрессирует цитокины, которые канонически связаны с активацией Т-клеток.

Как описано в родственной заявке согласно PCT, поданной на аналогичную дату и указанной выше, проводили скрининг нескольких антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением в модели ConA, которые оказались эффективными (иммуносупрессивными) в рамках данной модели, т.е. они подавляли индуцированную ConA выработку цитокинов и стимулировали выживаемость и, в частности, подавляли экспрессию цитокинов, вовлеченных в активацию Т-клеток, включая IL-2. В частности, авторы изобретения исследовали INX800, INX801 и INX903 и INX904, а также агонистические антитела против мышиного VISTA, и все они оказались эффективными (иммуносупрессивными) в рамках модели гепатита ConA. Следовательно, агонистические антитела против человеческого VISTA в соответствии с изобретением должны быть применимы в лечении/предотвращении воспаления и гепатотоксичности, связанной с некоторыми хроническими и острыми инфекционными состояниями, такими как гепатит.

2. Исследование агонистических антител к VISTA в соответствии с изобретением в животных моделях реакции «трансплантат против хозяина»

РТПХ представляет собой системное заболевание, опосредованное адоптивным переносом аллогенных Т-клеток облученному хозяину. Существует пять основных этапов, критических для патогенеза РТПХ: 1) повреждение хозяина, наиболее часто в форме облучения, которое предшествует переносу Т-клеток; 2) активация аллогенных Т-клеток АПК хозяина и донора; 3) размножение Т-клеток в лимфатических узлах и селезенке; 4) попадание в периферические участки, такие как кожа, кишечник, печень и легкие; и 5) повреждение хозяина, обусловленное Т-клетками и также привлеченными миелоидными клетками. В определенных моделях, таких как родительский штамм F1→, возникает хроническая РТПХ, которая является подходящей моделью для волчанки, так как у мышей развивается опосредованный антинуклеарными mAb и иммунным комплексом гломерулярный нефрит. Следует отметить, что генетическое удаление VISTA из донорских Т-клеток приводит к более агрессивной форме РТПХ, чем наблюдаемая у мышей, получающих Т-клетки ДТ.

Этот анализ можно использовать, чтобы идентифицировать и упорядочить по агонизму кандидатные агонистические антитела против человеческого VISTA. Также этот анализ можно использовать для подтверждения, что агонистические антитела согласно изобретению можно использовать для лечения или предотвращения РТПХ. В этой модели мышей BALB/c облучают летальной дозой и переносят им аллогенные Т-клетки костного мозга и селезенки от мышей hV-KI, чтобы индуцировать РТПХ; при этом одна группа не получает Т-клетки и служит отрицательным контролем. Мышей, получающих аллогенные Т-клетки, разбивают на контрольную Ig-группу и обрабатываемые группы. В одном эксперименте можно использовать до четырех уникальных VISTA mAb с восемью мышами на группу и проведением экспериментов в двух повторностях. 10 мг/кг другой дозы антитела вводят во время переноса Т-клеток, а также на 2 и 4 сутки после переноса. Нужно отслеживать массу тела каждой мыши и умерщвлять любых мышей, которые потеряли более 20% исходной массы тела. Для каждого эксперимента строят кривые Каплана-Мейера с логранговым статистическим критерием, сравнивая каждое анти-VISTA антитело с контролем. Если все четыре VISTA mAb полностью защищают от РТПХ, будут проводить анализ зависимости доза-ответ в модели РТПХ с группами, обрабатываемыми 10, 3, 1 и 0,3 мг/кг антитела. Для каждого антитела будут рассчитывать значения LD50.

Как описано в родственной заявке, поданной на аналогичную дату и указанной выше, в этой животной модели оценивали большое число агонистических антител против человеческого VISTA в соответствии с изобретением. В этой модели все исследуемые антитела были эффективными (иммуносупрессивными), т.е. они уменьшали симптомы заболевания, замедляли прогрессирование заболевания, снижали связанную с заболеванием потерю массы и стимулировали выживаемость. В частности, оценивали каждое из INX800, INX801, INX901, INX902, INX903 и INX904 и продемонстрировали, что они облегчают или предотвращают симптомы заболевания в этой животной модели. Также было определено, что формы A и B INX901, которое может быть как в A, так и в B форме, были одинаково эффективными в животной модели РТПХ.

3. Исследование агонистических антител к VISTA в соответствии с изобретением в животной модели воспалительного заболевания кишечника

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), болезнь Крона и язвенный колит возникают в результате неполностью определенных и сложных взаимодействий между иммунными ответами хозяина, генетической восприимчивостью, факторам окружающей среды и содержимым просвета кишечника. Недавние полногеномные ассоциативные исследования показали наличие ассоциации между регуляторными генами иммунных клеток и восприимчивостью к ВЗК. В этих исследованиях представлены гены, характерные для иммунных клеток как врожденного, так и адаптивного иммунитета, что указывает на решающую роль этих клеточных популяций в патогенезе ВЗК. На сегодняшний день существует более 50 животных моделей человеческого ВЗК. Хотя ни одна из моделей не является идеальной фенокопией человеческого ВЗК, многие применимы для изучения различных аспектов человеческого заболевания, включая начало и прогрессирование заболевания и реакцию заживления ран.

В одной наработанной модели ВЗК воспаление кишечника инициируется адоптивным переносом сингенных Т-клеток CD4⁺ CD45RB^hi реципиентным мышам с дефицитом Т- и В-клеток. Популяция Т-клеток CD4⁺ CD45RB^hi содержит в основном наивные Т-клетки, примированные для активации, которые способны индуцировать воспаление тонкого и толстого кишечника. Этот способ позволяет исследователю модифицировать ключевые экспериментальные переменные, включая популяции иммунных клеток как врожденного, так и адаптивного иммунитета, чтобы получить ответы на биологически релевантные вопросы, касающиеся патогенеза заболевания. Кроме того, этот способ обеспечивает точную инициацию начала заболевания и хорошо изученную экспериментальную динамику, что позволяет проводить кинетические исследования клинических признаков прогрессирования заболевания у мышей. Воспаление кишечника, индуцированное этим способом, имеет много общих черт с человеческим ВЗК, включая хроническое трансмуральное воспаление толстого и тонкого кишечника, патогенез, обусловленный цитокинами, такими как TNF и IL-12, и системные симптомы, такие как слабость. Таким образом, это идеальная модельная система для изучения патогенеза человеческого ВЗК.

Как описано в родственной заявке согласно PCT, поданной на аналогичную дату, исследовали агонистическое антитело против человеческого VISTA в соответствии с изобретением (INX901), которое оказалось эффективным в этой модели ВЗК. В частности, было продемонстрировано, что это агонистическое антитело супрессирует уровни цитокинов и эффективно предотвращает или ингибирует (i) связанную с колитом потерю массы, (ii) потерю массы, связанную с прогрессированием колита, (iii) укорочение толстой кишки, (iv) привлечение воспалительных инфильтратов в толстую кишку и (v) развитие колита. Следовательно, агонистические антитела к VISTA в соответствии с изобретением можно использовать в лечении ВЗК и связанных с ним воспалительных и кишечных патологических состояний.

4. Исследование агонистических антител к VISTA в соответствии с изобретением в животных моделях волчанки

Волчанка представляет собой аутоиммунное или воспалительное состояние с симптомами, включающими воспаление почек, повышенное содержание белка в моче и увеличение селезенки. Существует 4 типа волчанки, из которых наиболее обычной формой является системная красная волчанка («СКВ»). Это заболевание может быть легким или тяжелым и может поражать основные системы органов. Волчанка представляет собой аутоиммунное состояние неизвестного происхождения, которое может приводить к воспалению почек, называемому волчаночным нефритом, которое может отрицательно влиять на способность организма фильтровать отходы из крови, а в тяжелом случае может привести к повреждению почек, требующему диализа или трансплантации почек. Также СКВ может приводить к повышению кровяного давления в легких, называемому легочной гипертензией, что вызывает затруднения дыхания. Дополнительно СКВ может приводить к воспалению нервной системы и головного мозга, сто вызывает проблемы с памятью, помрачение сознания, головные боли и инсульт. Дополнительно СКВ может приводить к воспалению кровеносных сосудов головного мозга, что может вызывать высокую температуру, судорожные припадки и изменения в поведении. Также СКВ может приводить к артериосклерозу или ишемической болезни сердца, образованию отложений на стенках коронарных артерий, что может приводить к сердечному приступу.

Как описано в родственной заявке согласно PCT, поданной на аналогичную дату, исследовали агонистические антитела против человеческого VISTA в соответствии с изобретением (INX903, INX901, INX901-A и INX901-B) и антитела против мышиного VISTA и продемонстрировали их эффективность в разных моделях волчанки, включая модель волчанки MRL/lpr, модель волчанки NZBWF-1 и модель B6D2F. Модель B6D2F является мышиной моделью, в которой СКВ индуцируется переносом спленоцитов с истощенными CD8 от DDE1 с нокином человеческого VISTA (донор) хозяину B6D2F1 (реципиент). В этой модели поликлональная активация донорских Т-клеток CD4 обуславливает когнатную активацию, размножение В-клеток хозяина и выработку аутоантител, что приводит к болезни почек. Подобные волчанке признаки истощения B6 CD8, переносимые в модель B6D2F1, включают: (1) гломерулонефрит иммунного комплекса; (2) антинуклеарные антитела; (3) анти-дцДНК антитела; и (4) анти-ККТ антитела (положительная проба Кумбса). Кроме того, эта модель описывает зависимую от пола разницу в тяжести болезни почек.

В 3 разных моделях волчанки агонистические антитела против человеческого и мышиного VISTA продемонстрировали эффективность и снижение частоты развития волчанки, прогрессирования болезни, снижение уровней белка в моче, ингибирование нефрита и поражения почек, снижение активации и накопления Т-клеток, снижение активации и накопления В-клеток и ингибирование выработки аутоантител. В частности, было показано, что INX903, INX901, INX901-A и INX901-B (i) снижают пролиферацию и активацию Т-клеток, (ii) снижают когнатную активацию и накопление В-клеток (экспрессию ГКГСII), снижают увеличение селезенки, снижают количество выработки анти-дцДНК аутоантител IgG и снижают сигнатуру интерферона типа I. Также на иммуносупрессивный эффект не влияло то, была ли константная область человеческого IgG2 антитела в А или В форме. Следовательно, агонистические антитела к VISTA в соответствии с изобретением можно использовать в лечении волчанки и связанных с ней воспалительных и аутоиммунных состояний.

5. Исследование агонистических антител к VISTA в животной модели псориаза

Модель индуцированного имиквимодом (IMQD) псориаза

Способность антител против VISTA лечить псориаз оценивали, используя модель индуцированного имиквимодом (IMQD) псориаза. Имиквимод (IMQD) представляет собой коммерчески доступный кремообразный агонист TLR7/8, который широко используется для дерматологических состояний, таких как вирусные инфекции и меланома. Применение IMQD к коже в течение большого числа дней приводит к утолщению эпидермиса вследствие пролиферации кератиноцитов. Кроме того, происходит иммунологическая инфильтрация в слой дермы популяций Т-клеток и миелоидных клеток. Повторное применение IMQD приводит к появлению поражений кожи, схожих с наблюдаемыми у пациентов с псориазом. Считается, что IL-17 и IL-23 являются основными цитокинами, вовлеченными в иммунный ответ на IMQD.

Как описано в родственной заявке согласно PCT, поданной на аналогичную дату, исследовали агонистическое антитело против VISTA, которое оказалось эффективным в этой модели псориаза. В частности, это антитело снижало число Т-клеток CD3⁺, инфильтрирующих обработанную имиквимодом кожу. На основании наблюдаемых результатов агонистические антитела против человеческого VISTA можно использовать в лечении или предотвращении псориаза и других опосредованных Т-клетками аутоиммунных или воспалительных кожных состояний.

6. Исследование агонистических антител к VISTA в животной модели артрита

Иммуносупрессивный эффект антител против VISTA для лечения артрита можно исследовать в разных животных моделях. Как описано в родственной заявке согласно PCT, поданной на аналогичную дату, исследовали агонистические антитела против мышиного и человеческого VISTA, которые оказались эффективными в общепринятой модели артрита, т.е. модели индуцированного коллагеном артрита или CIA. INX800, INX901, INX902 и INX903, а также хомячьи антитела против мышиного VISTA исследовали в этой модели артрита. Развитие заболевания оценивали, измеряя воспалительный отек пораженных суставов в течение некоторого времени. Клиническое оценивание проводили, приписывая оценку 1 каждому отекшему пальцу, оценку 5 отекшей стопе и оценку 5 отекшему запястью или щиколотке (оценочная шкала Charles River Labs), которые при добавлении дают максимальную оценку 60 для каждого животного.

Как показано в этой заявке согласно PCT, каждое из этих антител снижало артрит, а INX901 и INX902 существенно снижали объем заболевания. На основании этих результатов агонистические антитела против человеческого VISTA можно использовать в лечении или предотвращении ревматоидного артрита и других воспалительных или аутоиммунных состояний.

Пример 14. Оценка роли остова человеческого IgG2 на агонистическую/иммуносупрессивную активность α-формы антитела к человеческому VISTA INX901 в разных in vitro и in vivo моделях

Антитела на остове нативного человеческого IgG2 существуют в виде смеси изоформ вследствие перестановки дисульфидных связей среди цистеинов, присутствующих в шарнире тяжелой цепи, CH1 и легкой цепи (Zhang, A., (2015), “Conformational difference in human IgG2 disulfide isoforms revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry”, Biochemistry, 54(10), 1956-1962; фиг. 10). Эти изоформы оценивали с помощью ОФ-ВЭЖХ (фиг. 10) на основании способов, разработанных Dillon et al., “Optimization of a reversed-phase high-performance liquid chromatography/mass spectrometry method for characterizing recombinant antibody heterogeneity and stability”, J Chromatography A, 1120(1), 112-120. В оптимизированном способе используется более мелкая и с большим содержанием органических веществ подвижная фаза В по сравнению с in Dillon (id). Отдельные формы A и B, обогащенные из INX901, готовили, придерживаясь условий, описанных в Dillon (id), но в комбинации с обратной заменой буфера на ДФСБ и процедурой удаления эндотоксинов, применяемой после реакций обогащения (фиг. 11).

Во время подготовки этих экспериментов наблюдали, что обращение А-обогащенной формы происходит быстрее, чем ожидалось, и при меньшей остаточной концентрации окислительно-восстановительного реагента, чем ожидалось. Следовательно, применяли эксклюзионную процедуру обессоливания с быстрым вращением, которая, как оказалось, в значительной степени предотвращает это обращение. Как показано на панели (A) на фиг. 10, дисульфидная перестановка приводит к получению изоформ A и B, наряду с переходом для A/B (взято из Zhang, A. et al., 2015). (B) Изоформы можно отличить с помощью ОФ-ВЭЖХ (Фиг. из Zhang, A. et al., 2015). (C) Наблюдаемая хроматограмма ОФ-ВЭЖХ для INX901.

Оптимизированный авторами изобретения метод ОФ-ВЭЖХ для выявления изоформ IgG2 описан ниже. На фиг. 11: (Черная линия, вверху) Хроматограмма демонстрирует наличие доминантного крайнего левого пика, определяющего B-форму. (Красная линия, внизу) Хроматограмма демонстрирует наличие доминантного правого пика, определяющего А-форму.

Оптимизированные методы ОФ-ВЭЖХ для выявления изоформ

Приготовление подвижной фазы A (0,1% об/об ТФУ в воде):

1. Отмеряли 1,0 л воды Milli-Q в 1,0 л проградуированном цилиндре

2. Добавляли 1,0 мл ТФУ в 1 л воды, используя 1 мл стеклянный шприц Гамильтона

3. Переносили раствор в 1 л бутылку, хорошо смешивали.

4. Срок годности составляет 2 недели после приготовления

Приготовление подвижной фазы B (70% об/об ИПС, 20% об/об АЦН, 9,9% об/об воды, 0,1% об/об ТФУ):

1. Отмеряли 700 мл ИПС в 1,0 л проградуированный цилиндр

2. Отмеряли 200 мл АЦН в 250 мл проградуированный цилиндр и переносили в 1,0 л проградуированный цилиндр, содержащий 700 мл ИПС

3. Добавляли воду Milli-Q в 1,0 л проградуированный цилиндр, содержащий 700 мл ИПС и 200 мл АЦН, до тех пор, пока жидкость не достигала отметки 1,0 л

4. Добавляли 1,0 мл ТФУ в 1 л воды, используя 1 мл стеклянный шприц Гамильтона

5. Переносили раствор в 1 л бутылку, хорошо смешивали.

6. Срок годности составляет 2 недели после приготовления

Условия ОФ-ВЭЖХ хроматографии

1. Колонка А (большой диаметр): Zorbax 300SB-C8, 5 мкм, 2,1×150 мм, <<OR>>

2. Колонка B (узкий диаметр): Zorbax 300SB-C8, 3,5 мкм, 1×50 мм

3. Подвижная фаза А: 0,1% об/об ТФУ в воде

4. Подвижная фаза B: 70% об/об ИПС, 20% об/об АЦН, 9,9% об/об воды, 0,1% об/об ТФУ

5. Скорость потока: 0,5 мл/мин для колонки A или 0,25 мл/мин для колонки B

6. Колоночное отделение: 75,0±1,0°C

7. Выявление: 214 нм

8. Градиент подвижной фазы ОФ-ВЭЖХ (таблица ниже)

Время (мин) Подвижная фаза В% 0 15 2 26 34 36 35 75 36 15 40 15

Способы обогащения дисульфидной изоформы INX901

Обогащение B-формы

1. В не содержащую эндотоксины апирогенную пробирку добавить:

2,1 мл INX901 (5,66 мг/мл)

792,6 мкл 1 M Трис, pH 8,0

495,4 мкл не содержащей эндотоксины воды

Дополнительные 396,3 мкл не содержащей эндотоксины воды

237,8 мкл 100 мМ цистеина

39,6 мкл 100 мМ цистамина

2. Пальцем перемешать вихревым способом (слегка), затем поместить в закрытом виде при 2-8°C на 24 ч

3. Выдержать концентратор-центрифугу Pall microsep в 0,3 M NaOH в течение 2 ч при КТ, затем промыть 3X 10X ДФСБ, затем 3X не содержащей эндотоксины водой. Высушить на воздухе в BSC перед применением

4. Следовать инструкциям поставщика для восстановления 0,5 мл колонки для удаления эндотоксинов, используя опцию 0,2N NaOH/95% этанол (2 ч при КТ) для этапа 3; использовать 1 X ДФСБ в качестве конечного уравновешивающего буфера

5. Сконцентрировать ~4,020 мкл реакции (с этапа 2) в отдельной PALL microsep (приготовленной как описано выше).

6. Сконцентрировать при 2500 X G в течение 35 мин до менее 0,4 мл (≥10X), затем повторно развести 4 мл 1X ДФСБ, повторить еще 2 раза

7. Сконцентрировать при 2500 X G в течение 15 мин до менее 2 мл, затем снова добавить 1X ДФСБ до 2 мл

8. Добавить все 2 мл образца с замененным буфером в восстановленную, высушенную в центрифуге колонку для удаления эндотоксинов с закрытым дном, плотно закрыть сверху, перевернуть, разместить при комнатной температуре, перевернуть еще 3 раза каждые ~20 минут, затем вытянуть образец в апирогенную пробирку (1 мин при 500 X G согласно инструкциям поставщика), поместить при 2-8°C

Обогащение A-формы

1. В не содержащую эндотоксины апирогенную пробирку добавить:

1750 мл INX901 (6,2 мг/мл)

370 мкл не содержащей эндотоксины воды

700 мкл 1 M Трис, pH 8,0

435 мкл 8 M GdCl

210 мкл 0,1 M цистеина HCl (полученного из 1 M исходного раствора)

35 мкл 0,1 M цистамина -2HCl (полученного из 1 M исходного раствора)

(Конечный объем 3500 мкл)

2. Пальцем перемешать вихревым способом (слегка), затем поместить в закрытом виде при 2-8°C на 24 ч

3. Приготовить #7-2 мл центрифужные колонки Zeba (Thermo P/N 89890) согласно инструкциям поставщика, уравновешивая в 1 X фосфатно-солевом буфере Дульбекко (ДФСБ).

4. Загрузить 500 мкл вышеуказанной реакционной смеси в каждую из колонок #7 и центрифугировать 2 минуты при 1000 X G (также согласно инструкциям поставщика), собирая в чистые апирогенный пробирки.

5. Поместить в апирогенную PALL microsep, центрифугировать всего 1 час, 1- минут, концентрировать приблизительно до 1,7 мл приблизительно при 5 мг/мл

6. Добавить все ~1,7 мл вышеуказанного в одну 0,5 мл центрифужную колонку для удаления эндотоксинов (Thermo P/N 88274), приготовленную согласно инструкциям поставщика (включая выдерживание в течение ночи в 0,2 M NaOH при комнатной температуре), уравновесить в 1 X ДФСБ. Оставить при комнатной температуре приблизительно на 1 ч, затем поместить при 4°C еще приблизительно на 1 ч, в обоих случаях переворачивая закрытую пробирку приблизительно каждые 15 минут.

7. Восстановить препарат путем центрифугирования при 500 X G в течение 1 минута (также согласно инструкциям поставщика).

8. Восстановить объем: приблизительно 1,3 мл при 4,61 мг/мл (все концентрации на основании встроенного коэффициента экстинкции 0,73 для IgG от NanoDrop)

A- и B-фиксированные варианты IgG2

[1] Определенные замены в аминокислотной последовательности IgG2 способны предотвращать дисульфидную перестановку и, в зависимости от мутации, приведут к получению фиксированной конформации, которая может быть А-подобной или В-подобной (Martinez, et al., (2008). “Disulfide connectivity of human immunoglobulin G2 structural isoforms”, Biochemistry, 47(28), 7496-7508; Allen, et al., (2009), “Interchain disulfide bonding in human IgG2 antibodies probed by site-directed mutagenesis”, Biochemistry, 48(17), 3755-3766.

[2] Следовательно, авторы изобретения разработали варианты INX901 и INX908 с C233S (A-фиксированная форма) или C127S (B-фиксированная форма) мутацией (нумерация Eu), чтобы соответствовать вариантам IgG2, используемым в White et al., (2015), “Conformation of the human immunoglobulin G2 hinge imparts superagonistic properties to immunostimulatory anticancer antibodies”, Cancer Cell, 27(1), 138-148. Последовательности константной области тяжелой цепи приведены ниже.

IgG2 C233S (A-фиксированная форма)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCSVECPPCPAPPVAGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR

VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 63)

IgG2 C127S (B-фиксированная)

ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR

VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64)

Молчащие Fc-варианты

[3] Авторы изобретения разработали варианты INX901 и INX908 с молчащей Fc-областью путем внесения следующих точечных мутаций в остов IgG1: L234A/L235A/G237A/P238A/H268A/A330S/P331S (McCarthy et al., (2015), заявка на патент США 14/818864. Washington, DC: U.S.). В варианте одного типа (INX901Si и INX908Si) CH1/шарнирная область константной области тяжелой цепи представляет нативный IgG1, который не поддерживает дисульфидную перестановку нативного IgG2 (фиг. 12, посередине). Iв варианте второго типа (INX901HSi и INX908HSi) CH1/шарнирная область представляет нативный IgG2, который поддерживает дисульфидную перестановку (White, A. L. et al., 2015) (фиг. 12, внизу). Последовательности константной области тяжелой цепи вариантов обоих типов приведены ниже.

IgG1 с молчащим Fc (INX901Si и INX908Si)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGA

SSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE

MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 65)

IgG2 CH1/шарнир + IgG1 с молчащим Fc (INX901HSi и INX908HSi)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAAGASSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 66)

[4] В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 12, сравнивали иммунные свойства Fc-молчащих вариантов INX901 в отношении дисульфидной перестановки. (Верх) INX901 на каркасе IgG2 демонстрирует ожидаемую смесь изоформ A, A/B и B. (Середина) INX901Si на молчащем каркасе IgG1 существует в одной изоформе. (Низ) INX901HSi содержит молчащую Fc-область IgG1 с CH1/шарниром из IgG2, что делает возможным дисульфидную перестановку, эквивалентную нативному IgG2. Эти результаты указывают, что связывание FcR влияет на агонистические свойства антител согласно изобретению.

Пример 15. Функция INX901 и INX908 в различных остовах Ig для определения требований в отношении шарнирной и Fc-областей

[5] Мы проводили эксперименты, чтобы оценить функциональные требования в отношении CH1/шарнирной и Fc-областей тяжелой цепи антител против человеческого VISTA, INX901 и INX908. В исходном состоянии обе молекулы имеют остовы нативного человеческого IgG2 и, следовательно, являются смесями конформационно отличных изоформ в результате дисульфидной перестановки. Для этих исследований была выбрана реакция смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ) с высокой плотностью клеток, так как предыдущие данные указывают на то, что этот анализ обеспечивает хороший результат по функциональности для обоих антител, INX901 и INX908. Осуществляли следующие модификации INX901 и/или INX908, чтобы исследовать, отвечают ли конкретные изоформы за функцию: биохимическое изменение на изоформу A или B, генетические модификации для «фиксации» конформации в форме A или B и химерные молекулы, в которых был осуществлен сайленсинг Fc, а CH1/шарнирная область получены из любого IgG1, в котором не происходит дисульфидная перестановка, или IgG2, который допускает нативную дисульфидную перестановку.

[6] Результаты анализа указывают на то, что INX901 и INX908 сохраняют функцию вне зависимости от того, находятся они в А-форме, В-форме или смеси форм, которая характерна для нативного IgG2. Кроме того, для функциональности обоих антител, INX901 и INX908, требуется активная Fc-область.

[7] РСКЛ представляет собой стандартный иммунологический анализ, который зависит от несовпадения ГКГС класса I и II для инициации аллогенного Т-клеточного ответа. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из двух несовпадающих индивидов, инкубируют вместе и в результате этих несовпадений происходит пролиферация и выработка цитокинов. Условия высокой плотности клеток (ВПК), означающие культуры с >1×10⁷ клеток/мл, согласно предыдущим данным позволяют прояснить агонистическую функцию антител in vitro. Наши предыдущие данные указывают на то, что оба антитела, INX901 и INX908, могут подавлять экспрессию TNFα в условиях ВПК в РСКЛ.

[8] Анализ ВПК РСКЛ использовали для оценки функции INX901 и INX908 после генетических или биохимических модификаций в отношении дисульфидных изоформ IgG2 и/или сайленсинга Fc для каждого антитела. Перед проведением РСКЛ связывание каждого антитела с рекомбинантным VISTA подтверждали с помощью ИФА. INX901 отсылали в Elion, LLC (Louisville, CO), где его модифицировали путем окислительно-восстановительных реакций так, чтобы оно имело преимущественно А-форму (A-измененная форма INX901) или B-форму (B-измененная форма INX901). Изменение подтверждали с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано в предыдущем примере. (фиг. 11). Каждое антитело, а также родительское INX901 разводили по схеме доза-ответ в ВПК РСКЛ и измеряли выработку цитокинов с помощью Luminex. Предыдущие данные показали, что TNFα и/или IL-2 являются яркими показателями функции антитела для родительского антитела INX901. В двух отдельных РСКЛ уровни TNFα и IL-2 были снижены родительским INX901, А-измененной формой INX901 и В-измененной формой INX901 по сравнению с контрольным IgG2 (фиг. 13).

[9] Чтобы подтвердить данные, проиллюстрированные на фиг. 13, создавали дополнительные варианты INX901 с мутациями для получения фиксированных вариантов в А-форме или В-форме. Дополнительно создавали химерные версии INX901 с полностью молчащими Fc-областями, чтобы исследовать функцию Fc-домена. INX901 Si представляет собой полностью молчащее антитело IgG1. INX901 HSi имеет полностью молчащую Fc-область IgG1, но также имеет CH1/шарнирную область IgG2, которая допускает дисульфидную перестановку, неотличимую от нативного IgG2. Перед проведением РСКЛ связывание каждого антитела с рекомбинантным VISTA подтверждали с помощью ИФА. Подтверждая данные биохимического изменения, обе версии INX901, А-фиксированная и В-фиксированная, были способны снижать выработку IL-2 и TNFα (фиг. 14). В противоположность этому, обе версии INX901, Si и HSi, были неспособны снижать выработку IL-2 и TNFα (фиг. 14).

[10] Чтобы подтвердить данные, проиллюстрированные на фиг. 14, проводили идентичные мутации в антителе INX908 для получения фиксированных вариантов в А-форме или В-форме. Дополнительно создавали химерные версии INX908 с полностью молчащими Fc-областями, чтобы исследовать функцию Fc-домена. INX908 Si представляет собой полностью молчащее антитело IgG1. INX908 HSi имеет полностью молчащую Fc-область IgG1, но содержит CH1/шарнирную область IgG2. Перед проведением РСКЛ связывание каждого антитела с рекомбинантным VISTA подтверждали с помощью ИФА. Подтверждая данные с вариантами INX901, обе версии INX908, А-фиксированная и В-фиксированная, были способны снижать выработку IL-2 и TNFα (фиг. 15). В противоположность этому, обе версии INX908, Si и HSi, были неспособны снижать выработку IL-2 и TNFα (фиг. 15).

Пример 15. Картирование прерывистых эпитопов агонистических антител с применением методов PEPPSCAN

[11] В Pepscan используются пептидные матрицы для определения как линейных, так и прерывистых эпитопов. Эта методика является общепринятым методом, используемым многими исследователями и компаниями для выявления эпитопов антител. На фиг. 16 схематически описана технология Pepscan®, применяемая для определения линейных и прерывистых эпитопов, связываемых различными агонистическими антителами против человеческого VISTA в соответствии с изобретением.

Принципы технологии CLIPS

[12] Технология CLIPS позволяет структурно фиксировать пептиды в определенных трехмерных структурах. Это приводит к функциональной имитации даже наиболее сложных участков связывания. Сейчас технологию CLIPS обычно используют для формирования пептидных библиотек в виде одно-, двух- или трехпетлевых структур, а также складчатых и спиралевидных укладок. Реакция CLIPS происходит между бромо-группами каркаса CLIPS и тиольными боковыми цепями цистеинов. Реакция является быстрой и специфической в умеренных условиях. Используя эту элегантную химию нативные белковые последовательности преобразуются с конструкции CLIPS с некоторым диапазоном структур.

Подробности скрининга комбинаторной библиотеки CLIPS

[13] Скрининг библиотеки CLIPS начинается с преобразования целевого белка в библиотеку из до 10000 перекрывающихся пептидных конструкций с применением комбинаторной матрицы. На твердом носителе синтезируют матрицу из линейных пептидов, из которых потом формируют пространственно определенные конструкции CLIPS. Конструкции, представляющие обе части прерывистого эпитопа в правильной конформации, связывают антитело с аффинностью, которую можно определить и количественно оценить. Конструкции, представляющие неполный эпитоп, связываю антитело с меньшей аффинностью, тогда как конструкции, не содержащие эпитоп, не демонстрирую связывание вообще. Информацию об аффинности используют для итеративного скрининга для детального определения последовательности и конформации эпитопов. Результаты этого анализа эпитопов обобщены ниже.

Антитела INX901, INX902, INX904, INX906, INX907, INX908

[14] При исследовании в условиях умеренной жесткости антитела INX901, INX902, INX904, INX906, INX907, INX908 сильно связывали миметики линейного и конформационного эпитопа. Связанные пептиды содержали коровые последовательности ₄₈NVTLTCRLLGPV₆₀ (SEQ ID NO: 67), ₇₉EVQTCSERRPIR₉₀ (SEQ ID NO: 68), ₁₂₃SDHHGNFS₁₃₀ (SEQ ID NO: 69) и ₁₅₃HHHSEH₁₅₈(SEQ ID NO: 70), в которых пептидный участок ₇₉EVQTCSERRPIR₉₀ (SEQ ID NO: 68) представляет доминантную часть эпитопа.

[15] Дополнительный анализ данных, полученных для миметиков линейного эпитопа, позволил идентифицировать остатки, важные для связывания для INX 904, INX906, INX907 и INX908, так как двойные мутации на Ala в определенных позициях заметно снижали интенсивность сигнала. В частности, замещение остатков CR в ₄₈NVTLTCRLLGPV₆₀ (SEQ ID NO: 71) влияет на связывание INX906, INX907 и INX908. Также замещение остатков TC в ₇₉EVQTCSERRPIR₉₀ (SEQ ID NO: 68) заметно влияет на связывание INX904 и INX907.

Антитело INX800

[16] При исследовании в условиях умеренной жесткости антитело INX800 не демонстрировало выявляемого связывания миметиков линейного и простого конформационно-ограниченного эпитопа, но демонстрировало выявляемое связывание с миметиками прерывистого эпитопа. Анализ данных, полученных для миметиков прерывистого эпитопа, позволяет предположить, что антитело INX800 распознает прерывистый эпитоп с коровыми последовательностями ₅₃TCRLLGPVDKG₆₃ (SEQ ID NO: 72), 101HGGHQAA₁₀₇ (SEQ ID NO: 73), ₁₂₁SASDHHGNFS₁₃₀(SEQ ID NO: 74) и ₁₅₃HHHSEHRVHGAM₁₆₄(SEQ ID NO: 75), в которых ₁₅₃HHHSEHRVHGAM₁₆₄ (SEQ ID NO: 76) представляет доминантный участок распознавания.

Антитела INX803 И INX804

[17] При исследовании в условиях высокой жесткости антитела INX803 и INX804 не связывали ни один из пептидов, присутствующих в матрице. При исследовании в условиях умеренной жесткости оба антитела связывали миметики прерывистого эпитопа. Кумулятивный анализ профилей связывания позволяет предположить, что оба антитела аналогичным образом распознают пептидные участки ₅₂LTCRLLGPV₆₀(SEQ ID NO: 77), ₇₉EVQTCSERRPIR₉₀(SEQ ID NO: 78), ₉₈HLHHGGHQAA₁₀₇ (SEQ ID NO: 79), ₁₂₃SDHHGNFS₁₃₀ (SEQ ID NO: 80), ₁₅₃HHHSEHRVHGAM₁₆₄ (SEQ ID NO: 81), в которых область ₅₂LTCRLLGPV₆₀ (SEQ ID NO: 77) представляет доминантный участок распознавания.

Антитело INX900

[18] При исследовании в условиях высокой жесткости антитело INX900 очень слабо связывало миметики линейного эпитопа с коровыми последовательностями ₇₉EVQTCSERRPIR₉₀(SEQ ID NO: 68). Заметно большее связывание наблюдали с миметиками прерывистого эпитопа, который в дополнение к последовательности ₇₉EVQTCSERRPIR₉₀(SEQ ID NO: 68) содержит коровые последовательности ₅₆LLGPVDKGHDVTFYK₇₀ (SEQ ID NO: 82), ₁₁₃LAQRHGLESASDHHG₁₂₇ (SEQ ID NO: 83), ₁₅₃HHHSEHRVHGAM₁₆₄ (SEQ ID NO: 84).

Антитело INX903

[19] При исследовании в условиях высокой жесткости антитело INX903 не связывало миметики линейного эпитопа, но слабо связывало миметики конформационного эпитопа. Анализ полученных профилей интенсивности позволяет предположить, что это антитело распознает прерывистый эпитоп, состоящий из коровых последовательностей ₇₉EVQTCSERR₈₇ (SEQ ID NO: 85), ₉₃TFQDLHLHHGGHQAA₁₀₇ (SEQ ID NO: 86), ₁₄₆CLVVEIRHHHSEH₁₅₈ (SEQ ID NO: 87), в которых последовательность ₇₉EVQTCSERR₈₇ (SEQ ID NO: 85) представляет сердцевину эпитопа.

Антитело INX905

[20] При исследовании в условиях высокой жесткости антитело INX905 связывало линейные пептиды с коровыми последовательностями ₇₉EVQTCSERRP₈₈ (SEQ ID NO: 88). Данные, полученные для двойных Ala-мутаций, указывают на то, что мотив RR в ₇₉EVQTCSERRP₈₈ (SEQ ID NO: 88) является критическим для распознавания. Профили интенсивности, полученные для миметиков прерывистого эпитопа, позволяют предположить, что добавление пептидных последовательностей ₅₃TCRLLGPVDKG₆₃(SEQ ID NO: 89), ₁₂₃SDHHG₁₂₇ (SEQ ID NO: 90) и ₁₅₃HHHSEHRVHGAM₁₆₄ (SEQ ID NO: 91) усиливает связывание антитела. На фиг. 17 проиллюстрировано, что агонистические антитела против человеческого VISTA связываются с одной коровой последовательностью. На фиг. 18 также обобщены результаты по эпитопам. На фиг. 19 проиллюстрированы эпитопы, связываемые типовыми агонистическими антителами против человеческого VISTA в соответствии с изобретением и определены важные остатки, вовлеченные в связывание.

Список литературы процитированной в данной заявке

1. Dong, C, Juedes, A.E., Temann, U.A., Shresta, S., Allison, J.P., Ruddle, N.H. and Flavell, R.A., ICOS co-stimulatory receptor is essential for T-cell activation and function. Nature 2001. 409: 97-101.

2. Suh, W.K., Gajewska, B. U., Okada, H., Gronski, M.A., Bertram, E.M., Dawicki, W., Duncan, G.S., Bukczynski, J., Plyte, S., Elia, A., Wakeham, A., Itie, A., Chung, S., Da Costa, J., Arya, S., Horan, T., Campbell, P., Gaida, K., Ohashi, P.S., Watts, T.H., Yoshinaga, S.K., Bray, M.R., Jordana, M. and Ma k, T.W., The B7 family member B7- H3 preferentially down-regulates T helper type 1-mediated immune responses. Nat Immunol 2003. 4: 899-906.

3. Borriello, F., Sethna, M.P., Boyd, S.D., Schweitzer, A.N., Tivol, E.A., Jacoby, D., Strom, T.B., Simpson, E.M., Freeman, G.J. and Sharpe, A.H., B7-1 and B7-2 have overlapping, critical roles in immunoglobulin class switching and germinal center formation. Immunity 1997. 6: 303-313.

4. Chambers, C.A., Sullivan, T.J. and Allison, J.P., Lymphoproliferation in CTLA-4- deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells. Immunity 1997. 7: 885-895.

5. Waterhouse, P., Penninger, J.M., Timms, E., Wakeham, A., Shahinian, A., Lee, K.P., Thompson, C.B., Griesser, H. and Mak, T. W., Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science 1995. 270: 985-988.

6. Tivol, E.A., Borriello, F., Schweitzer, A.N., Lynch, W.P., Bluestone, J.A. and Sharpe, A.H., Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4. Immunity 1995. 3: 541-547.

7. Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N. and Honjo, T., Development of lupuslike autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif- carrying immunoreceptor. Immunity 1999. 11: 141-151.

8. Keir, M.E., Liang, S.C, Guleria, I., Latchman, Y.E., Qipo, A., Albacker, L. A., Koulmanda, M., Freeman, G.J., Sayegh, M.H. and Sharpe, A.H., Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T cell tolerance. J Exp Med 2006. 203: 883-895.

9. Ortler, S., Leder, C, Mittelbronn, M., Zozulya, A.L., Knolle, P.A., Chen, L., Kroner, A. and Wiendl, H., B7-H1 restricts neuroantigen-specific T cell responses and confines inflammatory CNS damage: implications for the lesion pathogenesis of multiple sclerosis. Eur J Immunol 2008. 38: 1734-1744.

10. Zhu, G., Augustine, M.M., Azuma, T., Luo, L, Yao, S., Anand, S., Rietz, A.C, Huang, J., Xu, H., Flies, A. S., Flies, S. J., Tamada, K., Colonna, M., van Deursen, J. M. and Chen, L, B7-H4-deficient mice display augmented neutrophil-mediated innate immunity. Blood 2009. 113: 1759-1767.

11. Chen, Y., Wang, Q., Shi, B., Xu, P., Hu, Z., Bai, L. and Zhang, X., Development of a sandwich ELISA for evaluating soluble PD-Ll (CD274) in human sera of different ages as well as supernatants of PD-L1(+) cell lines. Cytokine 2011.

12. Greenwald, R.J., Freeman, G. J. and Sharpe, A.H., The B7 family revisited. Annu Rev Immunol 2005. 23: 515-548.

13. Zhu, Y., Yao, S., Iliopoulou, B.P., Han, X., Augustine, M.M., Xu, H., Phennicie, R. T., Flies, S.J., Broadwater, M., Ruff, W., Taube, J. M., Zheng, L., Luo, L., Zhu, G., Chen, J. and Chen, L., B7-H5 costimulates human T cells via CD28H. Nat Commun 2013. 4: 2043.

14. Brandt, C.S., Baratin, M., Yi, E.C, Kennedy, J., Gao, Z., Fox, B., Haldeman, B., Ostrander, C. D., Kaifu, T., Chabannon, C, Moretta, A., West, R., Xu, W., Vivier, E. and Levin, S.D., The B7 family member B7-H6 is a tumor cell ligand for the activating natural killer cell receptor N Kp30 in humans. J Exp Med 2009. 206: 1495-1503.

15. Wang, L., Rubinstein, R., Lines, J. L., Wasiuk, A., Ahonen, C, Guo, Y., Lu, L. F., Gondek, D., Wang, Y., Fava, R. A., Fiser, A., Almo, S. and Noelle, R. J., VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses. J Exp Med 2011. 208: 577-592.

16. Lines, J. L., Sempere, L. F., Wang, L., Panttazi, E., Mak, J., O'Connell, S., Ceeraz, S., Suriawinata, A.A., Yan, S., Ernstoff, M.S. and Noelle, R.J., VISTA is an immune checkpoint regulator for human T cells, in revision (Cancer Research).

17. LeMercier, I., Lines, J.L, Sergent, P., Li, J., Noelle, R.J. and Wang, L., VISTA regulates the development of protective anti-tumor immunity, in revision (Cancer Research).

18. Wolchok, J.D., Kluger, H., Callahan, M.K., Postow, M.A., Rizvi, N.A., Lesokhin, A.M., Segal, N.H., Ariyan, C.E., Gordon, R.A., Reed, K., Burke, M.M., Caldwell, A., Kronenberg, S.A., Agunwamba, B.U., Zhang, X., Lowy, I., Inzunza, H. D., Feely, W., Horak, C.E., Hong, Q., Korman, A.J., Wigginton, J.M., Gupta, A. and Sznol, M., Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med 2013. 369: 122-133.

19. lliopoulos, D., Kavousanaki, M., loannou, M., Boumpas, D. and Verginis, P., The negative costimulatory molecule PD-1 modulates the balance between immunity and tolerance via miR-21. Eur J Immunol 2011. 41: 1754-1763.

20. Ansari, M.J., Salama, A.D., Chitnis, T., Smith, R.N., Yagita, H., Akiba, H., Yamazaki, T., Azuma, M., Iwai, H., Khoury, S.J., Auchincloss, H., Jr. and Sayegh, M.H., The programmed death-1 (PD-1) pathway regulates autoimmune diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice. J Exp Med 2003. 198: 63-69.

21. Bertsias, G.K., Nakou, M., Choulaki, C, Raptopoulou, A., Papadimitraki, E., Goulielmos, G., Kritikos, H., Sidiropoulos, P., Tzardi, M., Kardassis, D., Mamalaki, C. and Boumpas, D.T., Genetic, immunologic, and immunohistochemical analysis of the programmed death l/programmed death ligand 1 pathway in human systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 2009. 60: 207-218.

22. Prokunina, L., Castillejo-Lopez, C, Oberg, F., Gunnarsson, I., Berg, L., Magnusson, V., Brookes, A.J., Tentler, D., Kristjansdottir, H., Grondal, G., Bolstad, A.I., Svenungsson, E., Lundberg, I., Sturfelt, G., Jonssen, A., Truedsson, L., Lima, G., Alcocer-Varela, J., Jonsson, R., Gyllensten, U. B., Harley, J. B., Alarcon-Segovia, D., Steinsson, K. and Alarcon-Riquelme, M. E., A regulatory polymorphism in PDCD1 is associated with susceptibility to systemic lupus erythematosus in humans. Nat Genet 2002. 32: 666-669.

23. Ozkaynak, E., Wang, L, Goodearl, A., McDonald, K., Qin, S., O'Keefe, T., Duong, T., Smith, T., Gutierrez-Ramos, J.C, Rottman, J.B., Coyle, A.J. and Hancock, W. W., Programmed death-1 targeting can promote al lograft survival. J Immunol 2002. 169: 6546-6553.

24. Watson, M.P., George, A.J. and Larkin, D.F., Differential effects of costimulatory pathway modulation on corneal allograft survival. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006. 47: 3417-3422.

25. Podojil, J.R., Liu, L.N., Marshall, S.A., Chiang, M.Y., Goings, G.E., Chen, L, Langermann, S. and Miller, S.D., B7-H4lg inhibits mouse and human T-cell function and treats EAE via IL-10/Treg-dependent mechanisms. J Autoimmun 2013. 44: 71-81.

26. Sica, G.L, Choi, I.H., Zhu, G., Tamada, K., Wang, S.D., Tamura, H., Chapoval, A.I., Flies, D.B., Bajorath, J. and Chen, L, B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity. Immunity 2003. 18: 849-861.

27. Wang, X., Hao, J., Metzger, D.L, Mui, A., Ao, Z., Verchere, C.B., Chen, L, Ou, D. and Warnock, G.L, B7-H4 induces donor-specific tolerance in mouse islet allografts. Cell Transplant 2012. 21: 99-111.

28. Yamaura, K., Watanabe, T., Boenisch, O., Yeung, M., Yang, S., Magee, C. N., Padera, R., Datta, S., Schatton, T., Kamimura, Y., Azuma, M. and Najafian, N., I n vivo function of immune inhibitory molecule B7-H4 in alloimmune responses. Am J Transplant 2010. 10: 2355-2362.

29. Yi, K.H. and Chen, L, Fine tuning the immune response through B7-H3 and B7-H4. Immunol Rev 2009. 229: 145-151.

30. Wang, X., Hao, J., Metzger, D.L, Ao, Z., Chen, L, Ou, D., Verchere, C.B., Mui, A. and Warnock, G.L, B7-H4 Treatment of T Cells Inhibits ERK, JN K, p38, and AKT Activation. PLoS One 2012. 7: e28232.

31. Terawaki, S., Tanaka, Y., Nagakura, T., Hayashi, T., Shibayama, S., Muroi, K., Okazaki, T., Mikami, B., Garboczi, D.N., Honjo, T. and Minato, N., Specific and high-affinity binding of tetramerized PD-L1 extracellular domain to PD-l-expressing cells: possible application to enhance T cell function. Int Immunol 2007. 19: 881-890.

32. Sedy, J.R., Gavrieli, M., Potter, K.G., Hurchla, M.A., Lindsley, R.C, Hildner, K., Scheu, S., Pfeffer, K., Ware, C.F., Murphy, T.L. and Murphy, K.M., B and T lymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction with herpesvirus entry mediator. Nat Immunol 2005. 6: 90-98.

33. Parisi, S., Battista, M., Musto, A., Navarra, A., Tarantino, C. and Russo, T., A regulatory loop involving Diesl and miR-125a controls BMP4 signaling in mouse embryonic stem cells. FASEB J 2012. 26: 3957-3968.

34. Youngnak, P., Kozono, Y., Kozono, H., Iwai, H., Otsuki, N., Jin, H., Omura, K., Yagita, H., Pardoll, D. M., Chen, L. and Azuma, M., Differential binding properties of B7-H1 and B7-DC to programmed death-1. Biochem Biophys Res Commun 2003. 307: 672-677.

35. Butte, M.J., Keir, M.E., Phamduy, T.B., Sharpe, A.H. and Freeman, G.J., Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the b7-l costimulatory molecule to inhibit T cell responses. Immunity 2007. 27: 111-122.

36. Sharpe, A.H. and Freeman, G.J., The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol 2002. 2: 116-126.

37. Bartel P.L et al. (1993) Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions. In Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, D.A. Hartley, Ed., Oxford University Press, Oxford; pp 153-179.

38. Beranger F. et al. (1997) Getting more from the two-hybrid system : N-terminal fusions to LexA are efficient and sensitive baits for two-hybrid studies. NAR 25: 2035-36.

39. Formstecher E. et al. (2005) Protein interaction mapping: a Drosophila case study. Genome Res. 15: 37684.

40. Fromont-Racine M., Rain J.C., and Legrain P. (1997) Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive two-hybrid screens. Nat. Genet. 16: 277-82.

41. Rain J.C. et al. (2001) The protein-protein interaction map of Helicobacter pylori. Nature 409: 211-15.

42. Vojtek A. and Hollenberg S.M. (1995) Ras-Raf interaction: two-hybrid analysis. Methods Enzymol. 255: 33142.

43. Wojcik J., Boneca I.G., and Legrain P. (2002) Prediction, assessment and validation of protein interaction maps in bacteria. J. Mol. Biol. 323: 763-70.

44. Franklin EC, Kunkel HG. I mmunologic Differences Between the 19 S and 7 S Components of Normal Human γ-Globulin. The Journal of Immunology. 1957;78(l):ll-8.

45. Roda G, Jharap B, Neeraj N, Colombel J-F. Loss of Response to Anti-TNFs: Definition, Epidemiology, and Management. Clin Trans Gastroenterol. 2016; 7:el35. doi: 10.1038/ctg.2015.63.

46. Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisited. Annual review of immunology. 2005; 23:515-48. PubMed PMID: 15771580.

47. Lines JL, Pantazi E, Mak J, Sempere LF, Wang L, O'Connell S, Ceeraz S, Suriawinata AA, Yan S, Ernstoff MS, Noelle R. VISTA is an immune checkpoint molecule for human T cells. Cancer research. 2014; 74(7):1924-32. doi: 10.1158/0008-5472. CAN-13-1504. PubMed PMID: 24691993; PMCID: 3979527.

48. Le Mercier I, Chen W, Lines JL, Day M, Li J, Sergent P, Noelle RJ, Wang L. VISTA Regulates the Development of Protective Antitumor Immunity. Cancer research. 2014; 74(7):1933-44. doi: 10.1158/0008-5472. CAN-13-1506. PubMed PMI D: 24691994; PMCID: PMC4116689.

49. Flies DB, Han X, Higuchi T, Zheng L, Sun J, Ye JJ, Chen L. Coinhibitory receptor PD-1H preferentially suppresses CD4(+) T cell-mediated immunity. The Journal of clinical investigation. 2014; 124(5):1966-75. doi: 10.1172/JCI74589. PubMed PMID: 24743150; PMCID: 4001557.

50. Lines JL, Sempere LF, Broughton T, Wang L, Noelle R. VISTA Is a Novel Broad-Spectrum Negative Checkpoint Regulator for Cancer Immunotherapy. Cancer immunology research. 2014; 2(6):510-7. doi: 10.1158/2326-6066.CIR- 14-0072. PubMed PMID: 24894088.

51. Wang L, Le Mercier I, Putra J, Chen W, Liu J, Schen k AD, Nowak EC, Suriawinata AA, Li J, Noelle RJ. Disruption of the immune-checkpoint VISTA gene imparts a proinflammatory phenotype with predisposition to the development of autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014; 111(41):14846-51. doi: 10.1073/pnas.l407447111. PubMed PMID: 25267631; PMCID: 4205642.

52. Wang L, Rubinstein R, Lines JL, Wasiuk A, Ahonen C, Guo Y, Lu LF, Gondek D, Wang Y, Fava RA, Fiser A, Almo S, Noelle RJ. VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses. The Journal of experimental medicine. 2011; 208(3):577-92. Epub 2011/03/09. doi: jem.20100619 [pii] 10.1084/jem.20100619. PubMed PMID: 21383057; PMCID: 3058578.

53. Flies DB, Han X, Higuchi T, Zheng L, Sun J, Ye JJ, Chen L. Coinhibitory receptor PD-1H preferentially suppresses CD4(+) T cell-mediated immunity. The Journal of clinical investigation. 2014; 124(5):1966-75. doi: 10.1172/JCI74589. PubMed PMID: PMC4001557.

54. Yoon KW, Byun S, Kwon E, Hwang SY, Chu K, Hiraki M, Jo SH, Weins A, Hakroush S, Cebulla A, Sykes DB, Greka A, Mundel P, Fisher DE, Mandinova A, Lee SW. Control of signaling-mediated clearance of apoptotic cells by the tumor suppressor p53. Science. 2015; 349(6247):1261669. doi: 10.1126/science. l261669. PubMed PMID: 26228159.

55. Bettelli E, Pagany M, Weiner HL, Linington C, Sobel RA, Kuchroo VK. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein-specific T Cell Receptor Transgenic Mice Develop Spontaneous Autoimmune Optic Neuritis. The Journal of experimental medicine. 2003; 197(9):1073-81. doi: 10.1084/jem.20021603.

56. Ceeraz S, Sergent P, Plummer S, Schned A, Pechenick D, Burns C, Noelle R. VISTA deficiency accelerates the development of fatal murine lupus nephritis. Arthritis and Rheumatology. 2016; submitted.

57. Liu J, Yuan Y, Chen W, Putra J, Suriawinata AA, Schenk AD, Miller H E, Guleria I, Barth RJ, Huang YH, Wang L. Immune-checkpoint proteins VISTA and PD-1 nonredundantly regulate murine T-cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2015;112(21):6682-7. doi: 10.1073/pnas.1420370112. PubMed PMI D: 25964334; PMCID: PMC4450438.

58. Flies DB, Higuchi T, Chen L. Mechanistic Assessment of PD-1H Coinhibitory Receptor-Induced T Cell Tolerance to Allogeneic Antigens. Journal of immunology. 2015; 194(ll):5294-304. doi: 10.4049/jimmunol.1402648. PubMed PMID: 25917101; PMCID: PMC4433880.

59. Di Li Mo DJ, Ravetch JV. Fc-Receptor Interactions Regulate Both Cytotoxic and Immunomodulatory Therapeutic Antibody Effector Functions. Cancer immunology research. 2015; 3(7):704-13. doi: 10.1158/2326-6066.cir-15-0120.

60. White AL, Chan HT, French RR, Willoughby J, Mockridge CI, Roghanian A, Penfold CA, Booth SG, Dodhy A, Polak ME, Potter EA, Ardern-Jones MR, Verbeek JS, Johnson PW, Al-Shamkhani A, Cragg MS, Beers SA, Glennie MJ. Conformation of the human immunoglobulin G2 hinge imparts superagonistic properties to immunostimulatory anticancer antibodies. Cancer Cell. 2015;27(l):138-48. doi: 10.1016/j.ccell.2014.11.001. PubMed PMI D: 25500122; PMCID: PMC4297290.

61. Dubey AK, Handu SS, Dubey S, Sharma P, Sharma KK, Ahmed QM. Belimumab: First targeted biological treatment for systemic lupus erythematosus. J Pharmacol Pharmacother. 2011; 2(4):317-9. doi: 10.4103/0976-500X.85930. PubMed PMID: 22025872; PMCID: PMC3198539.

62. Wallace DJ, Hobbs K, Clowse ME, Petri M, Strand V, Pike M, Merrill JT, Leszczynski P, Neuwelt CM, Jeka S, Houssiau F, Keiserman M, Ordi-Ros J, Bongardt S, Kilgallen B, Galateanu C, Kalunian K, Furie R, Gordon C. Long-term safety and efficacy of epratuzumab in the treatment of moderate-to-severe systemic lupus erythematosus: results from an open-label extension study. Arthritis Care Res (Hoboken). 2015. doi: 10.1002/acr.22694. PubMed PMID: 26316325.

63. Van Wauwe JP, De Mey JR, Goossens JG. OKT3: a monoclonal anti-human T lymphocyte antibody with potent mitogenic properties. The Journal of Immunology. 1980; 124(6):2708-13.

64. Robertson JM, Jensen PE, Evavold BD. DO11.10 and OT-II T Cells Recognize a C- Terminal Ovalbumin 323-339 Epitope. The Journal of Immunology. 2000; 164(9):4706-12. doi: 10.4049/jimmunol.164.9.4706.

65. Wang H-X, Liu M, Weng S-Y, Li J-J, Xie C, He H-L, Guan W, Yuan Y-S, Gao J. Immune mechanisms of Concanavalin A model of autoimmune hepatitis. World Journal of Gastroenterology: WJG. 2012;18(2):119-25. doi: 10.3748/wjg.vl8.i2.119. PubMed PM ID: PMC3257438.

66. Weiner GJ. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nat Rev Cancer.

2015; 15(6):361-70. doi: 10.1038/nrc3930. PubMed PMID: 25998715; PMCID: PMC4491443.

67. Ravetch JV, Bolland S. IgG Fc receptors. Annual review of immunology. 2001; 19:275- 90. doi: 10.1146/annurev.immunol.19.1.275. PubMed PMID: 11244038.

68. Li F, Smith P, Ravetch JV. I nhibitory Fey receptor is required for the maintenance of tolerance through distinct mechanisms(). Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 2014; 192(7):3021-8. doi: 10.4049/jimmunol.1302934. PubMed PMI D: PMC3967505.

69. Hinton PR, Johlfs MG, Xiong JM, Hanestad K, Ong KC, Bullock C, Keller S, Tang MT, Tso JY, Vasquez M, Tsurushita N. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. The Journal of biological chemistry. 2004; 279(8):6213-6. doi: 10.1074/jbc.C300470200. PubMed PMID: 14699147.

70. Vaccaro C, Zhou J, Ober RJ, Ward ES. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nature biotechnology. 2005; 23(10):1283-8. doi: 10.1038/nbtll43. PubMed PMID: 16186811.

71. Borrok MJ, Wu Y, Beyaz N, Yu X-Q, Oga nesyan V, Dall'Acqua WF, Tsui P. pH- dependent Binding Engineering Reveals an FcRn Affinity Threshold That Governs IgG Recycling. The Journal of biological chemistry. 2015; 290(7):4282-90. doi: 10.1074/jbc.M114.603712. PubMed PMI D: PMC4326836.

72. Oyarzun P, Ellis JJ, Gonzalez-Galarza FF, Jones AR, Middleton D, Boden M, Kobe B. A bioinformatics tool for epitope-based vaccine design that accounts for human ethnic diversity: Application to emerging infectious diseases. Vaccine. 2015; 33(10):1267-73. doi: http://dx.doi.Org/10.1016/j.vaccine.2015.01.040.

73. Haskins K, Kubo R, White J, Pigeon M, Kappler J, Marrack P. The major histocompatibility complex-restricted antigen receptor on T cells. I. Isolation with a monoclonal antibody. The Journal of experimental medicine. 1983; 157(4):1149-69. Epub 1983/04/01. PubMed PMI D: 6601175; PMCID: Pmc2186983.

74. Markees TG, Phillips NE, Noelle RJ, Shultz LD, Mordes JP, Greiner DL, Rossini AA.

Prolonged survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand. Transplantation. 1997; 64(2):329-35.

75. Ehst BD, I ngulli E, Jenkins MK. Development of a novel transgenic mouse for the study of interactions between CD4 and CD8 T cells during graft rejection. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2003; 3(ll):1355-62. PubMed PM ID: 14525595.

76. Wu S, Jin L, Vence L, Radvanyi LG. Development and application of 'phosphoflow' as a tool for immunomonitoring. Expert Rev Vaccines. 2010; 9(6):631-43. doi: 10.1586/erv.l0.59. PubMed PMID: 20518718; PMCID: PMC2933839.

77. Weissmuller S, Kronhart S, Kreuz D, Schnierle B, Kalinke U, Kirberg J, Ha nschmann KM, Waibler Z. TGN1412 Induces Lymphopenia and Human Cytokine Release in a Humanized Mouse Model. PloS one. 2016; ll(3):e0149093. doi: 10.1371/journal.pone.0149093. PubMed PMID: 26959227; PMCID: PMC4784892.

78. Piccotti JR, Alvey JD, Reindel JF, Guzman RE. T-cell-dependent antibody response: assay development in cynomolgus monkeys. J Immunotoxicol. 2005; 2(4):191-6. doi: 10.1080/15476910500362838. PubMed PMID: 18958673.

79. Muller PY, Brennan FR. Safety assessment and dose selection for first-in-human clinical trials with immunomodulatory monoclonal antibodies. Clin Pharmacol Ther. 2009; 85(3):247-58. doi: 10.1038/clpt.2008.273. PubMed PMID: 19177065

--->

Перечень последовательностей

SEQ ID N0:1: АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ VISTA (Альтернативные

названия: B7-H5; B7H5; DDlalpha; GI24; PP2135; SISP1) Homo sapiens

1 mgvptaleag swrwgsllfa Iflaaslgpv aafkvatpys lyvcpegqnv tltcrllgpv

61 dkghdvtfyk twyrssrgev qtcserrpir nltfqdlhlh hgghqaants hdlaqrhgle

121 sasdhhgnfs itmrnltlld sglycclwe irhhhsehrv hgamelqvqt gkdapsncvv

181 ypsssqdsen itaaalatga civgilclpl illlvykqrq aasnrraqel vrmdsniqgi

241 enpgfeaspp aqgipeakvr hplsyvaqrq psesgrhlls epstplsppg pgdvffpsld

301 pvpdspnfev i

SEQ ID N0:2: АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ VISTA Mus musculus

1 mgvpavpeas sprwgtllla iflaasrglv aafkvttpys lyvcpegqna tltcrilgpv

61 skghdvtiyk twylssrgev qmckehrpir nftlqhlqhh gshlkanash dqpqkhglel

121 asdhhgnfsi tlrnvtprds glycclviel knhhpeqrfy gsmelqvqag kgsgstcmas

181 neqdsdsita aalatgaciv gilclplil l Ivykqrqvas hrraqelvrm dsntqgienp

241 gfettppfqg mpeaktrppl syvaqrqpse sgryllsdps tplsppgpgd vffpsldpvp

301 dspnseai

SEQ ID N0:3: АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ VISTA Mus musculus

1 mgvpavpeas sprwgtllla iflaasrglv aafkvttpys lyvcpegqna tltcrilgpv

61 skghdvtiyk twylssrgev qmckehrpir nftlqhlqhh gshlkanash dqpqkhglel

121 asdhhgnfsi tlrnvtprds glycclviel knhhpeqrfy gsmelqvqag kgsgstcmas

181 neqdsdsita aalatgaciv gilclplil l Ivykqrqvas hrraqelvrm dssntqgien

241 pgfettppfq gmpeaktrpp Isyvaqrqps esgryllsdp stplsppgpg dvffpsldpv

301 pdspnseai

SEQ ID N0:4: НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ VISTA (Альтернативные

названия: B7-H5; B7H5; DDlalpha; GI24; PP2135; SISP1) Homo sapiens

1 gggggcgggt gcctggagca cggcgctggg gccgcccgca gcgctcactc gctcgcactc

61 agtcgcggga ggcttccccg cgccggccgc gtcccgcccg ctccccggca ccagaagttc

121 ctctgcgcgt ccgacggcga catgggcgtc cccacggccc tggaggccgg cagctggcgc

181 tggggatccc tgctcttcgc tctcttcctg gctgcgtccc taggtccggt ggcagccttc

241 aaggtcgcca cgccgtattc cctgtatgtc tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc

301 tgcaggctct tgggccctgt ggacaaaggg cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac

361 cgcagctcga ggggcgaggt gcagacctgc tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg

421 ttccaggacc ttcacctgca ccatggaggc caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg

481 gctcagcgcc acgggctgga gtcggcctcc gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg

541 cgcaacctga ccctgctgga tagcggcctc tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac

601 caccactcgg agcacagggt ccatggtgcc atggagctgc aggtgcagac aggcaaagat

661 gcaccatcca actgtgtggt gtacccatcc tcctcccagg atagtgaaaa catcacggct

721 gcagccctgg ctacgggtgc ctgcatcgta ggaatcctct gcctccccct catcctgctc

781 ctggtctaca agcaaaggca ggcagcctcc aaccgccgtg cccaggagct ggtgcggatg

841 gacagcaaca ttcaagggat tgaaaacccc ggctttgaag cctcaccacc tgcccagggg

901 atacccgagg ccaaagtcag gcaccccctg tcctatgtgg cccagcggca gccttctgag

961 tctgggcggc atctgctttc ggagcccagc acccccctgt ctcctccagg ccccggagac

1021 gtcttcttcc catccctgga ccctgtccct gactctccaa actttgaggt catctagccc

1081 agctggggga cagtgggctg ttgtggctgg gtctggggca ggtgcatttg agccagggct

1141 ggctctgtga gtggcctcct tggcctcggc cctggttccc tccctcctgc tctgggctca

1201 gatactgtga catcccagaa gcccagcccc tcaacccctc tggatgctac atggggatgc

1261 tggacggctc agcccctgtt ccaaggattt tggggtgctg agattctccc ctagagacct

1321 gaaattcacc agctacagat gccaaatgac ttacatctta agaagtctca gaacgtccag

1381 cccttcagca gctctcgttc tgagacatga gccttgggat gtggcagcat cagtgggaca

1441 agatggacac tgggccaccc tcccaggcac cagacacagg gcacggtgga gagacttctc

1501 ccccgtggcc gccttggctc ccccgttttg cccgaggctg ctcttctgtc agacttcctc

1561 tttgtaccac agtggctctg gggccaggcc tgcctgccca ctggccatcg ccaccttccc

1621 cagctgcctc ctaccagcag tttctctgaa gatctgtcaa caggttaagt caatctgggg

1681 cttccactgc ctgcattcca gtccccagag cttggtggtc ccgaaacggg aagtacatat

1741 tggggcatgg tggcctccgt gagcaaatgg tgtcttgggc aatctgaggc caggacagat

1801 gttgccccac ccactggaga tggtgctgag ggaggtgggt ggggccttct gggaaggtga

1861 gtggagaggg gcacctgccc cccgccctcc ccatccccta ctcccactgc tcagcgcggg

1921 ccattgcaag ggtgccacac aatgtcttgt ccaccctggg acacttctga gtatgaagcg

1981 ggatgctatt aaaaactaca tggggaaaca ggtgcaaacc ctggagatgg attgtaagag

2041 ccagtttaaa tctgcactct gctgctcctc ccccaccccc accttccact ccatacaatc

2101 tgggcctggt ggagtcttcg cttcagagcc attcggccag gtgcgggtga tgttcccatc

2161 tcctgcttgt gggcatgccc tggctttgtt tttatacaca taggcaaggt gagtcctctg

2221 tggaattgtg attgaaggat tttaaagcag gggaggagag tagggggcat ctctgtacac

2281 tctgggggta aaacagggaa ggcagtgcct gagcatgggg acaggtgagg tggggctggg

2341 cagaccccct gtagcgttta gcaggatggg ggccccaggt actgtggaga gcatagtcca

2401 gcctgggcat ttgtctccta gcagcctaca ctggctctgc tgagctgggc ctgggtgctg

2461 aaagccagga tttggggcta ggcgggaaga tgttcgccca attgcttggg gggttggggg

2521 gatggaaaag gggagcacct ctaggctgcc tggcagcagt gagccctggg cctgtggcta

2581 cagccaggga accccacctg gacacatggc cctgcttcta agccccccag ttaggcccaa

2641 aggaatggtc cactgagggc ctcctgctct gcctgggctg ggccaggggc tttgaggaga

2701 gggtaaacat aggcccggag atggggctga cacctcgagt ggccagaata tgcccaaacc

2761 ccggcttctc ccttgtccct aggcagaggg gggtcccttc ttttgttccc tctggtcacc

2821 acaatgcttg atgccagctg ccataggaag agggtgctgg ctggccatgg tggcacacac

2881 ctgtcctccc agcactttgc agggctgagg tggaaggacc gcttaagccc aggtgttcaa

2941 ggctgctgtg agctgtgttc gagccactac actccagcct ggggacggag caaaactttg

3001 cctcaaaaca aattttaaaa agaaagaaag aaggaaagag ggtatgtttt tcacaattca

3061 tgggggcctg catggcagga gtggggacag gacacctgct gttcctggag tcgaaggaca

3121 agcccacagc ccagattccg gttctcccaa ctcaggaaga gcatgccctg ccctctgggg

3181 aggctggcct ggccccagcc ctcagctgct gaccttgagg cagagacaac ttctaagaat

3241 ttggctgcca gaccccaggc ctggctgctg ctgtgtggag agggaggcgg cccgcagcag

3301 aacagccacc gcacttcctc ctcagcttcc tctggtgcgg ccctgccctc tcttctctgg

3361 acccttttac aactgaacgc atctgggctt cgtggtttcc tgttttcagc gaaatttact

3421 ctgagctccc agttccatct tcatccatgg ccacaggccc tgcctacaac gcactaggga

3481 cgtccctccc tgctgctgct ggggaggggc aggctgctgg agccgccctc tgagttgccc

3541 gggatggtag tgcctctgat gccagccctg gtggctgtgg gctggggtgc atgggagagc

3601 tgggtgcgag aacatggcgc ctccaggggg cgggaggagc actaggggct ggggcaggag

3661 gctcctggag cgctggattc gtggcacagt ctgaggccct gagagggaaa tccatgcttt

3721 taagaactaa ttcattgtta ggagatcaat caggaattag gggccatctt acctatctcc

3781 tgacattcac agtttaatag agacttcctg cctttattcc ctcccaggga gaggctgaag

3841 gaatggaatt gaaagcacca tttggagggt tttgctgaca cagcggggac tgctcagcac

3901 tccctaaaaa cacaccatgg aggccactgg tgactgctgg tgggcaggct ggccctgcct

3961 gggggagtcc gtggcgatgg gcgctggggt ggaggtgcag gagccccagg acctgctttt

4021 caaaagactt ctgcctgacc agagctccca ctacatgcag tggcccaggg cagaggggct

4081 gatacatggc ctttttcagg gggtgctcct cgcggggtgg acttgggagt gtgcagtggg

4141 acagggggct gcaggggtcc tgccaccacc gagcaccaac ttggcccctg gggtcctgcc

4201 tcatgaatga ggccttcccc agggctggcc tgactgtgct gggggctggg ttaacgtttt

4261 ctcagggaac cacaatgcac gaaagaggaa ctggggttgc taaccaggat gctgggaaca

4321 aaggcctctt gaagcccagc cacagcccag ctgagcatga ggcccagccc atagacggca

4381 caggccacct ggcccattcc ctgggcattc cctgctttgc attgctgctt ctcttcaccc

4441 catggaggct atgtcaccct aactatcctg gaatgtgttg agagggattc tgaatgatca

4501 atatagcttg gtgagacagt gccgagatag atagccatgt ctgccttggg cacgggagag

4561 ggaagtggca gcatgcatgc tgtttcttgg ccttttctgt tagaatactt ggtgctttcc

4621 aacacacttt cacatgtgtt gtaacttgtt tgatccaccc ccttccctga aaatcctggg

4681 aggttttatt gctgccattt aacacagagg gcaatagagg ttctgaaagg tctgtgtctt

4741 gtcaaaacaa gtaaacggtg gaactacgac taaa

SEQ ID N0:5: КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ VISTA

(Альтернативные названия: B7-H5; B7H5; DDlalpha; GI24; PP2135; SISP1)

Homo sapiens

1 ctcgccgcgc tgagccgcct cgggacggag ccatgcggcg ctgggcctgg gccgcggtcg

61 tggtccccct cgggccgcag ctcgtgctcc tcgggggcgt cggggcccgg cgggaggcac

121 agaggacgca gcagcctggc cagcgcgcag atccccccaa cgccaccgcc agcgcgtcct

181 cccgcgaggg gctgcccgag gcccccaagc catcccaggc ctcaggacct gagttctccg

241 acgcccacat gacatggctg aactttgtcc ggcggccgga cgacggcgcc ttaaggaagc

301 ggtgcggaag cagggacaag aagccgcggg atctcttcgg tcccccagga cctccaggtg

361 cagaagtgac cgcggagact ctgcttcacg agtttcagga gctgctgaaa gaggccacgg

421 agcgccggtt ctcagggctt ctggacccgc tgctgcccca gggggcgggc ctgcggctgg

481 tgggcgaggc ctttcactgc cggctgcagg gtccccgccg ggtggacaag cggacgctgg

541 tggagctgca tggtttccag gctcctgctg cccaaggtgc cttcctgcga ggctccggtc

601 tgagcctggc ctcgggtcgg ttcacggccc ccgtgtccgg catcttccag ttctctgcca

661 gtctgcacgt ggaccacagt gagctgcagg gcaaggcccg gctgcgggcc cgggacgtgg

721 tgtgtgttct catctgtatt gagtccctgt gccagcgcca cacgtgcctg gaggccgtct

781 caggcctgga gagcaacagc agggtcttca cgctacaggt gcaggggctg ctgcagctgc

841 aggctggaca gtacgcttct gtgtttgtgg acaatggctc cggggccgtc ctcaccatcc

901 aggcgggctc cagcttctcc gggctgctcc tgggcacgtg agggcgccca ggggggctgg

961 cgaggagctg ccgccggatc ccggggaccc tcctactgat gcccgtggtc accacaataa

1021 agagccctcc accctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

SEQ ID N0:6: КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ VISTA

Mus musculus