АНТИ-ГАЛЕКТИН-9 АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

По этой заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США №62/957,910, поданной 7 января 2020, полное содержание которой, включая все последовательности и чертежи, включено в настоящее описание посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Галектин-9 (или Gal9) является членом семейства белков галектина (или лектина типа-S), включающего, по меньшей мере, 15 членов у позвоночных, в том числе, 10 у людей. Галектин-9 представляет собой растворимый 34-39 кДа белок без лидерного пептида, но, тем не менее, секретируется по неклассическому механизму. Он преимущественно взаимодействует с бета-галактозидными остатками гликопротеинов и гликолипидов. У людей, галектин-9 существует в трех изоформах: длинной, средней и короткой.

Галектин-9 представляет собой один из наиболее изученных лигандов для HAVCR2 (TIM-3) и экспрессируется при различных гематологических злокачественных новообразованиях, таких как CLL, MDS, лимфома Ходжкина и неходжкинские лимфомы, AML, а также при солидных опухолях, таких как рак легких, рак молочной железы и гепатоцеллюлярная карцинома.

Было обнаружено, что взаимодействие HAVCR2/галектина-9 ослабляет размножение Т-клеток и функцию эффекторов в микроокружении опухоли и при хронических инфекциях. Более того, галектин-9 способствует онкогенезу за счет трансформации опухолевых клеток, регуляции клеточного цикла, ангиогенеза и клеточной адгезии.

Галектин-9 также непосредственно экспрессируется регуляторными Т-лимфоцитами (или Treg), и его экспрессия увеличивается во время активации Treg. Между тем, галектин-9 очень слабо экспрессируется эффекторными Т-лимфоцитами (такими как CD8⁺ CTL), и эта экспрессия исчезает при активации эффекторных Т-лимфоцитов. Было обнаружено, что ингибирование галектина-9 анти-Gal9 антителом ингибирует супрессорную активность Treg.

Wu et al. (Immunity 41(2):270-282, 2014) сообщали, что Gal-9 имеет решающее значение для регуляции иммунного ответа. Gal-9 в высокой степени экспрессируется индуцированными регуляторными Т-клетками (iTreg) и имеет решающее значение для образования и функционирования iTreg клеток, но не натуральных регуляторных Т-клеток (nTreg). Экспрессия Gal-9 в клетках iTreg управляется фактором транскрипции Smad3, образуя петлю упреждающего нервного сигнала, которая дополнительно способствует экспрессии Foxp3. Gal-9 повышал стабильность и функцию клеток iTreg, напрямую связываясь с их рецептором CD44, который образовывал комплекс с рецептором I трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) (TGF-βRI) и активировал Smad3. Кроме того, было обнаружено, что передача сигналов Gal-9 регулирует индукцию клеток iTreg, действуя преимущественно через область CNS1 локуса Foxp3. Экзогенный Gal-9, помимо того, что он является эффекторной молекулой для клеток Treg, действует синергически с TGF-β, усиливая дифференциацию и поддержание клеток iTreg.

Различные типы Т-лимфоцитов обычно развиваются, например, в «эффекторные» клетки или эффекторные Т-лимфоциты, которые будут выполнять специализированные иммунные функции для защиты организма хозяина. Таким образом, CD4⁺ Т-лимфоциты или вспомогательные Т-лимфоциты секретируют основные цитокины, помогающие, в частности, В-лимфоцитам в их гуморальной функции (продуцировании специфических антител) и CD8⁺ Т-лимфоцитам в их цитотоксической активности.

Другая популяция CD4⁺ Т-лимфоцитов состоит из натуральных регуляторных Т-лимфоцитов, или «регуляторных Т-лимфоцитов (Treg)». Они конститутивно сверхэкспрессируют молекулу CD25 (также называемую «CD4⁺CD25⁺») и фактор транскрипции Foxp3. Эта небольшая доля CD4⁺CD25⁺ T-лимфоцитов имеет особенность отрицательной регуляции участников иммунного ответа, которые распознают различные аутоантигены по их TCR. Регуляторные Т-лимфоциты также играют важную роль в физиологии иммунной системы, в частности, в защите организма от возникновения аутоиммунных заболеваний. Другими словами, Treg представляют собой субпопуляцию натуральных регуляторных Т-лимфоцитов (или «nTreg»), характеризующихся экспрессией, составляющей CD25, CTLA-4 и GITR, и специфической экспрессией фактора транскрипции Foxp3.

Treg оказывают иммунодепрессивное действие на эффекторные Т-лимфоциты. Такая активность, однажды активированная, в патологической ситуации, такой как опухоль, способствует росту опухоли. Таким образом, под супрессорной активностью Treg можно понимать активность, снижающую противоопухолевый иммунный ответ за счет ингибирования функции эффекторных Т-лимфоцитов.

Галектин-9 в основном ассоциирован с иммунодепрессией опухоли в результате взаимодействия с различными иммунными рецепторами. Например, Gal9 ингибирует ответы Th1 и индуцирует периферическую толерантность, о чем свидетельствует снижение апоптоза Th1 при блокаде Gal9, повышенная восприимчивость мышей с нокаутом Gal9 к CIA (коллаген-индуцированному артриту), и пролонгированная выживаемость трансплантата и супрессия AID при введении Gal9. Gal9 также регулирует функцию периферических NK клеток, способствуя толерантности матери и плода, способствует размножению MDSC и синергизируется с TGF-β, способствуя размножению Treg.

Циркулирующие уровни Gal9 значительно выше у некоторых больных раком по сравнению со здоровым контролем.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанное в настоящем документе изобретение предлагает гуманизированные антитела, направленные против галектина-9, и их применение для лечения заболеваний, связанных с супрессорной активностью регуляторных Т-лимфоцитов (Treg).

В частности, описанное в настоящем документе изобретение предлагает нейтрализующие анти-Gal9 антитела, которые вызывают иммунодепрессию в TME (микроокружении опухоли), что приводит к противоопухолевой активности и клиническому ответу у онкологических больных.

Нейтрализующие анти-Gal9 антитела по изобретению представляют собой производные антитела на основе двух нейтрализующих анти-Gal9 антител (Ab1 и Ab2, соответственно), описанных в US 2017-0283499 A1 (подана 5 июня 2015, включена в настоящий документ посредством ссылки), оба из которых связывают рекомбинантный Gal9 человека со значениями EC₅₀ в диапазоне суб-нМ, и оба блокируют индуцированный Gal9 человека апоптоз CD4⁺ Т-клеток или размножение Treg из периферической крови здоровых доноров. Однако эти два антитела отличаются тем, что Ab2 блокирует взаимодействие рекомбинантного Gal9 человека с двумя иммунными рецепторами (R1 и R2), тогда как Ab1 этого не делает.

Описанные в настоящем документе изобретения предлагают множественные гуманизированные моноклональные антитела на основе Ab1 и Ab2. Эти гуманизированные моноклональные антитела связываются с рекомбинантным Gal9 человека и/или мыши, блокируют Gal9-индуцированный апоптоз Th1 и блокируют Gal9-индуцированное размножение Treg. Более важно, гуманизированные моноклональные антитела по изобретению действуют синергически с антителами, таргетирующими иммунную контрольную точку PD-1/PD-L1, тем самым обеспечивая терапевтическое преимущество для преодоления резистентности, встречающейся при иммунотерапии (например, резистентности при неэффективности с использованием антагонистов PD-1 и PD-L1).

Антитела по изобретению имеют широкое применение при лечении гематологических раков, таких как AML и DLBCL, а также солидных раков, таких как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легких, меланома (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы.

Таким образом, один аспект изобретения предлагает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфичны в отношении галектина-9, и где указанное моноклональное антитело содержит: (1a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 2, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 4 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 6; и (1b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 12 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 14; или (2a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 20 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 22; и (2b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 28 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 30; или (3a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 34, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 36 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 38; и (3b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 42, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 44 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 46; или (4a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 50, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 52 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 54; и (4b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 58, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 60 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 62; или (5a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 66, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 68 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 70; и (5b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 74, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 76 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 78; или (6a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 82, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 84 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 86; и (6b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 90, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 92 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 94; или (7a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 98, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 100 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 102; и (7b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 106, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 108 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 110; или (8a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 114, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 116 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 118; и (8b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 122, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 124 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 128.

В некоторых вариантах осуществления, в выделенном моноклональном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте: (1c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из (1a) и (1b) дополнительно содержат HFR3 последовательность SEQ ID NO: 5 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 1; или (2c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из (2a) и (2b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 21 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 17; или (3c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (3a) и (3b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 37 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 33; или (4c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (4a) и (4b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 53 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 49; или (5c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (5a) и (5b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 69 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 65; или (6c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (6a) и (6b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 85 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 81; или (7c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (7a) и (7b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 101 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 97; или (8c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (8a) и (8b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 117 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 113.

В некоторых вариантах осуществления, в выделенном моноклональном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте: (1A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 8; и/или (1B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 16, или (2A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 24; и/или (2B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 32, или (3A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 40; и/или (3B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 48, или (4A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 56; и/или (4B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 64, или (5A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 72; и/или (5B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 80, или (6A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 88; и/или (6B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 96, или (7A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 104; и/или (7B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 112, или (8A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 120; и/или (8B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 128.

В некоторых вариантах осуществления, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело и содержит: (1) HCVR последовательность SEQ ID NO: 8 и LCVR последовательность SEQ ID NO: 16; или (2) HCVR последовательность SEQ ID NO: 72 и LCVR последовательность SEQ ID NO: 80.

В некоторых вариантах осуществления, его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(ab')2, Fd, одноцепочечный Fv или scFv, Fv, связанный дисульфидной связью, домен V-NAR, IgNar, интратело, IgGΔCH2, минитело, F(ab')3, тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 или scFv-Fc.

В некоторых вариантах осуществления, моноклональные антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты имеют сконструированную Fc область, которая отменяет иммунную эффекторную функцию. Например, сконструированная область Fc рассматриваемого антитела может иметь двойную мутацию «LALA» (Leu234Ala вместе с Leu235Ala) и, таким образом, иметь сниженную эффекторную функцию. Такие антитела могут иметь обозначение G1AA из-за наличия двойной мутации LALA в IgG1.

В данной области техники известны другие рекомбинантные антитела IgG человека (hIgG), частично или полностью лишенные связывания с рецепторами Fcγ (FcγR) и белком комплемента C1q, и, таким образом, с отмененными иммунными эффекторными функциями, которые можно использовать для различных терапевтических применений, чтобы уменьшить активацию FcγR и Fc-опосредованную токсичность. Определенные такие Fc сконструированные антитела/фрагменты частично достигают этой цели, в то время как другие полностью отменяют активацию FcγR и Fc-опосредованную токсичность. В некоторых вариантах осуществления, антитело/фрагмент по изобретению имеет сконструированный домен Fc hIgG, содержащий мутации hIgG1-P329G LALA или hIgG4-P329G SPLE (вариант IgG4 S228P/L235E IgG4 человека), с полной отменой взаимодействий FcγR и C1q, и с незатронутыми взаимодействиями FcRn и Fc стабильностью. Мутация Fc P329G нарушает образование сэндвич-мотива пролина с FcγR. Поскольку этот мотив присутствует на поверхности всех комплексов IgG Fc/FcγR, его разрушение может быть применено ко всем человеческим и большинству других подклассов IgG млекопитающих для создания эффекторных молчащих молекул IgG. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, рассматриваемое антитело/фрагмент имеет любой один подкласс IgG с такой эффекторной молчащей мутацией Fc.

В некоторых вариантах осуществления, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент перекрестно реагирует с Gal9 мыши.

В некоторых вариантах осуществления, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Gal9 человека при EC50 примерно 0,1-0,2 нМ и/или связывается с Gal9 мыши при EC50 примерно 0,5-1,0 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает Gal9 человека с Kd менее примерно 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ или 1 нМ.

В некоторых вариантах осуществления, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению включает одну или несколько точечных мутаций его аминокислотной последовательности, предназначенных для улучшения возможности разработки антитела. Например, в некоторых вариантах осуществления, одна или несколько точечных мутаций делают антитело более стабильным во время его экспрессии в клетке-хозяине, его очистки во время производства, и/или процессов составления и/или его введения субъекту-пациенту. В некоторых вариантах осуществления, одна или несколько точечных мутаций снижают вероятность агрегации антитела в процессе производства и/или составления.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение предлагает терапевтическое антитело с минимизированными или уменьшенными проблемами разработки, такими как удаленная или сниженная гидрофобность и/или оптимизированные заряды за счет замены одной или нескольких аминокислот в его последовательности (например, в одной или нескольких его CDR).

В некоторых вариантах осуществления, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Gal9 и ингибирует связывание Gal9 с рецептором Gal9 (например, TIM3 или CD44).

В некоторых вариантах осуществления, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует Gal-9-индуцированный Th1 апоптоз Т-клеток (таких как CD4+ Т-клетки).

В некоторых вариантах осуществления, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент подавляют Gal9-индуцированное размножение Treg.

В некоторых вариантах осуществления, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент синергически ингибирует рост опухоли in vivo и/или продлевает выживание у мыши с ксенотрансплантатом опухоли с антагонистом иммунной контрольной точки.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный для PD-1 или PD-L1.

В другом аспекте изобретения, предложен способ лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, где способ включает введение пациенту эффективного количества выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению и антагониста иммунной контрольной точки.

В некоторых вариантах осуществления, иммунная контрольная точка представляет собой иммунную контрольную точку PD-1/PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный для PD-1 или PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело, такое как цемиплимаб, ниволумаб или пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-L1 антитело, такое как авелумаб, дурвалумаб, атезолизумаб, KN035 или CK-301.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист иммунной контрольной точки представляет собой (не являющийся антителом) пептидный ингибитор PD-1/PD-L1, такой как AUNP12; низкомолекулярный ингибитор PD-L1, такой как CA-170, или макроциклический пептид, такой как BMS-986189.

В некоторых вариантах осуществления, рак представляет собой гематологический рак (такой как AML и DLBCL) или солидную опухоль (такую как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легких, меланома (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы).

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение пациенту химиотерапевтического агента, антиангиогенного агента, агента, ингибирующего рост, агента для иммуноонкологии и/или противоопухолевой композиции.

Другой аспект изобретения предлагает полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или легкую цепь, или их антигенсвязывающую часть по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотида является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке человека.

Другой аспект изобретения относится к вектору, содержащему полинуклеотид по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, вектор представляет собой вектор экспрессии (например, вектор экспрессии млекопитающих, вектор экспрессии дрожжей, вектор экспрессии насекомых или вектор экспрессии бактерий).

Другой аспект изобретения предлагает способ стимуляции, потенцирования, восстановления или спасения пролиферации эффекторных Т-клеток и/или усиления активности эффекторных Т-клеток у пациента с диагнозом рак, с риском развития рака или рецидивом рака, или способ идентификации и лечения пациента, страдающего раком, где способ включает: введение пациенту эффективного количества выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению при идентификации пациента как имеющего уровень галектина-9 в образце от пациента выше эталонного уровня галектина-9 у здорового или контрольного индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает идентификацию пациента с уровнем галектина-9 в образце выше эталонного уровня путем сравнения уровня галектина-9 в образце с эталонным уровнем.

В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение пациенту антагониста иммунной контрольной точки.

В некоторых вариантах осуществления, иммунная контрольная точка представляет собой иммунную контрольную точку PD-1/PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный для PD-1 или PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело, такое как цемиплимаб, ниволумаб или пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-L1 антитело, такое как авелумаб, дурвалумаб, атезолизумаб, KN035 или CK-301.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист иммунной контрольной точки представляет собой (не являющийся антителом) пептидный ингибитор PD-1/PD-L1, такой как AUNP12; низкомолекулярный ингибитор PD-L1, такой как CA-170, или макроциклический пептид, такой как BMS-986189.

В некоторых вариантах осуществления, рак представляет собой гематологический рак (такой как AML и DLBCL) или солидную опухоль (такую как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легких, меланома (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы).

В некоторых вариантах осуществления, пациент является пациентом с FAB M0, M1, M4 или M5 AML, или, где пациент не является пациентом с FAB M2 или M3 AML.

В некоторых вариантах осуществления, образец представляет собой образец крови, образец плазмы или образец сыворотки.

В другом аспекте изобретения предложен способ спасения или стимуляции пролиферации эффекторных Т-клеток и/или усиления активности эффекторных Т-клеток у пациента с диагнозом AML, с риском развития AML или рецидива AML, или способ идентификации и лечения пациента. с AML, где способ включает: введение пациенту эффективного количества выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению при выявлении у пациента наличия уровня мРНК, кодирующей галектин-9, в образце мононуклеарных клеток (MNC), полученных из костного мозга (BM) от пациента, статистически значимо выше или ниже, чем эталонный уровень в MNC, происходящих из BM, или CD34⁺ клетках у здорового или контрольного индивидуума

В некоторых вариантах осуществления, уровень мРНК, кодирующей галектин-9, в образце MNC, полученных из ВМ, у пациента значительно выше, чем эталонный уровень, когда пациент является пациентом с FAB M0, M1, M2, M4 или M5 AML.

В некоторых вариантах осуществления, уровень мРНК, кодирующей галектин-9, в образце MNC, полученных из ВМ, у пациента значительно ниже эталонного уровня, когда пациент является пациентом с FAB M3 AML.

В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающая часть, направленное против или специфичное к галектину-9, для применения при лечении рака, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть восстанавливают пролиферацию эффекторных Т-клеток, и/или усиливают активность эффекторных Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления, эффекторная Т-клетка представляет собой Th1-клетку.

Другой аспект изобретения предлагает способ восстановления или стимуляции пролиферации эффекторных Т-клеток и/или усиления активности эффекторных Т-клеток, включающий контакт указанной эффекторной Т-клетки с выделенным моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, эффекторная Т-клетка представляет собой Th1-клетку.

Другой аспект изобретения предлагает способ и родственные композиции для индуцирования или стимуляции иммунной памяти, что приводит к противоопухолевой (противораковой) активности. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение композиции (такой как фармацевтическая композиция, содержащая антитело по изобретению) субъекту в количестве, эффективном для индукции, стимулирования или активизации иммунной памяти, что эффективно снижает или ингибирует инициацию, прогрессирование или рецидив опухоли или рака у субъекта.

Следует понимать, что любой вариант осуществления изобретения, описанный в настоящем документе, включая варианты, описанные только в примерах или пунктах формулы изобретения, может быть объединен с любым одним или несколькими дополнительными вариантами осуществления изобретения, если прямо не заявлено иное, или иным образом неправомерно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ. 1 показано выравнивание последовательностей различных гуманизированных антител против галектина-9 человека.

На ФИГ. 2 показано выравнивание последовательностей различных гуманизированных антител против галектина-9 человека.

На ФИГ. 3 показана аффинность связывания (измеренная как EC₅₀ в нМ) различных гуманизированных антител против галектина-9 человека по отношению к рекомбинантному Gal-9 человека. Изотипически сходное антитело против другого антигена используют в качестве отрицательного контроля. В одном случае, исходное химерное антитело человека-мыши также включено для сравнения.

На ФИГ. 4 показана аффинность связывания (измеренная как EC₅₀ в нМ) различных гуманизированных антител против галектина-9 человека по отношению к рекомбинантному Gal-9 мыши. Изотипически сходное антитело против другого антигена используют в качестве отрицательного контроля. В одном случае, исходное химерное антитело человека-мыши также включено для сравнения.

На ФИГ. 5 показано, что различные гуманизированные антитела против галектина-9 человека по изобретению могут блокировать связывание с TIM3 и CDC44.

На ФИГ. 6 показана способность различных гуманизированных антител против галектина-9 человека по изобретению нейтрализовать Gal-9-индуцируемый апоптоз Th1 клеток.

На ФИГ. 7 показана способность различных гуманизированных антител против галектина-9 человека по изобретению нейтрализовать Gal-9-индуцированное размножение Treg.

На ФИГ. 8 показана способность различных гуманизированных антител против галектина-9 человека по изобретению способствовать долговременному выживанию при использовании в комбинации с анти-PD-1 антителами. Данные демонстрируют, что комбинированная терапия с анти-PD-1 антителами приводит к значительно лучшей/синергетической терапевтической эффективности, измеряемой ингибированием увеличения объема опухоли.

На ФИГ. 9 показана способность различных гуманизированных антител против галектина-9 человека по изобретению способствовать долговременному выживанию при использовании в комбинации с анти-PD-1 антителами. Данные демонстрируют, что комбинированная терапия с анти-PD-1 антителами приводит к значительно лучшей/синергетической терапевтической эффективности, измеряемой выживаемостью с течением времени.

На ФИГ. 10 показаны уровни галектина-9 в сыворотке или плазме пациентов с AML и здоровых людей. Данные показывают, что уровни галектина-9 в плазме больных AML на стадии диагноза или стадиях рецидива/рефрактерности (Р/Р) значительно выше, чем в плазме здоровых пациентов и больных AML в полной ремиссии после химиотерапевтического лечения.

На ФИГ. 11 показаны уровни галектина-9 в плазме или сыворотке пациентов с AML, разделенных в соответствии с франко-американо-британской (FAB) классификацией. Данные показывают, что уровни белка галектина-9 в плазме пациентов с AML FAB M2 или FAB M3 при постановке диагноза, значительно ниже, чем наблюдаемые в плазме пациентов с AML FAB M0, M1, M4 или M5. Уровни белка галектина-9 в плазме пациентов с FAB M3 AML при постановке диагноза находятся в пределах нормального физиологического диапазона.

На ФИГ. 12 показаны уровни мРНК, кодирующей галактин-9 (LGALS9), в мононуклеарных клетках (MNC), полученных из костного мозга (BM), у пациентов с AML, разделенных в соответствии с франко-американо-британской (FAB) классификацией, или у здоровых людей. Данные демонстрируют, что уровни мРНК, кодирующие галектин-9, в MNC, полученных из ВМ, у пациентов с AML на момент постановки диагноза (все рассматриваемые FAB) были выше, чем уровни, наблюдаемые в MNC, полученных из ВМ, или в клетках CD34⁺ здоровых людей. Уровни мРНК, кодирующие галектин-9, в MNC, полученных из ВМ, у пациентов с AML FAB M3 на момент постановки диагноза были значительно ниже, чем уровни, наблюдаемые в MNC, полученных из ВМ, у пациентов с AML FAB M0, M1, M4 или M5, или в MNC, полученных из ВМ, или CD34⁺ клетках здоровых индивидуумов.

На ФИГ. 13 показана противоопухолевая активность антитела по изобретению в качестве монотерапии. Этот эксперимент демонстрирует, что моноклональные анти-Gal9 антитела по изобретению эффективны в ингибировании роста опухоли in vivo на модели ксенотрансплантата у мыши. В частности, подопытным мышам прививают примерно полмиллиона раковых клеток, и опухолевой массе дают возможность вырасти до заранее определенного размера. Затем мышей рандомизируют и инъецируют внутрибрюшинно (в/б) одно из двух антител: (1) изотипический контроль IgG в дозе 10 мг/кг, (2) анти-Gal9 антитело HFB9-2 в дозе 10 мг/кг. Первую дозу антител для различных групп вводят в 1 день, и последующие дозы вводят каждые 3 дня, всего восемь доз для любых групп с анти-HFB9-2 антителом и контрольным антителом. Данные представлены как среднее значение ± с.о.с (n=10 мышей в группе). Очевидно, что рассматриваемое анти-Gal9 антитело проявляет ингибирующее действие на рост опухоли in vivo.

На ФИГ. 14 дополнительно показана противоопухолевая активность антитела по изобретению в качестве монотерапии с точки зрения выживаемости: все мыши в контрольной группе погибли, и 40% мышей (4 из 10) в группе лечения HFB9-2 выжили без опухоли в конце 6 недели.

На ФИГ. 15 показана иммунная память противоопухолевой активности антитела по изобретению. После первой инокуляции/провокации опухоли, у наивных животных развиваются опухоли, при этом у 2 из 4 животных достигли объема опухоли 3000 мм³ гуманной конечной точки за 31 день. Четыре животных с полной регрессией опухоли, предварительно обработанные и вылеченные с помощью HFB9-2, антитела по изобретению, полностью отторгли второе заражение опухоли Wehi-164, инокулированную через 63 дня после первого заражения опухолью. Эти данные свидетельствуют о долговременной иммунной памяти, вызванной лечением HFB9-2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Обзор

Хотя моноклональные антитела, таргетирующие иммунные контрольные точки, продемонстрировали клинический успех при ряде типов опухолей, устойчивые ответы наблюдаются только у части пациентов из-за первичной или вторичной резистентности к лечению.

Заявитель считает, что галектин 9 (Gal-9) является ключевым фактором, присутствующим в микроокружении опухоли, который придает опухолям резистентность к современным иммунотерапевтическим средствам. Среди других доказательств сообщается о высокой экспрессии Gal-9 при различных типах рака, включая гематологические злокачественные новообразования, такие как AML и ALL, и множественные солидные опухоли.

Описанное в настоящем документе изобретение предлагает антитела, таргетирующие Gal-9, которые преодолевают резистентность и улучшают клинический ответ, по меньшей мере, у подгруппы больных раком. Моноклональные антитела по изобретению специфически связываются с Gal-9 человека с субнаномолярной аффинностью, распознают рекомбинантный Gal-9 и Gal-9, продуцируемый опухолевыми клетками человека, и перекрестно реагируют с ортологами Gal-9 мыши и обезьяны. Они также блокируют взаимодействие Gal-9 с его рецепторами TIM3 и CD44 дозозависимым образом. Было описано, что эти два рецептора опосредуют Gal-9-иммунодепрессивные сигналы в эффекторных и регуляторных Т-клетках. Обработка РВМС человека от здоровых доноров антителами по изобретению предотвращает Gal-9-индуцированный апоптоз Th1 клеток и подавляет размножение регуляторных Т-клеток.

Определенные гуманизированные версии антител по изобретению обладают дополнительными благоприятными характеристиками с точки зрения стабильности и фармакокинетического (РК) профиля и, таким образом, однозначно подходят для дальнейшей разработки в качестве терапевтических антител. В частности, такие гуманизированные антитела проявляли стабильность в течение, по меньшей мере, 14 дней при 40°С, а также в течение нескольких часов при низком рН и после нескольких циклов замораживания-размораживания. Между тем, для гуманизированного антитела наблюдалось высокое воздействие на плазму после однократного введения дозы 10 мг/кг мышам C57BL/6.

Антитела по изобретению можно использовать для лечения ряда видов рака, таких как AML. Сообщалось, что Gal-9 играет двойную роль в AML как фактор самообновления лейкозных стволовых клеток и как супрессор противоракового иммунитета. Таким образом, противодействие функции Gal-9 с использованием нейтрализующих Gal-9 антител по изобретению представляет собой привлекательный терапевтический подход для лечения AML.

В совокупности, представленные в настоящем документе данные демонстрируют, что нейтрализация Gal-9 антителом по изобретению блокирует ключевые иммунодепрессивные механизмы, которые, как известно, ограничивают эффективность современных иммунотерапевтических средств.

Подробные аспекты изобретения описаны дополнительно и отдельно в различных разделах ниже. Однако следует понимать, что любой вариант осуществления изобретения, включая варианты осуществления, описанные только в примерах или чертежах, и варианты осуществления, описанные только в одном разделе ниже, можно комбинировать с любым(и) другим(и) вариантом(ами) осуществления изобретения.

2. Определения

Термин «антитело» в самом широком смысле охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела). Термин «антитело» может также в широком смысле относиться к молекуле, содержащей определяющую комплементарность область (CDR) 1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где молекула способна связываться с антигеном. Термин «антитело» также включает, но не ограничен ими, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека и антитела различных видов, таких как мышь, человек, яванский макак и т.д.

Однако в более узком смысле, «антитело» относится к различным моноклональным антителам, включая химерные моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела и моноклональные антитела человека, в частности, гуманизированные моноклональные антитела по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит, по меньшей мере, одну тяжелую цепь (HC), содержащую вариабельную область тяжелой цепи и, по меньшей мере, часть константной области тяжелой цепи, и, по меньшей мере, одну легкую цепь (LC), содержащую вариабельную область легкой цепи и, по меньшей мере, часть константной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит две тяжелые цепи, где каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи и, по меньшей мере, часть константной области тяжелой цепи, и две легкие цепи, где каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и, по меньшей мере, часть константной области легкой цепи.

Как используется в настоящем документе, одноцепочечный Fv (scFv) или любое другое антитело, которое содержит, например, одну полипептидную цепь, содержащую все шесть CDR (три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи), считается имеющим тяжелую цепь и легкую цепь. В некоторых таких вариантах осуществления, тяжелая цепь представляет собой область антитела, которая содержит три CDR тяжелой цепи, и легкая цепь представляет собой область антитела, которая содержит три CDR легкой цепи.

Термин «вариабельная область тяжелой цепи (HCVR)», используемый в настоящем документе, относится, как минимум, к области, содержащей CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1), каркасную область 2 (HFR2), CDR2 (CDR-H2), FR3 (HFR3) и CDR3 (CDR-H3). В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи также содержит, по меньшей мере, часть (например, всю) FR1 (HFR1), которая является N-концевой по отношению к CDR-H1, и/или, по меньшей мере, часть (например, всю) FR4 (HFR4), которая является С-концевой по отношению к CDR-H3.

Термин «константная область тяжелой цепи», используемый в настоящем документе, относится к области, содержащей, по меньшей мере, три константных домена тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Неограничивающие типовые константные области тяжелой цепи включают γ, δ и α. Неограничивающие типовые константные области тяжелой цепи также включают ε и μ. Каждая константная область тяжелой цепи соответствует изотипу антитела. Например, антитело, содержащее константную область γ, представляет собой антитело IgG, антитело, содержащее константную область δ, представляет собой антитело IgD, антитело, содержащее константную область α, представляет собой антитело IgA, антитело, содержащее константную область ε, представляет собой антитело IgE, и антитело, содержащее константную область μ, представляет собой антитело IgM.

Некоторые изотипы могут быть дополнительно подразделены на подклассы. Например, антитела IgG включают, но не ограничены ими, IgG1 (содержащий константную область γ1), IgG2 (содержащий константную область γ2), IgG3 (содержащий константную область γ3) и IgG4 (содержащий константную область γ4) антитела; антитела IgA включают, но не ограничены ими, IgA1 (содержащие константную область α1) и IgA2 (содержащие константную область α2) антитела; и антитела IgM включают, но не ограничены ими, IgM1 (содержащие константную область μ1) и IgM2 (содержащие константную область μ2).

Термин «тяжелая цепь», используемый в настоящем документе, относится к полипептиду, содержащему, по меньшей мере, вариабельную область тяжелой цепи с или без лидерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь содержит, по меньшей мере, часть константной области тяжелой цепи. Термин «полноразмерная тяжелая цепь», используемый в настоящем документе, относится к полипептиду, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, с или без лидерной последовательности, и с или без С-концевого лизина.

Термин «вариабельная область легкой цепи (LCVR)», используемый в настоящем документе, относится к области, содержащей CDR1 легкой цепи (CDR-L1), каркасную область (FR) 2 (LFR2), CDR2 (CDR-L2), FR3 (LFR3) и CDR3 (CDR-L3). В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область легкой цепи также содержит, по меньшей мере, часть (например, всю) FR1 (LFR1) и/или, по меньшей мере, часть (например, всю) FR4 (LFR4).

Термин «константная область легкой цепи», используемый в настоящем документе, относится к области, содержащей константный домен легкой цепи, C_L. Неограничивающие типовые константные области легкой цепи включают λ и κ.

Термин «легкая цепь», используемый в настоящем документе, относится к полипептиду, содержащему, по меньшей мере, вариабельную область легкой цепи с или без лидерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь содержит по меньшей мере, часть константной области легкой цепи. Термин «полноразмерная легкая цепь», используемый в настоящем документе, относится к полипептиду, содержащему вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи, с или без лидерной последовательности.

Термин «фрагмент антитела» или «антигенсвязывающая часть» (антитела) включает, но не ограничена ими, фрагменты, которые способны связывать антиген, такие как Fv, одноцепочечный Fv (scFv), Fab, Fab' и (Fab)₂. В некоторых вариантах осуществления, фрагмент антитела включает Fab, Fab', F(ab')₂, F_d, одноцепочечный Fv или scFv, Fv, связанный дисульфидной связью, домен V-NAR, IgNar, интратело, IgGΔCH₂, минитело, F(ab')₃, тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb₂, (scFv)₂ или scFv-Fc.

Термин «Fab» относится к фрагменту антитела с молекулярной массой приблизительно 50000 дальтон и обладает активностью связывания с антигеном. Он включает примерно половину N-концевой стороны тяжелой цепи и всю легкую цепь, соединенные дисульфидным мостиком. Fab можно получить, в частности, обработкой иммуноглобулина протеазой, папаином.

Термин «F(ab')₂» обозначает фрагмент приблизительно в 100000 дальтон и активность связывания с антигеном. Этот фрагмент немного больше, чем два Fab фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области. Эти фрагменты получают обработкой иммуноглобулина протеазой, пепсином. Фрагмент Fab может быть получен из фрагмента F(ab')2 путем расщепления дисульфидного мостика шарнирной области.

Одноцепочечный Fv «scFv» соответствует VH: VL полипептиду, синтезированному с использованием генов, кодирующих домены VL и VH, и последовательности, кодирующей пептид, предназначенный для связывания этих доменов. scFv по изобретению включает CDR, поддерживаемые в соответствующей конформации, например, с использованием методов генетической рекомбинации.

Димеры «scFv» соответствуют двум молекулам scFv, соединенным вместе пептидной связью. Эта цепь Fv часто является результатом экспрессии слитого гена, включающего гены, кодирующие VH и VL, связанные линкерной последовательностью, кодирующей пептид. Фрагмент scFv человека может включать области CDR, которые поддерживаются в подходящей конформации, предпочтительно с помощью методов генетической рекомбинации.

Фрагмент «dsFv» представляет собой VH-VL гетеродимер, стабилизированный дисульфидным мостиком; он может быть двухвалентным (dsFV₂). Фрагменты двухвалентных Sc(Fv)₂ или поливалентных антител могут образовываться спонтанно путем ассоциации одновалентных scFv или продуцироваться путем соединения фрагментов scFv с помощью последовательностей связывания пептидов.

Фрагмент Fc поддерживает биологические свойства антитела, в частности его способность распознаваться эффекторами иммунитета или активировать комплемент. Он состоит из константных фрагментов тяжелых цепей за пределами шарнирной области.

Термин «диатела» означает небольшие фрагменты антител, имеющие два сайта связывания антигена. Эти фрагменты содержат, в одной и той же полипептидной цепи VH-VL, вариабельный домен тяжелой цепи VH, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи VL. При использовании связывающей последовательности, которая слишком коротка, чтобы обеспечить спаривание двух доменов одной и той же цепи, обязательно происходит спаривание с двумя комплементарными доменами другой цепи, и, таким образом, создаются два антигенсвязывающих сайта.

«Антитело, которое связывается с тем же эпитопом», что и эталонное антитело, можно определить с помощью конкурентного анализа антител. Оно относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. Термин «конкурировать», когда он используется в контексте антител, которые конкурируют за один и тот же эпитоп, означает, что конкуренция между антителами определяется анализом, в котором тестируемое антитело предотвращает или ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном.

Можно использовать многочисленные типы анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), сэндвич-конкурентный анализ (см., например, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см., например, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); твердофазный анализ с прямым мечением; твердофазный сэндвич-анализ с прямым мечением (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный RIA с прямым мечением использованием метки I¹²⁵ (см., например, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см., например, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); и RIA с прямым мечением (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol.).

Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клетками, несущими любой из них, немеченого тестируемого антигенсвязывающего белка и меченого эталонного антитела. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого антитела. Обычно тестируемое антитело присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные в конкурентном анализе (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и эталонные антитела, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно проксимальным к эпитопу, связанному эталонным антителом, для возникновения пространственных затруднений. В некоторых вариантах осуществления, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, по меньшей мере, на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%. В некоторых случаях, связывание ингибируется, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95% или 97% или более.

Термин «антиген» относится к молекуле или части молекулы, способной связываться с селективным связывающим агентом, таким как антитело или его иммунологически функциональный фрагмент, и, кроме того, способной к использованию у млекопитающих для получения антител, способных связываться с этим антигеном. Антиген может иметь один или несколько эпитопов, способных взаимодействовать с антителами.

Термин «эпитоп» представляет собой часть молекулы антигена, которая связана агентом селективного связывания, таким как антитело или его фрагмент. Термин включает любую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитоп может быть непрерывным или не непрерывным (например, в полипептиде, аминокислотные остатки, которые не непрерывные относительно друг друга в полипептидной последовательности, но которые в контексте молекулы связаны с антигенсвязывающим белком). В некоторых вариантах осуществления, эпитопы могут быть миметиками в том смысле, что они содержат трехмерную структуру, аналогичную эпитопу, используемому для создания антитела, но при этом не содержат или содержат только некоторые из аминокислотных остатков, обнаруженных в этом эпитопе, используемом для получения антитела. Эпитопные детерминанты могут включать химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные или сульфонильные группы, и могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда.

В некоторых вариантах осуществления, «эпитоп» определяется способом, используемым для его определения. Например, в некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, если они связываются с одной и той же областью антигена, как определено с помощью водородно-дейтериевого обмена (HDX).

Например, последовательность эпитопов исходных антител HFB9-1 и HFB9-2 описана как SEQ ID NO: 9 в US 2017-0283499 A1 (включена в настоящий документ посредством ссылки). Эта последовательность соответствует пептиду Р4 и охватывает конец связывающего пептида и начало С-концевой части галектина-9. Он существует в трех изоформах галектина-9 (например, аминокислоты 166-178 изоформы S, аминокислоты 178-190 изоформы М, аминокислоты 210-222 изоформы L). Гуманизированные антитела по изобретению могут связывать, по меньшей мере, одну, предпочтительно, все изоформы галектина-9.

В некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, если они связываются с одним и тем же участком антигена, как определено с помощью рентгеновской кристаллографии.

«Химерное антитело», используемое в настоящем документе, относится к антителу, содержащему, по меньшей мере, одну вариабельную область первого вида (такого как, мышь, крыса, яванский макак и т.д.) и, по меньшей мере, одну константную область второго вида (такого как человек, яванский макак, курица и т.д.). В некоторых вариантах осуществления, химерное антитело содержит, по меньшей мере, одну вариабельную область мыши и, по меньшей мере, одну константную область человека. В некоторых вариантах осуществления, все вариабельные области химерного антитела относятся к первому виду, и все константные области химерного антитела относятся к второму виду.

Термин «гуманизированное антитело», используемый в настоящем документе, относится к антителу, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота в каркасной области вариабельной области нечеловеческого происхождения (например, мыши, крысы, яванского макака, курицы и т.д.) заменена соответствующей аминокислотой из вариабельной области человека. В некоторых вариантах осуществления, гуманизированное антитело содержит, по меньшей мере, одну константную область человека или ее фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, фрагмент гуманизированного антитела представляет собой Fab, scFv, (Fab')₂ и т.д.

Используемый в настоящем документе термин «антитело с привитыми CDR» относится к гуманизированному антителу, в котором одна или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) первого (нечеловеческого происхождения) вида были привиты к каркасным областям (FR) второго (человеческого) вида.

Используемый в настоящем документе термин «антитело человека» относится к антителам, продуцируемым у людей, антителам, продуцируемым у животных, отличных от человека, которые содержат гены иммуноглобулинов человека, таким как XENOMOUSE®, и антителам, селектированным с использованием способов in vitro, таких как фаговый дисплей, где репертуар антител основан на последовательностях иммуноглобулина человека.

«Клетка-хозяин» относится к клетке, которая может быть или была реципиентом вектора или выделенного полинуклеотида. Клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки или эукариотические клетки. Примеры эукариотических клеток включают клетки млекопитающих, такие как клетки приматов или животных, не являющихся приматами; клетки грибов, такие как дрожжи; клетки растений; и клетки насекомых. Неограничивающие типовые клетки млекопитающих включают, но не ограничены ими, клетки NSO, клетки PER.C6® (Crucell) и клетки 293 и CHO и их производные, такие как клетки 293-6E и DG44, соответственно.

Используемый в настоящем документе термин «выделенная» относится к молекуле, которая была отделена, по меньшей мере, от некоторых компонентов, с которыми она обычно встречается в природе, или была отделена, по меньшей мере, от некоторых компонентов, с которыми она обычно продуцируется. Например, полипептид называется «выделенным», когда он отделен, по меньшей мере, от некоторых компонентов клетки, в которой он был продуцирован. Когда полипептид секретируется клеткой после экспрессии, физическое отделение супернатанта, содержащего полипептид, от клетки, которая его продуцирует, считается «выделением» полипептида. Точно так же, полинуклеотид называется «выделенным», если он не является частью более крупного полинуклеотида (такого как, например, геномная ДНК или митохондриальная ДНК, в случае полинуклеотида ДНК), в котором он обычно встречается в природе, или отделен, по меньшей мере, от некоторых компонентов клетки, в которой он был продуцирован, например, в случае полинуклеотида РНК. Таким образом, полинуклеотид ДНК, который содержится в векторе внутри клетки-хозяина, может называться «выделенным», если этот полинуклеотид не встречается в этом векторе в природе.

Термины «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения млекопитающего, такого как человек. В некоторых вариантах осуществления, также предложены способы лечения других млекопитающих, отличных от человека, включая, но не ограничиваясь ими, грызунов, обезьян, кошачьих, псовых, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, овец, коз, млекопитающих лабораторных животных, млекопитающих сельскохозяйственных животных, млекопитающих спортивных животных, и млекопитающих домашних животных. В некоторых случаях, «субъект» или «пациент» относится к (человеку) субъекту или пациенту, нуждающемуся в лечении заболевания или нарушения.

Используемый в настоящем документе термин «образец» или «образец пациента» относится к материалу, полученному или производному от исследуемого субъекта, который содержит клеточный и/или другой молекулярный объект, подлежащий характеризации и/или идентификации, например, на основе физических, биохимических, химических и/или физиологических характеристик. Например, фраза «образец заболевания» и ее вариации относятся к любому образцу, полученному от представляющего интерес субъекта, который, как ожидается, или о котором известно, содержит клеточный и/или молекулярный объект, который необходимо охарактеризовать.

Под «образцом ткани или клеток» подразумевается коллекция подобных клеток, полученных из ткани субъекта или пациента. Источником образца ткани или клеток может быть твердая ткань, например, из свежего, замороженного и/или консервированного органа или образца ткани, биопсии или аспирата; кровь или любые компоненты крови; жидкости организма, такие как мокрота, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; клетки из любого периода беременности или развития субъекта. Образец ткани также может представлять собой первичные или культивированные клетки или клеточные линии. Необязательно, образец ткани или клетки получают из пораженной ткани/органа. Образец ткани может содержать соединения, которые в природе не смешиваются с тканями, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, питательные вещества, антибиотики или подобные.

«Эталонный образец», «эталонная клетка» или «эталонная ткань», используемые в настоящем документе, относятся к образцу, клетке или ткани, полученным из источника, о котором известно или считается, что он не поражен заболеванием или состоянием, для которого способ или композиция по изобретению используется для идентификации. В одном варианте осуществления, эталонный образец, эталонную клетку или эталонную ткань получают из здоровой части тела того же субъекта или пациента, у которого выявляют заболевание или состояние с использованием композиции или способа по изобретению. В одном варианте осуществления, эталонный образец, эталонную клетку или эталонную ткань получают из здоровой части тела, по меньшей мере, одного индивидуума, который не является субъектом или пациентом, у которого идентифицируется заболевание или состояние с использованием композиции или способа по изобретению. В некоторых вариантах осуществления, эталонный образец, эталонная клетка или эталонная ткань ранее были получены от пациента до развития заболевания или состояния или на более ранней стадии заболевания или состояния.

«Нарушение» или «заболевание» представляет собой любое состояние, при котором было бы полезно лечение одним или несколькими антагонистами Gal-9 по изобретению. Это включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры заболеваний, подлежащих лечению по настоящему изобретению, включают рак.

«Заболевание, ассоциированное с супрессорной активностью регуляторных Т-лимфоцитов» означает любое заболевание (не аутоиммунное), при котором играет роль супрессорная активность регуляторных Т-лимфоцитов, в частности, способствуя развитию или сохранению заболевания. В частности, показано, что супрессорная активность регуляторных Т-лимфоцитов способствует развитию опухолей. Таким образом, изобретение направлено, в частности, на рак, в котором играет роль супрессорная активность Т-лимфоцитов.

Термин «рак» используется в настоящем документе для обозначения группы клеток, которые демонстрируют аномально высокие уровни пролиферации и роста. Рак может быть доброкачественным (также называемым доброкачественной опухолью), пред-злокачественным или злокачественным. Раковые клетки могут быть клетками солидного рака (т.е. образующими солидные опухоли) или раковыми клетками лейкоза. Термин «рост рака» используется в настоящем документе для обозначения пролиферации или роста клетки или клеток, которые содержат рак, что приводит к соответствующему увеличению размера или распространенности рака.

Примеры рака включают, но не ограничены ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные неограничивающие примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, рак гипофиза, рак пищевода, астроцитому, саркому мягких тканей, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или матки, рак слюнных желез, рак почки, почечный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени, рак головного мозга, рак эндометрия, рак яичек, холангиокарциному, рак желчного пузыря, рак желудка, меланому и различные виды рака головы и шеи.

Французско-американо-британская (FAB) классификация острого миелоидного лейкоза (ALM) классифицирует ALM по различным стадиям заболевания. Подтипы FAB показаны в таблице 1.

Таблица 1: Классификация FAB Подтип по FAB Описание М0 Недифференцированный острый миелобластный лейкоз М1 Острый миелобластный лейкоз с минимальным созреванием М2 Острый миелобластный лейкоз с созреванием М3 Острый промиелоцитарный лейкоз (APL) М4 Острый миеломоноцитарный лейкоз М5 Острый моноцитарный лейкоз М6 Острый эритробластный лейкоз М7 Острый мегакариобластный лейкоз

В некоторых вариантах осуществления термин «рак», используемый в настоящем документе, включает гематологический рак (такой как AML и DLBCL) или солидную опухоль (такую как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легких, меланома (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, карцинома почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы).

«Химиотерапевтический агент» представляет собой химическое соединение, которое можно использовать при лечении рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают, но не ограничены ими, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и CYTOXAN® циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбокон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихимицин гаммал и калихеамицин омегалл (см., например, Agnew, Chem lntl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатин хромофор и родственные хромопротеинендииновые антибиотики хромофоры), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, Adriamycin® доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицин пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; агенты, угнетающие функцию надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бесстрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефамин; демеколцин; диазиквон; эльфомитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лосоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронит; митолактит; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ара-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, Taxol® паклитаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), Abraxane®, не содержащий кремофор, наночастичный состав паклитаксела, сконструированный с использованием альбумина (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и Taxotere® доксетаксел (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; Gemzar ® гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; Navelbine® винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Камптозар, СРТ-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметиллорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX); ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®)) и VEGF - A, которые снижают пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных.

Дополнительные неограничивающие примеры химиотерапевтических агентов включают антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на рак, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен Nolvadex®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON® торемифен; ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, регулирующий выработку эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, Megase® мегестрола ацетат, Aromasin® экземестан, форместани, фадрозол, Rivisor®, ворозол, Femara® летрозол и Arimidex® анастрозол; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также троксацитабин (аналог 1,3-диоксолана нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, особенно те, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, участвующих в пролиферации аберрантных клеток, таких как, например, PKC-альфа, Ralf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, Angiozyme® рибозим) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины для генной терапии, например вакцина Allovectin®, вакцина Leuvectin ® и вакцина Vaxid ®; Proleukin® rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1 Lurtotecan®; Abarelix® rmRH; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных.

«Антиангиогенный агент» или «ингибитор ангиогенеза» относится к веществу с небольшой молекулярной массой, полинуклеотиду (включая, например, ингибирующую РНК (РНКи или миРНК)), полипептиду, выделенному белку, рекомбинантному белку, антителу или их конъюгатом или слитым белкам, которые прямо или косвенно ингибируют ангиогенез, васкулогенез или нежелательную сосудистую проницаемость. Следует понимать, что агент против ангиогенеза включает такие агенты, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, антиангиогенный агент представляет собой антитело или другой антагонист ангиогенного агента, например, антитела к VEGF-A (например, бевацизумаб (Avastin®) или к рецептору VEGF-A (например, рецептору KDR или Flt-1), анти-PDGFR ингибиторы, такие как Gleevec® (иматиниб мезилат), малые молекулы, которые блокируют передачу сигналов рецептора VEGF (например, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (сунитиниба малат), AMG706 или описанные в, например, международной патентной заявке WO 2004/113304). Антиангиогенные агенты также включают нативные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (например, в Таблице 3 перечислена антиангиогенная терапия при злокачественной меланоме); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (например, таблица 2, в которой перечислены известные антиангиогенные факторы); и Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (например, в Таблице 1 перечислены антиангиогенные агенты, используемые в клинических испытаниях).

Используемый в настоящем документе термин «агент, ингибирующий рост» относится к соединению или композиции, которые ингибируют рост клетки (такой как клетка, экспрессирующая VEGF) либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, агентом, ингибирующим рост, может быть агент, который значительно снижает долю клеток (таких как клетки, экспрессирующие VEGF) в S фазе. Примеры агентов, ингибирующих рост, включают, но не ограничены ими, агенты, которые блокируют развитие клеточного цикла (в месте, отличном от S фазы), такие как агенты, которые вызывают остановку G1 и остановку М-фазы. Классические блокаторы М-фазы включают барвинок (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те агенты, которые блокируют G1, также переходят в S фазу, например, агенты, алкилирующие ДНК, такие как тамоксифен, преднизолон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-С. Дополнительную информацию можно найти в Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), например, p. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) являются противоопухолевыми лекарственными средствами, получаемыми из тиса. Доцетаксел (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer), полученный из европейского тиса, является полусинтетическим аналогом паклитаксела (Taxol®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел способствуют сборке микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, предотвращая деполимеризацию, что приводит к ингибированию митоза в клетках.

Термин «антинеопластическая композиция» относится к композиции, полезной для лечения рака, содержащей по меньшей мере, один активный терапевтический агент. Примеры терапевтических агентов включают, но не ограничены ими, например, химиотерапевтические агенты, агенты, ингибирующие рост, цитотоксические агенты, агенты, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные агенты, противораковые иммунотерапевтические агенты (также называемые иммуноонкологическими агентами), апоптотические агенты, антитубулиновые агенты и другие агенты для лечения рака, такие как анти-HER-2 антитела, анти-CD20 антитела, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®), ингибиторы фактора роста тромбоцитов (например, Gleevec® (иматиниб мезилат)), ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб), интерфероны, ингибиторы CTLA4 (например, анти-CTLA антитело ипилимумаб (YERVOY®)), ингибиторы PD-1 (например, анти-PD1 антитела, BMS-936558), ингибиторы PDL1 (например, анти-PDL1 антитела, MPDL3280A), ингибиторы PDL2 (например, анти-PDL2 антитела), ингибиторы VISTA (например, анти-VISTA антитела), цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или несколькими из следующих мишеней ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA, PD-1, PDL1, PDL2, CTLA4, VISTA или рецептором(ами) VEGF, TRAIL/Apo2, и другие биоактивные и органические химические агенты и т.д. Их комбинации также включены в изобретение.

«Лечение» относится к терапевтическому лечению, например, при котором целью является замедление (уменьшение) таргетируемого патологического состояния или нарушения, а также, например, при котором целью является подавление рецидива состояния или нарушения. «Лечение» охватывает любое введение или применение терапевтического агента для лечения заболевания (также называемого в настоящем документе «заболевание» или «состояние») у млекопитающего, включая человека, и включает ингибирование заболевания или прогрессирования заболевания, ингибирование или замедление заболевания или его прогрессирования, остановку его развития, частичное или полное облегчение заболевания, частичное или полное облегчение одного или нескольких симптомов заболевания или восстановление или восстановление утраченной, отсутствующей или дефектной функции; или стимулирование неэффективного процесса. Термин «лечение» также включает уменьшение тяжести любого фенотипического признака и/или снижение частоты, степени или вероятности такого признака. В число лиц, нуждающихся в лечении, входят лица, уже страдающие нарушением, а также лица, которым грозит рецидив заболевания, или лица, у которых необходимо предотвратить или замедлить рецидив заболевания.

Термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или нарушения у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество антагониста Gal9 по изобретению может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антагониста вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество включает количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антагониста Gal9 перевешиваются терапевтически полезными эффектами.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическая доза используется у субъектов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному веществу для составления, или носителю, общепринятому в данной области техники для применения с терапевтическим агентом, которые вместе составляют «фармацевтическую композицию» для введения субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель нетоксичен для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и совместим с другими ингредиентами состава. Фармацевтически приемлемый носитель подходит для используемой композиции. Например, если терапевтический агент следует вводить перорально, носитель может представлять собой желатиновую капсулу. Если терапевтический агент следует вводить подкожно, носитель в идеале не раздражает кожу и не вызывает реакции в месте инъекции.

«Готовое изделие» представляет собой любое изделие (например, упаковку или контейнер) или набор, содержащий, по меньшей мере, один реагент, например, лекарственное средство для лечения заболевания или нарушения, или зонд для специфического обнаружения биомаркера, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, производство или набор рекламируются, распространяются или продаются как единое целое для выполнения способов, описанных в настоящем документе.

3. Способы лечения рака

Описанное в настоящем документе изобретение предлагает антагонисты Gal9 (такие как анти-Gal9 антитело) для применения в способах лечения людей и других млекопитающих, отличных от человека.

В патологической ситуации, Treg могут вызывать неадекватную иммунодепрессию, которая может, например, способствовать росту опухоли. Treg были ассоциированы со снижением противоопухолевого иммунного ответа, в частности, за счет неадекватного ингибирования активности эффекторных Т-лимфоцитов, тем самым способствуя развитию многочисленных типов рака.

Во время активации, галектин-9 непосредственно экспрессируется Treg, тогда как эффекторными Т-лимфоцитами он экспрессируется очень слабо или вообще не экспрессируется. Таким образом, таргетирование галектина-9, например, с использованием Gal-9-специфического антитела, может специфически ингибировать супрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов без риска вызвать истощение эффекторных Т-лимфоцитов. Антитела по изобретению, направленные против галектина-9 и ингибирующие супрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов, поэтому могут быть использованы при лечении заболеваний или состояний, связанных с супрессорной активностью регуляторных Т-лимфоцитов, в частности, при лечении рака.

В некоторых вариантах осуществления, предложены способы лечения или профилактики рака, включающие введение эффективного количества антагониста Gal9 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.

В некоторых вариантах осуществления, предложены способы лечения рака, включающие введение антагониста Gal9 субъекту, больному раком.

В некоторых вариантах осуществления, предложено применение антагониста Gal9 для лечения рака.

Рак, поддающийся лечению способом/применением по изобретению, включает рак, при котором регуляторные Т-лимфоциты проявляют свою супрессорную активность, например, рак, при котором относительно большое количество регуляторных Т-лимфоцитов присутствует в опухолевой ткани или в кровотоке. Размножение регуляторных Т-лимфоцитов (которое можно измерить по частоте Treg) обычно коррелирует с усилением активации Treg. Частоту регуляторных Т-лимфоцитов можно оценить любым способом, известным в данной области техники, например, с помощью анализа проточной цитометрией (FACS) внутриопухолевых лимфоцитов или циркулирующих лимфоцитов или с помощью иммуногистологического окрашивания опухолевой ткани.

В настоящем документе предложены не ограничивающие примеры раковых заболеваний, которые можно лечить с помощью антагонистов Gal9, включая карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные неограничивающие примеры таких видов рака включают меланому, рак шейки матки, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, рак гипофиза, рак пищевода, астроцитому, саркому мягких тканей, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или матки, рак слюнных желез, рак почки, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени, рак головного мозга, рак эндометрия, рак яичка, холангиокарциному, рак желчного пузыря, рак желудка, меланому и различные виды рака головы и шеи.

В определенном варианте осуществления, способ/применение по изобретению можно использовать для лечения рака, при котором известны высокие уровни регуляторных Т-лимфоцитов и/или рак/опухоль которого явно ассоциированы с неблагоприятным прогнозом, включая: хронический миелоидный лейкоз (CML), рак толстой кишки, меланому, рак матки, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичников, первичную лимфому центральной нервной системы, множественную миелому, рак предстательной железы, лимфому Ходжкина или гепатоцеллюлярную карциному.

В определенном варианте осуществления, способ/применение по изобретению можно использовать для лечения рака, который продуцирует большие количества экзосом, несущих галектин-9, выполняющий роль иммуносупрессора. Неограничивающие примеры таких видов рака включают: вироиндуцированные виды рака, например, карциномы носоглотки, связанные с EBV (вирусом Эпштейн-Барр), или гепатоцеллюлярные карциномы (CHC), связанные с HCV (вирусом гепатита C) или HBV (вирусом гепатита B).

В некоторых вариантах осуществления, рак представляет собой гематологический рак (такой как AML и DLBCL) или солидную опухоль (такую как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легких, меланому (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы).

В определенном варианте осуществления, способ/применение по изобретению можно использовать для лечения рецидива фиброза, возникающего в результате гепатита С, поскольку также было продемонстрировано, что повышение частоты регуляторных Т-лимфоцитов является фактором, предсказывающим рецидив такого фиброза.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 представляет собой анти-Gal9 антитело или просто «Gal9 антитело».

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 для лечения рака может представлять собой белок, не являющийся антителом, такой как растворимая версия белка Gal9 или его часть (например, ECD), который ингибирует взаимодействие между Gal9 и его лигандом, необязательно дополнительно содержащий партнер по слиянию и имеющий форму молекулы слияния. Различные иллюстративные антагонисты Gal9 описаны более подробно в следующих разделах.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 по изобретению можно использовать отдельно или, альтернативно, использовать в комбинации с любым другим подходящим соединением, о котором известно, что оно способно лечить заболевание или показание.

Таким образом, в соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, антитело, направленное против галектина-9 и ингибирующее супрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов, как определено ранее, применяют в комбинации со вторым терапевтическим агентом для лечения заболевания, связанного с супрессорной активностью регуляторных Т-лимфоцитов, например, противораковым агентом.

То есть, когда применение представляет собой лечение рака, антитело можно использовать в сочетании с известными протиовораковыми терапиями, такими как, например, хирургия, лучевая терапия, химиотерапия или их комбинации. Например, антитело можно использовать в сочетании с адоптивной иммунотерапией, состоящей из одной или нескольких инъекций эффекторных лимфоцитов против опухолевых антигенов, в частности антигенов EBV. Согласно некоторым аспектам, другие противораковые агенты, используемые в комбинации с антителом, направленным против галектина-9, по изобретению, для лечения рака, включают антиангиогенные средства. Согласно некоторым аспектам, антитело можно вводить совместно с цитокином, например, цитокином, который стимулирует противоопухолевый иммунный ответ.

В такой комбинированной терапии, антитело по изобретению можно использовать до, после или одновременно со вторым терапевтическим агентом. См. следующий раздел, посвященный комбинированной терапии.

4. Пути введения и носители

В различных вариантах осуществления, антагонисты Gal9 (например, Gal9 Ab) можно вводить подкожно или внутривенно. Для простоты, «антагонист Gal9» в настоящем документе в узком смысле относится к антителу Gal1 по изобретению, например, к гуманизированному антителу Gal9 по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить in vivo различными путями, включая, помимо прочего, пероральный, внутриартериальный, парентеральный, интраназальный, внутримышечный, внутрисердечный, внутрижелудочковый, интратрахеальный, трансбуккальный, ректальный, внутрибрюшинный, путем ингаляции, внутрикожный, местный, трансдермальный и интратекальный, или иным образом, например, путем имплантации.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 представляет собой анти-Gal9 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и его вводят внутривенно (в/в) или подкожно (п/к).

Рассматриваемые композиции могут быть составлены в виде препаратов в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах; включая, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, клизмы, инъекции, ингалянты и аэрозоли.

В различных вариантах осуществления, композиции, содержащие антагонист Gal9, предложены в составе с широким спектром фармацевтически приемлемых носителей (см., например, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)). Доступны различные фармацевтически приемлемые носители, которые включают наполнители, адъюванты и разбавители. Кроме того, также доступны различные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как агенты, регулирующие рН и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, стабилизаторы, смачивающие агенты и подобные. Не ограничивающие примеры носителей включают солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации.

В различных вариантах осуществления, композиции, содержащие антагонист Gal9, могут быть составлены для инъекций, включая подкожное введение, путем их растворения, суспендирования или эмульгирования в водном или не водном растворителе, таком как растительные или другие масла, синтетические глицериды алифатических кислот, сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоль; и, при желании, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты.

В различных вариантах осуществления, композиции могут быть составлены для ингаляции, например, с использованием приемлемых пропеллентов под давлением, таких как дихлордифторметан, пропан, азот и подобные.

Композиции также могут быть составлены в различных вариантах осуществления в виде микрокапсул с замедленным высвобождением, например, с биоразлагаемыми или не биоразлагаемыми полимерами. Неограничивающий типовой биоразлагаемый состав включает полимер полимолочной кислоты - гликолевой кислоты (PLGA). Неограничивающий иллюстративный небиоразлагаемый состав включает сложный эфир полиглицерина и жирной кислоты. Некоторые способы приготовления таких составов описаны, например, в ЕР 1125584 А1.

Также предложены упаковки с фармацевтическими дозировками, содержащие один или несколько контейнеров, каждый из которых содержит одну или несколько доз антагониста Gal9. В некоторых вариантах осуществления, предложена стандартная доза, где стандартная доза содержит заданное количество композиции, содержащей антагонист Gal9, с или без одним или несколькими дополнительными агентами. В некоторых вариантах осуществления, такая стандартная доза поставляется в одноразовом предварительно заполненном шприце для инъекций. В различных вариантах осуществления, композиция, содержащаяся в стандартной дозировке, может содержать солевой раствор, сахарозу или подобные; буфер, такой как фосфат или подобные; и/или может быть приготовлена в стабильном и эффективном диапазоне рН. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления композиция может быть предложена в виде лиофилизированного порошка, который можно восстановить путем добавления соответствующей жидкости, например, стерильной воды. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит одно или несколько веществ, ингибирующих агрегацию белка, включая, но не ограничиваясь ими, сахарозу и аргинин. В некоторых вариантах осуществления, композиция по изобретению содержит гепарин и/или протеогликан.

Фармацевтические композиции вводят в количестве, эффективном для лечения или профилактики конкретного показания. Терапевтически эффективное количество обычно зависит от веса субъекта, подвергающегося лечению, его или ее физического состояния или состояния здоровья, распространенности состояния, подлежащего лечению, или возраста субъекта, подвергающегося лечению.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве в диапазоне от примерно 50 мкг/кг массы тела до примерно 50 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от примерно 100 мкг/кг массы тела до примерно 50 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от около 100 мкг/кг массы тела до около 20 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от около 0,5 мг/кг массы тела до около 20 мг/кг массы тела на дозу.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от примерно 10 мг до примерно 1000 мг на дозу. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от примерно 20 до примерно 500 мг на дозу. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от около 20 мг до около 300 мг на дозу. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 можно вводить в количестве от примерно 20 до примерно 200 мг на дозу.

Композиции антагониста Gal9 можно вводить субъектам по мере необходимости. В некоторых вариантах осуществления, эффективную дозу антагониста Gal9 вводят субъекту один или несколько раз. В различных вариантах осуществления, эффективную дозу антагониста Gal9 вводят субъекту один раз в месяц, реже одного раза в месяц, например, каждые два месяца, каждые три месяца или каждые шесть месяцев. В других вариантах осуществления, эффективную дозу антагониста Gal9 вводят более одного раза в месяц, например, каждые две недели, каждую неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, ежедневно или несколько раз в день. Эффективную дозу антагониста Gal9 вводят субъекту, по меньшей мере, один раз. В некоторых вариантах осуществления, эффективную дозу антагониста Gal9 можно вводить многократно, в том числе в течение периодов, по меньшей мере, один месяц, по меньшей мере, шесть месяцев или, по меньшей мере, год. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 вводят субъекту по мере необходимости для облегчения одного или нескольких симптомов состояния.

5. Комбинированная терапия

Антагонисты Gal9 по изобретению, включая любые антитела и их функциональные фрагменты, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, в сочетании с другими биологически активными веществами или другими лечебными процедурами для лечения заболеваний. Например, антагонисты Gal9 можно вводить отдельно или вместе с другими способами лечения. Они могут быть предоставлены до, практически одновременно или после других способов лечения, таких как лучевая терапия.

Для лечения рака, антагонист Gal9 можно вводить в сочетании с одним или несколькими противораковыми агентами, такими как ингибитор иммунной контрольной точки, химиотерапевтический агент, агент, ингибирующий рост, антиангиогенный агент или противоопухолевая композиция.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 специфически связывается с Gal9 («антагонист, связывающийся с Gal9»), например, Gal9 антагонистическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят со вторым антагонистом, таким как ингибитор иммунной контрольной точки (например, ингибитор пути PD-1 или PD-L1) субъекту, страдающему заболеванием, при котором стимуляция иммунной системы была бы полезной, например, раком или инфекционными заболеваниями. Два антагониста можно вводить одновременно или последовательно, например, как описано ниже для комбинации антагониста Gal9 с иммуноонкологическим агентом. Одно или несколько дополнительных терапевтических средств, например, модуляторы контрольных точек, могут быть добавлены к лечению антагонистом, связывающимся с Gal9, для лечения рака или инфекционных заболеваний.

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 вводят субъекту одновременно или последовательно с другим лечением, например, субъекту, страдающему раком. Например, антагонист Gal9 можно вводить вместе с одним или несколькими из следующих: лучевой терапией, хирургическим вмешательством или химиотерапией, например, таргетной химиотерапией или иммунотерапией.

Иммунотерапия, например, иммунотерапия рака, включает противораковые вакцины и иммуноонкологические агенты. Антагонист Gal9 может представлять собой, например, белок, антитело, фрагмент антитела или малую молекулу, которая связывается с Gal9. Антагонист Gal9 может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Gal9.

В некоторых вариантах осуществления, способ лечения субъекта, страдающего раком, включает введение субъекту, имеющему рак, антагониста Gal9, например, антитела Gal9, и одного или нескольких иммуноонкологических агентов, таких как ингибитор иммунной контрольной точки.

Иммунотерапия, например, терапия иммуноонкологическим агентом, эффективна для усиления, стимуляции и/или активации иммунных ответов у субъекта. В одном аспекте, введение антагониста Gal9 с иммуноонкологическим агентом (таким как ингибитор PD-1) оказывает синергический эффект при лечении рака, например, при ингибировании роста опухоли.

В одном аспекте, антагонист Gal9 вводят последовательно перед введением иммуноонкологического агента. В одном аспекте, антагонист Gal9 вводят одновременно с иммуноонкологическим агентом (таким как ингибитор PD-1). В еще одном аспекте, антагонист Gal9 вводят последовательно после введения иммуноонкологического агента (такого как ингибитор PD-1). Введение двух агентов может начинаться, например, с промежутком 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 5 дней, 7 дней или одна или несколько недель, или введение второго агента может начинаться, например, через 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дней, 5 дней, 7 дней или одной или нескольких недель после введения первого агента.

В некоторых аспектах, антагонист Gal9 и иммуноонкологический агент (например, ингибитор PD-1) вводят пациенту одновременно, например, вливают одновременно, например, в течение 30 или 60 минут. Антагонист Gal9 может быть составлен совместно с иммуноонкологическим агентом (таким как ингибитор PD-1).

Иммуноонкологические агенты включают, например, низкомолекулярное лекарственное средство, антитело или его фрагмент или другую биологическую или малую молекулу. Примеры биологических иммуноонкологических агентов включают, но не ограничены ими, антитела, фрагменты антител, вакцины и цитокины. В одном аспекте, антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых аспектах, моноклональное антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.

В одном аспекте, иммуноонкологический агент представляет собой (i) агонист стимулирующей (в том числе костимулирующей) молекулы (например, рецептора или лиганда) или (ii) антагонист ингибирующей (в том числе коингибирующей) молекулы (например, рецептора или лиганда) на иммунных клетках, например, Т-клетках, оба из которых приводят к усилению антиген-специфических Т-клеточных ответов. В некоторых аспектах, иммуноонкологический агент представляет собой (i) агонист стимулирующей (в том числе костимулирующей) молекулы (например, рецептора или лиганда) или (ii) антагонист ингибирующей (в том числе коингибирующей) молекулы (например, рецептора или лиганда) на клетках, участвующих во врожденном иммунитете, например, NK-клетках, и где иммуноонкологический агент усиливает врожденный иммунитет. Такие иммуноонкологические агенты часто называют регуляторами иммунных контрольных точек, например, ингибиторами иммунных контрольных точек или стимуляторами иммунных контрольных точек.

В некоторых вариантах осуществления, иммуноонкологический агент может представлять собой агент, который таргетирует (или специфически связывается) с членом семейства мембраносвязанных лигандов B7, которое включает B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 и B7-H6, или костимулирующий или коингибирующий рецептор, специфически связывающийся с членом семейства B7. Иммуноонкологический агент может представлять собой агент, который таргетирует член семейства мембраносвязанных лигандов TNF или костимулирующий или коингибирующий рецептор, специфически связывающийся с ним, например, член семейства рецепторов TNF. Примеры членов семейства TNF и TNFR, на которые могут воздействовать иммуноонкологические агенты, включают CD40 и CD40L, OX-40, OX-40L, GITR, GITRL, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137 (4-1BB), TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fnl4, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTfiR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, лимфотоксин α/ΤΝΡβ, TNFR2, TNFa, LTfiR, лимфотоксин a 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY и NGFR. Иммуноонкологический агент, который можно использовать в комбинации с агентом-антагонистом Gal9 для лечения рака, может представлять собой агент, например, антитело, таргетирующее член семейства B7, член семейства рецепторов B7, член семейства TNF или член семейства TNFR, такие, как описанные выше.

В одном аспекте, антагонист Gal9 вводят с одним или несколькими из (i) антагониста белка, который ингибирует активацию Т-клеток (например, ингибитора иммунной контрольной точки), такого как CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM3, CEACAM- 1, BTLA, CD69, галектин-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3, B7-H4, 2B4, CD48, GARP, PDIH, LAIRl, TIM-1, TIM-4 и PSGL-1 и (ii) агониста белка, который стимулирует активацию Т-клеток, такого как B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, CD40L, DR3 и CD28H.

В одном аспекте, иммуноонкологический агент представляет собой агент, который ингибирует (т.е. антагонист) цитокин, который ингибирует активацию Т-клеток (например, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF и другие иммунодепрессивные цитокины) или является агонистом цитокина, такого как IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 и IFNα (например, самого цитокина), который стимулирует активацию Т-клеток и стимулирует иммунный ответ.

Другие агенты, которые можно комбинировать с антагонистом Gal9 для стимуляции иммунной системы, например, для лечения рака и инфекционных заболеваний, включают антагонисты ингибирующих рецепторов на NK-клетках или агонисты активирующих рецепторов на NK-клетках. Например, анти-Gal9 антагонист можно комбинировать с антагонистом KIR.

Другие агенты для комбинированной терапии включают агенты, которые ингибируют или истощают макрофаги или моноциты, включая, но не ограничиваясь ими, антагонисты CSF-IR, такие как антитела-антагонисты CSF-IR, включая RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, W013/87699, W013/119716, WO13/132044) или FPA008 (WO11/140249; WO13/169264; WO14/036357).

Иммуноонкологические агенты также включают агенты, которые ингибируют передачу сигналов TGF-β.

Дополнительные агенты, которые можно комбинировать с антагонистом Gal9, включают агенты, которые усиливают презентацию опухолевого антигена, например, вакцины на основе дендритных клеток, клеточные вакцины, секретирующие GM-CSF, олигонуклеотиды CpG и имиквимод, или терапевтические агенты, которые повышают иммуногенность опухолевых клеток (например, антрациклины).

Еще другие методы лечения, которые можно комбинировать с антагонистом Gal9, включают методы лечения, которые истощают или блокируют клетки Treg, например, агент, который специфически связывается с CD25.

Другая терапия, которую можно комбинировать с антагонистом Gal9, представляет собой терапию, которая ингибирует метаболический фермент, такой как индоламиндиоксигеназа (IDO), диоксигеназа, аргиназа или синтетаза оксида азота.

Другой класс агентов, которые можно использовать, включает агенты, которые ингибируют образование аденозина или ингибируют рецептор аденозина A2A.

Другие методы лечения, которые можно комбинировать с антагонистом Gal9 для лечения рака, включают методы лечения, которые обращают/предотвращают анергию или истощение Т-клеток, и методы лечения, которые вызывают активацию врожденного иммунитета и/или воспаление в месте опухоли.

Антагонист Gal9 можно комбинировать с более чем одним иммуноонкологическим агентом (таким как ингибитор иммунной контрольной точки) и его можно, например, комбинировать с комбинаторным подходом, таргетирующим несколько элементов иммунного пути, таких как один или несколько из следующих: терапия, которая усиливает презентацию опухолевого антигена (например, вакцина на основе дендритных клеток, клеточные вакцины, секретирующие GM-CSF, олигонуклеотиды CpG, имиквимод); терапия, которая ингибирует отрицательную иммунную регуляцию, например, путем ингибирования пути CTLA-4 и/или PD1/PD-L1/PD-L2 и/или истощения или блокирования Treg или других иммунодепрессивных клеток; терапия, которая стимулирует положительную иммунную регуляцию, например, с агонистами, которые стимулируют путь CD-137, OX-40 и/или GITR и/или стимулируют эффекторную функцию Т-клеток; терапия, системно повышающая частоту противоопухолевых Т-клеток; терапия, которая истощает или ингибирует Treg, такие как Treg в опухоли, например, с использованием антагониста CD25 (например, даклизумаба) или путем истощения гранул анти-CD25 ex vivo; терапия, влияющая на функцию супрессорных миелоидных клеток в опухоли; терапия, повышающая иммуногенность опухолевых клеток (например, антрациклины); адоптивный перенос Т-клеток или NK-клеток, включая генетически модифицированные клетки, например, клетки, модифицированные химерными антигенными рецепторами (терапия CAR-T); терапия, которая ингибирует метаболический фермент, такой как индоламиндиоксигеназа (IDO), диоксигеназа, аргиназа или синтетаза оксида азота; терапия, которая устраняет/предотвращает анергию или истощение Т-клеток; терапия, которая запускает врожденную иммунную активацию и/или воспаление в месте опухоли; введение иммуностимулирующих цитокинов или блокирование иммунорепрессивных цитокинов.

Например, антагонист Gal9 можно использовать с одним или несколькими агонистическими агентами, которые лигируют положительные костимулирующие рецепторы; один или несколько антагонистов (блокирующих агентов), которые ослабляют передачу сигналов через ингибирующие рецепторы, такие как антагонисты, которые преодолевают различные пути подавления иммунитета в микроокружении опухоли (например, блокируют взаимодействия PD-L1/PD-1/PD-L2); один или несколько агентов, которые системно повышают частоту противоопухолевых иммунных клеток, таких как Т-клетки, истощают или ингибируют Treg (например, путем ингибирования CD25); один или несколько агентов, ингибирующих метаболические ферменты, такие как IDO; один или несколько агентов, которые обращают/предотвращают анергию или истощение Т-клеток; и один или несколько агентов, которые запускают активацию врожденного иммунитета и/или воспаление в опухолевых участках.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой антагонист CTLA-4, такой как антагонистическое антитело CTLA-4. Подходящие CTLA-4 антитела включают, например, YERVOY (ипилимумаб) или тремелимумаб.

В одном варианте осуществления субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой антагонист PD-1, такой как антагонистическое анти-PD-1 антитело. Подходящие анти-PD-1 антитела включают, например, OPDIVO (ниволумаб), KEYTRUDA (пембролизумаб) или MEDI-0680 (AMP-514; WO2012/145493). Иммуноонкологический агент может также включать пидилизумаб (CT-011). Другим подходом к таргетированию рецептора PD-1 является рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточного домена PD-L2 (B7-DC), слитого с Fc частью IgG1, называемый AMP-224.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой антагонист PD-L1, такой как антагонистическое PD-L1 антитело. Подходящие PD-L1 антитела включают, например, MPDL3280A (RG7446; WO2010/077634), дурвалумаб (MEDI4736), BMS-936559 (WO2007/005874), MSB0010718C (WO2013/79174) или rHigM12B7.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой антагонист LAG-3, такой как антагонистическое LAG-3 антитело. Подходящие антитела к LAG3 включают, например, BMS-986016 (WO10/19570, WO 14/08218) или IMP-731 или IMP-321 (WO08/132601, WO09/44273).

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой агонист CD137 (4-1BB), такой как агонистическое CD137 антитело. Подходящие антитела к CD137 включают, например, урелумаб или PF-05082566 (W012/32433).

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой агонист GITR, такой как агонистическое GITR антитело. Подходящие антитела к GITR включают, например, TRX-518 (WO06/105021, WO09/009116), MK-4166 (WO 11/028683) или GITR антитело, описанное в WO 2015/031667.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой агонист OX40, такой как агонистическое OX40 антитело. Подходящие OX40 антитела включают, например, MEDI-6383, MEDI-6469 или MOXR0916 (RG7888; WO06/029879).

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой агонист CD40, такой как агонистическое CD40 антитело. В некоторых вариантах осуществления, иммуноонкологический агент представляет собой антагонист CD40, такой как антагонистическое CD40 антитело. Подходящие CD40 антитела включают, например, лукатумумаб (HCD122), дацетузумаб (SGN-40), CP-870,893 или Chi Lob 7/4.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой агонист CD27, такой как агонистическое CD27 антитело. Подходящие CD27 антитела включают, например, варлилумаб (CDX-1127).

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой MGA271 (до B7H3) (WO11/109400).

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент является антагонистом KIR, таким как лирилумаб.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент является антагонистом IDO. Подходящие антагонисты IDO включают, например, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), индоксимод, NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO 12/142237) или F001287.

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой агонист Toll-подобного рецептора, например, агонист TLR2/4 (например, Bacillus Calmette-Guerin); агонист TLR7 (например, хилтонол или имихимод); агонист TLR7/8 (например, резиквимод); или агонист TLR9 (например, CpG7909).

В одном варианте осуществления, субъекта, страдающего заболеванием, при котором может помочь стимуляция иммунной системы, например, раком или инфекционным заболеванием, лечат путем введения субъекту антагониста Gal9 и иммуноонкологического агента, где иммуноонкологический агент представляет собой ингибитор TGF-β, например, GC1008, LY2157299, TEW7197 или IMC-TR1.

6. Типовые антагонисты Gal9

В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 представляет собой Gal9 антитело. В некоторых вариантах осуществления, антагонист Gal9 для лечения рака может представлять собой белок, не являющийся антителом, такой как растворимый Gal9 или его часть (например, ECD), который ингибирует взаимодействие между Gal9 и его лигандом, необязательно дополнительно содержащий партнер по слиянию и в виде слитой молекулы. Антагонист, в других вариантах осуществления, также может представлять собой малую молекулу или малый пептид.

Gal9 антитела

В некоторых вариантах осуществления, предложены антитела, которые блокируют связывание Gal9 и его лиганда. В некоторых вариантах осуществления, предложены антитела, которые ингибируют Gal9-опосредованную передачу сигналов. В некоторых таких вариантах осуществления, антитело представляет собой Gal9 антитело. В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело ингибирует связывание Gal9 с его лигандом. В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело ингибирует Gal9-опосредованную передачу сигналов.

В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело по изобретению имеет константу диссоциации (K_d) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10^-8 М или меньше, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М) для Gal9, например, для Gal9 человека. В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело имеет константу диссоциации (K_d) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10^-8 М или меньше, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М) для Gal9, например, для Gal9 человека.

В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело, обладающее любыми характеристиками, представленными в настоящем документе, ингибирует, по меньшей мере, 25%, 50%, 75%, 80%, 90% или 100% передачи сигналов Gal9.

В некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с Gal9 из нескольких видов. Например, в некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с Gal9 человека, и также связывается с Gal9, по меньшей мере, одного млекопитающего, отличного от человека, выбранного из мыши, крысы, собаки, морской свинки и яванского макака.

В некоторых вариантах осуществления, предложены мультиспецифические антитела. В некоторых вариантах осуществления, предложены биспецифические антитела. Неограничивающие типовые биспецифические антитела включают антитела, содержащие первое плечо, содержащее комбинацию тяжелой цепи/легкой цепи, которая связывает первый антиген, и второе плечо, содержащее комбинацию тяжелой цепи/легкой цепи, которая связывает второй антиген. Еще одно неограничивающее типовое мультиспецифическое антитело представляет собой антитело с двойным вариабельным доменом. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело содержит первое плечо, которое ингибирует связывание Gal9, и второе плечо, которое стимулирует Т-клетки, например, путем связывания CD3. В некоторых вариантах осуществления, первое плечо связывает Gal9.

В некоторых вариантах осуществления, моноклональные антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, включая гуманизированные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, включают одну или несколько точечных мутаций в аминокислотных последовательностях, предназначенных для улучшения способности антитела к разработке. Например, в Raybould et al. (Five computational developability guidelines for therapeutic antibody profiling, PNAS 116(10): 4025-4030, 2019) описан профилировщик терапевтического антитела (TAP), вычислительный инструмент, который строит загружаемые модели гомологии последовательностей вариабельных доменов, тестирует их на соответствие пяти рекомендациям по разработке, и сообщает о потенциальных обязательствах последовательности и канонических формах. Авторы также предлагают TAP в свободном доступе по адресу opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/TAP.php.

Помимо достижения желаемой аффинности к антигену, существует множество барьеров для разработки терапевтических mAb. К ним относятся внутренняя иммуногенность, химическая и конформационная нестабильность, самоассоциация, высокая вязкость, полиспецифичность и плохая экспрессия. Например, высокие уровни гидрофобности, особенно в высоко вариабельных определяющих комплементарность областях (CDR), неоднократно были вовлечены в агрегацию, вязкость и полиспецифичность. Асимметрия суммарного заряда вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей также коррелирует с самоассоциацией и вязкостью при высоких концентрациях. Участки положительного и отрицательного заряда в CDR связаны с высокими показателями клиренса и плохими уровнями экспрессии. Гетерогенность продукта (например, за счет окисления, изомеризации или гликозилирования) часто является результатом специфических мотивов последовательности, подверженных пост- или котрансляционной модификации. Имеются вычислительные инструменты, облегчающие идентификацию обязательств последовательности. В Warszawski et al. (Optimizing antibody affinity and stability by the automated design of the variable light-heavy chain interfaces. PLoS Comput Biol 15(8): e1007207. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007207) также описаны способы оптимизации аффинности и стабильности антител за счет автоматизированного проектирования интерфейсов вариабельной легкой цепи. Доступны дополнительные способы идентификации потенциальных проблем с возможностью разработки антитела-кандидата, и в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, одна или несколько точечных мутаций могут быть введены с помощью обычных способов в антитело-кандидат, чтобы решить такие проблемы, чтобы получить оптимизированное терапевтическое антитело по изобретению.

Последовательности некоторых типовых антител, включая вариабельные области легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (HC), области CDR и каркасные области (FR), перечислены ниже.

HFB9-1hz1-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 2)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 4)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 6)

HCVR: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 10)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 12)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 14)

LCVR: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 16)

Для всех последовательностей тяжелой цепи антитела, последовательности каркасной области HFR1-HFR4 определяются последовательностями VH-CDR. Например, HFR1 представляет собой HCVR последовательность, которая является N-концевой к VH-CDR1. HFR2 представляет собой HCVR последовательность, расположенную между VH-CDR1 и VH-CDR2. HFR3 представляет собой HCVR последовательность, расположенную между VH-CDR2 и VH-CDR3. HFR4 представляет собой наиболее С-концевую HCVR последовательность.

Аналогично, для всех последовательностей легкой цепи антитела, последовательности LFR1-LFR4 каркасной области определяются последовательностями VL-CDR. Например, LFR1 представляет собой LCVR последовательность, которая является N-концевой к VL-CDR1. LFR2 представляет собой LCVR последовательность, расположенную между VL-CDR1 и VL-CDR2. LFR3 представляет собой LCVR последовательность, расположенную между VL-CDR2 и VL-CDR3. LFR4 представляет собой наиболее С-концевую LCVR последовательность.

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz1-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz1-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 15.

HFB9-1hz2-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 18)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 20)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 22)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTRHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 26)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 28)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 30)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 32)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz2-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 17, 19, 21 и 23. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz2-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 25, 27, 29 и 31.

HFB9-1hz3-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 34)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 36)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 38)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 40)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 42)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 44)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 46)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 48)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz3-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 33, 35, 37 и 39. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz3-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 41, 43, 45 и 47.

HFB9-1hz4-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 50)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 52)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 54)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 56)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 58)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 60)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 62)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 64)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz4-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 49, 51, 53 и 55. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz4-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 57, 59, 61 и 63.

HFB9-2hz11-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 66)

VH-CDR2: WFYPGSGSTEYAQKFQG (SEQ ID NO: 68)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 70)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSGSTEYAQKFQGRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 72)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 74)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 76)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 78)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 80)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz11-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 65, 67, 69 и 71. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz11-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 73, 75, 77 и 79.

HFB9-2hz12-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 82)

VH-CDR2: WFYPGSGSAEYAQKFQG (SEQ ID NO: 84)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 86)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSGSAEYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 88)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 90)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 92)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 94)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 96)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz12-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 81, 83, 85 и 87. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz12-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 89, 91, 93 и 95.

HFB9-2hz13-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 98)

VH-CDR2: WFYPGSGSTEYAQKFQG (SEQ ID NO: 100)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 102)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSGSTEYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 104)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 106)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 108)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 110)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 112)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz13-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 97, 99, 101 и 103. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz13-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 105, 107, 109 и 111.

HFB9-2hz14-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 114)

VH-CDR2: WFYPGSGSTEYSPSFQG (SEQ ID NO: 116)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 118)

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTEYTIHWVRQMPGKGLEWMGWFYPGSGSTEYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 120)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 122)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 124)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 126)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 128)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz14-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 113, 115, 117 и 119. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz14-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 121, 123, 125 и 127.

7. Гуманизированные антитела

В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело представляет собой гуманизированное антитело. Гуманизированные антитела полезны в качестве терапевтических молекул, поскольку гуманизированные антитела уменьшают или устраняют иммунный ответ человека на нечеловеческие антитела (например, ответ анти-мышиного антитела человека (HAMA)), что может привести к иммунному ответу на терапевтическое антитело, и снижение эффективности терапевтических агентов.

Антитело может быть гуманизировано любым стандартным способом. Неограничивающие типовые способы гуманизации включают способы, описанные, например, в патентах США №№5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-27 (1988); Verhoeyen et al, Science 239: 1534-36 (1988); и публикации США № US 2009/0136500. Все включены посредством ссылки.

Гуманизированное антитело представляет собой антитело, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота в каркасной области нечеловеческой вариабельной области заменена аминокислотой из соответствующего положения в каркасной области человека. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь, по меньшей мере, восемь, по меньшей мере, девять, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 11, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 15, или, по меньшей мере, 20 аминокислот в каркасных областях нечеловеческой вариабельной области заменены аминокислотой из одной или нескольких соответствующих локаций в одной или нескольких каркасных областях человека.

В некоторых вариантах осуществления, некоторые из соответствующих аминокислот человека, используемых для замены, происходят из каркасных областей различных генов иммуноглобулина человека. То есть, в некоторых таких вариантах осуществления, одна или несколько нечеловеческих аминокислот могут быть заменены соответствующими аминокислотами из каркасной области человека первого антитела человека или кодируются первым геном иммуноглобулина человека, одна или несколько нечеловеческих аминокислот могут быть заменены соответствующими аминокислотами из каркасной области человека второго антитела человека или кодируются вторым геном иммуноглобулина человека, одна или несколько нечеловеческих аминокислот могут быть заменены соответствующими аминокислотами каркасной области человека третьего антитела человека или кодируются третьим геном иммуноглобулина человека и т.д. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления, все соответствующие аминокислоты человека, используемые для замены в одной каркасной области, например, FR2, не обязательно должны быть из одной и той же каркасной области человека. Однако в некоторых вариантах осуществления, все соответствующие аминокислоты человека, используемые для замены, происходят из одного и того же антитела человека или кодируются одним и тем же геном иммуноглобулина человека.

В некоторых вариантах осуществления, антитело гуманизировано путем замены одной или нескольких полноразмерных каркасных областей соответствующими каркасными областями человека. В некоторых вариантах осуществления, выбирают каркасную область человека, которая имеет самый высокий уровень гомологии с заменяемой нечеловеческой каркасной областью. В некоторых вариантах осуществления, такое гуманизированное антитело представляет собой антитело с привитой CDR.

В некоторых вариантах осуществления, после прививки CDR, одна или несколько аминокислот каркаса заменяются обратно на соответствующую аминокислоту в каркасной области мыши. Такие «обратные мутации», в некоторых вариантах осуществления, осуществляют для сохранения одной или нескольких аминокислот каркасной области мыши, которые, по-видимому, вносят вклад в структуру одной или нескольких CDR и/или которые могут быть вовлечены в контакты с антигенами и/или, по-видимому, вовлечены в общую структурную целостность антитела. В некоторых вариантах осуществления, десять или меньше, девять или меньше, восемь или меньше, семь или меньше, шесть или меньше, пять или меньше, четыре или меньше, три или меньше, две или меньше, одна или ноль обратных мутаций проводят в каркасных областях антитела после прививки CDR.

В некоторых вариантах осуществления, гуманизированное антитело также содержит константную область тяжелой цепи человека и/или константную область легкой цепи человека.

8. Антитела человека

В некоторых вариантах осуществления, Gal9 антитело представляет собой антитело человека. Антитела человека могут быть получены любым подходящим способом. Неограничивающие типовые способы включают получение антител человека у трансгенных мышей, которые содержат локусы иммуноглобулина человека. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-55 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-8 (1993); onberg et al, Nature 368: 856-9 (1994); и патенты США №№5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299; и 5,545,806.

Неограничивающие типовые способы также включают получение антител человека с использованием библиотек фагового дисплея. См., например, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381-8 (1992); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-97 (1991); и публикацию РСТ № WO 99/10494.

Константные области антитела человека

В некоторых вариантах осуществления, гуманизированное, химерное или человеческое антитело, описанное в настоящем документе, содержит одну или несколько константных областей человека. В некоторых вариантах осуществления, константная область тяжелой цепи человека относится к изотипу, выбранному из IgA, IgG и IgD. В некоторых вариантах осуществления, константная область легкой цепи человека относится к изотипу, выбранному из K и λ. В некоторых вариантах осуществления, антитело, описанное в настоящем документе, содержит константную область IgG человека, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления, антитело или партнер по слиянию Fc содержит мутацию C237S, например, в константной области IgG1. В некоторых вариантах осуществления, антитело, описанное в настоящем документе, содержит константную область тяжелой цепи IgG2 человека. В некоторых таких вариантах осуществления, константная область IgG2 содержит мутацию P331S, как описано в патенте США №6,900,292. В некоторых вариантах осуществления, антитело, описанное в настоящем документе, содержит константную область тяжелой цепи IgG4 человека. В некоторых таких вариантах осуществления, антитело, описанное в настоящем документе, содержит мутацию S241P в константной области IgG4 человека. См., например, Angal et al. Mol. Immunol. 30(1):105-108 (1993). В некоторых вариантах осуществления, антитело, описанное в настоящем документе, содержит константную область IgG4 человека и легкую цепь κ человека.

Выбор константной области тяжелой цепи может определить, будет ли антитело выполнять эффекторную функцию in vivo. Такая эффекторная функция, в некоторых вариантах осуществления, включает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и может приводить к гибели клетки, с которой связано антитело. Как правило, антитела, содержащие тяжелые цепи IgG1 или IgG3 человека, обладают эффекторной функцией.

В некоторых вариантах осуществления, эффекторная функция нежелательна. Например, в некоторых вариантах осуществления, эффекторная функция может быть нежелательной при лечении воспалительных состояний и/или аутоиммунных нарушений. В некоторых таких вариантах осуществления, выбирают или конструируют константную область тяжелой цепи IgG4 или IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления, константная область IgG4 содержит мутацию S241P.

Любое из описанных в настоящем документе антител может быть очищено любым подходящим способом. Такие способы включают, но не ограничены ими, использование аффинных матриц или хроматографию гидрофобного взаимодействия. Подходящие аффинные лиганды включают антиген и/или эпитоп, с которыми связывается антитело, и лиганды, которые связывают константные области антитела. Например, для связывания константной области и очистки антитела можно использовать белок A, белок G, белок A/G или аффинную колонку с антителом.

В некоторых вариантах осуществления, гидрофобная интерактивная хроматография (HIC), например, бутиловая или фениловая колонка, также используется для очистки некоторых полипептидов. В данной области техники известно множество способов очистки полипептидов.

Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления, описанное в настоящем документе антитело получают в бесклеточной системе. Неограничивающие типовые бесклеточные системы описаны, например, в Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al, Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).

9. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антагонисты Gal9

Изобретение также предлагает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют одну или несколько цепей описанного в настоящем документе антитела, такого как Gal9 антитело. В некоторых вариантах осуществления, молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или легкую цепь антитела, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, молекула нуклеиновой кислоты содержит как полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, так и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления первая молекула нуклеиновой кислоты содержит первый полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и вторая молекула нуклеиновой кислоты содержит второй полинуклеотид, кодирующий легкую цепь.

В некоторых таких вариантах осуществления, тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются из одной молекулы нуклеиновой кислоты или из двух отдельных молекул нуклеиновой кислоты в виде двух отдельных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления, например, когда антитело представляет собой scFv, один полинуклеотид кодирует один полипептид, содержащий как тяжелую цепь, так и легкую цепь, связанные вместе.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или легкую цепь антитела, описанного в настоящем документе, содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, которая при трансляции располагается на N-конце тяжелой цепи или легкой цепи. Как обсуждалось выше, лидерная последовательность может представлять собой нативную лидерную последовательность тяжелой или легкой цепи или может представлять собой другую гетерологичную лидерную последовательность.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы с использованием способов рекомбинантной ДНК, общепринятых в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор экспрессии, который подходит для экспрессии в выбранной клетке-хозяине, такой как клетка млекопитающего.

10. Векторы

Предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют тяжелые цепи и/или легкие цепи описанных в настоящем документе антител. Такие векторы включают, но не ограничены ими, ДНК-векторы, фаговые векторы, вирусные векторы, ретровирусные векторы и т.д. В некоторых вариантах осуществления, вектор содержит первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются из вектора в виде двух отдельных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются как часть одного полипептида, например, когда антитело представляет собой scFv.

В некоторых вариантах осуществления, первый вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и второй вектор содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления, первый вектор и второй вектор трансфицируют в клетки-хозяева в аналогичных количествах (например, в аналогичных молярных количествах или в аналогичных массовых количествах). В некоторых вариантах осуществления, первый вектор и второй вектор трансфицируют клетки-хозяева в молярном или массовом соотношении от 5:1 до 1:5. В некоторых вариантах осуществления, используют массовое соотношение вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь от 1:1 до 1:5. В некоторых вариантах осуществления, используют массовое соотношение вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь 1:2.

В некоторых вариантах осуществления, выбирают вектор, оптимизированный для экспрессии полипептидов в клетках СНО или клетках, происходящих из СНО, или в клетках NSO. Примеры таких векторов описаны, например, в Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004). В некоторых вариантах осуществления, вектор выбран для экспрессии in vivo антагониста Gal9 у животных, включая человека. В некоторых таких вариантах осуществления, экспрессия полипептида или полипептидов находится под контролем промотора или промоторов, которые функционируют тканеспецифическим образом. Например, печень-специфичные промоторы описаны, например, в публикации РСТ № WO 2006/076288.

11. Клетки-хозяева

В различных вариантах осуществления, тяжелые цепи и/или легкие цепи антител, описанных в настоящем документе, могут быть экспрессированы в прокариотических клетках, таких как клетки бактерий; или в эукариотических клетках, таких как клетки грибов (такие как дрожжи), клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Такую экспрессию можно осуществить, например, в соответствии с процедурами, известными в данной области техники. Примеры эукариотических клеток, которые можно использовать для экспрессии полипептидов, включают, но не ограничены ими, клетки COS, включая клетки COS 7; 293 ячейки, в том числе клетки 293-6Е; клетки CHO, включая клетки CHO-S и DG44; клетки PER.C6® (Crucell); и клетки NSO. В некоторых вариантах осуществления, тяжелые цепи и/или легкие цепи антител, описанных в настоящем документе, могут быть экспрессированы в дрожжах. См., например, публикацию США № US 2006/0270045 Al. В некоторых вариантах осуществления, конкретная эукариотическая клетка-хозяин выбрана на основе ее способности создавать желаемые посттрансляционные модификации тяжелых цепей и/или легких цепей Gal9 антитела. Например, в некоторых вариантах осуществления, клетки СНО продуцируют полипептиды с более высоким уровнем сиалирования, чем тот же полипептид, продуцируемый в клетках 293.

Введение одной или нескольких нуклеиновых кислот в желаемую клетку-хозяина может быть осуществлено любым способом, включая, но не ограничиваясь ими, трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, трансфекцию, опосредованную катионными липидами, электропорацию, трансдукцию, инфицирование и т.д. Неограничивающие типовые способы описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Нуклеиновые кислоты могут быть временно или стабильно трансфицированы в желаемые клетки-хозяева любым подходящим способом.

В некоторых вариантах осуществления, один или несколько полипептидов могут быть продуцированы in vivo у животного, которое было сконструировано или трансфицировано одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими полипептиды, любым подходящим способом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Гуманизированные анти-Gal-9 антитела обладают высокой аффинностью связывания с галектином-9 человека и мыши

Этот пример демонстрирует, что различные анти-человеческие Gal-9 гуманизированные антитела по изобретению обладают высокой аффинностью связывания с Gal-9 и человека, и мыши.

Аффинность связывания антител измеряют с использованием коммерчески доступной системы Octet от ForteBio (Creative Biolabs). Согласно описанию Creative Biolabs, платформа Octet основана на технологии интерферометрии биослоев (BLI), в которой используется целый набор систем, включая инструменты, биосенсоры, реагенты и наборы для анализа, для поддержки оценки биомолекулярных взаимодействий в 96- или 384-луночных микропланшетах. Система Octet использует режим анализа Dip-and-Read, чтобы избежать необходимости в микрожидкостях, и позволяет проводить анализ аффинности, а также кинетики без использования меток в режиме реального времени. Существует три направления анализа на основе биосенсоров, которые можно использовать для изучения взаимодействия антител: тандемное блокирование, блокирование премикса и классический сэндвич. По сравнению с Biacore, анализ Octet Dip-and-Read допускает более длительные стадии связывания аналита и способствует повторному связыванию аналита с датчиками, покрытыми лигандом. Между тем, более быстрое время ассоциации требует меньшего количества образца, что экономит ваши драгоценные белки.

Также согласно описанию Creative Biolabs, принцип технологии BLI основан на оптической интерференционной картине белого света, отраженного от двух поверхностей - слоя иммобилизованного белка и внутреннего эталонного слоя. Связывание между лигандом, иммобилизованным на поверхности наконечника биосенсора, и аналитом в растворе приводит к увеличению оптической толщины на наконечнике биосенсора, что приводит к смещению интерференционной картины, измеряемой в нанометрах. Сдвиг длины волны (Δλ) является прямой мерой изменения оптической толщины биологического слоя. Когда этот сдвиг измеряют в течение определенного периода времени и его величина отображается как функция времени, получается классическая кривая ассоциации/диссоциации. Это взаимодействие измеряют в режиме реального времени, что дает возможность контролировать специфичность связывания, скорость ассоциации и скорость диссоциации, а также концентрацию с исключительной точностью.

Используя эту систему, измеряют аффинность антител к рекомбинантному Gal-9 человека и мыши для выбранных гуманизированных антител по изобретению, и результаты суммированы в таблице ниже. Данные показывают, что протестированные гуманизированные антитела обладают высокой аффинностью в диапазоне нМ от среднего до низкого по отношению к белку/антигену Gal-9 как человека, так и мыши.

Антитело Gal-9 K_D (М) K_D ошибка Ка (1/Мс) Ка ошибка K_dis (1/с) K_dis ошибка Полный R² Эталонная партия HFB9-2hz11-hG1AA hGal9M 4,84E-09 2,21E-10 7,28E+04 2,75E+03 3,52E-04 9,13E-06 0,9509 mGal9M 3,66E-09 3,72E-11 1,66E+05 1,41E+03 6,06E-04 3,40E-06 0,9886 HFB9-2hz11-hG1AA MF20191024 hGal9M 1,96E-09 1,22E-10 9,14E+04 3,04E+03 1,79E-04 9,45E-06 0,949 mGal9M 1,15E-09 1,03E-11 4,02E+05 2,53E+03 4,62E-04 2,93E-06 0,9826

* hGal9M - галектин 9 человека; mGal9M - галектин 9 мыши.

Выравнивание последовательностей выбранных гуманизированных антител по изобретению проводят с использованием стандартного программного обеспечения для выравнивания последовательностей, и результаты показаны на ФИГ. 1 и 2. В частности, на ФИГ. 1, области V_H и V_L 4 гуманизированных антител выравнивают, чтобы показать изменения в аминокислотных остатках по сравнению с исходными областями V_H и V_L, соответственно, химерного антитела HFB9-1 человека-мыши. Гуманизация в основном изменяет аминокислотные последовательности в каркасных областях вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (HCVR и LCVR). Однако обширные изменения также происходят в последовательности CDR2 тяжелой цепи (см. ФИГ. 1).

Аналогично, на ФИГ. 2, сопоставлены области V_H и V_L 6 гуманизированных антител, чтобы показать изменения в аминокислотных остатках по сравнению с исходными областями V_H и V_L, соответственно, химерного антитела HFB9-2 человека-мыши. Гуманизация в основном изменяет аминокислотные последовательности в каркасных областях вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (HCVR и LCVR). Однако обширные изменения также происходят в последовательности CDR2 тяжелой цепи и в одном остатке в последовательности CDR1 тяжелой цепи для одного гуманизированного антитела (см. ФИГ. 2).

Пример 2. Анти-Gal9 антитела проявляют субнаномолярную (нМ) аффинность к Gal9

Этот эксперимент демонстрирует, что гуманизированные антитела по изобретению проявляют очень высокую (субнаномолярную) аффинность к рекомбинантному Gal9 человека и перекрестно реагируют с рекомбинантным Gal9 мыши, а также с Gal9 обезьяны (данные не представлены). Значения EC50 для каждого тестируемого гуманизированного антитела измеряют при возрастающих концентрациях каждого антитела, и результаты сводят в таблицу на ФИГ. 3 для связывания с рекомбинантным Gal9 человека, и на ФИГ. 4 для связывания с рекомбинантным Gal9 мыши.

Очевидно, что, за исключением антитела 1hz4, все три гуманизированных варианта HFB9-1 проявляют суб-нМ уровень аффинности к Gal-9 как человека, так и мыши (см. ФИГ. 3 и 4). Между тем, 5 из 6 гуманизированных антител HFB9-2 (за исключением 2hz12) проявляют суб-нМ уровень аффинности к Gal9 человека, но только 4 из 5 (за исключением 2h14) сохраняют суб-нМ уровень аффинности к Gal9 мыши.

Также наблюдается сильная перекрестная реактивность против ортолога Gal9 обезьяны (данные не показаны).

Последовательности этих типовых антител, включая вариабельные области легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (HC), области CDR и каркасные области (FR), перечислены ниже.

HFB9-1hz1-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 2)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 4)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 6)

HCVR: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 10)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 12)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 14)

LCVR: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 16)

Для всех последовательностей тяжелых цепей антитела, HFR1-HFR4 последовательности каркасных областей определяются VH-CDR последовательностями. Например, HFR1 представляет собой HCVR последовательность, которая является N-концевой по отношению к VH-CDR1. HFR2 представляет собой HCVR последовательность, расположенную между VH-CDR1 и VH-CDR2. HFR3 представляет собой HCVR последовательность, расположенную между VH-CDR2 и VH-CDR3. HFR4 представляет собой наиболее С-концевую HCVR последовательность.

Аналогично, для всех LFR1-LFR4 последовательностей легкой цепи антитела, последовательности каркасной области определяются VL-CDR последовательностями. Например, LFR1 представляет собой LCVR последовательность, которая является N-концевой по отношению к VL-CDR1. LFR2 представляет собой LCVR последовательность, расположенную между VL-CDR1 и VL-CDR2. LFR3 представляет собой LCVR последовательность, расположенную между VL-CDR2 и VL-CDR3. LFR4 представляет собой наиболее С-концевую LCVR последовательность.

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz1-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz1-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 15.

HFB9-1hz2-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 18)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 20)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 22)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTRHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 26)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 28)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 30)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 32)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz2-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 17, 19, 21 и 23. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz2-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 25, 27, 29 и 31.

HFB9-1hz3-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 34)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 36)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 38)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 40)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 42)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 44)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 46)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 48)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz3-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 33, 35, 37 и 39. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz3-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 41, 43, 45 и 47.

HFB9-1hz4-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTDYTIH (SEQ ID NO: 50)

VH-CDR2: WFYPGSHSIKYAQKFQGR (SEQ ID NO: 52)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 54)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSHSIKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGGYDGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 56)

VL-CDR1: KSSQSLFYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 58)

VL-CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 60)

VL-CDR3: QQYYYFPYT (SEQ ID NO: 62)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYYFPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 64)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-1hz4-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 49, 51, 53 и 55. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-1hz4-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 57, 59, 61 и 63.

HFB9-2hz11-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 66)

VH-CDR2: WFYPGSGSTEYAQKFQG (SEQ ID NO: 68)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 70)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSGSTEYAQKFQGRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 72)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 74)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 76)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 78)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 80)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz11-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 65, 67, 69 и 71. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz11-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 73, 75, 77 и 79.

HFB9-2hz12-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 82)

VH-CDR2: WFYPGSGSAEYAQKFQG (SEQ ID NO: 84)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 86)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSGSAEYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 88)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 90)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 92)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 94)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 96)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz12-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 81, 83, 85 и 87. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz12-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 89, 91, 93 и 95.

HFB9-2hz13-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 98)

VH-CDR2: WFYPGSGSTEYAQKFQG (SEQ ID NO: 100)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 102)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGQGLEWMGWFYPGSGSTEYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 104)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 106)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 108)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 110)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 112)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz13-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 97, 99, 101 и 103. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz13-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 105, 107, 109 и 111.

HFB9-2hz14-hG1AA

VH-CDR1: GYTFTEYTIH (SEQ ID NO: 114)

VH-CDR2: WFYPGSGSTEYSPSFQG (SEQ ID NO: 116)

VH-CDR3: HGGYDGFDY (SEQ ID NO: 118)

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTEYTIHWVRQMPGKGLEWMGWFYPGSGSTEYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCERHGGYDGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 120)

VL-CDR1: KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO: 122)

VL-CDR2: WASTRGS (SEQ ID NO: 124)

VL-CDR3: QQYYSYPFT (SEQ ID NO: 126)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 128)

HFR1-HFR4 последовательности HFB9-2hz14-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 113, 115, 117 и 119. LFR1-LFR4 последовательности HFB9-2hz14-hG1AA представляют собой SEQ ID NO: 121, 123, 125 и 127.

Пример 3. Связывание анти-Gal9-антителами блокирует связывание Gal9 с рецепторами TIM3 и CD44

Этот эксперимент демонстрирует, что анти-Gal9-антитела по изобретению могут блокировать связывание Gal-9 с его рецепторами TIM3 и CD44, противодействуя, таким образом, нисходящей передаче сигналов от Gal-9.

Данные на ФИГ. 5 ясно показано, что гуманизированные антитела по изобретению блокируют связывание Gal9 как с рецепторами TIM3, так и с рецепторами CD44 дозозависимым образом.

Пример 4. Анти-Gal9 антитела нейтрализуют вызываемый Gal9 апоптоз Th1

Yang et al. (Inflammation 40(3):1062-1071, 2017) сообщают, что повышенный уровень галектина-9 подавляет эффекторную функцию Th1 и индуцирует апоптоз активированных CD4⁺ Т-клеток при остеоартрите. Этот эксперимент демонстрирует, что анти-Gal9-антитела по изобретению нейтрализуют Gal9-индуцированный апоптоз Th1.

В частности, РВМС человека выделяют от здоровых доноров и инкубируют с увеличивающимися концентрациями антител по изобретению в присутствии количества Gal9, которое индуцирует апоптоз Т-клеток в отсутствие антитела. Доли апоптотических CD4+ Т-клеток определяют в диапазоне концентраций антител для определения значений EC50 для антител. Результаты суммированы на ФИГ. 6. Данные ясно показали, что обработка РВМС человека от здоровых доноров антителами по изобретению предотвращает индуцированный Gal-9 апоптоз клеток Th1 дозозависимым образом.

Пример 5. Анти-Gal9 антитела подавляют размножение Treg, индуцированное Gal9

Как обсуждалось выше, галектин-9 напрямую экспрессируется Treg, активация которых связана с повышенной экспрессией Gal9. Этот эксперимент демонстрирует, что ингибирование галектина-9 анти-Gal9 антителом по изобретению подавляет размножение Treg.

В частности, РВМС человека выделяют от здоровых доноров и инкубируют с увеличивающимися концентрациями антител по изобретению в присутствии количества Gal9, которое стимулирует размножение Treg в отсутствие антитела. Долю Foxp3⁺ Ki67^high T-клеток среди всех жизнеспособных клеток определяют в диапазоне концентраций антител для определения значений EC50 для антител. Результаты суммированы на ФИГ. 7. Данные ясно показали, что обработка РВМС человека от здоровых доноров антителами по изобретению подавляет индуцированное Gal-9 размножение Treg дозозависимым образом, в том смысле, что более высокие концентрации антител связаны с более низкой долей размноженных Treg на основе экспрессии маркерных генов Foxp3 и Ki67.

Пример 6. Комбинированное лечение анти-Gal9 антителом и анти-PD-1 антителом продемонстрировало синергетический эффект в отношении ингибирования роста опухоли in vivo и увеличения продолжительности жизни

Этот эксперимент демонстрирует, что моноклональные анти-Gal9 антитела по изобретению и анти-PD-1 антитела обладают синергетическим эффектом в отношении ингибирования роста опухоли in vivo в модели мышей с ксенотрансплантатом.

В частности, подопытным мышам прививают около полумиллиона раковых клеток, и опухолевой массе дают возможность вырасти до заранее определенного размера. Затем мышей рандомизируют и инъецируют внутрибрюшинно (в/б) одно из четырех антител или комбинаций антител: (1) изотипический контроль IgG в дозе 10 мг/кг, (2) анти-Gal9 антитело HFB9-2 (клон RMP1-14) в дозе 10 мг/кг, (3) анти-mPD-1 антитело в дозе 10 мг/кг или (4) комбинацию анти-mPD-1 антитела в дозе 10 мг/кг и анти-HFB9-2 антитела в дозе 10 мг/кг.

Первую дозу антител для различных групп вводят в 1 день, и последующие дозы вводят каждые 3 дня, всего четыре дозы для любых групп с анти-mPD-1 антителом, и всего семь доз для любых групп с анти-HFB9-2 антителом и контрольным антителом. Данные представлены как среднее значение ± с.о.с. (n=8 мышей в группе) (ФИГ. 8).

Очевидно, что исследуемое анти-Gal9 антитело и анти-mPD-1 антитело проявляют синергетический эффект в отношении ингибирования роста опухоли in vivo, поскольку комбинированная терапия по существу полностью подавляет рост опухоли до размера не более 500 мм³ в течение 7-недельного периода тестирования. При этом, рост опухоли в контрольной группе и группе анти-HFB9-2 превышает этот уровень уже через 2 недели, а в группе анти-mPD-1 превышает этот уровень уже через 4 недели.

Кроме того, с точки зрения выживаемости (ФИГ. 9) все мыши в контрольной группе умирают примерно к концу 3 недели, все мыши в группе, получавшей анти-HFB9-2 антитело, умирают примерно к концу 5 недели, и только 25% мышей (2 из 8) в группе анти-mPD-1 выживают без опухоли в конце 7 недели. Однако, к тому же времени, в группе комбинированной терапии показатель выживаемости составляет 75%, включая 5 из 8 мышей без опухоли и одну с опухолью примерно 100 мм³.

Это неожиданное открытие убедительно свидетельствует о том, что одновременное ингибирование функции Gal-9 и иммунной контрольной точки PD-1/PD-L1 может синергически ингибировать рост опухоли in vivo и продлевать выживаемость.

Пример 7. Анти-Gal9 антитела являются стабильными

Чтобы подтвердить, что рассматриваемые гуманизированные анти-Gal9 антитела стабильны при хранении и, таким образом, пригодны для дальнейшей разработки в качестве терапевтического агента, для выбранных гуманизированных антител проводят различные анализы способности к разработке.

В первом эксперименте, 1-2,75 мг/мл исследуемых гуманизированных антител, HFB9-1hz1-hG1AA, HFB9-1hz2-hG1AA, HFB9-1hz3-hG1AA, HFB9-2hz11-hG1AA и HFB9-2hz13-hG1AA хранят при 25 или 40°C в PBS (pH 7,4), и стабильность различных антител определяют в дни 0, 3, 7 и 14. Результаты (не показаны) демонстрируют, что все протестированные антитела являются стабильными в тестируемых условиях.

Во втором эксперименте, те же антитела тестируют на стабильность в условиях низкого рН (100 мМ АсН, рН 3,5, 25°С) в течение 0, 3 и 6 часов. Результаты (не показаны) снова демонстрируют, что все протестированные антитела являются стабильными в тестируемых условиях.

В третьем эксперименте те же антитела подвергают 1, 2 или 3 циклам замораживания-размораживания. Результаты (не показаны) снова демонстрируют, что все протестированные антитела являются стабильными в тестируемых условиях.

Пример 8. Уровни галектина-9 в плазме и сыворотке пациентов с AML

Для определения уровней Gal-9 в плазме и сыворотке пациентов, образцы периферической крови пациентов с AML получают из Clinical Hematology Department of the Gustave Roussy Institute (Villejuif, FRANCE) в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом. Информированное согласие получают от всех пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией. Пациентов разделяют в соответствии с критериями франко-американо-британской (FAB) классификации. Плазму или сыворотку периферической крови пациентов с AML готовят в соответствии со стандартными процедурами. Для здоровых доноров, образцы плазмы или сыворотки получают из коммерческих источников.

Уровни белка галектина-9 в плазме или сыворотке оценивают с помощью ELISA с использованием «Quantikine® ELISA Human Galectin-9» от R&D Systems®, и статистические анализы (непарные двусторонние t-критерии) проводят с использованием Prism® 5 для программного обеспечения Windows.

Как показано на ФИГ. 10, уровни белка галектина-9 в плазме больных AML при постановке диагноза или на стадии рецидива/рефрактерности (R/R) заболевания значительно выше, чем уровни, наблюдаемые в плазме здоровых людей. Уровни белка галектина-9 в плазме больных AML в период полной ремиссии после химиотерапии близки к физиологическим нормам.

Как показано на ФИГ. 11, уровни белка галектина-9 в плазме пациентов с AML FAB M2 или FAB M3 на момент постановки диагноза значительно ниже, чем уровни, наблюдаемые в плазме пациентов с AML FAB M0, M1, M4 или M5. Уровни белка галектина-9 в плазме пациентов с AML FAB M3 при постановке диагноза находятся в пределах нормального физиологического диапазона.

Кроме того, уровни экспрессии мРНК LGALS9 исследуют у пациентов с AML и здоровых людей. Уровни экспрессии мРНК LGALS9 извлекают из общедоступной базы данных «AML_Ohsu_Nature 2018», депонированной Tyner et al (см. PMID 30333627 для полного описания исследования). Данные выражены как нормализованный log2 RPKM на ФИГ. 12. Пунктирные линии представляют медианы уровней LGALS9 в MNC, полученных из ВМ, у здоровых людей или у пациентов с AML, соответственно.

Как показано на ФИГ. 12, уровни мРНК, кодирующие галектин-9, в MNC, полученных из ВМ от пациентов с AML на момент постановки диагноза (все рассматриваемые FAB) выше, чем уровни, наблюдаемые в MNC, полученных из ВМ, или в клетках CD34+ здоровых индивидуумов. Кроме того, уровни мРНК, кодирующие галектин-9, в MNC, полученных из ВМ от пациентов с AML FAB M3 на момент постановки диагноза, значительно ниже, чем уровни, наблюдаемые в MNC, полученных из ВМ от пациентов с AML FAB M0, M1, M4 или M5, или в MNC, полученных из ВМ, или CD34⁺ клетках здоровых людей.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ХАЙФАЙБАЙО (ЭйчКей) ЛИМИТЕД

<120> АНТИ-ГАЛЕКТИН-9 АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> CIE210001PCT

<160> 128

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 3

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 4

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 5

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 5

Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 6

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 10

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 11

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 11

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 12

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 13

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 13

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 14

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 15

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser

20 25 30

Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 17

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 18

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 19

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 19

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 20

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 20

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 21

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 21

Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 22

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 22

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 23

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 24

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 25

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 26

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 26

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 27

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 27

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 28

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 28

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 29

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 29

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 30

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 30

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 31

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 32

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser

20 25 30

Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 33

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 34

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 35

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 35

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 36

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 37

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 37

Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 38

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 38

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 39

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 39

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 41

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 42

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 42

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 43

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 43

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 44

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 44

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 45

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 45

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 46

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 46

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 47

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 47

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 48

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser

20 25 30

Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 49

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 50

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 50

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 51

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 51

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 52

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 52

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 53

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 53

Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 54

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 54

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 55

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 55

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser His Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 57

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 58

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 58

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 59

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 59

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 60

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 60

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 61

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 61

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 62

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 62

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 63

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 63

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 64

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser

20 25 30

Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 65

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 66

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 66

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 67

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 67

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 68

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 68

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 69

Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Glu Arg

20 25 30

<210> 70

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 70

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 71

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 71

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 72

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Glu Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 73

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 73

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 74

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 74

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 75

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 75

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 76

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 76

Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser

1 5

<210> 77

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 77

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 78

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 78

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 79

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 79

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 80

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 80

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 81

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 82

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 82

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 83

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 83

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 84

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 84

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 85

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 85

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg

20 25 30

<210> 86

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 86

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 87

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 87

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 88

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 88

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Glu Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 89

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 89

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 90

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 90

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 91

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 91

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 92

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 92

Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser

1 5

<210> 93

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 93

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 94

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 94

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 95

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 96

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 96

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 97

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 97

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 98

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 98

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 99

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 99

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 100

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 100

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 101

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 101

Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg

20 25 30

<210> 102

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 102

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 103

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 103

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 104

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 104

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Glu Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 105

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 105

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 106

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 106

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 107

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 107

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 108

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 108

Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser

1 5

<210> 109

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 109

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 110

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 110

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 111

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 111

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 112

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 112

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 113

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR1

<400> 113

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

20 25

<210> 114

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 114

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His

1 5 10

<210> 115

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR2

<400> 115

Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 116

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 116

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 117

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR3

<400> 117

Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Glu Arg

20 25 30

<210> 118

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 118

His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 119

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HFR4

<400> 119

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 120

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR

<400> 120

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Glu Arg His Gly Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 121

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR1

<400> 121

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 122

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 122

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 123

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR2

<400> 123

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 124

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 124

Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser

1 5

<210> 125

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR3

<400> 125

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 126

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 126

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 127

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LFR4

<400> 127

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 128

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR

<400> 128

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены гуманизированные моноклональные антитела против Gal9, а также кодирующие их полинуклеотиды и векторы экспрессии. Кроме того, предложены способы применения антител против Gal9 для лечения рака, включающие комбинированную терапию с антителами против PD-1/PD-L1. Изобретение может найти дальнейшее применение в терапии рака. 12 н. и 30 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл., 8 пр.

1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные в отношении галектина-9, где указанное моноклональное антитело содержит:

(1a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 66, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 68 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 70; и

(1b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 74, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 76 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 78; или

(2a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 82, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 84 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 86; и

(2b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 90, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 92 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 94; или

(3a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 114, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 116 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 118; и

(3b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 122, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 124 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 126; или

(4a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 2, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 4 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 6; и

(4b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 12 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 14; или

(5a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 20 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 22; и

(5b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 28 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 30; или

(6a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 34, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 36 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 38; и

(6b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 42, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 44 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 46; или

(7a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 50, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 52 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 54; и

(7b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 58, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 60 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 62.

2. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что:

(1c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (1a) и (1b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 69 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 65; или

(2c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (2a) и (2b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 85 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 81; или

(3c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (1a) и (1b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 101 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 97; или

(4c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (3a) и (3b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 117 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 113; или

(5c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (4a) и (4b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 5 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 1; или

(6c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (5a) и (5b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 21 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 17; или

(7c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (6a) и (6b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 37 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 33; или

(8c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам (7a) и (7b) дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 53 и, необязательно, дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 49.

3. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, отличающееся тем, что:

(1A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 8; и

(1B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 16, или

(2А) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 24; и

(2B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 32, или

(3A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 40; и

(3B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 48, или

(4A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 56; и

(4B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 64, или

(5A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 72; и

(5B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 80, или

(6А) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 88; и

(6B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 96, или

(7A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 104; и

(7B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 112, или

(8A) HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 120; и

(8B) LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 128.

4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, которое представляет собой гуманизированное антитело и содержит:

(1) HCVR последовательность SEQ ID NO: 8 и LCVR последовательность SEQ ID NO: 16; или

(2) HCVR последовательность SEQ ID NO: 72 и LCVR последовательность SEQ ID NO: 80.

5. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что указанный его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(ab')₂, F_d, одноцепочечный Fv или scFv, дисульфид-связанный F_v, интратело, IgGΔCH₂, минитело, F(ab')₃, тетратело, триатело, диатело, DVD-Ig, Fcab, mAb₂, (scFv)₂ или scFv-Fc.

6. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент перекрестно реагирует с Gal9 мыши.

7. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Gal9 человека с EC50 примерно 0,1-0,2 нМ и/или связывается с Gal9 мыши с EC50 примерно 0,5-1,0 нМ.

8. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Gal9 человека с K_d менее примерно 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ или 1 нМ.

9. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, которое связывается с Gal9 и ингибирует связывание Gal9 с рецептором Gal9 (например, TIM3 или CD44).

10. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, которое нейтрализует Gal-9-индуцированный Th1 апоптоз Т-клеток (таких как CD4⁺ Т-клетки).

11. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, которое подавляет Gal9 индуцированное размножение Treg.

12. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, которое синергически ингибирует рост опухоли in vivo и/или продлевает выживаемость мыши с ксенотрансплантатом опухоли с антагонистом иммунной контрольной точки.

13. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, отличающееся тем, что антагонист иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные в отношении PD-1 или PD-L1.

14. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую CDR1 HCVR последовательность SEQ ID NO: 66, CDR2 HCVR последовательность SEQ ID NO: 68 и CDR3 HCVR последовательность SEQ ID NO: 70; и

вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую CDR1 LCVR последовательность SEQ ID NO: 74, CDR2 LCVR последовательность SEQ ID NO: 76 и CDR3 LCVR последовательность SEQ ID NO: 78.

15. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 14, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит HFR3 последовательность SEQ ID NO: 69 и необязательно дополнительно содержит HFR1 последовательность SEQ ID NO: 65.

16. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 14 или 15, где HCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 72, и LCVR последовательность представляет собой SEQ ID NO: 80.

17. Способ лечения рака у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту эффективного количества выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-13 и антитела против PD-1/PD-L1.

18. Способ по п. 17, где антагонист иммунной контрольной точки PD-1/PD-L1 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный в отношении PD-1 или PD-L1; пептидный ингибитор PD-1/PD-L1; низкомолекулярный ингибитор PD-L1; макроциклический пептид; или любую их комбинацию.

19. Способ по любому из пп. 17, 18, отличающийся тем, что рак представляет собой гематологический рак (такой как AML и DLBCL) или солидную опухоль (такую как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легкого, меланома (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы).

20. Способ по любому из пп. 17-19, дополнительно включающий введение пациенту химиотерапевтического агента, антиангиогенного агента, агента, ингибирующего рост, иммуноонкологического агента и/или противоопухолевой композиции.

21. Полинуклеотид, кодирующий выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные в отношении галектина-9, по любому из пп. 1-13.

22. Полинуклеотид по п. 21, кодон которого оптимизирован для экспрессии в клетке человека.

23. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 21 или 22.

24. Вектор по п. 23, который представляет собой вектор экспрессии млекопитающих, вектор экспрессии дрожжей, вектор экспрессии насекомых или вектор экспрессии бактерий.

25. Способ спасения или стимуляции пролиферации эффекторных Т-клеток и/или усиления активности эффекторных Т-клеток у пациента с диагнозом рак, с риском развития рака или рецидива рака, где способ включает: введение пациенту эффективного количества выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-13 при идентификации пациента как имеющего уровень галектина-9 в образце, взятом у пациента, выше эталонного уровня галектина-9 у здорового или контрольного индивидуума.

26. Способ по п. 25, дополнительно включающий идентификацию пациента с уровнем галектина-9 в образце выше эталонного уровня путем сравнения уровня галектина-9 в образце с эталонным уровнем.

27. Способ по п. 25 или 26, дополнительно включающий введение пациенту антагониста иммунной контрольной точки, и, необязательно, где иммунной контрольной точкой является иммунная контрольная точка PD-1/PD-L1.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что антагонист иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный в отношении PD-1 или PD-L1; пептидный ингибитор (не антитело) PD-1/PD-L1; низкомолекулярный ингибитор PD-L1; макроциклический пептид; или любую их комбинацию.

29. Способ по любому из пп. 25-28, отличающийся тем, что рак представляет собой гематологический рак (такой как AML и DLBCL) или солидную опухоль (такую как рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легкого, меланома (включая увеальную меланому), рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак печени и рак предстательной железы).

30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что пациент является пациентом с AML FAB M0, M1, M4 или M5 или что пациент не является пациентом с AML FAB M2 или M3.

31. Способ по любому из пп. 25-30, отличающийся тем, что образец представляет собой образец крови, образец плазмы или образец сыворотки.

32. Способ спасения или стимуляции пролиферации эффекторных Т-клеток и/или усиления активности эффекторных Т-клеток у пациента с диагнозом AML, с риском развития AML или рецидива AML, включающий: введение пациенту эффективного количества выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-13 при идентификации пациента как имеющего уровень мРНК, кодирующей галектин-9, в образце мононуклеарных клеток (MNC), полученных из костного мозга (BM), от пациента, который статистически значимо выше или ниже эталонного уровня в клетках MNC, полученных из ВМ, или CD34⁺ клеток у здорового или контрольного индивидуума.

33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что (1) уровень мРНК, кодирующей галектин-9, в образце MNC, полученных из ВМ, у пациента значительно выше, чем эталонный уровень, когда пациент является пациентом с AML FAB M0, M1, M2, M4 или M5, или (2) уровень мРНК, кодирующей галектин-9, в образце MNC, полученных из ВМ, у пациента, значительно ниже эталонного уровня, когда пациент является пациентом AML с FAB M3.

34. Применение антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-13 при лечении рака, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть восстанавливают пролиферацию эффекторных Т-клеток и/или усиливают активность эффекторных Т-клеток.

35. Способ по п. 34, где эффекторная Т-клетка представляет собой Th1-клетку.

36. Способ восстановления или стимуляции пролиферации эффекторных Т-клеток и/или усиления активности эффекторных Т-клеток, включающий контакт указанной эффекторной Т-клетки с выделенным моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-13.

37. Способ по п. 36, где эффекторная Т-клетка представляет собой Th1-клетку.

38. Способ индукции или стимуляции иммунной памяти у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-13, где иммунная память эффективна для ингибирования или уменьшения прогрессирования или рецидива опухоли или пролиферации раковых клеток у субъекта.

39. Применение комбинации выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к галектину-9, по любому из пп. 1-13 и антитела против PD-1/PD-L1 для лечения рака у пациента, нуждающегося в этом.

40. Применение по п. 39, дополнительно включающее применение химиотерапевтического агента, антиангиогенного агента, агента, ингибирующего рост, иммуноонкологического агента и/или противоопухолевой композиции.

41. Фармацевтическая композиция для лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, содержащая эффективное количество выделенного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3.

42. Комбинация для лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, где комбинация состоит из изолированного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к галектину-9, по любому из пп. 1-3 и антитела против PD-1/PD-L1.