Способ детектирования вируса SARS-CoV-2 методом масс-спектрометрии Российский патент 2021 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической диагностике, к способу идентификации вируса SARS-CoV-2 в образцах различного биологического происхождения. В области медицины способ решает задачу по ускорению и повышению надежности процедуры идентификации вируса SARS-CoV-2 у пациентов COVID 19. Может быть использовано для экспресс-анализа различных образцов с целью определения содержания в них вируса как дополнение/подтверждение срочного ПЦР теста или как самостоятельное исследование.

Предшествующий уровень техники

Появление заболеваний, вызванных новым коронавирусом (2019-nCoV) поставило перед специалистами в области охраны здравоохранения и врачами задачи, связанные с быстрой диагностикой и клиническим ведением больных с этой инфекцией. На настоящий момент («23» декабря 2020 г. ) по данным ВОЗ [1] зарегистрировано более 76 миллионов случаев заболевания COVID-19 и более 1,702,1280 случаев смерти [1, 2]. Быстрая и своевременная диагностика, в том числе в ходе инкубационного периода, до момента проявления симптомов, позволяет предотвратить дальнейшее распространение вируса и скорректировать лечебные мероприятия.

В настоящее время для выявления SARS-CoV-2 вируса у пациентов в основном применятся тест на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Несмотря на высокую чувствительность данного метода, существует ряд ограничений и недостатков данной методики. Суммарно с момента забора образцов до выдачи результатов требуется порядка 3 часов реального времени, из которых 1 час 40 минут занимает амплификация и данное время не зависит от числа образцов. Кроме того, при ошибке внутреннего контрольного образца всю процедуру пробоподготовки (в том числе забора образца) необходимо повторять заново. Важным аспектом методики также является профессионализм сотрудников, осуществляющих пробоподготовку и постановку метода. Также в ходе анализа не исключены ложноположительные и ложноотрицательные результаты, связанные, например, с мутацией вирусных белков или выявлением вируса на относительно поздних циклах (40 + цикл). В связи с этим время выдачи результатов во многих медицинских учреждениях может занимать до 48 часов при достаточно высокой стоимости диагностики. Таким образом, существующий способ лабораторной диагностики - тест на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает рядом недостатков в плане надежности и скорости процедуры идентификации вируса SARS-CoV-2, что может приводить к несвоевременной или неверной постановке диагноза и задержке назначения лечения. Это увеличивает вероятность неблагоприятных исходов заболевания.

В связи с этим необходимы дополнительные тесты на базе современных высокоточных методов, в частности, масс-спектрометрии, чтобы обеспечить объективную и воспроизводимую основу для отбора пациентов с клинически значимым заболеванием. Вследствие недостаточной диагностической значимости одного биомаркера необходима разработка панели биомаркеров и на ее основе метода мониторинга, который позволит надежно проводить идентификацию вируса SARS-CoV-2 и различать состояния пациентов с хорошей клинической чувствительностью и специфичностью, а также давать точный прогноз вероятности заболевания COVID-19.

Вирус SARS-CoV-2 содержит четыре структурных белка, включенных в частицу вириона, известных как белки S (шип), E (оболочка), M (мембрана) и N (нуклеокапсид); белок N связан с молекулой РНК, а белки S, E и M вместе создают вирусную оболочку. Из данных, полученных ранее для SARS-CoV [3], который имеет структуру, сходную со структурой SARS-CoV-2, можно заключить, что число копий белков E, M и N намного больше (примерно в 10 раз), чем количество копий белка S. Белки E и M являются относительно короткими, неспецифичными, тесно связанными с мембраной белками, что затрудняет их выделение, обнаружение и идентификацию. Таким образом, перспективнее разрабатывать методологию обнаружения на основе N-белка [4].

Количественный протеомный анализ методами масс-спектрометрии может служить основой для новых, высокоточных и специфичных методов дифференциальной диагностики [5]. В случае известной мишени можно использовать «таргетные» масс-спектрометрические подходы на основе мониторинга множественны/параллельных реакций (MRM/PRM) для количественного определения изменений панели белков/пептидов. Таргетный количественный подход для мониторинга белка-мишени характеризует быстрота получения результатов, быстрая пробоподготовка и снижение влияния внешних параметров эксперимента, таких как размер и форма образца. Последний фактор преодолевается в том числе за счет добавления изотопно-меченного внутреннего стандарта [5].

В статье Ihling С.и др. [6] описан способ, согласно которому методом хромато-масс-спектрометрии проанализирован осажденный ацетоном белковый осадок в растворе для полоскания горла. В 2-х из трех образцов, полученных от пациентов с диагнозом COVID-19 был идентифицирован один пептид RPQGLPNNTASWFTALTQHGK из N-белка (nucleocapsid) вируса SARS-CoV-2. Недостатком данной работы является несколько этапов гидролиза белков (что усложняет процедуру приготовления пробы), очень разбавленный образец (раствор для полоскания горла), малая выборка образцов (3 образца без группы контроля), и в качестве основного результата авторы демонстрируют всего один повторяющийся пептид, который был идентифицирован не во всех образцах (в 2-х из 3-х). Более того, по данным базы данных Uniprot (https://www.uniprot.org/) известно, что указанный пептид характерен и для других вирусов SARS млекопитающих, а не только для SARS-CoV-2 (в том числе, Bat coronavirus HKU3 (BtCoV), Bat coronavirus Rp3/2004 (BtCoV/Rp3/2004) и др.). Таким образом, полученные данные не позволяют предложить какой-либо воспроизводимый подход на основе надежной пептидной панели для детектирования вируса SARS-CoV-2. Также серьезным недостатком описанного способа является отсутствие данных по инактивации вируса, что является важным для безопасности оператора, выполняющего манипуляции с образцами.

Таким образом, несмотря на известность ряда способов диагностики вируса SARS-CoV-2, на сегодняшний день все они обладают недостатками, и на рынке сохраняется потребность в быстром и эффективном методе детектирования вируса SARS-CoV-2

Раскрытие изобретения

Задачей, решаемой изобретением, является разработка способа надежной идентификации вируса SARS-CoV-2 в образцах различного происхождения, основанного на анализе N-белка (nucleocapsid) вируса SARS-CoV-2.

Поставленная задача решается при осуществлении предлагаемого способа идентификации вируса SARS-CoV-2 в образцах различного происхождения, включающего использование разработанной авторами изобретения панели пептидов N-белка (nucleocapsid) вируса SARS-CoV-2.

Более конкретно, поставленная задача решается при осуществлении способа идентификации вируса SARS-CoV-2 в образце, включающем следующие этапы:

(а) пробоподготовка биологического образца с использованием фермента трипсина, для гидролиза белков и получения смеси полипептидов

(б) масс-спектрометрический анализ полученной смеси полипептидов с целью выявления по меньшей мере двух пептидов, выбранных из SEQ ID NO: 1-19;

(в) в случае, если в образце выявлено по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-19, по меньшей мере один из которых представляет собой пептид, выбранный из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, вирус SARS-CoV-2 в образце считается идентифицированным.

Также для обеспечения биологической безопасности при работе с потенциально контагиозным биологическим объектом предварительно, до обработки образца трипсином, проводят инактивацию вируса SARS-CoV-2 в образце.

В некоторых частных вариантах осуществления изобретения инактивацию вируса SARS-CoV-2 проводят путем нагревания образца до 65°С в течение не менее 30 мин. с последующим добавлением изопропанола.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус SARS-CoV-2 в образце считается идентифицированным при выявлении в образце по меньшей мере двух пептидов, выбранных из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления изобретения образец представляет собой мазок из зева, мазок из носоглотки, кровь, плазму, сыворотку крови, бронхиальный лаваж, амниотическую жидкость, ткань плаценты, слюну, слезу, смыв или соскоб с продуктов питания, отходов, поверхности материалов: одежды, мебели, предметов индивидуального или общего пользования, сточную воду, пробу воздуха.

В некоторых вариантах осуществления изобретения масс-спектрометрический анализ относится к типу мониторинга параллельных реакций (PRM), мониторинга множественных (MRM), MRM³, мониторинга выбранных реакций (SRM), DDA (сбор данных в зависимости отданных), DIA (сбор данных независимо от данных) или iMALDI.

В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительно проводят масс-спектрометрический количественный анализ N-белка вируса SARS-CoV-в образце с использованием панели изотопно-меченных пептидов.

В результате осуществления способа достигаются следующие технические результаты:

- разработан способ надежной идентификации вируса SARS-CoV-2, основанный на анализе панели пептидов N-белка вируса;

- предлагаемый способ имеет высокую чувствительность и специфичность, обеспечиваемые за счет использования уникальной панели пептидов N-белка SARS-CoV;

- для проведения предлагаемого способа идентификации вируса SARS-CoV-2 могут быть использованы образцы различного происхождения, в том числе биологические образцы (ткани, физиологические жидкости (кровь, моча, слюна и др.), мазки с кожи, носоглотки, бронхиальный лаваж, амниотическая жидкость, ткань плаценты и др.), продукты жизнедеятельности (еда, отходы, например, сточные воды и т.п.), объекты окружающей среды (воздух, поверхности материалов (одежда, предметы общего пользования) и т.п.);

- способ является широко доступным для проведения в лабораторных и клинических условиях, быстро внедряемым и реализуемым;

- предлагаемый способ обеспечивает сокращение времени проведения диагностики при снижении вероятности технических ошибок во время лабораторных манипуляций;

- способ может быть проведен очень быстро, в течение менее 1 часа,

- разработанный способ может быть использован для экспресс-анализа различных образцов с целью определения содержания в них вируса как дополнение/подтверждение теста, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других методах анализа, а также как самостоятельное исследование.

Подробное описание изобретения

Определения и термины

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «образец» относится к образцам различного происхождения, включая как биологические образцы, так и продукты жизнедеятельности (отходы, например, сточные воды и т.п.), продукты питания, объекты окружающей среды (воздух, поверхности материалов (одежда, мебель, предметы общего пользования)) и др.

Термин «биологический образец» («биообразец») относится к любому полученному или выделенному от пациента компоненту и включает мазок (соскоб эпителия) из зева, мазок (соскоб эпителия) из носоглотки, кровь, плазму, сыворотку крови, мочу, бронхиальный лаваж, амниотическую жидкость, ткань плаценты, слюну, слезы.

Используемый здесь термин «пациент» относится к человеку. Однако пациентом может быть и животное, такое как птица или млекопитающее. Конкретные животные включают крысу, мышь, собаку, кошку, корову, овцу, лошадь, свинью или приматов. Пациент также может быть трансгенным животным.

Термин «пациент с COVID-19» относится к пациентам, у которых коронавирус SARS-CoV-2 был диагностирован альтернативными методами (такими, как тест, основанный на ПЦР (RT-qPCR); например, как это описано в [3]).

Термин «изотопно-меченые пептиды» («стандартные пептиды, меченные стабильными изотопами (SIS)») относится к пептидам, которые были синтезированы с использованием меченых стабильными изотопами аминокислот для получения пептида, который имеет большую массу, чем соответствующий немеченый целевой пептид, для использования в качестве внутреннего стандарта для определения количества целевого пептида в образце. Подходящие изотопы - это нерадиоактивные химические изотопы, которые не распадаются спонтанно. Например, стабильные изотопы, которые могут использоваться для исследования биологических систем, включают изотопы ¹⁸O, ¹³С, ¹⁵N, ²Н и ³²S.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Аминокислотная последовательность N-белка коронавируса SARS-CoV (P0DTC9|NCAP_SARS2), на которой выделены (жирный шрифт + подчеркивание) пептиды, входящие в разработанную авторами изобретения панель пептидов.

Пометка О (210) обозначает окисленный метионин, являющейся вариабельной модификацией одного из пептидов, входящих в предлагаемую панель пептидов по изобретению.

Фиг. 2а и 2б. Примеры масс-спектров фрагментации триптических пептидов N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, идентифицированных предлагаемым способом в эпителиальных мазках из носоглотки, полученных от пациентов COVID-19.

Фиг. З. Таблица 1: панель пептидов N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, идентифицированных способом по изобретению с помощью программного обеспечения PEAKS Studio в эпителиальных мазках из носоглотки, полученных от пациентов с COVID-19. Образцы 1-5 были взяты у 5 пациентов с COVID-19 (1-3 были подготовлены по протоколу 1; 4-5 - по протоколу 2). Пробы 6-8 - отрицательный контроль (здоровые лица). Для каждого образца были проведены два повторных анализа. Числа в таблице соответствуют числу спектров («spectral counts») для каждого пептида. Серым цветом отмечены строки для пептидов с пропущенными сайтами разрезания (Missed cleavages).

Фиг. 4. Таблица 2: панель пептидов N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, идентифицированных предлагаемым способом с помощью программного обеспечения MaxQuant в эпителиальных мазках из носоглотки, полученных от пациентов с COVID-19. Образцы 1-5 были взяты у 5 пациентов с COVID-19 (1-3 были подготовлены по протоколу 1; 4-5 - по протоколу 2). Пробы 6-8 - отрицательный контроль (здоровые лица). Для каждого образца были проведены два повторных анализа. Числа в таблице соответствуют числу спектров («spectral counts») для каждого пептида. Серым цветом отмечены строки для пептидов с пропущенными сайта разрезания (Missed cleavages).

Фиг. 5. Идентификация предлагаемым способом коронавируса SARS-CoV-2 по пептидам N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) в образце ткани плаценты, полученной от пациентки с COVID-19. Синими линиями отмечены триптические пептиды, идентифицированные предлагаемым способом.

Предлагаемый подход к идентификации вируса SARS-CoV-2 в образцах различного происхождения основан на проведении масс-спектрометрического анализа в образцах после специфической пробоподготовки. Преимуществом данного метода является возможность детекции вирусных белков в сложных биологических образцах. Предложенная авторами данного изобретения пептидная панель и применяемые способы пробоподготовки позволяют идентифицировать вирус SARS-CoV-2 с высокой точностью в образцах различного происхождения, в том числе в сложных образцах, содержащих большое количество белков различного происхождения.

Предлагаемый способ включает следующие этапы:

- инактивация вируса и обеззараживание поверхности пробирок,

- осаждение общего белка и его гидролиз трипсином,

- масс-спектрометрический анализ и идентификация триптических пептидов вируса SARS-CoV-2.

До инактивации вируса и обеззараживания поверхности пробирок все работы необходимо производить согласно правилам уровня биологической безопасности III [7].

Инактивация вируса может быть проведена следующим образом:

• Переносят 0,25 мл анализируемого материала(образец), в полипропиленовую (ПП) пробирку типа Эппендорф объемом 1,5-2,0 мл.

• Инактивируют нагреванием при 65°С в течение не менее 30 минут (водяная баня или термостат твердотельный с термоблоком) [8] (важно, что при термообработке нагреваются все части пробирки, и таким образом происходит инактивация всех, даже «недоступных» поверхностей).

• После инкубации добавляют 0,75 мл 100% изопропанола для получения 75% раствора и дают образцу выстояться 10 минут при комнатной температуре [9].

• Обрабатывают поверхности пробирок 70% изопропанолом или 1% гипохлоритом натрия: проливают из струйной промывалки и выдерживают не менее 15 минут, не вытирая.

В результате такой процедуры вирус дезактивируется, а поверхность пробирки становится безопасной.

На следующем этапе проводят осаждение общего белка и его гидролиз трипсином. Использование трипсина (а также других специфических протеаз, например, Arg-C, Arg-C, Glu-C, Lys-C) с целью гидролиза белков при проведении масс-спектрометрического анализа хорошо известно в данной области. Выбор фермента для проведения гидролиза зависит от многих параметров, в том числе, от структуры анализируемого белка, наличия в образах других белков. Разработанное авторами изобретения оптимальное сочетание метода пробоподготовки и проведения трипсинолиза обеспечивают высокую эффективность выявления N-белка в образцах.

Подготовка образцов может быть проведена согласно протоколам «стандартный» или «экспресс», обеспечивающим наиболее полное покрытие последовательности N-белка. В некоторых случаях, для наиболее точного анализа образца, следует использовать повторные анализы, применяя разные методики трипсинолиза, для обеспечения максимального выявления пептидов, входящих в панель пептидов N-белка по изобретению.

В случае «стандартного» протокола (1) инактивированные биообразцы лиофилизируют и растворяют в 50 мМ аммоний-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1% Rapigest (Waters). Восстанавливают дитиотреитолом (20 мМ) в течение 30 мин. при 500°С, алкилируют йодацетамидом (50 мМ) в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте, после чего гидролизуют трипсином 4 часа при 37°С. Реакцию останавливают добавлением муравьиной кислоты до конечной концентрации 0,5%.

В случае «экспресс» протокола (2) инактивированные биообразцы охлаждают в течение двух часов при -200°С и центрифугируют при 20000 g в течение 20 минут. Осадок растворяют в 50 мМ аммоний-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1% Rapigest (Waters), и гидролизуют трипсином 4 часа при 37°С. Реакцию останавливают добавлением муравьиной кислоты до конечной концентрации 0,5%.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что использование «экспресс» протокола (2) позволяет лучше обнаруживать N-белок, чем более тщательный, обычно используемый для приготовления образца белка «стандартный» протокол (1). Вероятно, такое неочевидное различие объясняется тем, что при использовании «экспресс» протокола (2) в образцах детектируется значительно меньшее количество пептидов из так называемых «белков-хозяев», которые изначально присутствуют в исследуемом образце и для их эффективной детекции обычно требуются более тщательная пробоподготовка включающая этапы: восстановления, алкилирования, дегликозилирования и других подготовительных стадий для хорошего покрытия последовательности.

Также возможны и другие варианты пробоподготовки. В частности, может быть использовано ускоренное расщепление трипсином.

«Быстрый» протокол (3) может быть реализован с использованием иммобилизированного трипсина. Иммобилизацию трипсина можно проводить на поверхности магнитных микросфер, например, могут использоваться карбоксильные функционализированные магнитные микросферы (BioMag Plus carboxyl). Иммобилизация проводится путем реакции между сукцинимидной группой на поверхности микросфер и аминной группой на трипсине, в соответствии с протоколом [10]. Использование такого протокола позволяет провести трипсинолиз в течение 15 минут. Применение «быстрого» протокола трипсинолиза (3) или других известных быстрых протоколов позволяет существенно ускорить общее время проведения анализа.

На следующем этапе проводят масс-спектрометрический анализ и идентификацию триптических пептидов вируса SARS-CoV-2.

Масс-спектрометрия широко известна специалистам в данной области как мощный инструмент для анализа, идентификации и количественного определения различных типов молекул (классов соединений). Основой метода служит ионизация молекулы, приводящая к образованию «молекулярного иона», на основе которого проводится анализ и идентификация путем измерения отношения массы к заряду и интенсивности ионного тока, от соответствующего молекулярного иона. В зависимости от природы обнаруживаемой молекулы (например, белкового или небелкового происхождения), сложности образца (смесь или чистое вещество) и задачи исследования (например, качественный или количественный анализ), выбирается подходящий метод ионизации и масс-спектрометрии.

Последние достижения в области пептидного и белкового анализа с помощью масс-спектрометрии (MS) являются результатом разработок передовых методик ионизации, таких как электрораспылительная ионизация (ESI) и лазерная десорбция-ионизация в присутствии матрицы (MALDI). Электрораспылительная ионизация (ESI) предусматривает ионизацию при атмосферном давлении жидкого образца. В ходе процесса электрораспыления создаются высокозаряженные капли, которые при испарении создают ионы, характерные для содержащихся в растворе молекул. С помощью метода ESI стало возможным использовать масс-спектрометрию в тандеме с жидкостной хроматографией.

Жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (LC-MS) является мощным инструментом для анализа и количественной оценки белка в сложных биообразцах. Поскольку пептиды, полученные в результате расщепления представляющего интерес белка и других белков биообразца, могут обладать одинаковой или сходной номинальной массой, то дополнительная фрагментация (MS/MS или MS2) зачастую дает уникальный фрагмент представляющего интерес пептида. Сочетание конкретного исходного пептида и его уникального фрагмента используется для избирательного мониторинга и количественной оценке концентрации пептида и соответствующего ему белка. Такой подход называется «мониторинг множественных реакций» (MRM), также используется термин «мониторинг выбранных реакций» (SRM), и является наиболее широко используемым способом количественной оценки белка. Еще одним подходом является мониторинг параллельных реакций (PRM).

Для разработки количественного метода под определенную панель белков выбираются и синтезируются соответствующие им триптические пептиды. Обычно синтезируется пара пептидов-стандартов: немеченный «легкий» пептид (NAT), полностью аналогичный природному пептиду, и парный ему меченный стабильными изотопами «тяжелый» пептид (SIS). Для количественного анализа проводится построение калибровочной кривой для каждой пары пептидов (NAT/SIS) путем разведения переменного количества легкого пептида в необходимом диапазоне концентраций, с добавлением одинакового количества SIS-пептида, как внутреннего стандарта для нормализации сигнала и количественной оценки концентрации немеченных пептидов. Для контроля точности калибровочной кривой используются дополнительные образцы контроля качества (QC), подготовленные при разведении пептидов-стандартов. Полученные калибровочные кривые для всех пептидных пар могут использоваться в дальнейшем для количественного анализа соответствующих природных белков и пептидов. Все перечисленные подходы могут быть использованы для идентификации и количественного анализа вирусного N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) в образце. Например, может быть использована соответствующая панель изотопно-меченных пептидов, в которой С-концевой лизин или аргинин помечены изотопами ¹³С и ¹⁵N: K (+8 Да; 6х 13С, 2х 15N), R (+10 Да; 6х 13С, 4х 15N).

В частном варианте осуществления изобретения пептиды, полученные в результате гидролиза трипсином на предыдущем этапе, могут быть проанализированы в режиме LC-MS/MS с использованием нанопоточной высокоэфективной жидкостной хроматографической (нано-ВЭЖХ) системы Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США), соединенной с время-пролетным масс-спектрометром TIMS TOF Pro (Bruker Daltonics, США), работающем в режиме спектрометрии подвижности захваченных ионов (TIMS). Загруженный объем образца при этом составляет 2 мкл на инъекцию. Разделение ВЭЖХ проводят с помощью насадочной эмиттерной колонки (С18, 25 см х 75 мкм, 1,6 мкм) методом градиентного элюирования. Подвижная фаза А - 0,1% муравьиной кислоты в воде; подвижная фаза В - 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Разделение нано-ВЭЖХ достигают при расходе 400 нл/мин. с использованием 40-минутного градиента от 4% до 90% фазы В.

Специалисту понятно, что могут быть использованы и другие методы идентификации пептидов при помощи масс спектрометрии.

В результате проведенных исследований, более подробно описанных в разделе «примеры» ниже, была разработана панель пептидов N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-19, которая может быть использована в качестве панели биомаркеров для проведения надежной идентификации вируса SARS-CoV-2, с хорошей клинической чувствительностью и специфичностью. На Фиг. 1, демонстрирующей покрытие последовательности N-белка входящими в панель пептидами, приведена аминокислотная последовательность N-белка коронавируса SARS-CoV (P0DTC9|NCAP_SARS2), на которой жирным шрифтом и подчеркиванием выделены пептиды, входящие в разработанную авторами изобретения панель пептидов. В таблице 1 приведен перечень всех пептидов, входящих в разработанную авторами панель.

Важно отметить, что в панели почти все пептиды являются уникальными именно для SARS-CoV-2. Такие уникальные пептиды отмечены в Таблице 1 жирным шрифтом и подчеркиванием.

В то же время, как показали проведенные исследования, выявление в образце лишь одного пептида, входящего в разработанную панель N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, недостаточно для надежного детектирования вируса SARS-CoV-2 в образце. Для более точной идентификации вируса необходимо детектирование по меньшей мере 2-х пептидов, входящих в разработанную панель пептидов N-белка, причем по меньшей мере один выявленный в образце пептид должен быть уникальным для SARS-CoV-2, т.е. представлять собой пептид, выбранный из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана панель уникальных легко обнаруживаемых пептидов, полученных в результате гидролиза белка нуклеокапсида SARS-CoV-2. Разработанная пептидная панель может использоваться в качестве мишеней для создания высокоспецифичных и чувствительных методов обнаружения вируса SARS-CoV-2 в образцах на основе масс-спектрометрии, в том числе с применением мониторинга параллельных реакций (PRM) или быстрых параллельных масс-спектрометрических подходов, основанных на иммунопреципитации и лазерной десорбции/ионизации в присутствии матрицы (iMALDI), позволяющим очень быстро проверить наличие вируса в образце.

Описанный подход показывает уверенную идентификацию N-белка в образцах даже при самых низких вирусных нагрузках и низком содержании вируса с помощью достаточно простой процедуры пробоподготовки.

При этом использование процедур быстрого трипсинолиза (~15 мин), быстрых процедур масс-спектрометрии (~15 мин) и применение автоматизации пробоподготовки позволяет провести анализ очень быстро, за время менее 1 часа (60 мин).

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Сбор образцов и инактивация вируса

Все процедуры по сбору, транспортировке и подготовке образцов проводились в соответствии с ограничениями и протоколами при работе с микроорганизмами уровня биологической безопасности III патогенности (опасности)».

Для детектирования вируса SARS-CoV-2 использовали соскобы слизистой оболочки нижней части носоглотки и задней стенки ротоглотки. Образцы собирали с помощью стерильного велюрового тампона с пластиковым аппликатором. Тампон вводили вдоль наружной стенки носа на глубину 2-3 см до нижней оболочки, а после проведения вращательного движения удаляли вдоль наружной стенки носа. После взятия материала тампон помещали до места разрушения в стерильную одноразовую трубку с транспортной средой и конец зонда отламывали. Ротоглоточные мазки брали сухими стерильными вискозными тампонами вращательными движениями вдоль поверхности миндалин, небных дуг и задней стенки ротоглотки. Чтобы увеличить концентрацию вируса, носоглоточные и ротоглоточные мазки помещают в одну пробирку, которая затем герметизируется и маркируется.

Образцы эпителиальных мазков из носоглотки были взяты у 5 пациентов с инфекцией COVID-19, подтвержденной RT-qPCR. Отрицательные контрольные образцы были взяты у 3-х здоровых лиц.

Инактивация вируса в отобранных образцах проводилась в соответствии с методикой, описанной выше.

Пример 2. Приготовление образцов для масс спектрометрии

После инактивации вируса была проведена пробоподготовка отобранных образцов в соответствии с протоколами «стандартный» (1) или «экспресс» (2), описанными выше, в результате которой было достигнуто осаждение общего белка, содержащегося в образцах, и его гидролиз трипсином.

Пробоподготовка части биообразцов, полученных у пациентов с инфекцией COVID-19, подтвержденной методом RT-qPCR, была проведена в соответствии с протоколом (1) (пациенты 1-3), пробоподготовка другой части биообразцов, полученных у пациентов с инфекцией COVID-19 (пациенты 4-5), а также биообразцов взятых у здоровых лиц, была проведена по протоколу (2) (см. Фиг. 3 и 4).

Пример 3. LC-MS/MS метод (сочетание жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии)

Пептиды после расщепления трипсином анализировали в двух повторах на нано-ВЭЖХ-системе Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, США), соединенной с масс-спектрометром TIMS TOF Pro (Bruker Daltonics, США), с использованием метода сбора данных с помощью параллельного накопления и последовательной фрагментации (PASEF) в режиме DDA (сбор данных в зависимости от данных). Настройки источника электроспрея (ESI) были следующими: напряжение на капилляре - 4500 В, потенциал смещения торцевой пластины - 500 В, расход сухого газа - 3,0 л/мин при температуре 180°С. Измерения проводились в диапазоне масса/заряд (m/z) от 100 до 1700. Диапазон подвижности ионов включал значения от 0,60 до 1,60 В⋅с/см² (1/k0, где k0 - подвижность ионов). Общее время цикла было установлено равным 1,16 с, а количество сканирований PASEF MS/MS - 10. Для малых количеств образцов общее время цикла было установлено равным 1,88 с.

На Фиг. 2 приведены примеры масс-спектров фрагментации триптических пептидов (Фиг. 2а - пептид RPQGLPNNTASWFTALTQHGK, Фиг. 2б - пептид DGIIWVATEGALNTPK).

Пример 4. Анализ данных

Полученные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения PEAKS Studio 8.5, а также программы MaxQuant версии 1.6.7.0 с использованием следующих параметров: погрешность измерения массы родительского иона - 20 ppm; погрешность массы фрагментна - 0,03 Да. Окисление метионина и карбамидометилирование остатков цистеина были установлены как возможные вариабельные модификации и допускалось до 3-х вариабельных модификаций на пептид. Поиск проводился с использованием базы данных Swissprot SARS-COV-2, в качестве базы данных для «загрязнения» была выбрана база белков человека. Пороговые значения FDR для всех этапов были установлены на уровне 0,01 (1%) или ниже.

В результате проведенного анализа в каждом образце были идентифицированы пептиды, относящиеся к примерно 1000-1500 белков. При этом в ряде образцов были зарегистрированы пептиды, относящиеся N-белку (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2 (Фиг. 1). Достоверность данных подтвердилась проведением детектирования в нескольких повторах, а также использованием для анализа данных 2-х разных программ. При этом проведенный анализ показал, что все образцы, в которых были идентифицированы пептиды, относящиеся N-белку, были взяты у пациентов с инфекцией COVID-19, ранее подтвержденной методом RT-qPCR. Кроме того, ни в одном из контрольных образцов, взятых у здоровых лиц, пептидов, относящихся N-белку, выявлено не было (Фиг. 3-4). Таким образом, проведенный анализ позволил идентифицировать панель пептидов N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-19, которая может быть использована в качестве панели биомаркеров для проведения надежной идентификации вируса SARS-CoV-2, с хорошей клинической чувствительностью и специфичностью.

Результаты дополнительного анализа, проведенного на большем количестве образцов, показали, что выявление в образце лишь одного пептида, входящего в панель N-белка (P0DTC9|NCAP_SARS2) коронавируса SARS-CoV-2, недостаточно для надежного детектирования вируса SARS-CoV-2 в образце. Необходимо детектирование по меньшей мере 2-х пептидов, входящих в разработанную панель пептидов N-белка, с обнаружением по меньшей мере одного пептида, уникального для SARS-CoV-2, приведенных в Таблице 1.

Пример 5. Применение разработанной панели пептидов N-белка для идентификации вируса SARS-CoV-2 в образце

Для проведения анализа был взят образец ткани плаценты, полученной от пациентки с инфекцией COVID-19, ранее подтвержденной методом RT-qPCR. После инактивации вируса и проведения пробоподготовки, включающей осаждение общего белка, содержащегося в образце, и его гидролиз трипсином, был проведен анализ триптических пептидов с помощью масс-спектрометрии и сравнение результатов масс-спектрометрии с разработанной панелью пептидов. В результате проведенного анализа в образце были выявлены входящие в разработанную панель пептиды DGIIWVATEGALNTPK (SEQ ID:NO: 5) и NPANNAAIVLQLPQGTTLPK (SEQ ID:NO 6), свидетельствующие о наличии вируса COVID-19 в анализируемом образце (Фиг. 5).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Цитируемые документы:

[1] Coronavirus disease (COVID-2019) situation reports https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports

[2] WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard https://covid19.who.int/

[3] Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019 https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[4] Mass-Spectrometric Detection of SARS-CoV-2 Virus in Scrapings of the Epithelium of the Nasopharynx of Infected Patients via Nucleocapsid N Protein. Nikolaev EN, Indeykina Ml, Brzhozovskiy AG, Bugrova AE, Kononikhin AS, Starodubtseva NL, Petrotchenko EV, Kovalev GI, Borchers CH, Sukhikh GT // J Proteome Res. 2020 Nov 6;19(11):4393-4397. doi: 10.1021 /acs.jproteome.0c00412.

[5] Gaither C, Popp R, Mohammed Y, Borchers CH. Determination of the concentration range for 267 proteins from 21 lots of commercial human plasma using highly multiplexed multiple reaction monitoring mass spectrometry //.Analyst. 2020 May 18; 145(10):3634-3644. doi: 10.1039/c9an01893j.

[6] Ihling C, Tänzler D, Hagemann S, Kehlen A, Hüttelmaier S, Arlt C, Sinz A. Mass Spectrometric Identification of SARS-CoV-2 Proteins from Gargle Solution Samples of COVID-19 Patients // J Proteome Res. 2020 Nov 6;19(11):4389-4392. doi: 10.1021/acs.jproteome.0c00280. Epub 2020 Jun 23.

[7] Laboratory biosafety guidance related to the novel coronavirus (2019-nCoV) https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/laboratory-biosafety-novel-coronavirus-version-1 -1.pdf?sfvrsn=912a9847_2.

[8] Darnell M.E., Taylor D.R. Evaluation of inactivation methods for severe acute respiratory syndrome coronavirus in noncellular blood products// Transfusion. 2006 Oct; 46(10): 1770-7.

[9] Rabenau, H. F., J. Cinatl, B. Morgenstern, G. Bauer, W. Preiser, and H. W. Doerr. 2005. Stability and inactivation of SARS coronavirus // Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 194:1-6.

[10] Sun L, Li Y, Yang P, Zhu G, Dovichi NJ. High efficiency and quantitatively reproducible protein digestion by trypsin-immobilized magnetic microspheres. J Chromatogr A. 2012; 1220:68.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АВТОНОМНАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

"СКОЛКОВСКИЙ ИНСТИТУТ НАУКИ И ТЕХНОЛОГИЙ"

<120> Способ детектирования вируса SARS-CoV-2 методом масс-спектрометрии

<130> 428398

<160> 19

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 1

Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

1 5 10 15

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 2

Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys

1 5 10 15 20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 3

Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg

1 5 10 15 20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 4

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys

1 5 10 15 20

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 5

Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys

1 5 10 15

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 6

Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys

1 5 10 15 20

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 7

Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg

1 5 10 15

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> окисление

<400> 8

Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg

1 5 10 15 <210> 9

<211> 24

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 9

Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp

1 5 10 15

Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys

20

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 10

Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg

1 5 10 15 <210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 11

Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg

1 5 10 15

<400> 12

Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys

1 5 10 15

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> SARS coronavirus <400> 13

Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 14

Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 15

Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 16

Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg

1 5 10

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 17

Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys

1 5 10 15

<210> 18

<211> 17<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 18

Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys

1 5 10 15

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> SARS coronavirus

<400> 19

Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala

1 5 10

<---

Изобретение относится к области к биохимии. Описан способ идентификации вируса SARS-CoV-2 в образце, включающий следующие этапы: (а) пробоподготовка биологического образца с использованием фермента трипсина для гидролиза белков и получения смеси полипептидов; (б) масс-спектрометрический анализ полученной смеси полипептидов с целью выявления по меньшей мере двух пептидов, выбранных из SEQ ID NO: 1-19; (в) в случае если в образце выявлено по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность SEQ ID NO: 1-19, по меньшей мере один из которых представляет собой пептид, выбранный из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, вирус SARS-CoV-2 в образце считается идентифицированным. Изобретение решает задачу по ускорению и повышению надежности процедуры идентификации вируса SARS-CoV-2 у пациентов. Поставленная задача решается предлагаемым способом, заключающимся в идентификации вируса SARS-CoV-2 с помощью масс-спектрометрического анализа на основе разработанной панели пептидов N-белка (nucleocapsid). 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Способ идентификации вируса SARS-CoV-2 в образце, включающий следующие этапы:

(а) пробоподготовка биологического образца с использованием фермента трипсина для гидролиза белков и получения смеси полипептидов;

(б) масс-спектрометрический анализ полученной смеси полипептидов с целью выявления по меньшей мере двух пептидов, выбранных из SEQ ID NO: 1-19;

(в) в случае если в образце выявлено по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность SEQ ID NO: 1-19, по меньшей мере один из которых представляет собой пептид, выбранный из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, вирус SARS-CoV-2 в образце считается идентифицированным.

2. Способ по п. 1, в котором вирус SARS-CoV-2 считается идентифицированным при выявлении в образце по меньшей мере двух пептидов, выбранных из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19.

3. Способ по п. 1, в котором предварительно, до обработки образца трипсином, проводят инактивацию вируса SARS-CoV-2 в образце.

4. Способ по п. 3, в котором инактивацию вируса SARS-CoV-2 проводят путем нагревания образца до 65°С в течение не менее 30 мин с последующим добавлением изопропанола.

5. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой мазок из зева, мазок из носоглотки, кровь, плазму, сыворотку крови, мочу, бронхиальный лаваж, амниотическую жидкость, ткань плаценты, слюну, мазок с кожи, смыв с поверхности предмета, пробу сточных вод или пробу воздуха.

6. Способ по п. 1, в котором масс-спектрометрический анализ относится к типу мониторинга параллельных реакций (PRM), мониторинга множественных (MRM), MRM³, мониторинга выбранных реакций (SRM), DDA (сбор данных в зависимости от данных), DIA (сбор данных независимо от данных) или iMALDI.

7. Способ по п. 1, дополнительно включающий масс-спектрометрический количественный анализ N-белка вируса SARS-CoV в образце с использованием панели изотопно-меченных пептидов.