Способ определения клеточного иммунитета Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и биологии, разделу клеточной иммунологии и может быть использовано для определения клеточного иммунитета организма в клинических и научно-исследовательских медицинских и ветеринарных лабораториях.

Целью изобретения является повышение точности и сокращение времени определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают пробу крови объемом 1-2 мл с добавлением 8-10 ед. гепарина на 1 мл крови. Кровь отстаивают при комнатной температуре 0,5-1,0 ч, отбирают слой лейкоцитов с плазмой, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Плазму крови отсасывают, а из осадка лейкоцитов готовят суспензию, содержащую 1,5 хЮ6 -2,0 хЮ6 клеток в 1 мл питательной среды.

Суспензию лейкоцитов наносят на обезжиренное стекло в виде капель и помещают во влажную камеру. Лейкоциты инкубируют

при 4-8°С в течение 1-2 ч. За 30-40 мин до окончания инкубации в суспензию лейкоцитов вносят взвесь инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн. микробных тел на 1 мл суспензии клеток. По окончании инкубации стекла вынимают из камеры, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Паппенгейму. Клеточный иммунитет определяют путем микроскопирования 100- 200 мононуклеарных лейкоцитов и подсчета среди них числа бластных клеток лимфоид- ной природы и нелимфоидной (по размерам, соотношению ядра и цитоплазмы, конденсации хроматина ядра) и определения в этих же клетках на тех же препаратах показателей фагоцитарной активности по поглощению ими инактивированных стафилококков.

Результаты реакции учитывают в следующих показателях.

Относительное содержание трансформированных лимфоцитов

А В х 100 %

А В -НС

сл

с

о

00

о со о

где А - показатель трансформированных лимфоцитов %;

В - количество трасформированных лимфоцитов;

С - количество нетрансформированных лимфоцитов.

Относительное содержание трансформированных клеток нелимфоидной природы

л Е х 100 %

д Е + К

где Д - показатель трансформированных нелимфоидных клеток, %;

Е - количество нелимфоидных трансформированных клеток,

К - количество нетрансформированных клеток.

Фагоцитарный показатель

., Тх 100 %

Н -

где Н - фагоцитарный показатель, %

Т - количество фагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов

Р - количество нефагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов Фагоцитарное число

«-Й.

где Ф - фагоцитарное число

Л - количество поглощенных кокков

М - количество мононуклеарных лейкоцитов, в которых подсчитывали поглощенные кокки

Число трансформированных лимфоци тов у здоровых людей 41 % трансформированных клеток нелимфоидной природы 22%, фагоцитарный показатель 63% фагоцитарное число 8

Учет реакции по бластной трансформации клеток и их фагоцитарной активности прост, удобен, доступен лабораторному работнику средней квалификации Властные клетки легко идентифицируются ввиду их крупных размеров (в 2-4 оаза больше лимфоцитов), отчетливого увеличения площади цитоплазмы, преобладания в ядре нежного эухроматина ярко розового окрашивания

Полученные результаты обрабатывают статистически Для этого удобен метод Мон- цевичуте - Эрингене.

Пример 1. Определение клеточного иммунитета больных хронической пневмонией.

На стационарном лечении находилось 12 больных в возрасте 29-52 лет с диагнозом: хроническая рецидивирующая пневмония пневмосклероз. Диагноз установлен на основании анамнестических аускультатив- ных, рентгенологических данных и результатах функциональной диагностики

В результате проведенного лечения через 24-31 день состояние у всех больных улучшилось и они в удовлетворительном состоянии были выписаны из стационара Субьективное улучшение сопровождалось улучшени ем аускультативной, рентгенологической симптоматики и функциональных проб

При поступлении и перед выпиской у больных отбирали пробы крови и проводили

0 определение клеточного иммунитета согласно предложенному способу

Для этого у больных отбирали кровь из локтевой вены в объеме 2 мл в обработанные гепарином пробирки отстаивали 40 мин пе5 реносили взвесь лейкоцитов в центрифужную пробирку и центрифугировали 20 мин при 800 об /мин Плазму отсасывали а к лейкоцитам добавляли питательную среду до конечной концентрации 2 0 х 10fi клеток

0 в 1 мл суспензии

Суспензию клеток наносили в виде капель на предметные стекла помещали во влажную камеру и инкубировали при 4°С 2 ч За 40 мин до окончания инкубации в тех же

5 препаратах к каждой капле суспензии клеток добавляли равные по обьему капли взвеси инактивированных стафилококков (150 млн микробных тел в 1 мл) По завершении инкубации стекла вынимали из камер споласкивали

0 дистиллированной водой подсушивали фик сировали 10 мин в метаноле и окрашивали по Паппенгеиму После подсчете) 100 200 клеток в каждом препарате определяли количество трансформированных лимфоцитов транс

5 формированных клеток нелимфоидной природы и в этих же клетках показатели их фагоцитарной активности Результаты исс ледований представлены в табл 1

Из приведенных в табп 1 данных следует

0 что определенный по предлагаемому способу уровень клеточного имм/нитета коррелируете изменением клинического состояния больных Повышение трансформационной и фагоцитарной активности при выписке свидетельствует

5 о нормализации подавченной клеточной иммунологической реактивности больных хронической пневмонией и сопровождается улучшением их общего состояния аускуль- тативных и рентгенологических данных Оп0 ределение клеточного иммунитета согласно предлагаемому способу по трансформационным и фагоцитарным показателям в одном препарате позволяет более точно, статистически достоверно установить различия клеточно5 го иммунитета, в то время как по известному способу выявленные различия статистически недостоверны. Кроме того значительно сокращается продолжительность исследований, так как определение клеточного иммунитета по фагоцитарной активности согласно известному способу требует 4-5 ч. а по предлагаемому способу 30-40 мин.

Пример 2. Определение клеточного иммунитета, заболеваемости и сохранности поросят различных пород.

Определяли клеточный иммунитет у 20- дневных поросят пород ландрас и крупная белая в животноводческом хозяйстве промышленного типа. С этой целью животных каждой породы объединяли в группы (по 30 голов в каждой) и проводили определение клеточного иммунитета согласно предлагаемому способу, а также регистрировали их заболеваемость и сохранность в течение последующих 30 дней наблюдений.

Для определения клеточного иммунитета у всех животных отбирали из ушных вен по 5 мл крови с гепарином и готовили взвеси лейкоцитов содержащие 2.0 х 106 клеток в 1 мл. Взвести лейкоцитов наносили на от- дельные предметные стекла в виде капель и помещали во влажную камеру. Лейкоциты инкубировали при 4 С в течение 2 ч. За 30 мин до окончания инкубации к каждой капле клеточной суспензии добавляли равные по объему капли взвеси инактивированных стафилококков, содержавшей 200 млн. микробных тел в 1 мл По завершении инкубации стекла вынимали из камеры, споласкивали дистиллированной водой, подсушивали, фиксировали 5 мин в метаноле и окрашивали по Паппенгейму При микроскопическом исследовании 100 клеток в каждом препарате подсчитывали количество трансформированных лимфоцитов трансформированных клеток нелимфоидной природы, а также в этих клетках определяли фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см. табл. 2). Заболеваемость и сохранность поросят определяли путем ежедневных клинических наблюдений

Из представленных в табл 2 данных следует, что уровень клеточного иммунитета, определенный согласно предлагаемому способу, статистически достоверно выше у поросят породы ландрас. Дальнейшие наблюдения за животными показали, что у этих же поросят на 12% ниже заболеваемость и на 3,3% выше сохранность. Это указывает на высокую точность определения у них клеточ- ного иммунитета и возможность прогнозирования по этим показателям ущерба от заболеваемости. Расчетный экономический эффект определения клеточного иммунитета по предлагаемому способу составил

А В С. где А - расчетный экономический эф( РКТ

В - стоимость прогнозируемого ущерба (4 головы х 12,0 кг х 2,5 руб.)

С - затраты на проведение исследо ваний

А 4 гол. х 12,0 кг х 2.5 руб. 10 руб -4 10 руб. или 36,6 тыс. руб. в год в хозяйстве на 800 основных свиноматок.

Следует отметить, что определение в данном примере клеточного иммунитета только по Властным клеткам (как это предла гает известное техническое решение) не обеспечивает получения статистически достоверных данных и не определяет клеточный иммунитет с необходимой для прогнозирования за болеваемости и ущерба точностью

Таким образом, по сравнению с известным, предложенный способ позволяет в Go лее короткие сроки (2 ч, а по известному способу только определение фагоцитарной активности требует 4-5 ч и с более высокой точностью определить состояние клеточного иммунитета. Его использование позво/mei избежать ошибок в оценке клеточного имму нитета у больных с инфекционными и други ми заболеваниями, при проведении у них лечебных мероприятий Предлагаемый способ более точно устанавливает клеточный иммунитет у животных, что позволяет повысить экономический эффект и результативность исследований по отбору животных с высокой устойчивостью к заболеваниям

Способ технологически не сложен, не требует дефицитных или импортных реактивов и оборудования и может быть использован в медицинских и ветеринарных лабораториях в качестве экспресс-метода диагностики и прогнозирования заболевании человека и животных.

Формула изобретения Способ определения клеточного иммунитета, включающий выделение лейкоцитов из крови, культивирование их на предметных стеклах и подсчет бластных клеток отличающийся гем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения, к суспензии лейкоцитов добавляют взвесь инактивированного стафилококка, при этом вносят его в количестве 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии за 30 40 мин до окончания культивирования и дополнительно определяют фагоцитарную активность лейкоцитов в том же препарате

Т а б л и ц а 1 Показатели клеточного иммунитета больных хронической пневмонией

Изобретение относится к ветеринарии, медицине и биологии, точнее к разделу клеточной иммунологии, и может быть использовано для характеристики состояния клеточного иммунитета организма в ветеринарных и медицинских лабораториях иммунологического профиля. Цель - повышение точности и сокращение времени исследования. Цель достигается введением в суспензию лейкоцитов за 30-40 мин до окончания культивирования взвеси инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии лейкоцитов с дополнительной оценкой клеточного иммунитета по фагоцитарной активности лейкоцитов и количеству бластов в одном препарате. 2 табл.

Показатели клеточного иммунитета, заболеваемости и сохранности поросят различных пород

,05 ,1

,05 ,1 Таблица2