СПОСОБ ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ТЯЖЕЛОЙ ФОРМЫ COVID-19 Российский патент 2021 года по МПК A61B5/00 G01N33/569 C12Q1/6858 C12Q1/6874 

Изобретение относится к медицине, а именно, к молекулярно-генетической диагностике, которая может быть использована для выявления индивидуумов, подверженных наибольшему риску тяжелой формы течения COVID-19.

Уровень техники

Известно, что риск летального исхода при инфицировании новой коронавирусной инфекцией повышается в зависимости от ряда факторов, в числе которых возраст, мужской пол (вероятность смерти при заражении коронавирусом выше для мужчин, чем для женщин), индекс массы тела, уровень глюкозы. Тяжелое течение с летальным исходом наиболее часто регистрируют у людей старшей возрастной группы с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, цереброваскулярной патологией и злокачественными новообразованиями. Из всех хронических заболеваний наиболее опасным при COVID-19 является сахарный диабет. На втором месте после диабета по опасности при COVID-19 находятся болезни почек и сердечно-сосудистые заболевания [Wang T., Du Z., Zhu F., Cao Z., An Y., Gao Y., et al. Comorbidities and multi-organ injuries in the treatment of COVID-19 // Lancet. 2020. Vol. 395, №10228. P. e52. DOI: 10.1016/S0140-6736(20)30558-4].

Известно, что на характер течения заболевания COVID-19 также влияет фактор генетической предрасположенности. При этом из уровня техники известно, что молекулы HLA класса I являются одним из ключевых медиаторов первых звеньев в развитии специфического иммунного ответа на COVID-19. Сразу после попадания в клетку SARS-CoV-2 индуцирует трансляцию белков вируса. Некоторые из этих белков попадают в протеасомы инфицированной клетки, расщепляются до пептидов длиной 8-12 аминокислотных остатков и связываются с рецепторами HLA класса I. После связывания комплекс, состоящий из молекулы HLA класса I и пептида, переносится на поверхность инфицированной клетки, где он может взаимодействовать с Т-клеточным рецептором CD8+ Т-лимфоцитов. В ответ на взаимодействие CD8+ Т-лимфоцит активируется и начинает делиться; через 5-7 дней образуются популяции вирусспецифических цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, способных разрушать инфицированные клетки с помощью перфоринов и сериновых протеаз [Wherry EJ, Ahmed R. Memory CD8 T-Cell Differentiation during Viral Infection. J Virol. 2004;78(11):5535-5545. doi:10.1128/jvi.78.11.5535-5545.2004].

Существует три основных типа рецепторов HLA класса I: HLA-A, HLA-B и HLA-C. Рецепторы каждого типа присутствуют в двух вариантах, унаследованных от родителей. Существуют десятки вариантов каждого аллеля рецепторов HLA-I; каждый аллель обладает индивидуальной способностью распознавать различные чужеродные белки. Распределение аллелей является специфичным для отдельных популяций [Wang JH, Zheng X, Ke X, Dorak MT, Shen J, Boodram B, et al. Ethnic and geographical differences in HLA associations with the outcome of hepatitis C virus infection. Virol J. 2009;6. doi:10.1186/1743-422X-6-46]. Комбинации рецепторов HLA класса I существенно влияют на тяжесть течения различных инфекционных заболеваний, включая малярию [Lima-Junior JdC, Pratt-Riccio LR. Major histocompatibility complex and malaria: Focus on Plasmodium vivax Infection. Front Immunol. 2016; 7(JAN). doi:10.3389/fimmu.2016.00013], туберкулез [Mazzaccaro R0, Gedde M, Jensen ER, Van Santen HM, Ploegh HL, Rock KL, et al. Major histocompatibility class I presentation of soluble antigen facilitated by Mycobacterium tuberculosis infection. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(21):11786-11791. doi:10.1073/pnas.93.21.11786.], ВИЧ [Goulder PJR, Watkins DI. Impact of MHC class I diversity on immune control of immunodeficiency virus replication. Nat Rev Immunol. 2008; 8(8):619-630. doi:10.1038/nri2357] и вирусный гепатит [Wang JH, Zheng X, Ke X, Dorak MT, Shen J, Boodram B, et al. Ethnic and geographical differences in HLA associations with the outcome of hepatitis C virus infection. Virol J. 2009;6. doi:10.1186/1743-422X-6-46].

Существуют ряд публикаций, в которых описаны взаимосвязи между генотипом HLA и чувствительностью к SARS-CoV. В частности известно, что аллели HLA-B*07:03 [Ng MHL, Lau KM, Li L, Cheng SH, Chan WY, Hui PK, et al. Association of human-leukocyte-antigen class I (B*0703) and class II (DRB1*0301) genotypes with susceptibility and resistance to the development of severe acute respiratory syndrome. J Infect Dis. 2004; 190(3):515-518. doi:10.1086/421523], HLA-B*46:01 [Lin M, Tseng HK, Trejaut JA, Lee HL, Loo JH, Chu CC, et al. Association of HLA class I with severe acute respiratory syndrome coronavirus infection. BMC Med Genet. 2003; 4. doi:10.1186/1471-2350-4-9] и HLA-C*08:01 [Chen YMA, Liang SY, Shih YP, Chen CY, Lee YM, Chang L, et al. Epidemiological and genetic correlates of severe acute respiratory syndrome coronavirus infection in the hospital with the highest nosocomial infection rate in Taiwan in 2003. J Clin Microbiol. 2006; 44(2):359-365. doi:10.1128/JCM.44.2.359-365.2006] являются факторами предрасположенности к тяжелой форме заболевания; аллель 21 HLA-C*15:02 ассоциирован с легкой формой [Wang SF, Chen KH, Chen M, Li WY, Chen YJ, Tsao CH, et al. Human-leukocyte antigen class i Cw 1502 and Class II DR 0301 genotypes are associated with resistance to severe acute respiratory syndrome (SARS) infection. Viral Immunol. 2011; 24(5):421-426. doi:10.1089/vim.2011.0024].

В исследовании, проведенном китайскими учеными, было выявлено наличие редкого аллеля HLA-C*07:29 и HLA-B*15:27 у китайских пациентов с COVID-19 [Wang W, Zhang W, Zhang J, He J, Zhu F. Distribution of HLA allele frequencies in 82 Chinese individuals with coronavirus disease-2019 (COVID-19). Hla. 2020;96(2):194-196. doi:10.1111/tan.13941].

Из уровня техники известна взаимосвязь количества пептидов с высокой константой взаимодействия с индивидуальным генотипом HLA: чем больше вирусных пептидов с высокой аффинностью связывается с HLA I класса, тем легче протекает заболевание. Также было показано, что частота встречаемости аллелей HLA-A*01:01 и HLA-A*02:01 связана с числом случев COVID-19 и смертей от нее в различных регионах Италии [Pisanti S, Deelen J, Gallina AM, Caputo M, Citro M, Abate M, et al. Correlation of the two most frequent HLA haplotypes in the Italian population to the differential regional incidence of Covid-19. J Transl Med. 2020;18(1). doi:10.1186/s12967-020-02515-].

Таким образом, из уровня техники известно влияние различных сочетаний аллелей HLA I класса на течение заболевания, вызванного SARS-CoV-2. При этом очевидно, что сочетание отдельных аллелей, прогностически значимых для оценки риска развития тяжелого течения COVID-19, для разных популяций может отличаться. Из уровня техники не выявлено результатов исследований комбинации аллелей HLA I класса для российской популяции, которые бы обеспечивали получение достоверных прогнозных оценок по течению данного заболевания.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ оценки риска развития тяжелой формы COVID-19 [Iturrieta-Zuazo, I., Rita, C.G., A., de Malet Pintos-Fonseca, A., N., R., Tejeda-Velarde, A., Serrano-Villar, S., J.L., & I. (2020). Possible role of HLA class-I genotype in SARS-CoV-2 infection and progression: A pilot study in a cohort of Covid-19 Spanish patients. Clinical Immunology, 219, 108572. https://doi.org/10.1016/j.clim.2020.108572], включающий забор биологического материала, выделение геномной ДНК с последующим генотипированием аллелей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, обработку результатов генотипирования и прогнозирование риска развития тяжелой форма COVID-19 с высокой вероятностью летального исхода. Известный способ основан на исследовании биологического материала 5 пациентов с легкой формой, 20 пациентов средней тяжести и 20 пациентов с тяжелой формой COVID-19. Выделение геномной ДНК с последующим генотипированием аллелей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C было проведено с помощью наборов реагентов RSSOW1A, RSSOW1B и RSSOW1C (One lambda inc) и мультиплексного анализатора FlexMap 3D. Критерии для оценки риска развития тяжелой формы COVID-19 были получены на основе анализа аффинности взаимодействия пептидов вируса SARS-CoV-2 c молекулами HLA-I пациента, относящегося к одной из трех групп по тяжести течения заболевания; в случае, если аффинность взаимодействия пептида с одной из молекул HLA-I была менее 50 нМоль, то Индекс высокоаффинных пептидов увеличивали на 1; пороговые значения для прогноза риска развития тяжелой формы COVID-19 для всех пациентов определяли после определения Индекса высокоаффинных пептидов.

Однако в известном способе пороговые значения для прогноза риска развития тяжелой формы COVID-19 определялись на основе выборки без учета данных об умерших пациентах. При этом малый объем выборки, использование только качественных, а не количественных характеристик взаимодействия вирусный пептид - молекула HLA-I, отсутствие этапа проверки чувствительности и специфичности критериев прогноза риска развития тяжелой форма COVID-19 на контрольной выборке, ставят под сомнение точность и достоверность получаемых прогнозных оценок развития тяжелой формы COVID-19.

Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является разработка способа оценки риска развития тяжелой формы COVID-19, который может быть применен для российской популяции, с получением достоверных и высокоточных прогнозных оценок.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение точности прогнозных оценок риска развития тяжелой формы COVID-19 для лиц российской популяции возрастом от 35 до 60 лет.

Под тяжелой формой COVID-19 понимается состояние пациента, требующее его пребывания в отделении интенсивной терапии и/или кислородной поддержки, в процессе лечения (ЧДД более 30/мин, SpO2 ≤ 93%, PaO2 /FiO2 ≤ 300 мм рт.ст.).

Технический результат достигается тем, что способ оценки риска развития тяжелой формы COVID-19 включает забор биологического материала, выделение геномной ДНК с последующим генотипированием аллелей гена HLA-A и прогнозирование по результатам генотипирования риска развития тяжелой форма COVID-19 (в т.ч. с высокой вероятностью летального исхода). При этом по результатам генотипирования определяют наличие аллелей HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01, и прогнозируют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19 при выявлении гомозиготности по аллелю HLA-A*01:01, низкий риск - при выявлении гомозиготности по аллелям HLA-A*02:01 или HLA-A*03:01, или гетерозиготности с парой аллелей HLA-A*02:01, HLA-A*03:01.

При выявлении остальных комбинаций данных аллелей (HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, или HLA-A*01:01, HLA-A*03:01), индивидуума относят к группе неопределенного риска.

В качестве биологического материала для оценки риска развития тяжелой формы COVID-19 может быть использована венозная или капиллярная кровь, букальный соскоб.

Геномная ДНК может быть выделена с помощью различных наборов реагентов, например, QIAamp DNA Blood, или HigherPurity™ Blood DNA Extraction Kit (Convax), или GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific), или любого аналогичного набора для выделения геномной ДНК. Генотипирование осуществляют с применением набора реагентов для подготовки библиотек фрагментов ДНК генов HLA-A для генотипирования секвенированием нового поколения, например, HLA-Эксперт (ООО «ДНК-Технология») или любого аналогичного набора, известного из уровня техники для указанного применения.

Заявляемый способ был разработан по итогам проведенных исследований генетического материала около 540 пациентов, составляющих российскую популяцию, включая генетически материал умерших пациентов в возрасте до 60 лет и после 60 (111 пациентов). В результате выявлены возможные связи между генотипами умерших пациентов, их возрастом на момент смерти с критическим течением COVID-19, на основании которых разработаны критерии, обеспечивающие высокую точность и достоверность получаемых прогнозных оценок, а также генетические факторы, ассоциированные с тяжестью течения COVID-19.

Использование в заявляемом способе данных HLA-генотипа пациентов умерших от COVID-19 в возрасте до 60 лет и старше 60 лет значимо повлияло на повышение точности получаемых оценок. Смерть - крайнее проявление тяжелого течения заболевания; смерть от COVID-19 - сочетание сопутствующих заболеваний, неадекватного ответа иммунной системы, одной из причин которого является генетическая предрасположенность; сравнение умерших от COVID-19 в возрасте до 60 лет (когда у большинства популяции сопутствующие заболевания еще не могут внести значительный вклад в течение заболевания) с умершими в возрасте старше 60 лет позволили выявить преимущественный вклад наследственного фактора.

Кроме того, в способе, описанном в работе Iturrieta-Zuazo и соавторов, оценку риска проводят только по генотипу HLA-A, только по генотипу HLA-B, только по генотипу HLA-C, и по полному генотипу HLA-1. В процессе разработки заявляемого способа было выявлено, в повышение точности прогнозных оценок для российской популяции вносит вклад комплекс, состоящий из аллелей HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01.

Кроме того, применение способа, описанного в работе Iturrieta-Zuazo и соавторов, к данным генотипов выборки пациентов, предложенной в заявляемом способе, показало значение площади под ROC-кривой равное 0.57, p = 0.15 при пороге на аффинность равным 500 нМ и 0.59, p = 0.07 при пороге на аффинность равным 50 нМоль. При этом площадь под ROC-кривой при использовании заявляемого способа составила 0,68, p = 0,003, что свидетельствует о ее большей чувствительности и специфичности.

Кроме того, при получении заявляемого комплекса генетических маркеров были использованы иные критерии оценки аффинности пептидов и аллелей HLA-I. В способе, описанном в работе Iturrieta-Zuazo и соавторов, упоминается два способа интерпретации математического моделирования аффинности пептида и аллели HLA-I: при аффинности менее 50 нМоль взаимодействие считалось возможным, при более и равно 50 нМоль - нет; при аффинности менее 500 нМоль взаимодействие считалось возможным, при более и равно 500 нМоль - нет. Заявляемые оценочные критерии были получены при использовании непрерывной шкалы значений аффинности от 1 до 5000 в отличие от способа Iturrieta-Zuazo и соавторов, который бинаризует (0 или 1) значение аффинности. Учитывая, что значение площади под ROC-кривой заявляемого способа превосходит значение для прототипа, использование непрерывной шкалы аффинностей позволяет повысить точность прогноза.

Таким образом, заявляемый способ демонстрирует более высокую точность получения прогнозных оценок по течению COVID-19 по сравнению со способом - прототипом, что является важным для применения/изменения тактики лечения пациента.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется иллюстративными материалами.

На фиг. 1 представлена оценка риска, разделяющая группы пациентов российской популяции, умерших в возрасте до и после 60 лет, и контрольных индивидуумов. А: распределение индекса риска в рассматриваемых группах. Б: рабочая характеристическая кривая приемника для индекса риска. В: эмпирическая функция распределения индекса риска. Вертикальные пунктирные линии определяют пороговое и дополнительное пороговое значения. Г: распределение исследуемых индивидуумов по группам низкого и высокого рисков.

Осуществление изобретения

Оценку риска развития тяжелой формы COVID-19 у пациента из российской популяции проводят в два этапа.

1. Забор биологического материала и генотипирование.

Для проведения генотипирования аллелей HLA-A получают биологический материал индивидуума, выделяют из него геномную ДНК и проводят анализ секвенирования нового поколения. Биологическим материалом может служить венозная или капиллярная кровь, букальный соскоб. Выделение геномной ДНК можно проводить с помощью различных наборов реагентов, например, QIAamp DNA Blood, или HigherPurity™ Blood DNA Extraction Kit (Convax), или GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific), или использовать любой аналогичный набор для выделения геномной ДНК.

Генотипирование осуществляют с применением набора реагентов для подготовки библиотек фрагментов ДНК генов HLA-A для генотипирования секвенированием нового поколения HLA-Эксперт (ООО «ДНК-Технология»), или TruSight HLA v2 Sequencing Panel Library Preparation Kits (Illumina), иллюбого аналогичного набора для подготовки фрагментов ДНК генов HLA-A. Секвенирование производят в обоих направлениях 2-4 экзонов, аннотация генотипов может быть произведена, например, с использованием базы данных IMGT/HLA [Robinson J, Barker DJ, Georgiou X, Cooper MA, Flicek P, Marsh SGE. IPD-IMGT/HLA Database. Nucleic Acids Res. 2020; 48(D1):D948-D955. doi:10.1093/nar/gkz950].

2. Оценка результатов генотипирования.

По результатам генотипирования определяют наличие аллелей HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01, и прогнозируют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19 при выявлении гомозиготности по аллели HLA-A*01:01, низкий риск - при выявлении гомозиготности по аллелям HLA-A*02:01 или HLA-A*03:01, или гетерозиготности с аллелями HLA-A*02:01, HLA-A*03:01.

При выявлении остальных комбинаций данных аллелей (HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, или HLA-A*01:01, HLA-A*03:01) индивидуума относят к группе неопределенного риска.

Данные оценочные критерии были получены в результате исследования, которое включало формирование для российской популяции БД аллелей генов HLA-A, HLA-В, HLA-C со значениями главных компонент по итогам соответствующего генотипирования популяции. Популяционный срез включал не менее 400 человек, в т.ч. пациентов, умерших от COVID-19 - предпочтительно не менее 20 пациентов в возрасте до 60 лет, не менее 80 пациентов в возрасте от 60 лет. Из выборки были исключены пациенты с иммуносупрессией (например, больные ВИЧ, принимающие химиотерапию, лица с автоиммунными заболеваниями, принимающие иммуносупрессанты, пациенты с трансплантациями).

В процессе проведения исследования была сформирована матрица связывания вирусных пептидов и аллелей.

Для формирования матрицы связывания были использованы последовательности белков SARS-CoV-2 требуемого штамма, а также последовательности белков SARS-CoV-2, опубликованные на портале GISAID [Elbe S, Buckland-Merrett G. Data, disease and diplomacy: GISAID's innovative contribution to global health. Glob Challenges. 2017; 1(1):33{46. doi:10.1002/gch2.1018.]. Выравнивание белковых последовательностей с целью получения консенсусной последовательности может быть произведено с помощью таких программных продуктов, как Clustal Omega [Sievers F, Higgins DG. Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences. Protein Sci. 2018; 27(1):135{145. doi:10.1002/pro.3290.], или Kalign [https://doi.org/10.1186/1471-2105-6-298], или любого аналогичного продукта для осуществления множественного выравнивания аминокислотных последовательностей. Для каждой аминокислоты каждого вирусного белка производили расчет вероятности разрезания протеасомой в данной позиции, которое может быть реализовано, например, с использованием программного продукта NetChop [https://doi.org/10.1007/s00251-005-0781-7]. Список вирусных пептидов определяли в виде множества всевозможных фрагментов белков, состоящих из 8-12 аминокислот, имеющих вероятность протеасомного разреза не менее 0.1 с каждого из концов фрагмента.

Далее определяли аффинности связывания вирусных пептидов с рецепторами HLA-I, которые могут быть реализованы с использованием программы netMHCpan [https://doi.org/10.1093/nar/gkaa379], или MHCflurry [https://doi.org/10.1016/j.cels.2018.05.014], или любой аналогичной программой для предсказания аффинностей связывания аллелей HLA класса I и множества пептидов. Пептиды, имеющие низкую аффинность связывания ко всем аллелям из данной популяции, исключали. В качестве порогового значения, характеризующего низкую аффинность, использовали 500 нмоль. Для оставшихся пептидов аффинности инвертировали, умножали на 500 и логарифмировали по основанию 10 (константы 500 и 10 не влияли на дальнейший статистический анализ и были введены для удобства визуального исследования). Результат вычислений записывали в матрицу, строкам которой соответствовали аллели популяции, а столбцам - вирусные пептиды.

Далее проводили обработку матрицы связывания методом главных компонент. Для чего в рамках данного метода исходный набор пептидов заменяли на их наиболее информативные линейные комбинации. Количество главных компонент определяли таким образом, чтобы доля дисперсии, обусловленная каждой компонентой, составляла не менее 5%.

Для каждого индивидуума с определенным генотипом рецепторов HLA-I, производили суммирование главных компонент, соответствующих каждой паре двух аллелей (HLA-A, HLA-C). При этом в суммировании участвуют вторая и третья главные компоненты по аллелям HLA-A, и четвертая компонента по HLA-C. Итоговая формула выглядит следующим образом:

,

где HLA-A₁, HLA-A₂, HLA-C₁, HLA-C₂ - аллели, соответствующие генотипу рассматриваемого индивидуума; РС₂, РС₃, РС ₄ - вторая, третья и четвертая главная компонента генов HLA-A, HLA-A и HLA-C, соответственно.

Далее, полученную сумму приводили к диапазону путем линейной нормировки: , где - нормированный индекс риска, - минимально возможная сумма среди рассматриваемой популяции, - максимально возможная сумма среди рассматриваемой популяции.

Далее определяли группы высокого и низкого рисков. Сравнение нормированного индекса риска с заданными пороговыми значениями - верхним и нижним, определяет группы пациентов высокого и низкого рисков развития тяжелой формы COVID-19. А именно, если значение выше верхнего порогового значения (основного), то индивидуума относят к группе высокого риска, если же ниже нижнего порогового значения (дополнительного), то индивидуума относят к группе низкого риска.

Пороговое значение определяли следующим образом. Сначала, для выборки умерших пациентов определяли нормированные индексы риска , , …, ( - нормированная сумма для -го пациента, - общее число пациентов). Выбор порогового значения происходит последовательной проверкой каждого значения : для каждого такого значения подсчитывают долю умерших в возрасте до 60 лет со значением большим , далее полученную долю сравнивают с общей долей умерших до 60 лет с помощью точного теста Фишера. В качестве порогового значения выбирали то значение , для которого тест определил минимальное -значение. Расчет дополнительного порогового значения производили аналогичным образом: для каждого , определяли долю умерших пациентов в возрасте до 60 лет со значением меньшим , далее полученную долю сравнивали с общей долей умерших до 60 лет с помощью точного теста Фишера; в качестве дополнительного порогового значения выбирали то значение , для которого тест определил минимальное -значение.

Заявляемый способ был разработан по итогам проведенных исследований на основе данных контрольной группы из 428 добровольцев, которая была сформирована с использованием электронных записей генотипов HLA Федерального регистра доноров костного мозга (Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова) и 111 пациентов, инфицированных COVID-19, которые умерли в период с мая по июль 2020 года по данным Городской клинической 46-ой больницы им. О.М. Филатова (Москва, Россия). Для изучения влияния генотипа HLA класса I на течение COVID-19 было проведено генотипирование HLA для умерших пациентов с COVID-19, а также контрольной группы (n = 428) и исследована взаимосвязь между генотипами и возрастом на момент смерти. Все пациенты имели, по крайней мере, один положительный результат теста на SARS-CoV-2 с помощью RT-qPCR из мазков носоглотки или бронхоальвеолярного лаважа. Из исследований были исключены пациенты с патологиями ВИЧ, рак и принимавшие иммуносупрессивные препараты.

Кровь (2 мл) у умерших пациентов была взята врачом из правого желудочка во флаконе с ЭДТА. Пациенты были разделены на две группы в зависимости от возраста смерти: взрослые (возраст ≤ 60 лет, n = 26) и пожилые люди (возраст > 60 лет, n = 85).

Хотя пациенты с тяжелой сопутствующей патологией были исключены из исследования, 76,6% умерших пациентов имели, по крайней мере, одно основное заболевание. Только цереброваскулярные заболевания имели статистически значимое отношение шансов при сравнении групп взрослых и пожилых людей (3,8% против 34,1%, точный критерий Фишера Р = 1,89×10-3). Другие сердечно-сосудистые заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца и сердечная недостаточность, также были более частыми в группе пожилых людей, что, однако, не было статистически значимым. Было выявлено, что процент случаев диабета составил около 3,5% в обеих анализируемых группах. Кроме того, частота хронических заболеваний почек (стадии 4-5) в обеих группах составляла 23,1% для взрослых и 16,5% для пожилых.

Полученные значения нормированного индекса риска достоверно разделяли группы умерших до и после 60 лет (P = 3,48×10-3, U-критерий Манна-Уитни) и площадью под кривой рабочей характеристики приемника (AUC ROC), равной 0,68 (перестановочный тест Р = 3,10×10-3), см. фиг. 1. Различия распределений нормированных индексов риска в когорте умерших до 60 и контрольной группе также были статистически значимыми (U-критерий Р = 3,31×10-3), в то время как разница между умершими после 60 и контрольными группами отсутствовала (Р = 0,283).

Разделение пациентов на группы высокого и низкого риска с использованием порогового и дополнительного порогового значений привело как к значимому разделению пациентов, умерших до 60 и после 60 лет (точный тест Фишера), так и к разделению от умерших до 60 от контрольных индивидуумов в группах низкого и высокого риска.

В проведенных исследованиях были использованы следующие функции из модуля scipy.stats Python [Virtanen P, Gommers R, Oliphant TE, Haberland M, Reddy T, Cournapeau D, et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nat Methods. 2020; 17(3):261-272. doi:10.1038/s41592-019-0686-2]: fisher exact для точного теста Фишера, mannwhitneyu для U-теста Манна-Уитни. Процедура Бенджамини-Хохберга использовалась для выполнения множественной коррекции тестирования. Анализ главных компонент проводился с помощью модуля scikit-learn Python [Pedregosa F, Varoquaux G, Gramfort A, Michel V, Thirion B, Grisel O, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 2011; 12(85):2825-2830]. Перестановочный тест для оценки значимости площади под рабочим приемником значений характеристической кривой (AUC ROC) проводился с n = 1000000 перестановками меток. Участки ROC-кривой были построены с помощью Seaborn и Matplotlib [Hunter JD. Matplotlib: A 2D graphics environment. Comput Sci Eng. 2007; 9(3):90-95. doi:10.1109/MCSE.2007.55].

Таким образом при анализе групп высокого риска было выявлено, что более половины (пять из восьми) умерших пациентов, содержащих аллели HLA-A*01:01, были гомозиготны по этому аллелю, в то время как в средней группе не было ни одного индивидуума, гомозиготного по HLA-A*01:01 (точный критерий Фишера Р = 0,0103). Выявлено, что доли гомозигот по HLA-A*01:01 в группе умерших (4 из 26 пациентов, умерших в возрасте не более 60 лет и 1 из 85 пациентов, умерших в возрасте старше 60 лет) приводят к двум статистически значимым различиям: р-значение точного критерия Фишера при сравнении группы взрослых с группой старших равно 3,10×10-3, и р-значение критерия сравнения группы взрослых и контрольной группы равно 0,0104 (8 из 428 членов контрольной группы были гомозиготны по HLA-A*01:01). Однако разница между группой старших и контрольной группой статистически незначима (Р = 0,155). Других статистически значимых различий в распределении гомозиготности между группами не было обнаружено. Однако группа низкого риска также содержала гомозиготных лиц: все случаи гомозиготности по HLA-A*02:01 (шесть случаев) и HLA-A*03:01 (два случая) аллели были связаны с низким риском, и только один из данных пациентов умер в возрасте до 60 лет. Таким образом, гомозиготность по аллели HLA-A*01:01 ассоциируется с плохим прогнозом, за исключением некоторых аллелей, таких как HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01 с “релевантными” профилями связывания вирусных пептидов.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан способ прогнозирования риска развития тяжелой формы COVID-19, основанный на анализе представленности комплекса аллелей HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01. Наличие аллели HLA-A*01:01 связано с высоким риском развития тяжелой формы COVID-19, включая летальный исход, в то время как HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01 связано с низким риском развития тяжелой формы COVID-19 (низким риском смертности у пациентов с COVID-19).

Ниже представлены примеры реализации заявляемого изобретения.

Пример 1

Сергей П., 52 года. Был произведен забор венозной крови. Геномная ДНК была выделена с помощью набора QIAamp DNA Blood. В процессе генотипирования с помощью секвенирования нового поколения был использован набор реагентов HLA-Эксперт. В результате было определено, что индивидуум является гомозиготой по гену HLA-A с парой аллелей HLA-A*01:01., и индивидуум был отнесен к высокой группе риска.

Через полтора месяца после анализа индивидуум переболел тяжелой формой COVID-19 (реанимация, искусственная вентиляция легких, ЧДД 34/мин, SpO2 90%, PaO2/FiO2 293 мм рт.ст).

Пример 2

Юлия С., 44 года. Был произведен забор капиллярной крови. Геномная ДНК была выделена с помощью набора GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit. В процессе генотипирования с помощью секвенирования нового поколения был использован набор реагентов HLA-Эксперт. В результате было определено, что индивидуум обладает аллелями HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01 (гетерогизота по гену HLA-A), индивидуум был отнесен к низкой группе риска.

Через две недели после анализа индивидуум бессимптомно переболел COVID-19 (диагностика проведена с помощью ПЦР теста).

Таким образом, заявляемый способ продемонстрировал высокую точность получения прогнозных оценок.

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярно-генетической диагностике, и может быть использовано для оценки риска развития тяжелой формы COVID-19. Осуществляют забор биологического материала, выделение геномной ДНК с последующим генотипированием аллелей гена HLA-A и прогнозирование по результатам генотипирования риска развития тяжелой формы COVID-19. По результатам генотипирования определяют наличие аллелей HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01. Прогнозируют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19 при выявлении гомозиготности по аллели HLA-A*01:01, низкий риск – при выявлении гомозиготности по аллелям HLA-A*02:01 или HLA-A*03:01 или гетерозиготности с парой аллелей HLA-A*02:01, HLA-A*03:01. Способ обеспечивает возможность повышения точности прогнозных оценок риска развития тяжелой формы COVID-19 для лиц российской популяции возрастом от 35 до 60 лет за счет генотипирования аллелей гена HLA-A и прогнозирования по результатам генотипирования риска развития тяжелой формы COVID-19 при обнаружении наличия определенных аллелей гена HLA-A. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

1. Способ оценки риска развития тяжелой формы COVID-19, включающий забор биологического материала, выделение геномной ДНК с последующим генотипированием аллелей гена HLA-A и прогнозирование по результатам генотипирования риска развития тяжелой формы COVID-19, отличающийся тем, что по результатам генотипирования определяют наличие аллелей HLA-A*01:01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01 и прогнозируют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19 при выявлении гомозиготности по аллели HLA-A*01:01, низкий риск – при выявлении гомозиготности по аллелям HLA-A*02:01 или HLA-A*03:01 или гетерозиготности с парой аллелей HLA-A*02:01, HLA-A*03:01.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что геномную ДНК выделяют с помощью набора реагентов для выделения геномной ДНК: QIAamp DNA Blood, или HigherPurity™ Blood DNA Extraction Kit, или GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что генотипирование осуществляют с применением набора реагентов для подготовки библиотек фрагментов ДНК гена HLA-A для генотипирования секвенированием нового поколения HLA-Эксперт.