СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ РИСКА ТЯЖЕЛОГО ТЕЧЕНИЯ COVID-19 Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6883 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной патологии, реаниматологии, лабораторной диагностике, и касается способа прогнозирования тяжелого течения заболевания у пациентов с COVID-19.

В настоящее время продолжается активный поиск маркеров генетического детерминирования тяжести течения и исхода COVID-19. Основной массив исследований касается полиморфизмов генов ангиотензинпревращающих ферментов и мембрано-связанной сериновой протеазы (TMPRSS2). Получены данные о влиянии на течение COVID-19 полиморфизмов генов молекул адгезии, компонентов системы интерферона, цитокинов и факторов транскрипции, окислительного стресса и метаболических молекул. Определение генетического риска тромботических событий приобрело большое научное и практическое значение, так как иммунотромбоз/тромбовоспалительный синдром - ведущее звено патогенеза тяжелого COVID-19. Однако роль носительства протромбогенных мутаций и полиморфизмов при COVID-19 остается неясной; публикаций, посвященных этой теме, явно недостаточно. Доказано лишь защитное влияние полиморфизма гена эпоксиредуктазного комплекса витамина К (VKORC1), ассоциированное с меньшей выраженностью тромбовоспалительного синдрома при COVID-19. А также, ряд исследователей рассматривают полиморфизм С677Т гена редуктазы метилентетрагидрофолиевой кислоты (MTHFR) как причину гипергомоцистеинемии, приводящей к тяжелому ОРДС при COVID-19. Вместе с тем, крупные метаанализы (не касающиеся COVID-19) не подтверждают значимой ассоциации между полиморфизмом генов фолатного цикла и риском тромбозов. Кроме того, аллели риска в генах фолатного цикла регистрируются в популяции с высокой частотой. Например, в г. Краснодаре у женщин 62-80 лет с хронической кардиальной патологией полиморфизм гена MTHFR отмечен в 40% случаев, a MTRR - в 77%. Результаты проведенных к настоящему времени исследований не позволяют сделать вывод о целесообразности использования какого-либо отдельного генетического маркера в качестве прогностического критерия неблагоприятного течения COVID-19 и/или развития тромбоза. Указанные аспекты нуждаются в более детальном изучении для обоснования мероприятий динамического наблюдения и лечения пациентов с новой коронавирусной инфекцией.

Известен способ прогнозирования риска развития нарушения мозгового кровообращения на основании определения полиморфизма генов системы гемостаза, предложенный И.В. Куртовым и соавторами в 2021 г. Сущность способа заключается в том, что у пациентов молодого и среднего возраста, перенесших ОНМК по ишемическому типу, провели определение полиморфизма генов системы гемостаза методом ПЦР. У всех пациентов выявлены различные сочетания генетических полиморфизмов протромбогенной направленности (FGB, FII, FV, FVII, PAI-I, Gp1a). Выявлено состояние гипофибринолиза, вероятно связанное с полиморфизмом PAI-1 (Куртов И.В., Кривова СП., Хайретдинов Р.К., Давыдкин И.Л. Гематогенная тромбофилия как дополнительный фактор риска развития нарушения мозгового кровообращения // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2021. - №4. - С. 49-52 Но у данного способа есть недостатки:

1. Прогностический характер влияния на эпизоды ранних ишемических ОНМК не доказан ни для одного полиморфизма генов системы гемостаза.

2. У обследованных больных не было выявлено тромбофилий группы высокого риска.

Существует способ прогнозирования тяжести течения COVID-19, предложенный Weiner J. и соавторами в 2021 г. Сущность способа заключается в том, что у пациентов, болеющих COVID-19, в пробе венозной крови методом ПЦР определяют все гены 1 класса HLA (HLA -А, -В, -С). У больных носителей гена HLA-C*04:01 наибольший риск тяжелого течения заболевания вплоть до летального исхода, что требует подбора индивидуальной тактики лечения, учитывающей более слабую, относительно носителей других вариантов генов 1 класса HLA, иммунную защиту от SARS-CoV-2 (Weiner J, Suwalski P, Holtgrewe M, et al. Increased risk of severe clinical course of COVID-19 in carriers of HLA-C*04:01. EClinicalMedicine. 2021 Oct;40:101099. doi: 10.1016/j.eclinm.2021.101099).

Недостатками данного способа являются:

1. Наличие только одного предиктора тяжести течения COVID-19.

2. Отсутствие практической значимости в виде изменения тактики лечения больных носителей гена HLA-C*04:01, имеющих наибольший риск тяжелого течения заболевания.

Аналога, предусматривающего прогнозирование высокой степени риска тяжелого течения COVID-19 на основании полиморфизма генов системы гемостаза Gp1a, Gp3a, FGB, FII, FV, FVII, F13A1, PAI-I, заявителем не выявлено.

Задачи:

1. Определение в момент поступления больного COVID-19 генетического протромбогенного риска, способного привести к тяжелому течению инфекции с неблагоприятным исходом.

2. Разработка информативного и доступного в практическом применении способа прогнозирования тяжести течения COVID-19.

Сущностью изобретения является то, что в пробе венозной крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяют полиморфизм генов системы гемостаза и при наличии мутации G20210A в гене FII, и/или отсутствии полиморфизма G10976A в гене FVII, и/или наличии полиморфизма С807Т в гене интегрина альфа-2 (Gp1a), выявляют высокую степень риска тяжелого течения COVID-19 вплоть до летального исхода и в сочетании с лечебными препаратами назначают одновременно в лечебной дозе антикоагулянты в период госпитализации и затем - в профилактической дозе дополнительно в течение 1-го месяца в амбулаторных условиях.

Технический результат: использование способа позволяет в кратчайшие сроки спрогнозировать тяжесть течения COVID-19, провести эскалацию антикоагулянтной терапии и, тем самым, уменьшить выраженность иммунотромбоза и предупредить неблагоприятный исход болезни.

Для доказательства достоверности предлагаемого способа проведен анализ данных 102 больных COVID-19, у которых определяли носительство протромбогенных мутаций и полиморфизмов методом ПЦР в ООО КДЛ ДОМОДЕДОВО-ТЕСТ (г. Москва). Всех больных в исследовании разделили на 3 группы: с крайне тяжелым (Группа 1, n=27), тяжелым (Группа 2, n=53), легким и бессимптомным (Группа 3, n=22) течением COVID-19, отвечавших критериям: возраст от 18 лет и старше, добровольное информированное согласие на участие в исследовании, подтвержденный диагноз COVID-19. В спектр диагностики входили аллельные варианты генов, ассоциированные с дисфункцией тромбоцитарного (Gp1a и Gp3a) и плазменного (FGB, FII, FV, FVII, F13A1, PAI-I) звеньев гемостаза. Полученные данные сравнивали с результатами крупнейшего популяционного исследования Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН на территории России в 2012 г.

В статистической обработке использовалось программное обеспечение Statistica version 12 (Stat Soft, USA). Характер распределения в совокупности по выборочным данным оценивали по Лиллиефорсу. При распределениях, не являющихся нормальными, использовали медиану и интерквартильный размах (в виде 25% и 75% процентилей) (Me [CI]). Для сравнения выборок с категориальными переменными использовали анализ таблиц сопряженности, критерий χ2 Пирсона с поправкой Йейтса, рассчитывали относительный риск с 95% доверительным интервалом RR[CI]. Статистически значимыми считались различия данных при р<0,05.

Для COVID-19 наиболее интересным оказался полиморфизм по редкому аллелю А в гене проконвертина FVII, который способен резко снижать риск тромбообразования при повреждении эндотелия. Варианты «защитного» генотипа G/A и А/А у больных с крайне тяжелым течением COVID-19 встречались в 10 раз реже, чем у пациентов с легким и бессимптомным течением. У всех (100%) умерших пациентов не было протективного полиморфизма в гене FVII.

Статистически значимую разницу удалось установить в носительстве аллеля риска Т гена интегрина альфа-2 или тромбоцитарного гликопротеина I-альфа Gp1a (rs1126643) у больных с крайне тяжелым и легким течением COVID-19. Частота полиморфизма по редкому аллелю у пациентов с крайней степенью тяжести болезни значимо отличалась и от контроля (таб. 1). У погибших больных генотипы ТТ/СТ, при которых увеличивается скорость фиксации тромбоцитов к сосудистой стенке, встречались в 100%) случаев.

Мутация высокого тромбогенного риска в гене протромбина (FII) G20210A зарегистрирована в нашем исследовании только у пациентов тяжелого и крайне тяжелого течения COVID-19 (таб. 1), являясь значимым фактором риска тяжести болезни RR=1,78 [1,40-2,28].

Еще одна мутация высокого тромбогенного риска или мутация Лейдена (генотипы G/A и А/А) в гене проакцелерина FV (rs 6025) при тяжелом течении COVID-19 отмечалась статистически значимо чаще, чем в контроле (таб. 1). Мутация Лейдена зарегистрирована у двух погибших больных молодого возраста.

Однако следует отметить, что гетерозиготное носительство аллели риска G/A встречалось и у пациентов с легкой формой COVID-19 (9,1%). Поэтому значимость мутации Лейдена в определении тяжести и исхода COVID-19 оказалась меньше, чем полиморфизмы в генах предыдущих факторов (FVII, Gp1a и FII).

Относительный риск (RR) развития тяжелого течения и летального исхода при полиморфизмах других генов (таб.1) не был статистически значимым.

Способ осуществляют следующим образом. При поступлении больного в стационар, подтверждают диагноз «COVID-19», затем проводят анализ венозной крови методом полимеразной цепной реакции на определение аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза (FGB, FII, FV, FVII, F13A1, PAI-I,Gp1a и Gp3a).

В качестве примеров приводим следующие наблюдения:

Пример 1.

Пациент К., 67 лет, поступил в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 04.11.21 на 8-й день болезни. Заболевание началось с кашля и повышения температуры до 38,0°С. На 8-й день болезни появилось ощущение недостатка воздуха, вызвал СП, госпитализирован. При поступлении состояние средней тяжести. Температура тела - 37,9°С. Больной в сознании, адекватен. При объективном осмотре: кожные покровы влажные, розоватого цвета. ЧДД - 17/мин. АД 120/80 мм рт.ст., ЧСС - 85/мин, SpO2=94% на атмосферном воздухе. Была проведена КТ грудной клетки, процент поражения легких составил 20% (КТ 1). Пальпация живота безболезненна, симптомов раздражения брюшины нет. Менингеальных знаков и очаговой симптоматики не выявлено. Диагноз: COVID-19, среднетяжелое течение. В лабораторных анализах при поступлении (табл. 2):

Результаты анализа венозной крови методом полимеразной цепной реакции на определение аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза:

Как видно из таблицы 3, у данного пациента отсутствует протективный полиморфизм по FVII 10976 G→А, имеется гомозиготная мутация по FII, что является предикторами крайне тяжелого течения COVID-19. За время нахождения в стационаре состояние пациента постепенно ухудшалось: нарастала одышка (ЧДД=26), снизилась сатурация SpO2=92% в покое и 89%о при любой физической нагрузке, была начата масочная оксигенотерапия со скоростью 12 л/мин. Медикаментозное лечение: противовирусный препарат (фавипиравир), ГКС (дексаметазон, пульмикорт), профилактическая доза антикоагулянта (гепарин-15 тыс. Ед/сут). Несмотря на проводимое лечение, состояние пациента продолжало ухудшаться, больной был переведен в ОРИТ, где респираторная поддержка осуществлялась в виде интраназальной высокопоточной оксигенотерапии, на повторном КТ было выявлено 80% поражения легочной ткани (КТ4), произошло ухудшение всех лабораторных показателей (таблица 4). На 20-й день болезни пациент был переведен на инвазивную ИВЛ и на 21-й день скончался. На вскрытии обнаружили тромбы в легочной артерии, тромбоваскулит и тромб размером до 9 см в правом предсердии, приведшие к летальному исходу. Если бы при поступлении в стационар, несмотря на низкий уровень опасности по шкалам NEWS и SOFA, опираясь на определенную мутацию высокого тромбогенного риска, была начата антикоагуляционная терапия в лечебных дозах, летального исхода, вероятно, можно было бы избежать.

Пример 2.

Пациент Е., 76 лет, поступил в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 09.11.21 на 8-й день болезни. Заболевание началось с повышения температуры до 37,8°С, слабости и тошноты. На 7-й день болезни появились боль в груди, кашель и невозможность сделать глубокий вдох. При поступлении состояние средней тяжести, 2 балла по NEWS. Температура тела - 37,6°С.Больной в сознании, адекватен. Цианоза нет. ЧДД - 18/мин. АД 125/82 мм рт.ст., ЧСС - 83/мин, SpO2=94% на атмосферном воздухе. Была проведена КТ грудной клетки, процент поражения легких составил 32% (КТ 2). Диагноз: COVID-19, среднетяжелое течение, в респираторной поддержке не нуждается. В лабораторных анализах при поступлении (таблица 5):

Результаты анализа венозной крови методом полимеразной цепной реакции на определение аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза представлены в таблице 6:

Как видно из таблицы 6, у данного пациента отсутствует протективный полиморфизм по FVII 10976 G→А, имеется полиморфизм по ITGA2 и гетерозиготная мутация по FII, что является предикторами крайне тяжелого течения COVID-19 вплоть до летального исхода. После определения мутаций высокого тромбогенного риска было принято решение начать антикоагуляционную терапию в лечебных дозах. Пациент, помимо уже назначенного медикаментозного лечения, получал гепарин в виде непрерывной в/в инфузии 50 тыс. ЕД в сутки. Благодаря своевременной мощной антикоагулянтной терапии тромботических осложнений удалось избежать, и 20.11.2021 пациент Е. был благополучно выписан из больницы с предписанием продолжить принимать антикоагулянтные препараты в течение 1-го месяца (ривароксабан в дозе 10 мг в сутки).

Пример 3.

Пациентка Л., 62 года, поступила в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 05.12.21 на 9-й день болезни в среднетяжелом состоянии с оценкой 2 балла по NEWS. На КТ - 24% поражения легочной ткани. В лабораторных анализах при поступлении (таблица 7) не было предикторов тяжелого течения болезни: выраженной лимфопении, тромбоцитопении, лейкоцитоза, CPB>5-7N, гипоальбуминемии, значимого повышения ЛДГ и D-димера.

Однако больная прогрессивно ухудшалась, через 3 дня стационарного лечения КТ показала 78% поражения легких (КТ-4), больная переведена в ОРИТ на неинвазивную ИВЛ, только тогда была начата антикоагуляция лечебными дозами низкомолекулярного гепарина (Эноксапарин), больная выписана с улучшением, проведя в стационаре 33 дня.

Ретроспективно оценены результаты анализа венозной крови методом ПЦР на определение аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза, которые показали отсутствие протективного полиморфизма по FVII 10976 G→А и гетерозиготную мутацию по FII, что являлось единственным предиктором тяжелого течения COVID-19 у данной пациентки (таблица 8).

Пример 4.

Пациент М., 52 года, поступил в тяжелом состоянии сразу в ОРИТ. В лабораторных анализах при поступлении (таблица 9):

Кроме того, у пациента отсутствует протективный полиморфизм по FVII 10976 G→А и есть полиморфизм по ITGA2, что является предикторами тяжелого течения COVID-19 (таблица 10). После определения мутации высокого тромбогенного риска было принято решение начать антикоагуляционную терапию в лечебных дозах. Пациент, помимо уже назначенного медикаментозного лечения получал эноксапарин п/к по 40 мг два раза в сутки. Благодаря своевременной антикоагулянтной терапии в лечебной дозе тромботических осложнений удалось избежать и 07.11.2021 пациент М. был благополучно выписан из больницы с предписанием продолжить принимать антикоагулянтные препараты в течение 1-го месяца (эликвис 2,5 два раза в день).

Пример 5.

Пациентка С, 70 лет, поступила в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 15.11.21 на 6-й день болезни в среднетяжелом состоянии: ЧДД - 18/мин. АД 121/82 мм рт.ст., ЧСС - 85/мин, Sp02=94% на атмосферном воздухе. Была проведена КТ грудной клетки, процент поражения легких составил 28% (КТ 2). Диагноз: COVID-19. В лабораторных анализах при поступлении отсутствовали предикторы тяжести заболевания (таблица 11). Однако в дальнейшем произошло лавинообразное ухудшение состояния.

Результат определения мутаций протромбогенного риска показал наличие гетерозиготной мутации по FII и полиморфизм по ITGA2, что является предикторами тяжелого течения COVID-19 (таблица 12). После определения мутации высокого тромбогенного риска было принято решение начать антикоагуляционную терапию в лечебных дозах (назначен гепарин в/в 40 тыс. ME в сутки). Благодаря такой тактике тромботических осложнений удалось избежать и 30.11.2021 пациентка С. была благополучно выписана из больницы с рекомендацией продолжить принимать пероральные антикоагулянтные препараты в течение 1-го месяца в профилактической дозе.

Пример 6.

Пациент А., 65 лет, поступил в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 07.12.21 на 10-й день болезни. Заболевание началось с кашля и повышения температуры до 39,8°С.На 10-й день болезни появились выраженная одышка в покое, ощущение недостатка воздуха, вызвал СП, госпитализирован в тяжелом состоянии в ОРИТ. В результате определения гомозиготной мутации по FII высокого тромбогенного риска (таблица 13) начата интенсивная антикоагулянтная терапия в лечебных дозах. Пациент, помимо уже назначенного медикаментозного лечения: противовирусный препарат (фавипиравир), ГКС (дексаметазон, пульмикорт), получал парнапарин и/к по 0,6 мл два раза в сутки. Благодаря своевременной антикоагулянтной терапии тромботических осложнений удалось избежать, и 15.12.2021 пациент А. был благополучно выписан из больницы с предписанием продолжить принимать антикоагулянтные препараты в течение 1-го месяца (ривароксабан 10 мг/сутки).

Пример 7.

Пациент Д., 69 лет, поступил в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 18.12.21 на 6-й день болезни в состоянии средней тяжести. Температура тела - 37,8°С. Больной в сознании, адекватен. Цианоза нет.ЧДД- 18/мин. АД 126/82 мм рт.ст., ЧСС -80/мин, SpO2=94% на атмосферном воздухе. Была проведена КТ грудной клетки, процент поражения легких составил 21% (КТ 1). Диагноз: COVID-19, среднетяжелое течение. Несмотря на упреждающую противовоспалительную терапию, состояние прогрессивно ухудшалось, появилась и нарастала дыхательная недостаточность, а на 14-е сутки пребывания в стационаре произошел тромбоз правой подключичной вены, больная было проведено успешное оперативное вмешательство и антикоагулянтная терапия в лечебной дозе. Ретроспективно оценили результаты анализа венозной крови методом полимеразной цепной реакции на определение аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза:

Как видно из таблицы 14, у данного пациента отсутствует протективный полиморфизм по FVII 10976 G→А, что является предикторами тяжелого течения COVID-19 и, в данном случае, причиной тромбоза подключичной вены.

Пример 8.

Пациентка С, 43 года, поступила в ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара 03.10.21 переводом из Лабинской ЦРБ на 8-й день болезни в состоянии крайней степени тяжести за счет дыхательной недостаточности IIст. Поражение легких носило субтотальный характер (86%). Начата неинвазивная ИВЛ в условиях ОРИТ.

При анализе полученных данных (таблица 15) выявлен полиморфизм по ITGA2, что является предикторами тяжелого течения COVID-19.

После этого, помимо уже назначенного медикаментозного лечения: противовирусный препарат (ремдесивир), ГКС (дексаметазон), ингибитора рецептора ИЛ-6 (тоцилизумаб) пациентке назначен гепарин в/в 45 тыс. ME в сутки. Несмотря на крайнюю степень тяжесть, наличие коморбидного фона (ожирение IIст.) пациентке удалось выжить. При выписке назначено продолжение терапии пероральными антикоагулянтами в течение месяца в профилактической дозировке.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной патологии, реаниматологии, лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования высокой степени риска тяжелого течения COVID-19. В пробе венозной крови выявляют полиморфизм генов системы гемостаза методом полимеразной цепной реакции. При наличии гомо- и гетерозиготной мутации: генотипы АА и AG G20210A гена FII и/или отсутствия полиморфизма G10976А гена FVII - генотип GG выявляют высокую степень риска тяжелого течения COVID-19. Способ позволяет в кратчайшие сроки спрогнозировать тяжесть течения COVID-19 и провести эскалацию антикоагулянтной терапии за счет определения наличия мутации G20210A гена FII и/или отсутствия полиморфизма G10976А гена FVII. 15 табл., 8 пр.

Способ прогнозирования высокой степени риска тяжелого течения COVID-19, включающий исследование пробы венозной крови, отличающийся тем, что в пробе выявляют полиморфизм генов системы гемостаза методом полимеразной цепной реакции и при наличии гомо- и гетерозиготной мутации: генотипы АА и AG G20210A гена FII и/или отсутствия полиморфизма G10976А гена FVII - генотип GG выявляют высокую степень риска тяжелого течения COVID-19.