УСТОЙЧИВЫЕ К РИТУКСИМАБУ ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/705 C07K16/28 C12N5/783 A61K35/17 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/839455, поданной 26 апреля 2019 года, и предварительной заявки на патент США №63/005041, поданной 3 апреля 2020 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[002] Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), содержащим антигенсвязывающую молекулу, которая связывается с CD19, полинуклеотидам, кодирующим их, и способам лечения рака у пациента с их использованием.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[003] Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 21 апреля 2020 года, называется АТ-028_03WO_SL.txt и имеет размер 81460 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Адоптивный перенос иммунных клеток, генетически модифицированных для распознавания антигенов, ассоциированных со злокачественными новообразованиями, является многообещающим новым подходом к лечению рака (см., например, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Иммунные клетки могут быть генетически модифицированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), слитых белков, состоящих из фрагмента, распознающего антиген CD19, и доменов активации Т-клеток (см., например, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993) и Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)). Иммунные клетки, которые содержат CAR, например, Т-клетки с CAR (CAR-T), сконструированы с приданием им специфичности к антигену при сохранении или усилении их способности распознавать и уничтожать клетку-мишень.

[005] Существует необходимость в видах лечения рака и в частности злокачественных опухолей, включающих аберрантную экспрессию CD19. В данном документе предусмотрены способы и композиции, удовлетворяющие эту потребность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[006] В данном документе предусмотрены химерные антигенные рецепторы (CAR), которые содержат домен, связывающийся с антигеном CD19, который специфически связывается с CD19; полинуклеотиды, кодирующие такие CAR; и иммунные клетки, экспрессирующие такие CAR, специфические по отношению к CD19, например Т-клетки с CAR. Также предусмотрены способы получения и применения таких CAR, специфических по отношению к CD19, и иммунных клеток, содержащих такие CAR, специфические по отношению к CD19.

[007] В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий химерный антигенный рецептор для CD19 (CAR), который на по меньшей мере 70% идентичен с SEQ ID NO: 9, где полипептид не содержит участок связывания ритуксимаба, и где полинуклеотид содержит короткий промотор EF1a, который способен экспрессировать химерный антигенный рецептор для CD19 (CAR) в Т-клетке млекопитающего.

[008] В некоторых вариантах осуществления короткий промотор EF1a не содержит интронную последовательность в пределах последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления интрон содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 39.

[009] В некоторых вариантах осуществления промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 16.

[010] В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой полноразмерный промотор EF1a, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15.

[011] В некоторых вариантах осуществления промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15, и полинуклеотид кодирует полипептид, который на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с любой из SEQ ID NO: 8-14.

[012] В некоторых вариантах осуществления полипептид дополнительно содержит переключатель безопасности.

[013] В некоторых вариантах осуществления переключатель безопасности связан с CAR к CD19 с использованием линкерного пептида.

[014] В некоторых вариантах осуществления переключатель безопасности связан с CAR для CD19 с использованием линкера Т2А.

[015] В некоторых вариантах осуществления переключатель безопасности содержит участок связывания антитела.

[016] В некоторых вариантах осуществления переключатель безопасности содержит мутированный мимотоп CD20.

[017] В некоторых вариантах осуществления полипептид дополнительно содержит шарнирный/трансмембранный домен CD8.

[018] В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит эпитоп CD34.

[019] В некоторых вариантах осуществления эпитоп CD34 представляет собой эпитоп QBEND-10.

[020] В некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентична любой из SEQ ID NO: 1-7.

[021] В некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид, который на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с любой из SEQ ID NO: 8-14.

[022] В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен вектор, содержащий выделенный полинуклеотид, описанный в данном документе.

[023] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой ретровирусный вектор, ДНК-вектор, плазмиду, РНК-вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса, лентивирусный вектор или любую их комбинацию.

[024] В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая выделенный полинуклеотид, описанный в данном документе.

[025] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентична с SEQ ID NO: 3.

[026] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая полинуклеотид, который на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с лентивирусной конструкцией CAR для CD19 v1.2, v1.3, v1.4, v1.5 или v1.6, как показано в таблице 1.

[027] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая полинуклеотид, который на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с лентивирусной конструкцией CAR для CD19 v1.2, как показано в таблице 1.

[028] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая полинуклеотид, который кодирует полипептид, который на по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, с сигнальной последовательностью или без нее.

[029] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, функционирующую с помощью короткого промотора EF1a, содержащего нуклеиновую кислоту под SEQ ID NO: 16.

[030] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, содержащая полинуклеотид, который кодирует полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10, с сигнальной последовательностью или без нее, функционирующую с помощью короткого промотора EF1a, содержащего нуклеиновую кислоту под SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления промотор не содержит первый интрон гена EF1a.

[031] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка не содержит мимотоп ритуксимаба.

[032] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит полинуклеотид, содержащий лентивирусную конструкцию CAR к CD19 v1.2, как представлено на ФИГ. 1 (также может называться ALLO-501А).

[033] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит вектор, описанный в данном документе.

[034] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку, лимфоцит, инфильтрирующий опухоль (TIL), NK-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку или NK-T-клетку.

[035] В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой аутологичную Т-клетку.

[036] В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой аллогенную Т-клетку.

[037] В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена сконструированная иммунная клетка, описанная в данном документе, где клетка является устойчивой к ритуксимабу.

[038] В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая сконструированную иммунную клетку, описанную в данном документе.

[039] В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту сконструированной иммунной клетки, описанной в данном документе, или фармацевтической композиции, описанной в данном документе.

[040] В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой неходжкинскую лимфому (NHL).

[041] В некоторых вариантах осуществления субъект получал лечение или в настоящее время получает лечение ритуксимабом.

[042] В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрено изделие, содержащее сконструированную иммунную клетку или фармацевтическую композицию, содержащую сконструированную иммунную клетку, экспрессирующую химерные антигенные рецепторы, описанные в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[043] На ФИГ. 1 схематически показаны устойчивые к ритуксимабу химерные антигенные рецепторы CD19.

[044] На ФИГ. 2А и 2В показаны графики проточной цитометрии, демонстрирующие экспрессию CAR в день 5 из пан-Т-клеток, трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR. На ФИГ. 2А показана экспрессия CAR в клетках от доноров 541 и 604. На ФИГ. 2В показана экспрессия CAR и CD34 в клетках от донора 410. Подобный профиль наблюдали у донора 2593 (данные не показаны).

[045] На ФИГ. 3 показаны нормализованное размножение клеток и конечная экспрессия CAR у всех четырех доноров в день 13.

[046] На ФИГ. 4A-4D показаны размножение клеток и экспрессия CAR с течением времени пан-Т-клеток от доноров 541 (ФИГ. 4А), 604 (ФИГ. 4В), 410 (ФИГ. 4С), 2593 (ФИГ. 4D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR.

[047] На ФИГ. 5A-5D показаны соотношения CD4/CD8 в дни 5, 9 и 13 пан-Т-клеток от доноров 541 (ФИГ. 5А), 604 (ФИГ. 5В), 410 (ФИГ. 5С), 2593 (ФИГ. 5D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR.

[048] На ФИГ. 6A-6D показаны фенотип и активация в день 9 пан-Т-клеток от доноров 541 (ФИГ. 6А), 604 (ФИГ. 6В), 410 (ФИГ. 6С), 2593 (ФИГ. 6D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR.

[049] На ФИГ. 7 показаны фенотип, % активации CD8+ и анергия, измеренные с использованием среднего значения окрашивания TIM3 и PD1 для всех четырех доноров в день 9.

[050] На ФИГ. 8A-8D показаны фенотип и активация в день 13 пан-Т-клеток от доноров 541 (ФИГ. 8А), 604 (ФИГ. 8В), 410 (ФИГ. 8С), 2593 (ФИГ. 8D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR.

[051] На ФИГ. 9 показаны фенотип, % активации CD8+ и анергия, измеренные с использованием окрашивания TIM3 и PD1 для всех четырех доноров в день 13.

[052] На ФИГ. 10 показаны средние краткосрочные (24 ч.) значения анализа гибели клеток с использованием клеток Раджи в качестве клеток-мишеней для каждой конструкции CAR.

[053] На ФИГ. 11A-11D показаны средние долговременные значения анализа гибели клеток с использованием клеток A549-CD19+ в качестве клеток-мишеней с Е:Т, составляющим 8:1 (ФИГ. 11А), 4:1 (ФИГ. 11В), 2:1 (ФИГ. 11С) и 1:1 (ФИГ. 11D) для каждой конструкции CAR.

[054] На ФИГ. 12 показан уровень в % CAR+ Т-клеток в день 5 после трансдукции пан-Т-клеток последовательными разбавлениями лентивирусных препаратов устойчивых к ритуксимабу лентивирусных конструкций (ALLO-501v1.2 и v1.3) или устойчивой к ритуксимабу лентивирусной конструкции (ALLO-501v1.0).

[055] На ФИГ. 13А 13В показана in vivo эффективность пан-Т-клеток от доноров 541 (ФИГ. 13А) и 604 (ФИГ. 13В), трансдуцированных устойчивым к ритуксимабу экспрессионным вектором CAR (ALLO-501v1.2) или чувствительным к ритуксимабу экспрессионным вектором CAR (ALLO-501v1.0) при тестировании в мышиной модели опухоли NSG, несущей клетки Раджи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[056] Терапия с помощью химерного антигенного рецептора (CAR) является многообещающим подходом в лечении рака. Конструкция CAR, описанная в данном документе как v1.0, представляет собой иллюстративный CAR для CD19, который экспрессирует синтетический пептид RQR8, который служит в качестве переключателя безопасности. RQR8 содержит два ритуксимаб-связывающих мимотопа. В случае побочного явления пациенты могут получать лечение ритуксимабом для снижения уровней циркулирующего v1.0 для CD19. Ритуксимаб также используется в качестве стандарта лечения при некоторых признаках неходжкинской лимфомы (NHL) и вводится в высоких дозах. В связи с длительным периодом полужизни ритуксимаба v1.0 для CD19 нельзя вводить пациентам, пока уровень циркулирующего ритуксимаба не достигнет низкой концентрации. Терапия с помощью устойчивого к ритуксимабу CAR к CD19 дала бы возможность пациентам, которые ранее получали лечение ритуксимабом, получать терапию с помощью CAR-T непосредственно, без необходимости ждать снижения уровней ритуксимаба и без необходимости подвергать пациентов аферезу. В данном документе предусмотрены химерные антигенные рецепторы CD19 (CAR), которые являются устойчивыми к CD20, связывающему антитело ритуксимаб. Новые конструкции CAR сконструированы так, чтобы исключить связывание с ритуксимабом, сохраняя при этом экспрессию и активность CAR.

I. Химерные антигенные рецепторы

[057] Как используется в данном документе, химерные антигенные рецепторы (CAR) представляют собой белки, которые специфически распознают целевые антигены (например, целевые антигены на раковых клетках). При связывании с целевым антигеном CAR может активировать иммунную клетку, чтобы атаковать и разрушить клетку, несущую этот антиген (например, раковую клетку). CAR могут также включать костимуляторные или сигнальные домены для повышения их эффективности. См. Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797, Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011) и Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016); патенты США №№7741465 и 6319494.

[058] Химерные антигенные рецепторы, описанные в данном документе, содержат внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, где внеклеточный домен содержит домен, связывающийся с антигеном CD19, который специфически связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления специфический по отношению к CD19 CAR содержит следующие элементы от 5'- к 3'-концу: сигнальную последовательность, домен, связывающийся с антигеном CD19 (например, scFv, полученный из 4G7), шарнирную и трансмембранную области и один или более из последующих сигнальных доменов. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающийся с антителом, связывается с CD19 для лечения гемобластоза, ассоциированного с экспрессией CD19.

[059] Часть scFv химерного антигенного рецептора (CAR), используемая в аллогенном CAR для CD19 v1.0, получена из клона антитела мыши 4G7 к CD19 человека. 4G7 представляет собой моноклональное антитело к CD19, которое распознает CD19. Одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), образованные из 4G7, содержат нацеливающий компонент некоторых химерных антигенных рецепторов (CAR) (см. WO 2014184143 A1). В некоторых вариантах осуществления scFv, полученный из моноклонального антитела к CD19 4G7, содержит часть тяжелой гамма-цепи 1 иммуноглобулина моноклонального антитела к CD19 4G7 (GenBank: CAD88275.1; SEQ ID NO: 17), и часть легкой каппа-цепи иммуноглобулина моноклонального антитела к CD19 4G7 (GenBank: CAD88204.1; SEQ ID NO: 35), связанные вместе посредством гибкого линкера. (Peipp М., D. Saul, et al., 2004. Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications. J. Immunol. Methods 285: 265-280). В некоторых вариантах осуществления scFv содержит вариабельные фрагменты тяжелой гамма-цепи 1 иммуноглобулина моноклонального антитела к CD19 4G7, и вариабельные фрагменты легкой каппа-цепи иммуноглобулина моноклонального антитела к CD19 4G7, связанные вместе посредством гибкого линкера.

[060] Тяжелая гамма-цепь 1 иммуноглобулина моноклонального антитела к CD19 4G7 (сигнальная последовательность подчеркнута)

[062] Легкая каппа-цепь иммуноглобулина моноклонального антитела к CD19 4G7 (сигнальная последовательность подчеркнута)

[064] В некоторых вариантах осуществления scFv содержит часть аминокислотных последовательностей под SEQ ID NO: 17 и/или SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления scFv характеризуется по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с вариабельной областью из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 34 и/или SEQ ID NO: 35. В данном документе раскрыты антигенсвязывающие молекулы, в том числе антитела, которые специфически связываются с scFv для CD19, полученным из 4G7, а также молекулы, содержащие эти последовательности, и клетки, представляющие такие молекулы. Гуманизированные формы антигенсвязывающих молекул также являются аспектом настоящего изобретения. Также раскрыты пути применения и использования этих антигенсвязывающих молекул.

а. Антигенсвязывающий домен

[065] Как обсуждалось выше, описанные в данном документе CAR для CD19 содержат антигенсвязывающий домен. Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий домен» означает любой полипептид, который связывает конкретный целевой антиген, например, конкретный целевой антиген может представлять собой белок CD19 или его фрагмент В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с антигеном CD19 на опухолевой клетке. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с антигеном CD19 на клетке, вовлеченной в гиперпролиферативное заболевание.

[066] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную тяжелую цепь, вариабельную легкую цепь и/или одну или более CDR. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий легкие цепи CDR CDR1, CDR2 и CDR3 и тяжелые цепи CDR CDR1, CDR2 и CDR3. Варианты антигенсвязывающих доменов (например, варианты CDR VH и/или VL) также находятся в пределах объема настоящего изобретения, например, каждая из вариабельной легкой и/или вариабельной тяжелой цепей характеризуется по меньшей мере 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99% или более чем 99% идентичностью с аминокислотными последовательностями последовательностей антигенсвязывающего домена, описанных в данном документе. В некоторых случаях такие молекулы включают по меньшей мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, тогда как в других случаях вариантные формы содержат две вариабельные легкие цепи и две вариабельные тяжелые цепи (или их подчасти). Специалист в данной области техники сможет определить подходящие варианты антигенсвязывающих доменов, изложенных в данном документе, с использованием хорошо известных методик. В определенных вариантах осуществления специалист в данной области может идентифицировать подходящие области молекулы, которые можно изменить без нарушения активности путем нацеливания на области, которые, как считается, не являются важными для активности.

[067] В определенных вариантах осуществления полипептидная структура антигенсвязывающих доменов основана на антителах, в том числе без ограничения моноклональных антителах, биспецифических антителах, мини-телах, доменных антителах, синтетических антителах (иногда называемых в данном документе «миметиками антител»), химерных антителах, гуманизированных антителах, человеческих антителах, слитых антителах (иногда называемых в данном документе «конъюгатами антител») и их фрагментах соответственно. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит авимеры или состоит из них.

[068] Домен, связывающийся с антигеном CD19, считается «селективным», когда он связывается с одной мишенью более прочно, чем со второй мишенью. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающийся с антигеном CD19, представляет собой scFv.

[069] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим любой из химерных антигенных рецепторов CD19 (CAR), описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим CAR к CD19, описанным в таблице 1. Также в данном документе предусмотрены векторы, содержащие полинуклеотиды, и способы их получения.

b. Переключатели безопасности и эпитопы, специфические в отношении моноклонального антитела

Переключатели безопасности

[070] Следует принимать во внимание, что нежелательные явления могут быть минимизированы путем трансдуцирования иммунных клеток (содержащих один или более CAR) с «суицидальным» геном, помимо ритуксимаб-связывающего эпитопа. Также необходимо включать в иммунные клетки индуцибельный переключатель «включения» или «ускорения». Подходящие методики включают использование индуцибельной каспазы-9 (заявка на патент США №2011/0286980) или тимидинкиназы до, после или одновременно с трансдукцией клеток конструкцией CAR по настоящему изобретению. Дополнительные способы введения «суицидальных» генов и/или переключателей «включения» включают использование TALENS, цинковых пальцев, RNAi, siRNA, shRNA, антисмысловую технологию и другие методики, известные из уровня техники.

[071] В соответствии с настоящим изобретением в данный документ могут быть включены дополнительные переключатели включения-выключения или другие типы методик контролируемого переключения. В этих методиках можно реализовать использование доменов димеризации и необязательных активаторов димеризации таких доменов. Эти методики включают, например, методики, описанные Wu et al., Science 2014 350 (6258), с использованием систем димеризации FKBP/Rapalog в определенных клетках, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме. Дополнительная технология димеризации описана, например, в Fegan et al. Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336, а также в патентах США №№5830462, 5834266, 5869337 и 6165787, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме. Дополнительные пары димеризации могут включать циклоспорин-А/рецептор циклофилина, эстроген/рецептор эстрогена (необязательно с использованием тамоксифена), глюкокортикоиды/рецептор глюкокортикоида, тетрациклин/рецептор тетрациклина, витамин D/рецептор витамина D. Дополнительные примеры технологии димеризации можно найти, например, в WO 2014/127261, WO 2015/090229, US 2014/0286987, US 2015/0266973, US 2016/0046700, патенте США №8486693, US 2014/0171649 и US 2012/0130076, содержания которых дополнительно включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме.

[072] В некоторых вариантах осуществления CAR-иммунная клетка (например, Т-клетка с CAR) по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, кодирующий «суицидальный» полипептид, который характеризуется недостаточным связыванием ритуксимаба. В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» пептид содержит мутированную последовательность RQR8. См., например, WO 2013153391 А, который тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте. В CAR-иммунной клетке (например, Т-клетке с CAR), содержащей полинуклеотид, «суицидальный» полипептид экспрессируется на поверхности CAR-иммунной клетки (например, Т-клетки с CAR). В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 19.

[073] «Суицидальный» полипептид также может содержать сигнальный пептид на аминоконце, например, MGTSLLCWMALCLLGADHADA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 21, которая включает в себя сигнальную последовательность SEQ ID NO: 20.

[074] В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» пептид содержит аминокислотную последовательность, которая содержит один или более мутированных остатков, вставленных остатков или удаленных остатков, которые уменьшают или исключают связывание с ритуксимабом.

[075] Если «суицидальный» полипептид экспрессируется на поверхности CAR-иммунной клетки (например, Т-клетки с CAR), то связывание антитела с эпитопами «суицидального» гена полипептида вызывает лизис клетки. Делеция CAR-иммунной клетки, специфической по отношению к CD19 (например, Т-клетки с CAR), может происходить in vivo, например, при введении «суицидального» средства пациенту. Решение о делеции перенесенных клеток может быть обусловлено выявлением у пациента нежелательных эффектов, связанных с перенесенными клетками, таких как, например, выявление неприемлемых уровней токсичности. Используемый в данном документе термин «суицидальное средство» относится к молекуле, которая связывается с иммунной клеткой с CAR и вызывает лизис CAR-экспрессирующей иммунной клетки.

[076] В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид включен в конструкцию CAR. В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид не является частью конструкции CAR CD19.

[077] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен любого из CAR, специфических по отношению к CD19, раскрытых в данном документе, может содержать один или более эпитопов, специфических по отношению к (т.е. конкретно распознаваемых) моноклональному антителу. Эти эпитопы также называются в данном документе mAb-специфическими эпитопами. Иллюстративные mAb-специфические эпитопы раскрыты в международной патентной публикации № WO 2016/120216, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В таких вариантах осуществления внеклеточный домен CAR содержит антигенсвязывающие домены, которые специфически связываются с CD19, и один или более эпитопов, которые связываются с одним или более моноклональными антителами (mAb). CAR, содержащие mAb-специфические эпитопы, могут быть одноцепочечными или многоцепочечными.

[078] Включение эпитопов, специфических в отношении моноклональных антител, во внеклеточный домен CAR, описанный в данном документе, позволяет сортировать и истощать сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR. В некоторых вариантах осуществления эта особенность также способствует восстановлению эндогенных С019-экспрессирующих клеток, которые были истощены путем введения сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления возможность истощения обеспечивает переключатель безопасности в случае вредных эффектов, например, при введении субъекту.

[079] Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу сортировки и/или истощения сконструированных иммунных клеток, несущих CAR, содержащих mAb-специфические эпитопы, и способу обеспечения восстановления эндогенных CD19-экспрессирующих клеток.

[080] Несколько пар эпитоп-моноклональное антитело можно использовать для создания CAR, содержащих эпитопы, специфические по отношению к моноклональным антителам; в частности те, которые уже одобрены для медицинского применения или применения в изготовлении в соответствии с GMP, такие как эпитоп CD34/QBEND-10, в качестве неограничивающего примера.

[081] Настоящее изобретение также охватывает способы сортировки сконструированных иммунных клеток, имеющих CAR, специфические по отношению к CD19, и экспрессирующих mAb-специфический(-ие) эпитоп(-ы), и терапевтические способы, при которых активация сконструированных иммунных клеток, имеющих эти CAR, модулируется путем истощения клеток с использованием антитела, которое нацелено на внешний лигандсвязывающий домен указанных CAR. В таблице 2 представлены иллюстративные мимотопные последовательности, которые могут быть вставлены во внеклеточные домены любого из CAR по настоящему изобретению.

[082] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность эпитопа или мимотопа, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или на 100% идентична с аминокислотными последовательностями эпитопа или мимотопа, изложенными в данном документе в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность эпитопа или мимотопа, которая не является или не содержит SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит эпитоп или мимотоп, содержащие аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30.

с. Шарнирный домен

[083] Внеклеточный домен CAR по настоящему изобретению может содержать «шарнирный» домен (или шарнирную область). Термин обычно относится к любому полипептиду, который функционирует, чтобы связать трансмембранный домен в CAR с внеклеточным антигенсвязывающим доменом в CAR. В частности, шарнирные домены можно использовать для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного антигенсвязывающего домена.

[084] Шарнирный домен может содержать не более 300 аминокислот, в некоторых вариантах осуществления от 10 до 100 аминокислот или в некоторых вариантах осуществления от 25 до 50 аминокислот. Шарнирный домен может быть получен из всех или части встречающихся в природе молекул, например, из всей или части внеклеточной области CD8, CD4, CD28, 4-1ВВ или IgG (в частности, шарнирной области IgG; следует принимать во внимание, что шарнирная область может содержать часть или всех представителей семейства иммуноглобулинов, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM или их фрагменты), или из всей или части константной области тяжелой цепи антитела. Альтернативно шарнирный домен может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в природе шарнирной последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую шарнирную последовательность. В некоторых вариантах осуществления указанный шарнирный домен является частью цепи CD8α человека (например, NP_001139345.1). В другом конкретном варианте осуществления указанные шарнирный и трансмембранный домены составляют часть цепи CD8α человека. В некоторых вариантах осуществления шарнирный домен CAR, описанных в данном документе, содержит подпоследовательность CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 или FcγRIIIα, в частности шарнирную область любого из CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 или FcγRIIIα. В некоторых вариантах осуществления шарнирный домен включает шарнир CD8α человека, шарнир IgG1 человека, шарнир IgG4 человека, PD-1 человека или FcγRIIIα человека. В некоторых вариантах осуществления CAR, раскрытые в данном документе, содержат scFv, шарнир CD8α человека и транс мембранные домены, сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1 ВВ. В таблице 3 представлены аминокислотные последовательности для иллюстративных шарниров, предусмотренных в данном документе.

[085] В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или на 100% идентична с аминокислотными последовательностями шарнирного домена, изложенными в данном документе в таблице 3.

d. Трансмембранный домен

[086] CAR по настоящему изобретению сконструированы с трансмембранным доменом, который слит с внеклеточным доменом CAR. Аналогичным образом он может быть слит с внутриклеточным доменом CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или разных поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать уровни взаимодействия с другими представителями рецепторного комплекса. В некоторых вариантах осуществления короткие линкеры могут образовывать связи между любыми или некоторыми из внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменов CAR. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит повторяющиеся последовательности глицина. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит (GGGGS)n, где n равняется 1, 2, 3, 4 или 5 (SEQ ID NO: 41).

[087] Подходящие трансмембранные домены для CAR, раскрытые в данном документе, обладают способностью (а) экспрессироваться на поверхности иммунной клетки, такой как, например, без ограничения лимфоцит, такой как хелперная (T_h) Т-клетка, цитотоксическая (Т_с) Т-клетка, регуляторная (T_reg) Т-клетка или естественные киллерные (NK) клетки, и/или (b) взаимодействовать с внеклеточным антигенсвязывающий доменом и внутриклеточным сигнальным доменом для управления клеточным ответом иммунной клетки против клетки-мишени.

[088] Трансмембранный домен может быть получен либо из природного, либо из синтетического источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка.

[089] Трансмембранные области, в частности применимые в настоящем изобретении, могут быть получены (содержаться или соответствовать им) из CD28, ОХ-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка-1 запрограммированной гибели клетки (PD-1), индуцибельного Т-клеточного костимулятора (ICOS), функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС 1 класса, белков рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегринов, сигнальных активирующих лимфоцит молекул (белков SLAM), активирующих NK-клеточных рецепторов, BTLA, Toll-подобных рецепторов, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, СD8альфа, CD8бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильные), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфически связывается с CD83, или любой их комбинации.

[090] В качестве неограничивающих примеров, трансмембранная область может быть получена из или может быть частью Т-клеточного рецептора, такого как α, β, γ или δ, полипептида, составляющего комплекс CD3, IL-2 рецептора р55 (цепи), р75 (β-цепи) или γ-цепи, цепи субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептора III, или белков CD. Альтернативно трансмембранный домен может быть синтетическим и может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления указанный трансмембранный домен получен из цепи CD8α человека {например, NP_001139345.1).

[091] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляет собой транс мембранный домен CD8α. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляет собой трансмембранный домен CD8α, содержащий аминокислотную последовательность IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD8α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления шарнир и транс мембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляют собой шарнир CD8α и трансмембранный домен, содержащий аминокислотную последовательность TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 36).

е. Внутриклеточный домен

[092] Внутриклеточный (цитоплазматический) домен CAR по настоящему изобретению может обеспечивать активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, содержащей CAR. Эффекторная функция Т-клетки, например, может относиться к цитолитической активности или хелперной активности, в том числе к секреции цитокинов.

В некоторых вариантах осуществления активирующий внутриклеточный сигнальный домен для применения в CAR может представлять собой цитоплазматические последовательности, например, без ограничения Т-клеточного рецептора и корецепторов, которые действуют совместно, инициируя передачу сигнала после соединения с антигенным рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая имеет такие же функциональные возможности.

[093] Следует принимать во внимание, что подходящие (например, активирующие) внутриклеточные домены включают без ограничения сигнальные домены, полученные (или соответствующие им) из CD28, ОХ-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка-1 запрограммированной гибели клетки (PD-1), индуцибельного Т-клеточного костимулятора (ICOS), функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС 1 класса, белков рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегринов, сигнальных активирующих лимфоцит молекул (белков SLAM), активирующих NK-клеточных рецепторов, BTLA, Toll-подобных рецепторов, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, СD8альфа, CD8бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфически связывается с CD83, или любой их комбинации.

[094] Внутриклеточные домены CAR по настоящему изобретению могут включать, помимо описанных выше активирующих доменов, костимуляторные сигнальные домены (взаимозаменяемо называемые в данном документе костимуляторными молекулами) для повышения их эффективности. Костимуляторные домены могут обеспечивать сигнал в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому активирующей молекулой, как описано в данном документе.

[095] Следует принимать во внимание, что подходящие костимуляторные домены в объеме настоящего изобретения могут быть получены (или соответствовать им) из, например, CD28, ОХ40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (альфа, бета, дельта, эпсилон, гамма, дзета), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD 137, CD 154, PD-1, ICOS, функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1 (CD1 1a/CD18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (представителя 14 суперсемейства фактора некроза опухоли; TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС 1 класса, TNFR, интегрина, сигнальной активирующей лимфоцит молекулы, BTLA, Toll-подобных рецепторов, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, СВ8альфа, CD8бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1-1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1-1a, LFA-1, ITGAM, CD1-1b, ITGAX, CD1-1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD 18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда CD83, или их фрагментов или комбинаций. Следует принимать во внимание, что дополнительные костимуляторные молекулы или их фрагменты, не перечисленные выше, попадают в объем настоящего изобретения.

[096] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован с возможностью содержания домена 41BB/CD137 самого по себе или в комбинации с любым(-и) другим(-и) требуемым(-и) внутриклеточным(и) доменом(-ами), применимым(-и) в контексте CAR по настоящему изобретению. Полная нативная аминокислотная последовательность 41BB/CD137 описана в базе данных эталонных последовательностей NCBI: NP_001552.2. Полная нативная последовательность нуклеиновой кислоты 41BB/CD137 описана в базе данных эталонных последовательностей NCBI: NM_001561.5.

[097] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован с возможностью содержания домена CD28 самого по себе или в комбинации с любым(-и) другим(-и) требуемым(-и) внутриклеточным(-и) доменом(-ами), применимым(-и) в контексте CAR по настоящему изобретению. Полная нативная аминокислотная последовательность CD28 описана в базе данных эталонных последовательностей NCBI: NP_006130.1. Полная нативная последовательность нуклеиновой кислоты CD28 описана в базе данных эталонных последовательностей NCBI: NM_006139.1.

[098] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован с возможностью содержания домена CD3 дзета самого по себе или в комбинации с любым(-и) другим(-и) требуемым(-и) внутриклеточным(-и) доменом(-ами), применимым(-и) в контексте CAR по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать сигнальный домен CD3ξ, который имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 38. Например, внутриклеточный домен CAR может содержать часть цепи CD3 дзета и часть костимуляторной сигнальной молекулы. Внутриклеточные сигнальные последовательности во внутриклеточной сигнальной части CAR по настоящему изобретению могут быть связаны друг с другом в произвольном или определенном порядке. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен конструируют с возможностью содержания активирующего домена CD3 дзета и сигнального домена CD28.

[099] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен конструируют с возможностью содержания активирующего домена CD3 дзета и сигнального домена 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ (внутриклеточный домен) содержит аминокислотную последовательность

[0100] Аминокислотная последовательность CD3 дзета может содержать SEQ ID NO: 38.

[0101] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит домен костимуляторной молекулы. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит часть костимулирующей молекулы, выбранной из группы, состоящей из фрагментов 41ВВ (GenBank: ААА53133.) и CD28 (NP_006130.1). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 37, и/или по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 38.

[0102] В иллюстративных вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению содержит, от N-конца к С-концу: сигнальную последовательность CD8α, scFv CD19, шарнирную и трансмембранную области CD8α, цитоплазматический сигнальный домен 41ВВ и цитоплазматический сигнальный домен CD3ξ.

III. Иммунные клетки, содержащие CAR

а. Иммунные клетки

[0103] В данном документе предусмотрены сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR по настоящему изобретению (например, Т-клетки с CAR).

[0104] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит разные внеклеточные антигенсвязывающие домены. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит внеклеточные антигенсвязывающие домены.

[0105] Сконструированные иммунные клетки могут быть аллогенными или аутологичными.

[0106] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку (например, воспалительный Т-лимфоцит, цитотоксический Т-лимфоцит, регуляторный Т-лимфоцит, хелперный Т-лимфоцит, лимфоцит, инфильтрирующий опухоль (TIL)), NK-клетку, NK-Т-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку или В-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка может быть получена из группы, состоящей из CD4+ Т-лимфоцитов и CD8+ Т-лимфоцитов. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой гамма дельта Т-клетку. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой макрофаг.

[0107] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка может быть получена, например, без ограничения из стволовой клетки. Стволовые клетки могут быть зрелыми стволовыми клетками, не являющимися человеческими эмбриональными стволовыми клетками, более конкретно не являющимися человеческими стволовыми клетками, стволовыми клетками пуповинной крови, клетками-предшественниками, стволовыми клетками костного мозга, индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, тотипотентными стволовыми клетками или гематопоэтическими стволовыми клетками.

[0108] В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из периферической крови. В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из костного мозга. В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из пуповинной крови. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления клетку трансфицируют или трансдуцируют вектором нуклеиновой кислоты с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из электропорации, сонопорации, биолистики (например, генной пушки), липидной трансфекции, полимерной трансфекции, наночастиц, вирусной трансфекции (например, с помощью ретровируса, лентивируса, AAV) или полиплексов.

[0109] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны CAR, специфический по отношению к CD19, по настоящему изобретению, характеризуются процентным соотношением стволовых клеток памяти и центральных клеток памяти, составляющим более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности их клеточной мембраны CAR, специфический по отношению к CD19, по настоящему изобретению, характеризуются процентным соотношением стволовых клеток памяти и центральных клеток памяти, составляющим от приблизительно 10% до приблизительно 100%, от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 80%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 10% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 20%, от приблизительно 15% до приблизительно 100%, от приблизительно 15% до приблизительно 90%, от приблизительно 15% до приблизительно 80%, от приблизительно 15% до приблизительно 70%, от приблизительно 15% до приблизительно 60%, от приблизительно 15% до приблизительно 50%, от приблизительно 15% до приблизительно 40%, от приблизительно 15% до приблизительно 30%, от приблизительно 20% до приблизительно 100%, от приблизительно 20% до приблизительно 90%, от приблизительно 20% до приблизительно 80%, от приблизительно 20% до приблизительно 70%, от приблизительно 20% до приблизительно 60%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 20% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 30%, от приблизительно 30% до приблизительно 100%, от приблизительно 30% до приблизительно 90%, от приблизительно 30% до приблизительно 80%, от приблизительно 30% до приблизительно 70%, от приблизительно 30% до приблизительно 60%, от приблизительно 30% до приблизительно 50%, от приблизительно 30% до приблизительно 40%, от приблизительно 40% до приблизительно 100%, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 40% до приблизительно 70%, от приблизительно 40% до приблизительно 60%, от приблизительно 40% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 50% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 80%, от приблизительно 50% до приблизительно 70%, от приблизительно 50% до приблизительно 60%, от приблизительно 60% до приблизительно 100%, от приблизительно 60% до приблизительно 90%, от приблизительно 60% до приблизительно 80%, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 70% до приблизительно 90%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 100%, от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 90% до приблизительно 100%, от приблизительно 25% до приблизительно 50%, от приблизительно 75% до приблизительно 100% или от приблизительно 50% до приблизительно 75%.

[0110] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой воспалительный Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой цитотоксический Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой регуляторный Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой хелперный Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе.

[0111] До размножения и генетической модификации источник клеток может быть получен от субъекта с помощью различных неограничивающих способов. Клетки могут быть получены из ряда неограничивающих источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, Т-клетки или NK-клетки, полученные из стволовых клеток или iPSC, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любое количество доступных и известных специалистам в данной области линий Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть получены от здорового донора, от пациента, у которого диагностирован рак, или от пациента, у которого диагностирована инфекция. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть частью смешанной популяции клеток, которые обладают разными фенотипическими характеристиками.

[0112] Также в данном документе представлены клеточные линии, полученные из трансформированной иммунной клетки (например, Т-клетки) в соответствии с любым из описанных выше способов. Также в данном документе представлены модифицированные клетки, устойчивые к иммуносупрессивному лечению. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.

[0113] Иммунные клетки по настоящему изобретению могут быть активированы и подвергнуты экспансии до или после генетической модификации иммунных клеток с использованием общеизвестных способов. Обычно сконструированные иммунные клетки по настоящему изобретению могут быть подвергнуты экспансии, например, путем контакта со средством, которое стимулирует комплекс TCR CD3, и костимулирующей молекулы на поверхности Т-клеток для создания сигнала активации для Т-клетки. Например, химические вещества, такие как ионофор кальция А23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (РНА), могут использоваться для создания сигнала активации для Т-клетки.

[0114] В некоторых вариантах осуществления популяции Т-клеток также можно стимулировать in vitro путем приведения в контакт, например, с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD28, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для совместной стимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяция Т-клеток может быть приведена в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Антитело к CD3 и антитело к CD28 могут быть расположены на грануле, планшете или другом субстрате. Условия, подходящие для культуры Т-клеток, включают подходящую среду {например, минимальную основную среду, или среду RPMI 1640, или Х-vivo 15 (Lonza)), которая может содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку крови {например, фетальную бычью или сыворотку крови человека), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGF бета и TNF, или любые другие добавки для выращивания клеток, известные специалисту в данной области. Другие добавки для выращивания клеток включают без ограничения поверхностно-активное вещество, плазманат и восстанавливающие средства, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, а-МЕМ, F-12, Х-Vivo 15 и Х-Vivo 20, Optimizer с добавленными аминокислотами, пируватом натрия и витаминами, либо без сыворотки крови, либо дополненные соответствующим количеством сыворотки крови (или плазмы), или определенного набора гормонов, и/или количества цитокина(-ов), достаточного для роста и размножения Т-клеток {например, IL-7 и/или IL-15). Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включены только в экспериментальные культуры, а не в культуры клеток, которые подлежат введению субъекту. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре {например, 37°С) и атмосфере {например, воздух плюс 5% СО₂). Т-клетки, подвергшиеся воздействию стимуляции с варьирующимися значениями времени, могут проявлять разные характеристики.

В некоторых вариантах осуществления клетки по настоящему изобретению могут быть размножены путем совместного культивирования с тканью или клетками. Клетки также могут быть размножены in vivo, например, в крови субъекта после введения клетки субъекту.

[0115] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка в соответствии с настоящим изобретением может содержать один или более нарушенных или инактивированных генов. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит один нарушенный или инактивированный ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, CD19, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2В4, HLA, TCRα и TCRβ, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или трансген рТа. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка содержит полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие многоцепочечный CAR. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит два нарушенных или инактивированных гена, выбранных из группы, состоящей из CD52 и GR, CD52 и TCRα, CDR52 и TCRβ, CD19 и CD52, CD19 и TCRα, CD19 и TCRβ, GR и TCRα, GR и TCRβ, TCRα и TCRβ, PD-1 и TCRα, PD-1 и TCRβ, CTLA-4 и TCRα, CTLA-4 и TCRβ, LAG3 и TCRα, LAG3 и TCRβ, TIM3 и TCRα, Tim3 и TCRβ, BTLA и TCRα, BTLA и TCRβ, BY55 и TCRα, BY55 и TCRβ, TIGIT и TCRα, TIGIT и TCRβ, B7H5 и TCRα, B7H5 и TCRβ, LAIR1 и TCRα, LAIR1 и TCRβ, SIGLEC10 и TCRα, SIGLEC10 и TCRβ, 2B4 и TCRα, 2B4 и TCRβ, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и трансген pTa. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает нарушение или инактивирование одного или более генов путем введения в клетки эндонуклеазы, способной селективно инактивировать ген путем селективного расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления эндонуклеаза может представлять собой, например, нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), нуклеазу megaTAL, мегануклеазу, подобную активатору транскрипции эффекторную нуклеазу (TALE-нуклеаза) или CRIPR (например, Cas9) эндонуклеазу.

[0116] В некоторых вариантах осуществления TCR становится нефункциональным в клетках в соответствии с настоящим изобретением из-за нарушения или инактивации гена TCRα и/или гена(-ов) TCRβ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ получения модифицированных клеток, полученных от индивидуума, при этом клетки могут пролиферировать независимо от пути передачи сигнала главного комплекса гистосовместимости (МНС). Модифицированные клетки, которые могут пролиферировать независимо от пути передачи сигнала МНС, которые могут быть получены этим способом, входят в объем настоящего изобретения. Модифицированные клетки, раскрытые в данном документе, могут быть использованы в лечении пациентов, нуждающихся в этом, от отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD); поэтому способ лечения пациентов, нуждающихся в этом, против отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), включающий лечение указанного пациента путем введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных клеток, содержащих нарушенные или инактивированные гены TCRα и/или TCRβ, входит в объем настоящего изобретения.

[0117] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки сконструированы так, чтобы быть устойчивыми к одному или более химиотерапевтическим лекарственным средствам. Химиотерапевтическое лекарственное средство может представлять собой, например, аналог пуринового нуклеотида (PNA), что таким образом делает иммунную клетку подходящей для лечения рака, сочетающего адоптивную иммунотерапию и химиотерапию. Иллюстративные PNA включают, например, клофарабин, флударабин, циклофосфамид и цитарабин, по отдельности или в комбинации. PNA метаболизируются дезоксицитидинкиназой (dCK) в моно-, ди- и трифосфатные PNA. Их трифосфатные формы конкурируют с АТФ за синтез ДНК, действуют как проапоптотические средства и являются мощными ингибиторами рибонуклеотидредуктазы (RNR), которая участвует в продуцировании тринуклеотидов. В данном документе предусмотрены специфические по отношению к CD19 Т-клетки с CAR, содержащие нарушенный или инактивированный ген dCK. В некоторых вариантах осуществления клетки, подвергнутые нокауту dCK, получены путем трансфекции Т-клеток с использованием полинуклеотидов, кодирующих специфическую TAL-нуклеазу, нацеленную на гены dCK, с помощью, например, электропорации mRNA. Специфические по отношению к CD19 Т-клетки с CAR с подвергнутым нокауту dCK являются устойчивыми к PNA, включая, например, хлорофарабин и/или флударабин, и поддерживают цитотоксическую активность Т-клеток по отношению к С019-экспрессирующим клеткам.

[0118] В некоторых вариантах осуществления выделенные клетки или клеточные линии по настоящему изобретению могут содержать рТα или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка или клеточная линия может быть дополнительно генетически модифицирована путем нарушения или инактивации гена TCRα.

[0119] В настоящем изобретении также представлены сконструированные иммунные клетки, содержащие любой из полинуклеотидов CAR, описанных в данном документе.

с. Способы получения

[0120] В данном документе предусмотрены способы получения CAR и CAR-содержащих иммунных клеток по настоящему изобретению. В получении полинуклеотидов, полипептидов, векторов, антигенсвязывающих доменов, иммунных клеток, композиций и т.п. в соответствии с настоящим изобретением можно использовать ряд известных методик.

Полинуклеотиды и векторы

[0121] В некоторых вариантах осуществления CAR может быть введен в иммунную клетку в виде трансгена с помощью плазмидного вектора. В некоторых вариантах осуществления плазмидный вектор может также содержать, например, маркер отбора, который обеспечивает идентификацию и/или отбор клеток, которые получили вектор.

[0122] Полипептиды CAR можно синтезировать in situ в клетке после введения в клетку полинуклеотидов, кодирующих полипептиды CAR. Альтернативно полипептиды CAR могут быть получены вне клеток, а затем введены в клетки. Способы введения полинуклеотидной конструкции в клетки известны из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления можно использовать способы стабильной трансформации (например, с использованием лентивирусного вектора) для интеграции полинуклеотидной конструкции в геном клетки. В других вариантах осуществления могут использоваться способы временной трансформации для временной экспрессии полинуклеотидной конструкции, и полинуклеотидная конструкция не интегрирована в геном клетки. В других вариантах осуществления могут быть использованы способы, с использованием эффектов, опосредованных вирусом. Полинуклеотиды можно вводить в клетку с помощью любых подходящих средств, таких как, например, рекомбинантные вирусные векторы {например, ретровирусные, аденовирусные), липосомы и т.п. Способы временной трансформации включают, например, без ограничения микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Полинуклеотиды могут быть включены в векторы, такие как, например, плазмидные векторы или вирусные векторы.

[0123] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие промотор, функционально связанный с первым полинуклеотидом, кодирующим домен, связывающийся с антигеном CD19, по меньшей мере, одну костимуляторную молекулу и активирующий домен. В некоторых вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержится в вирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор выбран из группы, состоящей из ретровирусных векторов, векторов вируса мышиного лейкоза, векторов SFG, аденовирусных векторов, лентивирусных векторов, векторов аденоассоциированного вируса (AAV), векторов вируса герпеса и векторов вируса осповакцины. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержится в плазмиде.

[0124] В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена полинуклеотидная последовательность, содержащая промотор, который способен к экспрессии трансгена CAR в Т-клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор EF1a. Нативный промотор EF1a инициирует экспрессию альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации-1, который является ответственным за ферментативную доставку аминоацил-tRNA к рибосоме. Промотор EF1a является широко используемым в экспрессионных плазмидах млекопитающих, и было показано, что он является эффективным для инициации экспрессии CAR из трансгенов, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). В некоторых вариантах осуществления промотор EF1a содержит последовательность, показанную под SEQ ID NO: 15.

[0125] Последовательность промотора EF1a, показанная выше, содержит первый экзон (выделен жирным шрифтом) и первый интрон (подчеркнут, SEQ ID NO: 39) с последующей N-концевой частью второго экзона гена EF1a. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит короткий промотор EF1a. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит промотор EF1a, который является более коротким, чем последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит промотор EF1a, который не содержит первый интрон гена EF1a. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит промотор EF1a, который не содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 39.

[0126] В некоторых вариантах осуществления промотор содержит последовательность, показанную под ID NO: 16.

[0127] До манипуляции in vitro или генетической модификации иммунных клеток, описанных в данном документе, клетки могут быть получены от субъекта. Клетки, экспрессирующие CAR для CD19, могут быть получены с помощью аллогенного или аутологичного способа.

Исходный материал

[0128] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки включают Т-клетки. Т-клетки могут быть получены из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В определенных вариантах осуществления Т-клетки можно получать из единицы крови, взятой у субъекта, с использованием любого числа методик, известных специалисту, таких как разделение с помощью FICOLL™.

[0129] Клетки можно получать из циркулирующей крови индивидуума посредством афереза. Продукт, полученный посредством афереза, обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В определенных вариантах осуществления клетки, собранные посредством афереза, можно промывать для удаления фракции плазмы крови и помещать в соответствующие буфер или среды для последующей обработки.

[0130] В определенных вариантах осуществления Т-клетки выделяют из РВМС путем лизирования эритроцитов и истощения моноцитов, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLL™. Определенные субпопуляции Т-клеток (например, CD28+, CD4+, CD45RA- и CD45RO+ Т-клеток или CD28+, CD4+, CDS+, CD45RA-, CD45RO+ и CD62L+ Т-клеток) могут быть далее выделены с помощью известных из уровня техники методик положительного или отрицательного отбора. Например, обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора может быть достигнуто с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для полученных отрицательным отбором клеток. Одним из способов применения в данном документе является сортировка и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которой используют коктейль моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на полученных отрицательным отбором клетках. Например, для обогащения клетками CD4+ путем отрицательного отбора коктейль моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CDllb, CD16, HLA-DR и CD8. Проточная цитометрия и сортировка клеток также могут использоваться для выделения представляющих интерес популяций клеток для применения в настоящем изобретении.

[0131] РВМС можно использовать непосредственно для генетической модификации иммунными клетками (такими как CAR или TCR) с использованием способов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления после выделения РВМС далее могут быть выделены Т-лимфоциты, и при этом как цитотоксические, так и хелперные Т-лимфоциты могут быть отсортированы на субпопуляции интактных, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток либо до, либо после генетической модификации и/или размножения.

[0132] В некоторых вариантах осуществления CD8+клетки далее сортируют на интактные, стволовые клетки памяти, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации антигенов клеточной поверхности, которые ассоциированы с каждым из этих типов CD8+ клеток. В некоторых вариантах осуществления экспрессия фенотипических маркеров центральных Т-клеток памяти включает в себя CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127 и является отрицательной в отношении гранзима В. В некоторых вариантах осуществления стволовые Т-клетки памяти представляют собой CD45RO-, CD62L+, CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления центральные Т-клетки памяти представляют собой CD45RO+, CD62L+, CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления эффекторные Т-клетки являются отрицательными в отношении CD62L, CCR7, CD28 и CD127 и положительными в отношении гранзима В и перфорина. В определенных вариантах осуществления CD4+ Т-клетки дополнительно сортируют по субпопуляциям. Например, CD4+ Т-хелперные клетки можно сортировать на интактные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации клеточных популяций, которые имеют антигены клеточной поверхности.

Иммунные клетки, полученные из стволовых клеток

[0133] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки могут быть получены из эмбриональных стволовых (ES) или индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток. Подходящие HSC, ES-клетки, iPS-клетки и другие типы стволовых клеток могут представлять собой культивируемые иммортализованные клеточные линии или могут быть выделены непосредственно у пациента. Различные способы выделения, разработки и/или культивирования стволовых клеток известны из уровня техники и могут применяться для осуществления настоящего изобретения на практике.

[0134] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), полученную из перепрограммированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления исходный материал может представлять собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), полученную из Т-клетки или клетки, отличной от Т-клетки. Исходным материалом может быть эмбриональная стволовая клетка. Исходным материалом может являться В-клетка или любая другая клетка из изолятов мононуклеарных клеток периферической крови, гематопоэтическая клетка-предшественник, гемопоэтическая стволовая клетка, мезенхимальная стволовая клетка, жировая стволовая клетка или любой другой тип соматических клеток.

Генетическая модификация выделенных клеток

[0135] Иммунные клетки, такие как Т-клетки, могут быть генетически модифицированы после выделения с использованием известных способов, или иммунные клетки могут быть активированы и размножены (или дифференцированы в случае предшественников) in vitro перед генетической модификацией. В некоторых вариантах осуществления выделенные иммунные клетки генетически модифицированы для снижения или устранения экспрессии эндогенных TCRα и/или CD52. В некоторых вариантах осуществления клетки генетически модифицированы с использованием технологии редактирования генов (например, CRISPR/Cas9, нуклеаза с «цинковыми пальцами» (ZFN), TALEN, MegaTAL, мегануклеаза) для снижения или устранения экспрессии эндогенных белков (например, TCRα и/или CD52). В другом варианте осуществления иммунные клетки, такие как Т-клетки, генетически модифицированы химерными антигенными рецепторами, описанными в данном документе (например, трансдуцированы вирусным вектором, содержащим одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих CAR), а затем активированы и/или размножены in vitro. Способы активации и размножения Т-клеток известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США №6905874, патенте США №6867041, патенте США №6797514 и в РСТ WO 2012/079000, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме. Обычно такие способы включают приведение в контакт РВМС или выделенных Т-клеток с дополнительной стимулирующей молекулой и костимулирующей молекулой, такой как антитела к CD3 и к CD28, как правило, присоединенной к грануле или другой поверхности, в культуральной среде с соответствующими цитокинами, такими как IL-2. Антитела к CD3 и к CD28, присоединенные к одной и той же грануле, служат «имитацией» антигенпрезентирующей клетки (АРС). Одним примером является система Dynabeads®, система CD3/CD28 активатор/стимулятор для физиологической активации Т-клеток человека. В других вариантах осуществления Т-клетки могут быть активированы и стимулированы для пролиферации питающими клетками и соответствующими антителами и цитокинами с применением способов, таких как описанные в патенте США №6040177, патенте США №5827642 и в WO 2012129514, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме.

[0136] Определенные способы получения конструкций и сконструированных иммунных клеток по настоящему изобретению описаны в заявке согласно РСТ PCT/US15/14520, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме.

[0137] Следует учитывать, что РВМС могут дополнительно включать другие цитотоксические лимфоциты, такие как NK-клетки или NKT-клетки. Экспрессионный вектор, несущий кодирующую последовательность химерного рецептора, как раскрыто в данном документе, может быть введен в популяцию донорских Т-клеток человека, NK-клеток или NKT-клеток. Успешно трансдуцированные Т-клетки, несущие экспрессионный вектор, могут быть отсортированы с использованием проточной цитометрии для выделения СО3-положительных Т-клеток, а затем размножены для увеличения количества этих CAR-экспрессирующих Т-клеток в дополнение к активации клеток с использованием антител к CD3 и IL-2 или других способов, известных из уровня техники, как описано в других местах в данном документе. Стандартные процедуры используют для криоконсервации Т-клеток, экспрессирующих CAR, для хранения и/или получения для использования в отношении субъекта-человека. В одном варианте осуществления трансдукцию, культивирование и/или размножение Т-клеток in vitro проводят в отсутствие продуктов, полученных от животных, отличных от человека, таких как фетальная телячья сыворотка и фетальная бычья сыворотка.

[0138] Для клонирования полинуклеотидов вектор можно ввести в клетку-хозяина (выделенную клетку-хозяина), чтобы обеспечить репликацию самого вектора и таким образом амплифицировать копии содержащегося в нем полинуклеотида. Клонирующие векторы могут содержать компоненты последовательности, как правило, включающие без ограничения точку начала репликации, промоторные последовательности, последовательности инициации транскрипции, энхансерные последовательности и селектируемые маркеры. Эти элементы могут быть выбраны соответствующим образом специалистом средней квалификации в данной области. Например, точка начала репликации может быть выбрана так, чтобы способствовать автономной репликации вектора в клетке-хозяине.

[0139] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные клетки-хозяева, содержащие вектор, предусмотренный в данном документе. Клетки-хозяева, содержащие вектор, можно использовать для экспрессии или клонирования полинуклеотида, содержащегося в векторе. Подходящие клетки-хозяева могут включать без ограничения прокариотические клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки или клетки высших эукариот, такие как клетки млекопитающих. Подходящие прокариотические клетки для этой цели включают без ограничения эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescens и Shigella, а также бациллы, такие как В. subtilis и В. licheniformis, Pseudomonas, например, P. aeruginosa и Streptomyces.

[0140] Вектор может быть введен в клетку-хозяина с использованием любых подходящих способов, известных из уровня техники, в том числе без ограничения доставки, опосредованной DEAE-декстраном, способа осаждения фосфата кальция, опосредованной катионными липидами доставки, трансфекции, опосредованной липосомами, электропорации, бомбардировки микрочастицами, опосредованной рецептором доставки гена, доставки, опосредованной полилизином, гистона, хитозана и пептидов. Стандартные способы трансфекции и трансформации клеток для экспрессии представляющего интерес вектора хорошо известны из уровня техники. В дополнительном варианте осуществления смесь различных экспрессионных векторов может быть использована для генетической модификации донорной популяции иммунных эффекторных клеток, где каждый вектор кодирует различный CAR, как раскрыто в данном документе. Полученные трансдуцированные иммунные эффекторные клетки образуют смешанную популяцию сконструированных клеток, при этом часть сконструированных клеток экспрессирует более одного отличающегося CAR.

[0141]

[0142] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит лентивирусный вектор. Лентивирусный вектор, содержащий кодирующую последовательность CAR, может быть введен в лентивирусную пакующую клеточную линию и лентивирус, продуцируемый пакующей клеточной линией, может использоваться для трансдукции Т-клеток с целью создания Т-клеток с CAR. Чтобы получить лентивирус, кодирующий CAR, клетки HEK-293Т можно высеять из расчета 0,4 миллиона клеток на мл в 2 мл DMEM (Gibco), дополненной 10% FBS (Hyclone или JR Scientific), на лунку 6-луночного планшета в день 0. В день 1 лентивирус может быть получен путем смешивания вместе лентивирусных упаковывающих векторов 1,5 мкг psPAX2, 0,5 мкг pMD2G и 0,5 мкг соответствующего вектора для переноса CAR в 250 мкл Opti-MEM (Gibco) на лунку 6-луночного планшета («смесь ДНК»). 10 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в 250 мкл Opti-MEM можно инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем добавить к смеси ДНК. Смесь можно инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут и медленно добавлять общий объем 500 мкл по бокам лунок, содержащих HEK-293Т. Общие способы получения и трансдукции лентивирусов, содержащих CAR, широко известны из уровня техники, например, см. Milone et al., Leukemia, 2018, 32:1529-1541; Sanber et al., Construction of stable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production, Nature 2015, DOI: 10.1038; Roddie et al., Cytotherapy 2019, 21:327-340, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ хранения сконструированных посредством генной инженерии клеток, экспрессирующих CAR или TCR, которые нацелены на белок CD19. Он предусматривает криоконсервацию иммунных клеток так, чтобы клетки оставались жизнеспособными после оттаивания. Фракция иммунных клеток, экспрессирующих CAR, может быть криоконсервирована способами, известными из уровня техники, чтобы обеспечить постоянный источник таких клеток для будущего лечения пациентов, пораженных злокачественными новообразованиями. При необходимости криоконсервированные трансформированные иммунные клетки можно разморозить, вырастить и размножить для получения большего количества таких клеток.

[0143] В некоторых вариантах осуществления клетки составляют сначала собирая их из культуральной среды, а затем промывая и концентрируя клетки в среде и системе контейнеров, подходящей для введения («фармацевтически приемлемый» носитель) в эффективном для лечения количестве. Подходящей инфузионной средой может быть любой состав изотонической среды, обычный нормальный солевой раствор, Normosol™ R (Abbott) или Plasma-Lyte™ A (Baxter), но также можно использовать 5% декстрозу в воде или лактат Рингера. Инфузионная среда может быть дополнена человеческим сывороточным альбумином.

Аллогенные Т-клетки с CAR

[0144] Процесс получения средств терапии на основе аллогенных Т-клеток с CAR или AlloCARs™ предусматривает сбор здоровых, отобранных, подвергнутых скринингу и тестированных Т-клеток от здоровых доноров. Затем конструируют Т-клетки для экспрессии CAR, которые распознают определенные белки клеточной поверхности (например, CD19), экспрессируемые в гематологических или солидных опухолях. Аллогенные Т-клетки подвергают редактированию генов, чтобы снизить риск заболевания «трансплантат против хозяина» (GvHD) и предупредить аллогенное отторжение. Ген рецептора Т-клеток (например, TCRα, TCRβ) нокаутируют, чтобы избежать GvHD. Ген CD52 может быть нокаутирован, чтобы сделать продукт на основе Т-клеток с CAR устойчивым к обработке антителом kCD52. Таким образом, обработка антителом kCD52 может быть использована для подавления иммунной системы хозяина и обеспечивает приживление Т-клеток с CAR для достижения полного терапевтического эффекта. Затем сконструированные Т-клетки подвергают стадии очистки и в конечном итоге криоконсервируют во флаконах для доставки пациентам.

Аутологичные Т-клетки с CAR

[0145] Терапия на основе аутологичных Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR) включает сбор собственных клеток пациента (например, белых кровяных клеток, в том числе Т-клеток) и генетическое конструирование Т-клеток для экспрессии CAR, которые распознают мишень, экспрессируемую на клеточной поверхности одной или более специфических раковых клеток, и уничтожают раковые клетки. Затем сконструированные клетки криоконсервируют и впоследствии вводят пациенту.

IV. Способы лечения

[0146] Настоящее изобретение предусматривает способы лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с нежелательными и/или повышенными уровнями CD19 у пациента, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного CAR или иммунных клеток, содержащих CAR, раскрытые в данном документе.

[0147] Предусмотрены способы лечения заболеваний или нарушений, включающих рак. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к созданию опосредованного Т-клетками иммунного ответа у субъекта, предусматривающему введение субъекту эффективного количества сконструированных иммунных клеток согласно настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления опосредованный Т-клетками иммунный ответ направлен против клетки-мишени или клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой опухолевую клетку. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного выделенного антигенсвязывающего домена, описанного в данном документе. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одной иммунной клетки, при этом иммунная клетка содержит по меньшей мере один химерный антигенный рецептор, Т-клеточный рецептор и/или выделенный антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе.

[0148] Содержащие CAR иммунные клетки по настоящему изобретению могут использоваться для лечения злокачественных новообразований, связанных с аберрантной экспрессией CD19. В некоторых вариантах осуществления содержащие CAR иммунные клетки по настоящему изобретению могут использоваться для лечения рака. Используемый в данном документе термин «рак» включает без ограничения солидные опухоли и опухоли, происходящие из кровяных клеток. Термин «рак» относится к заболеванию тканей кожи, органов, крови и сосудов, включающему без ограничения формы рака мочевого пузыря, костей или крови, головного мозга, молочной железы, шейки матки, груди, толстой кишки, эндометрия, пищевода, глаза, головы, почки, печени, лимфатических узлов, легкого, ротовой полости, шеи, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, прямой кишки, желудка, яичка, гортани и матки. Конкретные формы рака включают без ограничения опухоль на поздней стадии, амилоидоз, нейробластому, менингиому, гемангиоперицитому, множественные метастазы головного мозга, мультиформную глиобластому, глиобластому, глиому ствола головного мозга, злокачественную опухоль головного мозга с неблагоприятным прогнозом, злокачествленную глиому, рецидивирующую злокачествленную глиому, анапластическую астроцитому, анапластическую олигодендроглиому, нейроэндокринную опухоль, ректальную аденокарциному, колоректальный рак на стадиях С и D согласно системе стадирования по Дюку, неоперабельную колоректальную карциному, метастатическую гепатоклеточную карциному, саркому Капоши, острый миелобластный лейкоз с его кариотипом, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому (NHL), кожную Т-клеточную лимфому, кожную В-клеточную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, низкодифференцированную фолликулярную лимфому, злокачественную меланому, злокачественную мезотелиому, синдром злокачественного плеврального выпота при мезотелиоме, перитонеальную карциному, папиллярную серозную карциному, гинекологическую саркому, саркому мягкой ткани, склеродерму, кожный васкулит, гистиоцитоз из клеток Лангерганса, лейомиосаркому, оссифицирующую прогрессирующую фибродисплазию, гормонорезистентный рак предстательной железы, удаленную саркому мягкой ткани с высоким риском, неоперабельную гепатоклеточную карциному, макр огл о булине мию Вальденстрема, вялотекущую миелому, невыраженную миелому, рак фаллопиевых труб, андрогеннезависимый рак предстательной железы, андрогензависимый не метастатический рак предстательной железы IV стадии, рак предстательной железы, нечувствительный к гормональной терапии, рак предстательной железы, нечувствительный к химиотерапии, папиллярную карциному щитовидной железы, фолликулярную карциному щитовидной железы, медуллярную карциному щитовидной железы и лейомиому. В конкретном варианте осуществления рак является метастатическим. В другом варианте осуществления рак является трудноподдающимся лечению или устойчивым к химиотерапии или радиоактивному излучению.

[0149] В иллюстративных вариантах осуществления CAR-содержащие иммунные клетки, например, Т-клетки с CAR по настоящему изобретению, используются для лечения NHL.

[0150] Также предусмотрены способы уменьшения размера опухоли у субъекта, включающие введение субъекту сконструированной клетки по настоящему изобретению субъекту, при этом клетка содержит химерный антигенный рецептор, содержащий домен, связывающийся с антигеном CD19, и связывается с антигеном CD19 в опухоли.

[0151] В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется солидная опухоль или злокачественное новообразование крови, такое как лимфома или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления сконструированную клетку доставляют в ложе опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак присутствует в костном мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки представляют собой аутологичные иммунные клетки, например, аутологичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки представляют собой аллогенные иммунные клетки, например, аллогенные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки представляют собой гетерологичные иммунные клетки, например, гетерологичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки согласно настоящей заявке трансфицируют или трансдуцируют in vivo. В других вариантах осуществления сконструированные клетки трансфицируют или трансдуцируют ex vivo. Используемый в данном документе термин «клетка in vitro» относится к любой клетке, которую культивируют ex vivo.

[0152] Термины «терапевтически эффективное количество», «эффективная доза», «эффективное количество» или «терапевтически эффективная дозировка» терапевтического средства, например, сконструированных Т-клеток с CAR, означают любое количество, которое при использовании отдельно или в комбинации с другим терапевтическим средством защищает субъекта от проявления заболевания или способствует регрессии заболевания, о чем свидетельствует уменьшение тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания, или предупреждает ухудшение или нетрудоспособность вследствие заболевания. Способность терапевтического средства обеспечивать регрессию заболевания может быть оценена с использованием различных способов, известных квалифицированному практикующему специалисту, например, на субъектах-людях во время клинических испытаний, на животных модельных системах, предсказывающих эффективность у людей, или путем анализа активности средства в анализах in vitro.

[0153] Термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и включают субъектов-людей и отличных от человека субъектов-животных, а также субъектов с официально диагностированными нарушениями, субъектов без официально признанных нарушений, субъектов, получающих медицинскую помощь, субъектов с риском развития нарушений и т.д.

[0154] Термины «лечить» и «лечение» включают виды терапевтического лечения, виды профилактического лечения и виды применения, в которых снижается риск того, что у субъекта разовьется нарушение или другой фактор риска. Лечение не требует полного излечения нарушения и охватывает варианты осуществления, в которых уменьшаются проявления симптомов или основные факторы риска. Термин «предупреждать» не требует 100% исключения вероятности события. Скорее, он означает, что вероятность возникновения события уменьшилась в присутствии соединения или вследствие применения способа.

[0155] Необходимые терапевтические количества клеток в композиции, как правило, составляют по меньшей мере 2 клетки (например, подгруппа из по меньшей мере 1 CD8+ центральной Т-клетки памяти и по меньшей мере 1 CD4+ хелперной Т-клетки), или более часто составляют более чем 10² клеток и не более 10⁶, не более 10⁸ или 10⁹ клеток включительно и могут составлять более чем 1010 клеток. Количество клеток будет зависеть от необходимого пути применения, для которого предназначена композиция, и типа клеток, включенных в нее. Плотность необходимых клеток обычно превышает 10⁶ клеток/мл и, как правило, составляет более чем 10⁷ клеток/мл, как правило, 108 клеток/мл или больше. Клинически значимое количество иммунных клеток может быть разделено на несколько инфузий, которые в совокупности равняются 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеткам или превышают это количество. В некоторых аспектах настоящего изобретения, в частности, поскольку все клетки для инфузий будут перенаправлены на конкретный целевой антиген (CD19), можно вводить меньшие количества клеток в диапазоне 10⁶/килограмм (10⁶-10¹¹ на пациента). Средства лечения на основе CAR можно вводить несколько раз в дозах в этих диапазонах. Клетки могут быть аутологичными, аллогенными или гетерологичными по отношению к пациенту, проходящему терапию.

[0156] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество Т-клеток с CAR составляет приблизительно 1×10⁵ клеток/кг, приблизительно 2×10⁵ клеток/кг, приблизительно 3×10⁵ клеток/кг, приблизительно 4×10⁵ клеток/кг, приблизительно 5×10⁵ клеток/кг, приблизительно 6×10⁵ клеток/кг, приблизительно 7×10⁵ клеток/кг, приблизительно 8×10⁵ клеток/кг, приблизительно 9×10⁵ клеток/кг, 2×10⁶ клеток/кг, приблизительно 3×10⁶ клеток/кг, приблизительно 4×10⁶ клеток/кг, приблизительно 5×10⁶ клеток/кг, приблизительно 6×10⁶ клеток/кг, приблизительно 7×10⁶ клеток/кг, приблизительно 8×10⁶ клеток/кг, приблизительно 9×10⁶ клеток/кг, приблизительно 1×10⁷ клеток/кг, приблизительно 2×10⁷ клеток/кг, приблизительно 3×10⁷ клеток/кг, приблизительно 4×10⁷ клеток/кг, приблизительно 5×10⁷ клеток/кг, приблизительно 6×10⁷ клеток/кг, приблизительно 7×10⁷ клеток/кг, приблизительно 8×10⁷ клеток/кг или приблизительно 9×10⁷ клеток/кг.

[0157] В некоторых вариантах осуществления целевые дозы для CAR+/CAR-T+/TCR+ клеток варьируют от 1×10⁶ до 2×10⁸ клеток/кг, например, составляют 2×10⁶ клеток/кг. Следует понимать, что дозы выше и ниже этого диапазона могут быть подходящими для определенных субъектов, и подходящие уровни доз могут быть определены поставщиком медицинских услуг, при необходимости. Кроме того, согласно настоящему изобретению могут быть предусмотрены множественные дозы клеток.

[0158] В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительное активное средство.

[0159] Популяции CAR-экспрессирующих клеток по настоящему изобретению можно вводить либо отдельно, либо в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины или популяции клеток. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать популяцию CAR или TCR-экспрессирующих клеток, например, Т-клеток, описанных в данном документе, в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно составляют для внутривенного введения.

[0160] Фармацевтические композиции (растворы, суспензии и т.п.) могут включать одно или более из следующего: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, а также средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократными дозами, сделанные из стекла или пластика. Фармацевтическая композиция для инъекций предпочтительно является стерильной.

[0161] В некоторых вариантах осуществления при введении пациенту сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на их клеточной поверхности любой из CAR, специфических по отношению к CD19, описанных в данном документе, могут уменьшать, уничтожать или лизировать эндогенные СВ19-экспрессирующие клетки пациента. В одном варианте осуществления процентное соотношение уменьшения или лизиса CD19-экспрессирующих эндогенных клеток или клеток из CD19-экспрессирующей клеточной линии сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими любой из CAR, специфических по отношению к CD19, описанных в данном документе, составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% или больше. В одном варианте осуществления процентное соотношение уменьшения или лизиса CD19-экспрессирующих эндогенных клеток или клеток из CD19-экспрессирующей клеточной линии сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими CAR, специфический по отношению к CD19, составляет от приблизительно 5% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 80%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 90%, от приблизительно 20% до приблизительно 80%, от приблизительно 20% до приблизительно 70%, от приблизительно 20% до приблизительно 60%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 25% до приблизительно 75% или от приблизительно 25% до приблизительно 60%. В одном варианте осуществления эндогенные CD19-экспрессирующие клетки представляют собой эндогенные CD19-экспрессирующие клетки костного мозга.

[0162] В одном варианте осуществления процент уменьшения или лизиса клеток-мишеней, например, CD19-экспрессирующей клеточной линии сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими на своей мембране клеточной поверхности CAR, специфический по отношению к CD19, по настоящему изобретению, может быть измерен с использованием анализа, раскрытого в данном документе.

[0163] Способы могут дополнительно включать введение одного или более химиотерапевтических средств. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой лимфодеплеционное (прекондиционирующее) химиотерапевтическое средство. Например, способы улучшения физического состояния пациента, нуждающегося в Т-клеточной терапии, включают введение пациенту конкретных эффективных доз циклофосфамида (от 200 мг/м²/сутки до 2000 мг/м²/сутки, от приблизительно 100 мг/м²/сутки до приблизительно 2000 мг/м²/сутки; например, приблизительно 100 мг/м²/сутки, приблизительно 200 мг/м²/сутки, приблизительно 300 мг/м²/сутки, приблизительно 400 мг/м²/сутки, приблизительно 500 мг/м²/сутки, приблизительно 600 мг/м²/сутки, приблизительно 700 мг/м²/сутки, приблизительно 800 мг/м²/сутки, приблизительно 900 мг/м²/сутки, приблизительно 1000 мг/м²/сутки, приблизительно 1500 мг/м²/сутки или приблизительно 2000 мг/м²/сутки) и определенных доз флударабина (от 20 мг/м²/сутки до 900 мг/м²/сутки, от приблизительно 10 мг/м²/сутки до приблизительно 900 мг/м²/сутки; например, приблизительно 10 мг/м²/сутки, приблизительно 20 мг/м²/сутки, приблизительно 30 мг/м²/сутки, приблизительно 40 мг/м²/сутки, приблизительно 40 мг/м²/сутки, приблизительно 50 мг/м²/сутки, приблизительно 60 мг/м²/сутки, приблизительно 70 мг/м²/сутки, приблизительно 80 мг/м²/сутки, приблизительно 90 мг/м²/сутки, приблизительно 100 мг/м²/сутки, приблизительно 500 мг/м²/сутки или приблизительно 900 мг/м²/сутки). Предпочтительный режим введения дозы включает лечение пациента, предусматривающее ежедневное введение пациенту приблизительно 300 мг/м²/сутки циклофосфамида и приблизительно 30 мг/м²/сутки флударабина в течение трех дней до введения терапевтически эффективного количества сконструированных Т-клеток пациенту.

[0164] В некоторых вариантах осуществления лимфодеплеция дополнительно предусматривает введение антитела к CD52. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD52 вводят в дозе приблизительно 13 мг/сутки IV.

[0165] В других вариантах осуществления каждое из антигенсвязывающего домена, транс дуциро ванных (или иным образом сконструированных) клеток и химиотерапевтического средства вводят в количестве, эффективном для лечения заболевания или состояния у субъекта.

[0166] В определенных вариантах осуществления композиции, содержащие CAR-экспрессирующие иммунные эффекторные клетки, раскрытые в данном документе, могут быть введены в сочетании с любым количеством химиотерапевтических средств. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтретамин, триэтиле имел амин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметил о ло мел аминов ую смолу; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихемицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; добавку для восполнения фолиевой кислоты, такую как фолиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиниума ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RF S2000; дифторметиломитин (DMFO); производные ретиноевой кислоты, такие как Targretin™ (бексаротен), Panretin™ (алитретиноин); ONTAK™ (денилейкин дифтитокс); эсперамицины; капецитабин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных. Также в это определение включены антигормональные средства, которые регулируют или подавляют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, в том числе, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-имидазолы, подавляющие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных. Также при необходимости вводят комбинации химиотерапевтических средств, в том числе без ограничения CHOP, т.е. циклофосфамид (Cytoxan®), доксорубицин (гидроксидоксорубицин), винкристин (Oncovin®) и преднизон.

[0167] В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтические средства вводят в одно и то же время или через одну неделю после введения сконструированной клетки, полипептида или нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления химиотерапевтическое средство вводят через 1-4- недели или от 1 недели до 1 месяца, от 1 недели до 2 месяцев, от 1 недели до 3 месяцев, от 1 недели до 6 месяцев, от 1 недели до 9 месяцев или от 1 недели до 12 месяцев после введения сконструированной клетки, полипептида или нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления химиотерапевтическое средство вводят по меньшей мере за 1 месяц до введения клетки, полипептида или нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение двух или более химиотерапевтических средств.

[0168] Ряд дополнительных терапевтических средств можно использовать в сочетании с композициями, описанными в данном документе. Например, потенциально применимые дополнительные терапевтические средства включают ингибиторы PD-1, такие как ниволумаб (Opdivo®), пембролизумаб (Keytruda®), пембролизумаб, пидилизумаб и атезолизумаб.

[0169] Дополнительные терапевтические средства, подходящие для применения в комбинации по настоящему изобретению, включают без ограничения ибрутиниб (Imbruvica®), офатумумаб (Arzerra®, ритуксимаб (Rituxan®), бевацизумаб (Avastin®), трастузумаб (Herceptin®), трастузумаб эмтанзин (KADCYLA®, иматиниб (Gleevec®), цетуксимаб (Erbitux®, панитумумаб) (Vectibix®), катумаксомаб, ибритумомаб, офатумумаб, тозитумомаб, брентуксимаб, алемтузумаб, гемтузумаб, эрлотиниб, гефитиниб, вандетаниб, афатиниб, лапатиниб, нератиниб, акситиниб, мазитиниб, пазопаниб, сунитиниб, сорафениб, тоцераниб, лестауртиниб, акситиниб, седираниб, ленватиниб, нинтеданиб, пазопаниб, регорафениб, семаксаниб, сорафениб, сунитиниб, тивозаниб, тоцераниб, вандетаниб, энтректиниб, сабозантиниб, иматиниб, дазатиниб, нилотиниб, понатиниб, радотиниб, босутиниб, лестауртиниб, руксолитиниб, пакритиниб, кобиметиниб, селуметиниб, траметиниб, биниметиниб, алектиниб, церитиниб, кризотиниб, афлиберцепт, адипотид, денилейкин дифтитокс, ингибиторы mTOR, такие как эверолимус и темсиролимус, ингибиторы hedgehog, такие как сонидегиб и висмодегиб, ингибиторы CDK, такие как ингибитор CDK (палбоциклиб).

[0170] В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая CAR-содержащие иммунные клетки, может быть введена при терапевтическом режиме для предупреждения синдрома высвобождения цитокина (CRS) или нейротоксичности. Терапевтический режим для предупреждения синдрома высвобождения цитокина (CRS) или нейротоксичности может включать введение лензилумаба, тоцилизумаба, предсердного натрийуретического пептида (ANP), анакинры, ингибиторов iNOS (например, L-NIL или 1400W). В дополнительных вариантах осуществления композиция, содержащая иммунные клетки, содержащие CAR, может быть введена с противовоспалительным средством. Противовоспалительные средства или лекарственные средства включают без ограничения стероиды и глюкокортикоиды (в том числе бетаметазон, будесонид, дексаметазон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон, триамцинолон), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), в том числе аспирин, ибупрофен, напроксен, метотрексат, сульфасалазин, лефлуномид, лекарственные препараты против TNF, циклофосфамид и микофенолат.Иллюстративные NSAID включают ибупрофен, напроксен, напроксен натрия, ингибиторы Сох-2 и сиалилаты. Иллюстративные анальгетики включают ацетаминофен, оксикодон, трамадол и пропоксифена гидрохлорид. Иллюстративные глюкокортикоиды включают кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон или преднизон. Иллюстративные модификаторы биологических ответов включают молекулы, направленные против маркеров клеточной поверхности (например, CD4, CD5 и т.д.), ингибиторы цитокинов, такие как антагонисты TNF (например, этанерцепт (ENBREL®), адалимумаб (HUMIRA®) и инфликсимаб (REMICADE®), ингибиторы хемокина и ингибиторы адгезивных молекул. Модификаторы биологического ответа включают моноклональные антитела, а также рекомбинантные формы молекул. Иллюстративные DMARD включают азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат, пеницилламин, лефлуномид, сульфасалазин, гидроксихлорохин, Gold (пероральный (ауранофин) и внутримышечный) и миноциклин.

[0171] В определенных вариантах осуществления композиции, описанные в данном документе, вводят в сочетании с цитокином. Примерами цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. В число цитокинов входят гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метиониловый гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; паращитовидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени (HGF); фактор роста фибробластов (FGF); пролактин; плацентарный лактоген; вещество, подавляющее муллериан; пептид, ассоциированный с гонадотропином мыши; ингибин; активин; эндотелиальные факторы роста сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов (NGF), такие как NGF-бета; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста I и II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма, колониестимулирующие факторы (CSF), такие как CSF макрофагов (M-CSF); CSF гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и CSF гранулоцитов (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, 1b-1альфа, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21; фактор некроза опухолей, такой как TNF-альфа или TNF-бета; и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и лиганд KIT (KL). Используемый в данном документе термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

V. Способы сортировки и истощения

[0172] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы сортировки популяции иммунных клеток in vitro, где подгруппа популяции иммунных клеток содержит сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие любые из CAR, специфических по отношению к CD19, содержащие эпитопы, специфические по отношению к моноклональным антителам (например, иллюстративные последовательности мимотопа). Способ предусматривает введение в контакт популяции иммунных клеток с моноклональным антителом, специфическим по отношению кэпитопам, и отбор иммунных клеток, которые связываются с моноклональным антителом, с получением популяции клеток, обогащенной сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими CAR, специфический по отношению к CD19.

[0173] В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело, специфическое по отношению к указанному эпитопу, необязательно конъюгировано с флуорофором. В этом варианте осуществления стадия отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, может быть осуществлена посредством сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).

[0174] В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело, специфическое по отношению к указанному эпитопу, необязательно конъюгировано с магнитной частицей. В этом варианте осуществления стадия отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, может быть осуществлена посредством активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS).

[0175] В некоторых вариантах осуществления mAb, используемое в способе сортировки иммунных клеток, экспрессирующих CAR, выбрано из алемтузумаба, ибритумомаба тиуксетана, муромонаб-СОЗ, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 и/или устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления указанное mAb представляет собой ритуксимаб. В другом варианте осуществления указанное mAb представляет собой QBEND-10.

[0176] В некоторых вариантах осуществления популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученных при использовании способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанных выше, содержит по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% экспрессирующих CAR иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученных при использовании способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, содержит по меньшей мере 85% экспрессирующих CAR иммунных клеток.

[0177] В некоторых вариантах осуществления популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученных при использовании способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанных выше, демонстрирует повышенную цитотоксическую активность in vitro по сравнению с изначальной (несортированной) клеточной популяцией. В некоторых вариантах осуществления указанная цитотоксическая активность in vitro повышается на 10%, 20%, 30% или 50%. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой Т-клетки.

[0178] В некоторых вариантах осуществления mAb предварительно связывают с подложкой или поверхностью. Неограничивающие примеры твердой подложки могут включать гранулу, гранулу агарозы, магнитную гранулу, пластиковый планшет с лунками, стеклянный планшет с лунками, керамический планшет с лунками, колонку или пакет для культивирования клеток.

[0179] CAR-экспрессирующие иммунные клетки, подлежащие введению реципиенту, могут быть обогащены in vitro из исходной популяции. Способы размножения исходных популяций могут включать отбор клеток, которые экспрессируют антиген, такой как антиген CD34, с использованием комбинаций центрифугирования в градиенте плотности, очистки иммуномагнитными гранулами, аффинной хроматографии и сортировки клеток с активированной флуоресценцией.

[0180] Для количественного определения конкретных типов клеток в популяции клеток может использоваться проточная цитометрия. В целом, проточная цитометрия представляет собой способ количественного определения компонентов или структурных признаков клеток, главным образом с помощью оптических средств. Поскольку различные типы клеток можно различить путем количественного определения структурных признаков, проточная цитометрия и сортировка клеток могут использоваться для подсчета и сортировки клеток разных фенотипов в смеси.

[0181] Анализ проточной цитометрии включает две основных стадии: 1) мечение выбранных типов клеток одним или более мечеными маркерами и Т) определение количества меченых клеток по отношению к общему количеству клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления способ мечения типов клеток предусматривает связывание меченых антител с маркерами, экспрессируемыми конкретным типом клеток. Антитела могут быть либо непосредственно мечены флуоресцентным соединением, либо опосредованно мечены с использованием, например, второго антитела с флуоресцентной меткой, которое распознает первое антитело.

[0182] В некоторых вариантах осуществления способ, используемый для сортировки Т-клеток, экспрессирующих CAR, представляет собой сортировку клеток с магнитной активацией (MACS). Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS) представляет собой способ разделения различных популяций клеток в зависимости от их поверхностных антигенов (молекул CD) с использованием суперпарамагнитных наночастиц и колонок. MACS может использоваться для получения чистой популяции клеток. Клетки в одноклеточной суспензии можно подвергнуть магнитному мечению с помощью микрогранул. Образец наносят на колонку, состоящую из ферромагнитных сфер, покрытых безвредным для клеток покрытием, обеспечивающим быстрое и осторожное разделение клеток. Немеченые клетки проходят, а клетки с магнитной меткой остаются внутри колонки. Проходящий поток можно собрать как фракцию немеченных клеток. После стадии промывки колонку удаляют из сепаратора и клетки с магнитной меткой элюируют из колонки.

[0183] Подробный протокол очистки конкретной популяции клеток, например Т-клеток, можно найти у Basil S et al. (2010). (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp.(41): 1546).

[0184] В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способ истощения CAR-экспрессирующих иммунных клеток, специфических по отношению к CD19, путем in vivo истощения. In vivo истощение может предусматривать введение средства лечения (например, молекулы, которая связывает эпитоп на CAR) в организм млекопитающего с целью прекращения пролиферации экспрессирующих CAR иммунных клеток путем подавления или элиминации.

[0185] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR для CD19, содержащий специфический по отношению к mAb эпитоп, включающий приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной CAR-экспрессирующей иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим по отношению к эпитопу mAb. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ in vivo истощения CAR-экспрессирующей иммунной клетки, которая содержит химерный scFv (например, образованный путем вставки специфического по отношению к mAb эпитопа), путем приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки со специфическими по отношению к эпитопу антителами. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой Т-клетки, и/или антитела являются моноклональными.

[0186] В соответствии с одним вариантом осуществления in vivo истощение иммунных сконструированных клеток выполняют на сконструированных иммунных клетках, которые были предварительно отсортированы с применением способа in vitro по настоящему изобретению. В данном случае можно использовать то же инфузированное mAb. В некоторых вариантах осуществления специфический по отношению к mAb антиген представляет собой антиген CD20, а специфическое по отношению к mAb представляет собой ритуксимаб. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, содержащий специфический по отношению к mAb эпитоп (CAR-экспрессирующей иммунной клетки), у пациента, включающий приведение в контакт указанной CAR-экспрессирующей иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим по отношению к эпитопу mAb.

[0187] В некоторых вариантах осуществления стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной CAR-экспрессирующей иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим по отношению к эпитопу mAb предусматривает инфузию пациенту специфического по отношению к эпитопу mAb (например, ритуксимаба). В некоторых вариантах осуществления количество специфического в отношении эпитопа mAb, вводимое пациенту, является достаточным для уничтожения по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% экспрессирующих CAR иммунных клеток у пациента.

[0188] В некоторых вариантах осуществления стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной CAR-экспрессирующей иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим по отношению к эпитопа mAb предусматривает инфузию пациенту 375 мг/м² ритуксимаба один или более раз. В некоторых вариантах осуществления mAb (например, ритуксимаб) вводят один раз в неделю.

[0189] В некоторых вариантах осуществления при истощении иммунных клеток, экспрессирующих CAR, содержащий специфический в отношении mAb эпитоп (экспрессирующих CAR иммунных клеток), в анализе комплементзависимой цитотоксичности (CDC) с использованием специфического по отношению к эпитопу mAb количество жизнеспособных экспрессирующих CAR иммунных клеток снижается. В некоторых вариантах осуществления количество жизнеспособных экспрессирующих CAR иммунных клеток снижается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления указанный специфический в отношении mAb эпитоп представляет собой эпитоп CD20 или мимотоп, и/или специфическое по отношению к эпитопу mAb представляет собой ритуксимаб.

[0190] В определенных вариантах осуществления in vivo истощение CAR-сконструированных иммунных клеток осуществляют путем инфузий биспецифических антител. По определению биспецифическое моноклональное антитело (BsAb) представляет собой искусственный белок, который состоит из фрагментов двух разных моноклональных антител и, следовательно, связывается с антигенами двух разных типов. Эти BsAb и их применение в иммунотерапии были рассмотрены в Muller D and Kontermann R.E. (2010) Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2): 89-98.

[0191] В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления инфузированное биспецифическое mAb способно связывать как специфический по отношению к mAb эпитоп, переносимый на сконструированных иммунных клетках, экспрессирующих химерный scFv, так и поверхностный антиген на эффекторной и цитотоксической клетке (например, на иммунных клетках, таких как лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки, натуральные киллерные клетки (NK-клетки), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL)). Таким образом, истощение сконструированных иммунных клеток, вызванное BsAb, может происходить из-за антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). (Deo Y М, Sundarapandiyan K, Keler Т, Wallace PK, and Graziano RF, (2000), Journal of Immunology, 165 (10):5954-5961).

[0192] В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое лекарственное средство связывается со специфическими по отношению к эпитопу mAb, которые можно использовать для истощения CAR-экспрессирующих иммунных клеток. При объединении нацеливающих способностей моноклональных антител со способностью цитотоксических лекарственных средств уничтожать раковые клетки конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) позволяет четко различать здоровую и больную ткань по сравнению с применением лекарственного средства отдельно. Одобрения к продаже были получены для нескольких ADC; технология их получения, особенно на линкерах, описана в (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; патент США №4975278).

[0193] В некоторых вариантах осуществления специфическое по отношению к эпитопу mAb, подлежащее инфузии, предварительно конъюгируют с молекулой, способной стимулировать комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Следовательно, система комплемента усиливает или дополняет способность антител выводить патогены из организма. При стимуляции запускается каскад активации как массивное усиление ответа и активация мембраноатакующего комплекса, уничтожающего клетки. Для конъюгации с mAb могут использоваться различные молекулы, такие как гликаны (Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, С, Guezermec, J., Bordron, A. and Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments may be acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5).

VI. Наборы и изделия

[0194] Настоящая заявка предусматривает наборы, включающие любой из CD19-содержащих CAR или CAR для CD19, содержащие иммунные клетки, описанные в данном документе, и их фармацевтические композиции. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления набор по настоящему изобретению содержит аллогенные Т-клетки, содержащие CAR для CD19, и антитело CD52 для введения субъекту в соответствии со схемой проведения лимфодеплеции и CAR-T.

[0195] Настоящая заявка также предусматривает изделия, содержащие любые из терапевтических композиций или наборов, описанных в данном документе. Примеры изделия включают флаконы (например, закупоренные флаконы).

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Создание устойчивых к ритуксимабу иммунных клеток с CAR для CD19

[0196] Создавали устойчивые к ритуксимабу конструкции химерного антигенного рецептора CD19, которые не экспрессируют участок связывания ритуксимаба, как показано на ФИГ. 1 и в таблице 4. Конструкции лентивирусных векторов вводили в клеточную линию, пакующую вирусы, и получали лентивирусы, содержащие CAR для CD19, в Allogene.

[0197] Пан-Т-клетки от четырех доноров-людей (541, 604, 410 и 2593) размораживали и активировали в концентрации 1,5×10⁶ клеток/мл с помощью крупномасштабного Т Cell TransAct™ (соотношение 1:15) в присутствии IL-2 (100 МЕ/мл). После 2 дней 1,5×10⁶ клеток (в 3 мл) трансдуцировали 2 мл свежеполученного лентивируса, содержащего векторы, описанные в таблице 4. Схематические изображения модифицированных векторов представлены на фигуре 1. Добавляли IL-2 (100 МЕ/мл) в дни 0, 2, 5, 7, 9 и 12. Общее количество клеток, составляющее 6×10⁶, переносили в 6-луночный планшет G-Rex в день 5 и осуществляли обмен сред в дни 9 и 12. Клетки замораживали в день 13.

[0198] Эксперименты с использованием проточной цитометрии проводили на трансдуцированных клетках, с отображением данных для лимфоцитов, живых CD3+, CAR+, CD4/CD8 и маркеров нижеследующих процессов. Проверку трансдукции клеток человека и анализ с использованием панели CD34 проводили в день 5 и день 13 с использованием панели CD3, CD4, CD8, жизнеспособности, CD34 и антиидиотипа к антителу к CAR для CD19 (anti-Id 4G7). На ФИГ. 2А и 2В представлены графики проточной цитометрии, демонстрирующие экспрессию CAR в день 5, полученных от пан-Т-клеток, транс дуцированных экспрессионными векторами CAR, показанными в таблице 4, с использованием anti-Id к антителу к CAR для CD19.

[0199] Проточную цитометрию с использованием фенотипа человека и панели для активации проводили в день 9 и 13. Панель включала CD3, CD4, CD8, жизнеспособность, CD45RO, CD62L, CD25, 4-1 ВВ, PD-1, антиидиотип к антителу к CAR для CD19 и TIM3. Клетки нормализовали для размножения клеток и конечной экспрессии CAR для всех четырех доноров в день 13 (ФИГ. 3). Данные на ФИГ. 3 показывают, что хотя v1.2 продемонстрировал более высокую степень трансдукции (% CAR+), клетки, трансдуцированные v1.2 , продемонстрировали более низкие уровни экспрессии CAR (CAR MFI) по сравнению с, например, v1.0 и vl.l. За размножением клеток и экспрессией CAR для пан-Т-клеток от донора 541 (ФИГ. 4А), 604 (ФИГ. 4В), 410 (ФИГ. 4С), 2593 (ФИГ. 4D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR, следили с течением времени.

[0200] Соотношение CD4/CD8 измеряли в дни 5, 9 и 13 для пан-Т-клеток от донора 541 (ФИГ. 5А), 604 (ФИГ. 5В), 410 (ФИГ. 5С), 2593 (ФИГ. 5D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR. На ФИГ. 6A-6D показаны фенотип и активация в день 9 пан-Т-клеток от доноров 541 (ФИГ. 6А), 604 (ФИГ. 6В), 410 (ФИГ. 6С), 2593 (ФИГ. 6D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR. На ФИГ. 7 показаны фенотип, % активации CD8+ и анергия Т-клеток, измеренные с использованием среднего значения окрашивания TIM3 и PD1 для всех четырех доноров в день 9. Фенотип и активацию измеряли в день 13 для пан-Т-клеток от донора 541 (ФИГ. 8А), 604 (ФИГ. 8В), 410 (ФИГ. 8С), 2593 (ФИГ. 8D), трансдуцированных устойчивыми к ритуксимабу экспрессионными векторами CAR. На ФИГ. 9 показаны фенотип, % активации CD8+ и анергия Т-клеток, измеренные с использованием значения окрашивания TIM3 и PD1 для всех четырех доноров в день 13.

Пример 2. Кратко- и долговременные in vitro анализы гибели клеток

[0201] Трансдуцированные клетки CAR из примера 1 тестировали для определения характеристик кратко- и долговременной гибели клеток. Совместные культуры Т-клеток с CAR с клетками Раджи (соотношение эффектора-и-мишени 2:1) получали для последующего анализа Luminex. Средние значения кратковременных (24 ч.) анализов гибели клеток с использованием клеток Раджи в качестве клеток-мишеней определяли для каждой конструкции CAR (ФИГ. 10). На ФИГ. 11А 11D показаны средние долговременные значения анализа гибели клеток с использованием клеток A549-CD19+в качестве клеток-мишеней с Е:Т, составляющим 8:1 (ФИГ. 11А), 4:1 (ФИГ. 11В), 2:1 (ФИГ. 11С) и 1:1 (ФИГ. 11D) для каждой конструкции CAR.

[0202] Результаты анализа гибели клеток анализировали для определения корреляции с фенотипическими характеристиками. Процент гибели клеток в день 7 при соотношении эффектора-и-мишени, составляющем 1:1, отрицательно коррелировал с CAR+CD4+41BB+, CAR+CD4+Tim3+(р=0,0352), CAR+CD4+T_EM+ (р=0,0328), CAR+CD8+PD-1+ (р=0,0269) и % экспрессии CAR в день 13 (р=0,0245). Процент гибели клеток в день 7 при соотношении эффектора-и-мишени, составляющем 1:1, положительно коррелировало с CAR+CD8+T_SCM+. Процент гибели клеток в день 9 при соотношении эффектора-и-мишени, составляющем 1:1, отрицательно коррелировало с CAR+CD4+Tim3+, CAR+CD4+T_EM+ (р=0,0031), CAR+CD8+T_cm+ (р=0,0182) и % экспрессии CAR в день 13 (р=0,0469). Процент гибели клеток в день 9 при соотношении эффектора-и-мишени, составляющем 1:1, положительно коррелировало с CAR+CD8+T_SCM+, CAR+CD8+Tim3-PD-1- (р=0,0318) и CAR+CD4+T_SCM+ (p=0,0289).

Пример 3. Анализ титров лентивируса, содержащих разные лентивирусные конструкции

[0203] В этом эксперименте конструкции лентивирусных векторов вводили в клеточную линию, пакующую вирусы, и CAR для CD19, содержащие лентивирусы, получали и титры определяли с помощью Lentigen (Гейтерсберг, Мэриленд, США) согласно протоколу, подобному таковому из примера 1.

[0204] Титры лентивируса оценивали либо путем измерения физических титров уровней вирусного белка р24, либо путем измерения трансдуцирующих титров. Неожиданно было обнаружено, что если переключатель безопасности RQR8 удаляли из лентивирусной конструкции v1.0 , то вирусный титр в значительной степени уменьшался (сравнение v1.0 c v1.1b таблице 5). Титр был улучшен, когда промотор EF1aB v1.1 заменяли коротким или укороченным промотором EF1a, как и в v1.2 («ЕЕ1а(короткий)промотор»).

[0205] Для анализа стойкости лентивирусных препаратов CAR v1.0 для CD19, v1.2 и vl.3 проводили анализ с титрованием вируса. Анализировали последовательное объемное разбавление лентивирусных препаратов v1.0 , v1.2 и v1.3 для определения % CAR+ Т-клеток в день 5 после трансдукции пан-Т-клеток. Результаты показали, что при низком разбавлении (например, 10% об./об.), все три конструкции продемонстрировали подобную приемлемую эффективность трансдукции. Однако при возрастающих разбавлениях (например, 3,3%, 1,1% об./об.) эффективность трансдукции устойчивой к ритуксимабу конструкции CAR v1.3 для CD19 в значительной степени падала по сравнению с другой устойчивой к ритуксимабу конструкции CAR v1.2 для CD19. См. ФИГ. 12. Конструкцию v1.2 выбирали для in vivo анализа.

Пример 4. In vivo анализ количественного определения биологической активности

[0206] В данном эксперименте in vivo противоопухолевую биологическую активность ALLO-501v1.2 анализировали по сравнению с ALLO-501v1.0 в мышиной модели опухоли. CD19-положительные клетки Раджи, которые несут репортерный ген люциферазы, вводили мышам NSG. Лентивирус, содержащий лентивирусную конструкцию v1.0 или v1.2, трансдуцировали пан-Т-клеткам доноров 541 и 604. Вводили 100000 клеток Раджи с люциферазой мышам NSG посредством инъекции в хвостовую вену. В день 4 после введения несущим клетки Раджи мышам NSG вводили конструкцию CAR в указанных дозах. Приживление и прогрессирование клеток Раджи оценивали с помощью введения внутрибрюшинно субстрата люциферазы с последующим измерением кумулятивных сигналов люциферазы. Результаты показаны на ФИГ. 13А (донор 541) и ФИГ. 13В (донор 604).

[0207] Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные варианты применения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от идей данного документа и формулы изобретения, представленной ниже. Вышеприведенные примеры предусмотрены для лучшего иллюстрирования раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, представленных в данном документе. Хотя настоящие идеи были описаны в определениях этих иллюстративных вариантов осуществления, специалист в данной области техники легко поймет, что многочисленные вариации и модификации этих иллюстративных вариантов осуществления возможны без чрезмерных экспериментов. Все такие вариации и модификации находятся в рамках действующих идей.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АЛЛОДЖЕН ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.

<120> УСТОЙЧИВЫЕ К РИТУКСИМАБУ ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ПУТИ

ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> AT-028/03WO

<140>

<141>

<150> 63/005,041

<151> 2020-04-03

<150> 62/839,455

<151> 2019-04-26

<160> 41

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 2019

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 1

atgctgacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgat

60

gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggaggcg gcggcagcga gctgcccacc

120

cagggcacct tctccaacgt gtccaccaac gtgagcccag ccaagcccac caccaccgcc

180

tgtccttatt ccaatccttc cctgtgtagc ggagggggag gcagcccagc ccccagacct

240

cccaccccag cccccaccat cgccagccag cctctgagcc tgagacccga ggcctgccgc

300

ccagccgccg gcggcgccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc

360

tgggccccac tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac

420

tgcaaccacc gcaaccgcag gcgcgtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt gagagccgag

480

ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga acccaggccc catggagacc

540

gacaccctgc tgctgtgggt gctgctgctg tgggtgccag gcagcaccgg cgaggtgcag

600

ctgcagcaga gcggacccga gctgatcaag ccaggcgcca gcgtgaagat gagctgcaag

660

gccagcggct acaccttcac cagctacgtg atgcactggg tgaagcagaa gccaggccag

720

ggcctggagt ggatcggcta catcaacccc tacaacgacg gcaccaagta caacgagaag

780

ttcaagggca aggccaccct gaccagcgac aagagcagca gcaccgccta catggagctg

840

agcagcctga ccagcgagga cagcgccgtg tactactgcg ccagaggcac ctactactac

900

ggcagccggg tgttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgag ctctggcgga

960

ggcggctctg gcggaggcgg ctctggcgga ggcggcagcg acatcgtgat gacccaggct

1020

gcccccagca tccccgtgac cccaggcgag agcgtgagca tcagctgccg gagcagcaag

1080

agcctgctga acagcaacgg caacacctac ctgtactggt tcctgcagcg gccaggccag

1140

agcccccagc tgctgatcta ccggatgagc aacctggcca gcggcgtgcc cgaccggttc

1200

agcggcagcg gcagcggcac cgccttcacc ctgcggatca gccgggtgga ggccgaggac

1260

gtgggcgtgt actactgcat gcagcacctg gagtacccct tcaccttcgg agccggcacc

1320

aagctggagc tgaagcggtc ggatcccacc accaccccag ccccacggcc acctacccct

1380

gccccaacca tcgccagcca gcccctgagc ctgcggcctg aagcctgcag gcctgccgcc

1440

ggaggagccg tgcacacaag gggcctggac ttcgcctgcg acatctatat ctgggccccc

1500

ctggccggga catgcggggt gctgctgctg tccctggtga ttacactgta ttgcaaacgg

1560

ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccacc

1620

caggaggagg acggctgcag ctgccggttc cccgaggaag aggaaggcgg ctgcgagctg

1680

cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc ccagcctacc agcagggcca gaaccagctg

1740

tacaacgagc tgaacctggg acggcgggag gagtacgacg tgctggacaa gcggcgggga

1800

cgggaccccg agatgggcgg caagcctcgc cggaagaatc cccaggaggg cctgtacaac

1860

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg

1920

cgccggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc

1980

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgcca ccccggtga

2019

<210> 2

<211> 1488

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 2

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg cagcaccggc

60

gaggtgcagc tgcagcagag cggacccgag ctgatcaagc caggcgccag cgtgaagatg

120

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgtga tgcactgggt gaagcagaag

180

ccaggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac

240

aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accagcgaca agagcagcag caccgcctac

300

atggagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagaggcacc

360

tactactacg gcagccgggt gttcgactac tggggccagg gcaccaccct gaccgtgagc

420

tctggcggag gcggctctgg cggaggcggc tctggcggag gcggcagcga catcgtgatg

480

acccaggctg cccccagcat ccccgtgacc ccaggcgaga gcgtgagcat cagctgccgg

540

agcagcaaga gcctgctgaa cagcaacggc aacacctacc tgtactggtt cctgcagcgg

600

ccaggccaga gcccccagct gctgatctac cggatgagca acctggccag cggcgtgccc

660

gaccggttca gcggcagcgg cagcggcacc gccttcaccc tgcggatcag ccgggtggag

720

gccgaggacg tgggcgtgta ctactgcatg cagcacctgg agtacccctt caccttcgga

780

gccggcacca agctggagct gaagcggtcg gatcccacca ccaccccagc cccacggcca

840

cctacccctg ccccaaccat cgccagccag cccctgagcc tgcggcctga agcctgcagg

900

cctgccgccg gaggagccgt gcacacaagg ggcctggact tcgcctgcga catctatatc

960

tgggcccccc tggccgggac atgcggggtg ctgctgctgt ccctggtgat tacactgtat

1020

tgcaaacggg gccggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg

1080

cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc

1140

tgcgagctgc gggtgaagtt cagccggagc gccgacgccc cagcctacca gcagggccag

1200

aaccagctgt acaacgagct gaacctggga cggcgggagg agtacgacgt gctggacaag

1260

cggcggggac gggaccccga gatgggcggc aagcctcgcc ggaagaatcc ccaggagggc

1320

ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag

1380

ggcgagcggc gccggggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc

1440

aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgccac cccggtga

1488

<210> 3

<211> 1488

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 3

atggagacag ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcctgg ctccacagga

60

gaggtgcagc tgcagcagtc tggaccagag ctgatcaagc ctggagcatc cgtgaagatg

120

tcttgcaagg ccagcggcta tacattcacc agctacgtga tgcactgggt gaagcagaag

180

cctggccagg gcctggagtg gatcggctat atcaatccat acaacgacgg caccaagtat

240

aatgagaagt ttaagggcaa ggccacactg acctctgata agagctcctc tacagcctac

300

atggagctga gctccctgac ctctgaggac agcgccgtgt actattgcgc cagaggcaca

360

tactattacg gcagcagggt gttcgattac tggggccagg gcaccacact gaccgtgtct

420

agcggaggag gaggctccgg aggaggaggc tctggcggcg gcggcagcga catcgtgatg

480

acacaggcag caccaagcat cccagtgacc cctggcgaga gcgtgtccat ctcttgtcgg

540

tcctctaagt ccctgctgaa ctctaatggc aacacctatc tgtactggtt tctgcagcgg

600

cccggacagt ccccacagct gctgatctat aggatgagca acctggcatc cggagtgcct

660

gatcgcttca gcggctccgg ctctggaaca gcctttaccc tgaggatctc tcgggtggag

720

gcagaggacg tgggcgtgta ttactgcatg cagcacctgg agtacccctt cacatttggc

780

gcaggaacca agctggagct gaagcggagc gaccccacca caacccctgc accacggccc

840

cctacaccag cacctaccat cgcatctcag ccactgagcc tgcggcccga ggcctgtagg

900

cctgcagcag gaggagcagt gcacaccagg ggcctggact tcgcctgcga tatctatatc

960

tgggcaccac tggcaggaac atgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtat

1020

tgcaagagag gcaggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agccttttat gcggccagtg

1080

cagacaaccc aggaggagga tggctgctcc tgtagattcc cagaggagga ggagggagga

1140

tgtgagctgc gcgtgaagtt tagccggtcc gccgacgcac cagcatatca gcagggccag

1200

aatcagctgt acaatgagct gaacctgggc cggagagagg agtacgacgt gctggataag

1260

aggaggggaa gggaccccga gatgggaggc aagccacgga gaaagaatcc ccaggagggc

1320

ctgtataacg agctgcagaa ggataagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag

1380

ggagagaggc gccggggcaa gggacacgac ggcctgtatc agggcctgtc cacagccacc

1440

aaggacacct acgatgccct gcacatgcag gccctgccac caaggtga

1488

<210> 4

<211> 1875

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 4

atgggaacaa gcctgctgtg ctggatggct ctgtgcctgc tgggggccga ccacgctgac

60

gcctccgggg gggggggctc tcctgcccct aggcccccta cacctgcacc aaccatcgca

120

tcccagccac tgtctctgcg ccctgaggcc tgccggccag cagcaggagg agcagtgcac

180

acccgcggcc tggacttcgc ctgcgatatc tatatctggg caccactggc aggcacatgt

240

ggcgtgctgc tgctgagcct ggtcatcacc ctgtactgca atcacaggaa ccggagaagg

300

gtgtgcaagt gtccccggcc tgtggtgaga gcagagggaa ggggcagcct gctgacatgt

360

ggcgacgtgg aggagaatcc aggccctatg gagacagata ccctgctgct gtgggtgctg

420

ctgctgtggg tgcccggcag caccggagag gtgcagctgc agcagtccgg accagagctg

480

atcaagcctg gagccagcgt gaagatgtcc tgtaaggcct ctggctatac attcaccagc

540

tacgtgatgc actgggtgaa gcagaagcct ggccagggcc tggagtggat cggctatatc

600

aatccataca acgacggcac aaagtataac gagaagttta agggcaaggc cacactgacc

660

tccgataaga gctcctctac agcctacatg gagctgagct ccctgacctc tgaggacagc

720

gccgtgtact attgcgccag aggcacatac tattacggct ctagggtgtt cgattactgg

780

ggccagggca ccacactgac cgtgtctagc ggaggaggag gcagcggagg aggaggctcc

840

ggcggcggcg gctctgacat cgtgatgaca caggcagcac catccatccc agtgacccct

900

ggcgagagcg tgtccatctc ttgtcggtcc tctaagagcc tgctgaactc caatggcaac

960

acctatctgt actggtttct gcagcggccc ggacagagcc cacagctgct gatctatagg

1020

atgtctaatc tggcaagcgg cgtgcccgat cgcttcagcg gctccggctc tggcacagcc

1080

tttaccctga ggatctcccg cgtggaggca gaggacgtgg gcgtgtatta ctgcatgcag

1140

cacctggagt accccttcac atttggcgca ggcaccaagc tggagctgaa gcggagcgac

1200

cccaccacaa cccctgcacc acggccaccc acaccagcac ctactattgc atcccagcca

1260

ctgagcctgc ggcccgaggc ctgtaggcct gccgccggcg gcgcagtgca cacccggggc

1320

ctggactttg cctgcgatat ctacatctgg gcacctctgg ccggcacatg cggcgtgctg

1380

ttactgagcc tggtcatcac cctgtattgc aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc

1440

ttcaagcagc cttttatgcg gccagtgcag acaacccagg aggaggatgg ctgctcctgt

1500

agattcccag aggaggagga gggaggatgt gagctgcgcg tgaagtttag ccggtccgcc

1560

gacgcaccag catatcagca gggccagaac cagctgtaca atgagctgaa cctgggccgg

1620

agagaggagt atgacgtgct ggataagaga cggggccggg accccgagat gggaggcaag

1680

ccacgccgga agaatcccca ggagggcctg tataacgagc tgcagaagga taagatggcc

1740

gaggcctaca gcgagatcgg catgaaggga gagagaaggc gcggcaaggg acacgacggc

1800

ctgtaccagg gcctgagcac agcaacaaaa gacacctacg acgcactgca catgcaggct

1860

ctgccccctc ggtaa

1875

<210> 5

<211> 1941

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 5

atgggaacct ctctgctgtg ctggatggct ctgtgcctgc tgggggccga tcacgctgac

60

gcaagtggcg ggggggggtc cgaactgccc acacagggca ccttctccaa cgtgagcacc

120

aacgtgagct ccggcggagg aggcagccct gcaccaaggc cccctacacc agcacctacc

180

atcgcatctc agccactgag cctgcgcccc gaggcctgcc ggcctgcagc aggcggcgcc

240

gtgcacaccc gcggcctgga ctttgcctgc gatatctata tctgggcacc tctggcaggc

300

acatgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaatca caggaaccgg

360

agaagggtgt gcaagtgtcc acggcccgtg gtgagagcag agggaagggg ctccctgctg

420

acatgtggcg acgtggagga gaatcctggc ccaatggaga cagataccct gctgctgtgg

480

gtgctgctgc tgtgggtgcc cggctccacc ggagaggtgc agctgcagca gtctggacca

540

gagctgatca agccaggagc atccgtgaag atgtcttgta aggccagcgg ctatacattc

600

accagctacg tgatgcactg ggtgaagcag aagccaggac agggcctgga gtggatcggc

660

tatatcaatc cttacaacga cggcaccaag tataacgaga agtttaaggg caaggccaca

720

ctgacctctg ataagtctag ctccacagcc tacatggagc tgtctagcct gaccagcgag

780

gactccgccg tgtactattg cgccagaggc acatactatt acggcagcag ggtgttcgat

840

tactggggcc agggcaccac actgaccgtg tcctctggag gaggaggctc cggaggagga

900

ggctctggcg gcggcggcag cgacatcgtg atgacacagg cagcaccttc catcccagtg

960

accccaggcg agtctgtgag catctcctgt cggagctcca agtccctgct gaactctaat

1020

ggcaacacct atctgtactg gtttctgcag cggcccggac agtccccaca gctgctgatc

1080

tataggatga gcaatctggc ctccggcgtg ccagatcgct tctctggcag cggctccggc

1140

acagccttta ccctgaggat ctctcgcgtg gaggcagagg acgtgggcgt gtattactgc

1200

atgcagcacc tggagtaccc attcacattt ggcgcaggca ccaagctgga gctgaagcgg

1260

agcgacccca ccacaacccc agcacctcgg ccacccacac cagcacccac catcgcatct

1320

cagcctctga gcctgcggcc cgaggcctgt aggcccgcag caggaggagc agtgcacacc

1380

cggggcctgg acttcgcctg cgatatctac atctgggcac cactggccgg cacatgcggc

1440

gtgctgttac tgagcctggt catcaccctg tattgcaagc ggggcagaaa gaagctgctg

1500

tacatcttca agcagccctt tatgcggcct gtgcagacaa cccaggagga ggatggctgc

1560

tcctgtagat tccctgagga ggaggaggga ggatgtgagc tgcgcgtgaa gttttctcgg

1620

agcgccgacg caccagcata tcagcaggga cagaaccagc tgtacaatga gctgaacctg

1680

ggccggagag aggagtatga cgtgctggat aagagacggg gccgggaccc cgagatggga

1740

ggcaagcctc gccggaagaa tccacaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggataag

1800

atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggagaga gaaggcgcgg caagggacac

1860

gacggcctgt accagggcct gagcacagca acaaaagaca cctacgacgc actgcacatg

1920

caggctctgc caccaagatg a

1941

<210> 6

<211> 2019

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 6

atggggacct cactgctgtg ctggatggct ctgtgcctgc tgggggccga ccacgctgac

60

gcctgctctg gggggggggg gggctcatgc tccggaggag gaggctctga gctgccaacc

120

cagggcacat tctccaacgt gagcaccaac gtgtctcctg ccaagccaac cacaaccgca

180

tgcagcggcg gaggaggagg cagctgttcc ggcggcggcg gcagccctgc cccaaggccc

240

cctaccccag cacctacaat cgcatctcag cctctgagcc tgcgcccaga ggcctgtcgg

300

cccgcagcag gaggagcagt gcacacccgc ggcctggact ttgcctgcga tatctatatc

360

tgggcaccac tggcaggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac

420

tgcaatcaca ggaaccggag aagggtgtgc aagtgtccac ggcccgtggt gagagcagag

480

ggaaggggct ctctgctgac ctgtggcgac gtggaggaga atcctggccc tatggagaca

540

gatacactgc tgctgtgggt gctgctgctg tgggtgcccg gcagcacagg agaggtgcag

600

ctgcagcagt ccggacctga gctgatcaag ccaggcgcct ccgtgaagat gtcttgcaag

660

gccagcggct ataccttcac aagctacgtg atgcactggg tgaagcagaa gccaggccag

720

ggcctggagt ggatcggcta tatcaatccc tacaacgacg gcaccaagta taacgagaag

780

tttaagggca aggccaccct gacaagcgat aagagctcct ctaccgccta catggagctg

840

agctccctga caagcgagga ctccgccgtg tactattgcg ccagaggcac ctactattac

900

ggctccaggg tgttcgatta ctggggccag ggcacaaccc tgacagtgtc tagcggagga

960

ggaggcagcg gaggaggagg ctccggcggc ggcggctctg acatcgtgat gacccaggca

1020

gcaccatcca tccctgtgac accaggcgag tctgtgagca tctcctgtcg gtcctctaag

1080

tccctgctga actctaatgg caacacctat ctgtactggt ttctgcagcg gcccggacag

1140

tctcctcagc tgctgatcta taggatgagc aatctggcct ccggcgtgcc tgatcgcttc

1200

tctggcagcg gctccggcac cgcctttaca ctgaggatca gccgcgtgga ggcagaggac

1260

gtgggcgtgt attactgcat gcagcacctg gagtaccctt tcacctttgg cgccggcaca

1320

aagctggagc tgaagcggag cgaccccaca accacaccag cacctcggcc acccacccca

1380

gcaccaacaa tcgcatctca gccactgagc ctgcggcccg aggcctgtag gccagccgcc

1440

ggcggcgcag tgcacacccg gggcctggac ttcgcctgcg atatctacat ctgggcccct

1500

ctggccggca cctgcggcgt gctgttactg agcctggtca tcaccctgta ttgcaagcgg

1560

ggcagaaaga agctgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccaca

1620

caggaggagg atggctgctc ctgtagattc ccagaggagg aggagggagg atgtgagctg

1680

cgcgtgaagt tttctcggag cgccgacgca cctgcatatc agcagggaca gaaccagctg

1740

tacaatgagc tgaacctggg ccggagagag gagtatgacg tgctggataa gagacggggc

1800

cgggaccccg agatgggagg caagccccgc cggaagaatc ctcaggaggg cctgtataac

1860

gagctgcaga aggataagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggagagaga

1920

aggcgcggca agggccacga cggcctgtac cagggcctgt ccacagcaac aaaggatact

1980

tatgacgctc tgcacatgca ggctctgccc cctcggtga

2019

<210> 7

<211> 2061

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 7

atgggaacca gcctgctgtg ctggatggca ctgtgcctgc tgggagcaga ccacgccgat

60

gccgaactgc ctactcaggg gacattctct aatgtgagca ccaacgtgag ctctggagga

120

ggaggctccg agctgccaac ccagggcaca ttctctaatg tgagcacaaa cgtgtctccc

180

gccaagccta ccacaaccgc cgaactgcct acccagggca cattttccaa cgtgtctacc

240

aacgtgtcta gcggaggagg aggctccccc gcacctaggc cccctacccc agcaccaaca

300

atcgcaagcc agcctctgtc cctgcgccca gaggcatgca ggccagcagc aggaggagca

360

gtgcacaccc gcggcctgga ctttgcctgc gatatctata tctgggcacc actggcagga

420

acctgtggcg tgctgctgct gtctctggtc atcaccctgt actgcaatca cagaaaccgg

480

agaagggtgt gcaagtgtcc tcggccagtg gtgagagcag agggaagggg cagcctgctg

540

acctgtggcg acgtggagga gaatcccggc cctatggaga cagatacact gctgctgtgg

600

gtgctgctgc tgtgggtgcc aggctctaca ggagaggtgc agctgcagca gagcggacct

660

gagctgatca agccaggcgc ctctgtgaag atgagctgca aggcctccgg ctataccttc

720

acaagctacg tgatgcactg ggtgaagcag aagccaggcc agggcctgga gtggatcggc

780

tatatcaatc cctacaacga cggcaccaag tataacgaga agtttaaggg caaggccacc

840

ctgacatccg ataagagctc ctctaccgcc tacatggagc tgagctccct gacatccgag

900

gactctgccg tgtactattg cgccagaggc acctactatt acggctctag ggtgttcgat

960

tactggggcc agggcacaac cctgacagtg tctagcggag gaggaggctc tggaggagga

1020

ggcagcggcg gcggaggctc cgacatcgtg atgacccagg cagcaccatc catcccagtg

1080

acacctggcg agagcgtgtc catctcttgt aggtcctcta agtctctgct gaacagcaat

1140

ggcaacacct atctgtactg gtttctgcag cggcccggac agagccctca gctgctgatc

1200

tataggatgt ccaatctggc ctctggagtg cctgatcgct tcagcggctc cggctctgga

1260

accgccttta cactgaggat ctcccgcgtg gaggcagagg acgtgggcgt gtattactgc

1320

atgcagcacc tggagtaccc tttcaccttt ggcgccggca caaagctgga gctgaagcgg

1380

agcgacccca caaccacacc agcaccccgg ccaccaaccc ctgcccctac aatcgcaagc

1440

cagccactgt ccctgcggcc cgaggcctgt agacctgccg ccggcggcgc cgtccatacc

1500

cgcggcctgg atttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggccgg cacttgcggc

1560

gtgctgctgc tgagcctggt catcaccctg tattgcaagc ggggcagaaa gaagctgctg

1620

tacatcttca agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cacaggagga ggatggctgc

1680

tcctgtagat tcccagagga ggaggaggga ggatgtgagc tgcgcgtgaa gtttagccgg

1740

tccgccgacg cacctgcata tcagcagggc cagaaccagc tgtacaatga gctgaacctg

1800

ggccggagag aggagtacga cgtgctggat aagagaaggg gacgggaccc cgagatggga

1860

ggcaagcccc gccggaagaa tcctcaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggataag

1920

atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggagaga gaaggcgcgg caagggacac

1980

gacggcctgt atcagggcct gtccaccgcc acaaaggaca cctacgatgc cctgcacatg

2040

caggccctgc ctccaagatg a

2061

<210> 8

<211> 672

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 8

Met Leu Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

165 170 175

Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val

180 185 190

Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

195 200 205

Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

210 215 220

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

225 230 235 240

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

245 250 255

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

260 265 270

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

275 280 285

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val

290 295 300

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

325 330 335

Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val

340 345 350

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn

355 360 365

Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu

370 375 380

Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

385 390 395 400

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val

405 410 415

Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr

420 425 430

Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp

435 440 445

Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

450 455 460

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

465 470 475 480

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

485 490 495

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

500 505 510

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

515 520 525

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

530 535 540

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

545 550 555 560

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

565 570 575

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

595 600 605

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

610 615 620

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

625 630 635 640

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

645 650 655

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 9

<211> 495

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 9

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr

180 185 190

Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu

225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro

245 250 255

Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

305 310 315 320

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

325 330 335

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

340 345 350

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

355 360 365

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

370 375 380

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

385 390 395 400

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

405 410 415

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

420 425 430

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

435 440 445

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

450 455 460

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

465 470 475 480

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 10

<211> 495

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 10

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr

180 185 190

Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu

225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro

245 250 255

Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

305 310 315 320

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

325 330 335

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

340 345 350

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

355 360 365

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

370 375 380

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

385 390 395 400

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

405 410 415

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

420 425 430

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

435 440 445

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

450 455 460

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

465 470 475 480

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 11

<211> 624

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 11

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

20 25 30

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

35 40 45

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

50 55 60

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

65 70 75 80

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

85 90 95

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu

100 105 110

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

115 120 125

Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val

130 135 140

Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

145 150 155 160

Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

195 200 205

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val

245 250 255

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

275 280 285

Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val

290 295 300

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn

305 310 315 320

Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu

325 330 335

Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

340 345 350

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val

355 360 365

Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr

370 375 380

Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp

385 390 395 400

Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

405 410 415

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

420 425 430

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

435 440 445

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

450 455 460

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

465 470 475 480

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

485 490 495

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

500 505 510

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

515 520 525

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

530 535 540

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

545 550 555 560

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

565 570 575

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

580 585 590

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

595 600 605

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

610 615 620

<210> 12

<211> 646

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 12

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln

20 25 30

Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

50 55 60

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

65 70 75 80

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

85 90 95

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

100 105 110

Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg

115 120 125

Pro Val Val Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

130 135 140

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp

145 150 155 160

Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln

165 170 175

Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser

180 185 190

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val

195 200 205

Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro

210 215 220

Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr

225 230 235 240

Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser

245 250 255

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr

260 265 270

Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

275 280 285

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

290 295 300

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val

305 310 315 320

Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu

325 330 335

Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro

340 345 350

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

355 360 365

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr

370 375 380

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

385 390 395 400

Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

405 410 415

Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

420 425 430

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

435 440 445

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

450 455 460

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

465 470 475 480

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

485 490 495

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

500 505 510

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

515 520 525

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

530 535 540

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

545 550 555 560

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

565 570 575

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

580 585 590

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

595 600 605

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

610 615 620

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

625 630 635 640

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645

<210> 13

<211> 672

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 13

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Ser Gly Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

165 170 175

Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val

180 185 190

Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

195 200 205

Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

210 215 220

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

225 230 235 240

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

245 250 255

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

260 265 270

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

275 280 285

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val

290 295 300

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

325 330 335

Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val

340 345 350

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn

355 360 365

Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu

370 375 380

Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

385 390 395 400

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val

405 410 415

Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr

420 425 430

Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp

435 440 445

Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

450 455 460

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

465 470 475 480

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

485 490 495

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

500 505 510

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

515 520 525

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

530 535 540

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

545 550 555 560

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

565 570 575

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

595 600 605

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

610 615 620

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

625 630 635 640

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

645 650 655

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 14

<211> 686

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="химерный антигенный рецептор"

<400> 14

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val

20 25 30

Ser Thr Asn Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln

35 40 45

Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr

50 55 60

Thr Thr Ala Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr

65 70 75 80

Asn Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

85 90 95

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

100 105 110

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

115 120 125

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

130 135 140

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg

145 150 155 160

Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu Gly Arg

165 170 175

Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

180 185 190

Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly

195 200 205

Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys

210 215 220

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

225 230 235 240

Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu

245 250 255

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

260 265 270

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser

275 280 285

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

290 295 300

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp

305 310 315 320

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

325 330 335

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

340 345 350

Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile

355 360 365

Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

370 375 380

Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

385 390 395 400

Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

405 410 415

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala

420 425 430

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe

435 440 445

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr

450 455 460

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

465 470 475 480

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

485 490 495

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

500 505 510

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

515 520 525

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

530 535 540

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

545 550 555 560

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

565 570 575

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

580 585 590

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

595 600 605

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

610 615 620

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

625 630 635 640

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

645 650 655

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

660 665 670

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680 685

<210> 15

<211> 1189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="искусственный промотор"

<400> 15

gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag

60

ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg

120

gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata

180

agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta

240

agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct

300

tgaattactt ccacgcccct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg

360

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt

420

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg

480

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct

540

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt

600

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg

660

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc

720

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg

780

gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc

840

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag

900

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag

960

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt

1020

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca

1080

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa

1140

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga

1189

<210> 16

<211> 237

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="промотор"

<400> 16

gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag

60

ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg

120

gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata

180

agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacag

237

<210> 17

<211> 464

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="тяжелая гамма-цепь 1 иммуноглобулина "

<400> 17

Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr

130 135 140

Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn

145 150 155 160

Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val

210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg

225 230 235 240

Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser

245 250 255

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu

260 265 270

Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro

275 280 285

Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala

290 295 300

Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val

305 310 315 320

Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe

325 330 335

Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile

355 360 365

Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380

Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp

405 410 415

Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser

420 425 430

Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly

435 440 445

Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 18

<211> 239

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="легкая каппа-цепь иммуноглобулина"

<400> 18

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp

165 170 175

Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys

195 200 205

Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys

210 215 220

Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 19

<211> 136

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="последовательность, связывающая ритуксимаб"

<400> 19

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro

20 25 30

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

35 40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

50 55 60

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

65 70 75 80

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

85 90 95

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

100 105 110

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val

115 120 125

Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

130 135

<210> 20

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="сигнальный пептид"

<400> 20

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala

20

<210> 21

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 21

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

145 150 155

<210> 22

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 22

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

1 5

<210> 23

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 23

Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn

20

<210> 24

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 24

Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 25

Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 26

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 26

Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys

1 5 10

<210> 27

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 27

Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys

1 5 10

<210> 28

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 28

Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

1 5 10 15

Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg

20 25

<210> 29

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 29

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

1 5 10 15

Ile Lys Glu

<210> 30

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 30

Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser

1 5 10 15

<210> 31

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 31

Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 32

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 32

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

1 5 10 15

<210> 33

<211> 45

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 33

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 34

<211> 231

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 34

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 35

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 35

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 36

<211> 66

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 36

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr

65

<210> 37

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 37

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 38

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 38

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 39

<211> 943

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="интрон"

<400> 39

gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg

60

ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt

120

tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg

180

agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc

240

ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac

300

gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc

360

ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag

420

gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc

480

tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc

540

ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag

600

ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa

660

aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc

720

caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg

780

gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg

840

gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct

900

caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt cag

943

<210> 40

<211> 136

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="мутированная последовательность, связывающая

молекулы ритуксимаба"

<400> 40

Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro

20 25 30

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys

35 40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

50 55 60

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

65 70 75 80

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

85 90 95

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

100 105 110

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val

115 120 125

Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

130 135

<210> 41

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> УЧАСТОК

<222> (1)..(25)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-5 'Gly

Gly Gly Gly Ser'

повторяющиеся звенья"

<400> 41

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид, содержащий химерный антигенный рецептор для CD19 (CAR), в котором полипептид не содержит участок связывания ритуксимаба, и где полинуклеотид содержит короткий промотор EF1a, который способен экспрессировать химерный антигенный рецептор для CD19 (CAR) в Т-клетке млекопитающего, а также к вектору и Т-клетке, его содержащим. Также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая вышеуказанную клетку. Изобретение эффективно для лечения заболевания или нарушения, связанных с повышенными уровнями CD19, у субъекта. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 13 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий химерный антигенный рецептор для CD19 (CAR), который на по меньшей мере 90% идентичен с SEQ ID NO: 9, где полипептид не содержит участок связывания ритуксимаба, и где полинуклеотид содержит короткий промотор EF1a, который способен экспрессировать химерный антигенный рецептор для CD19 (CAR) в Т-клетке млекопитающего,

причем короткий промотор EF1a не содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 39 и при этом содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 16.

2. Выделенный полинуклеотид по п. 1, где короткий промотор EF1a представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 16.

3. Выделенный полинуклеотид по любому из предыдущих пунктов, где полипептид содержит переключатель безопасности.

4. Выделенный полинуклеотид по п. 3, где переключатель безопасности связан с CAR к CD19 с использованием линкерного пептида.

5. Выделенный полинуклеотид по п. 3, где переключатель безопасности связан с CAR к CD19 с использованием линкера Т2А.

6. Выделенный полинуклеотид по любому из пп. 3-5, где переключатель безопасности содержит участок связывания антитела.

7. Выделенный полинуклеотид по любому из пп. 3-5, где переключатель безопасности содержит мутированный мимотоп CD20.

8. Выделенный полинуклеотид по любому из пп. 3-7, где полипептид содержит эпитоп CD34.

9. Выделенный полинуклеотид по п. 8, где эпитоп CD34 представляет собой эпитоп QBEND-10.

10. Выделенный полинуклеотид по любому из пп. 3-9, где полипептид содержит шарнирный/трансмембранный домен CD8.

11. Выделенный полинуклеотид по любому из предыдущих пунктов, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая на по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентична с любой из последовательностей нуклеиновых кислот под SEQ ID NO: 1-7.

12. Выделенный полинуклеотид по любому из предыдущих пунктов, причем полинуклеотид кодирует полипептид, который на по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8-14.

13. Экспрессионный вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по любому из предыдущих пунктов.

14. Вектор по п. 13, где вектор представляет собой ретровирусный вектор, ДНК-вектор, плазмиду, РНК-вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса, лентивирусный вектор или любую их комбинацию.

15. Сконструированная Т-клетка, которая сконструирована для экспрессии CAR к CD19, содержащая выделенный полинуклеотид по любому из пп. 1-12, где сконструированная Т-клетка не экспрессирует участок связывания ритуксимаба.

16. Сконструированная Т-клетка, которая сконструирована для экспрессии CAR к CD19, содержащая вектор по п. 13 или 14, где сконструированная Т-клетка не экспрессирует участок связывания ритуксимаба.

17. Сконструированная Т-клетка по п. 15 или 16, где иммунная клетка представляет собой Т-клетку, лимфоцит, инфильтрирующий опухоль (TIL), NK-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку или NK-T-клетку.

18. Сконструированная Т-клетка по п. 17, где клетка представляет собой аутологичную Т-клетку.

19. Сконструированная Т-клетка по п. 17, где клетка представляет собой аллогенную Т-клетку.

20. Сконструированная Т-клетка по любому из пп. 15-19, где клетка содержит полинуклеотид, который на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичен с последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3.

21. Сконструированная Т-клетка по любому из пп. 15-20, где клетка является устойчивой к ритуксимабу.

22. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, связанных с повышенными уровнями CD19, у субъекта, нуждающегося в этом, содержащая сконструированную Т-клетку по любому из пп. 15-21.

23. Применение сконструированной Т-клетки по любому из пп. 15-21 или фармацевтической композиции по п. 22 для лечения заболевания или нарушения, связанных с повышенными уровнями CD19, у субъекта, нуждающегося в этом.

24. Применение по п. 23, где заболевание или нарушение представляет собой неходжкинскую лимфому (NHL).

25. Применение по п. 23 или 24, где субъект получал лечение или в настоящее время получает лечение ритуксимабом.