СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИЛИТИЕВОЙ СОЛИ ФОСФО-АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2021 года по МПК A61K31/375 A61K31/66 C07D307/62 A61N5/10 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицинской химии и онкологии, а именно к средствам, обладающим радиосенсибилизирующей активностью, и может быть использовано для лучевой терапии в лечении онкозаболеваний.

Известен ряд соединений, обладающих радиосенсибилизирующей активностью, но их терапевтическое применение ограничено в основном низкой эффективностью и в ряде случаев токсичностью.

Известен способ получения аскорбата лития [Plotnikov E, Korotkova E, Voronova O, Dorozhko E, Bohan N, Plotnikov S. Lithium-based antioxidants: electrochemical properties and influence on immune cells. Physiology and pharmacology. 2015; 19, 107-113], включающий взаимодействие аскорбиновой кислоты и карбоната лития.

Однако получаемый препарат нестабилен в водных растворах.

Известно применение аскорбата лития в качестве радиосенсибилизатора [RU 2720455 C1, МПК A61K31/375 (2006.01), A61K41/00 (2006.01), A61P35/00 (2006.01), опубл. 30.04.2020].

Техническим результатом заявленного изобретения является получение нового средства, обладающего радиосенсибилизирующими свойствами.

Способ получения трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты с общей формулой Li₃C₆H₆O₉P заключается в том, что к аскорбиновой кислоте добавляют диоксан и 2,2-диметоксипропан, промывают петролейным эфиром, проводят фосфорилирование хлорокисью фосфора с добавлением пиридина, добавляют хлорокись фосфора, перемешивают, добавляют воду и катионит до рН 1-2. Полученный раствор фильтруют, добавляют оксид магния до рН 8, перемешивают, фильтруют, упаривают под вакуумом, затем добавляют этиловый спирт. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом и сушат на воздухе, затем растворяют в воде, добавляют катионит до рН 1, фильтруют, добавляют 1М раствор гидроксида лития в воде до рН 7, упаривают воду. Затем к остатку добавляют этиловый спирт, выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе, получая порошок трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты.

Проведенные исследования показали, что полученная трилитиевая соль фосфо-аскорбиновой кислоты обладает радиосенсибилизирующим действием, то есть усиливает повреждающее действие ионизирующего облучения на биологические объекты.

На фиг. 1 показана схема этапов получения заявленного соединения.

На фиг. 2 представлены результаты определения уровня жизнеспособности культуры клеток Jurkat через 24 и 48 часов после лучевого воздействия в дозе 5 г с применением и без применения трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения заявляемого соединения.

1 г аскорбиновой кислоты сушили в вакууме в течение 30 минут, колбу заполнили азотом, добавили 8 мл диоксана и 2,9 мл 2,2-диметоксипропана. Затем добавили 10 мкл трифторуксусной кислоты. Подключили обратный холодильник и кипятили в течение 2 часов. Реакционную массу охладили, добавили 15 мл петролейного эфира, отфильтровали полученный осадок и промыли петролейным эфиром. Получили белый порошок 4,6-ацетонида аскорбиновой кислоты, который поместили в круглодонную колбу объемом 100 мл. Заполнили колбу азотом, добавили 2 мл пиридина и 8,8 мл дистиллированной воды, перемешали. Полученную смесь охладили до -5°С, добавили 1 мл 10 М раствора KOH. Проверили рН полученного раствора (должен быть равен 13-14). Добавляли по каплям в течение 30 мин 0,6 мл свежеперегнанной хлорокиси фосфора (POCl₃). При прибавлении каждые 5 минут проверяли рН раствора. При отклонении рН ниже 12 добавляли 10 М раствора KOH до достижения рН 13-14. По окончании прибавления всего объема хлорокиси фосфора, раствор перемешивали в течение10 минут, затем добавили 5 мл воды и катионит КУ-2-8 до рН 1-2. Полученный раствор отфильтровали от катионита. Катионит промыли 200 мл воды. К полученному раствору добавили оксид магния MgO до рН 8, перемешивали в течение 30 мин, затем отфильтровали и промыли осадок 150 мл воды. Водный раствор упарили под вакуумом, добавили 30 мл этилового спирта. Выпавший осадок отфильтровали, промыли 20 мл спирта, сушили на воздухе в течение 2 часов, затем растворили в 30 мл воды, добавили катионит КУ-2-8 до рН 1, отфильтровали от катионита, катионит промыли 50 мл воды. Добавили 1М раствор гидроксида лития в воде до рН 7, после чего упарили воду. К остатку добавили 30 мл этилового спирта, выпавший осадок отфильтровали и высушили на воздухе.

Выход трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты составил 0,866 г (68%).

Элементный анализ показал состав C – 23.214, H – 2.699 2.770, что соответствует моногидрату трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты. Для соединения получен ИК спектр (KBr), ν_max, см^-1: 2800–3800 (ш), 1729, 1586, 1405, 1117, 996. ЯМР ¹H спектр (400 MHz, D₂O, δ, ppm): 3.66 (м, 2H), 3.98 (дд, 1H, J 3.5, J 9.6 Гц), 4.45 (с, 1H). ЯМР ¹³C спектр (101 MHz, D₂O, d, ppm): 63.4, 70.4, 79.3, 113.3, 113.4, 178.4.

Пример 2. Оценка радиосенсибилизирующей активности заявляемого соединения.

Исследование радиосенсибилизирующих свойств трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты проводили до и после лучевого воздействия по уровню жизнеспособности опухолевой клеточной культуры.

Готовили рабочий раствор препарата, для чего растворили 22 мг трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты в 5 мл физиологического раствора. В качестве тестовой клеточной линии использовали культуру клеток Jurkat (суспензионная опухолевая линия Т-лимфобластной лейкемии человека) в среде RPMI 1640, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков. Суспензию клеток в концентрации 500 тыс. кл/мл разливали в стерильные пробирки Эппендорфа (1,5 мл) по 975 мкл. Далее добавляли 25 мкл раствора трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты в физиологическом растворе, получая конечную концентрацию препарата в среде 1,2 ммоль/л, что соответствует установленной терапевтической концентрации лития. В контрольные образцы вносили 25 мкл физиологического раствора. Клетки выдерживали 60 минут в СО₂ инкубаторе при 37°С в среде 5% углекислого газа. Далее проводили облучение на рентгеновской установке с интенсивностью 20 мг/сек в суммарной дозе 5 г. После чего клетки переносили в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 48 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. Для учета результатов проводили определение уровня жизнеспособных клеток и мертвых клеток перед облучением и через 24 и 48 часов после облучения.

Состояние клеток учитывали методом проточной цитофлуориметрии, оценивая количество жизнеспособных клеток, погибших клеток и апоптотических клеток с использованием набора флуоресцентных красителей, набор Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, (Abcam, Великобритания) на цитометре «CytoFlex» (Beckman Coulter, США). Для этого клетки извлекали из планшета, осаждали центрифугированием (5 мин, 200 g) и ресуспендировали в красящем буфере, содержащем смесь аннексин V – FITC и пропидий иодид. Далее цитофлуометрически подсчитывали живые клетки и мертвые или погибающие клетки в состоянии апоптоза.

Результаты определения уровня жизнеспособности культуры клеток Jurkat через 24 и 48 часов после лучевого воздействия в дозе 5 г с применением и без применения трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты представлены на фиг. 2. Процент жизнеспособных клеток после лучевого воздействия в дозе 5 г при инкубации с 1,2 ммоль/л трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты был менее 3% уже через 24 часа и менее 1% через 48 часов, что статистически значимо ниже по сравнению с облучением без заявляемого соединения, где выживаемость была 36% популяции (p<0,001).

Изобретение относится к способу получения трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты с общей формулой Li₃C₆H₆O₉P, заключающемуся в том, что к аскорбиновой кислоте добавляют диоксан и 2,2-диметоксипропан, промывают петролейным эфиром, проводят фосфорилирование хлорокисью фосфора с добавлением пиридина, добавляют хлорокись фосфора, перемешивают, добавляют воду и катионит до рН 1-2, полученный раствор фильтруют, добавляют оксид магния до рН 8, перемешивают, фильтруют, упаривают под вакуумом, затем добавляют этиловый спирт, выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом и сушат на воздухе, затем растворяют в воде, добавляют катионит до рН 1, фильтруют, добавляют 1М раствор гидроксида лития в воде до рН 7, упаривают воду, далее к остатку добавляют этиловый спирт, выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе, получая порошок трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты. Технический результат заключается в создании нового радиосенсибилизирующего средства. Полученное соединение обладает радиосенсибилизирующей активностью и может быть использовано для лучевой терапии в лечении онкозаболеваний. 2 ил.

Способ получения трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты с общей формулой Li₃C₆H₆O₉P, включающий использование аскорбиновой кислоты, отличающийся тем, что к аскорбиновой кислоте добавляют диоксан и 2,2-диметоксипропан, промывают петролейным эфиром, проводят фосфорилирование хлорокисью фосфора с добавлением пиридина, добавляют хлорокись фосфора, перемешивают, добавляют воду и катионит до рН 1-2, полученный раствор фильтруют, добавляют оксид магния до рН 8, перемешивают, фильтруют, упаривают под вакуумом, затем добавляют этиловый спирт, выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом и сушат на воздухе, затем растворяют в воде, добавляют катионит до рН 1, фильтруют, добавляют 1М раствор гидроксида лития в воде до рН 7, упаривают воду, далее к остатку добавляют этиловый спирт, выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе, получая порошок трилитиевой соли фосфо-аскорбиновой кислоты.