Способ выделения нуклеозид-5-монофосфорных кислот Советский патент 1984 года по МПК C07H19/00 

Изобретение относится к области химий, конкретно, к усовершенствованнону способу получения нуклеозид5-монофосфатов, используемых в производстве- различных производных нуклеотидов для. научно-исследователь ских работ в области молекулярной биологии и генетики. Нуклеозид-5-монофосфаты получают гидролизом рибонуклеиновой кислоты, или химическим фосфорилированием нуклеозидов с последующим вьщелением целевых продуктов хроматографическими методами. . Наиболее перспективным из химических способов получения нуклеотидов является способ фосфорилирования галогенпроизводными фосфорных кисло в среде, содержащей.полярный органический растворитель Пи И Реакционная смесь после фосфорили рования нуклеозидов галогенпронзв,одными фосфорных кислот -известными способами ij и 2j содержит, в основном хлорангидрид нуклеозид-5-монофосфорной кислоты, непрореагировавший остаток нуклеозида, остаток фосфори лируюгцего агента .и полярный органический растворитель (например, три- алкилфосфат,ацетонитрил, пиридин). Известен, например, способ вьщеления целевого продукта из данной реакционной смеси ij , заключающийся в том, что реакционну1о смесь после проведения синтеза гидролизуют водой и далее после нейтрализации разделяют полученные при этом продукты на колонке с анионитом в формиатной форме. (Недостатками известного способа анионного обмена являются большие объемы колонок с ,анионитом. Кроме того, полученные растворы нуклеознд-5-монофосфорньгх к;ислот имеют очень высокую кислотность ph-5l) . При такой кислотности вьщелять непосредственно нуклеозид-5монофосфорные кислоты невозможно из-за их неустойчивости и повьппенной растворимости в кислотах. Поэтому полученные растворы нейтрализуют и целевой проду1ст выделяют в виде соли. Наиболее близким к предлагаемому является способ вьщеления нуклеозид5-монофосфорных кислот из реакционно смеси,- образующейся в процессе фосф рилирования хлорпроизводньми фосфорных кислот 2 ,3 -0-защи11ценных нукле 132 зидов, в котором использовано свойство нуклеотидов существовать в катионной форме 3j . Согласно известному способу, реакционную смесь после.фосфорилирования гидролизуют водой. Обра.зовавшуюся соляную кислоту удаляют в виде соли четвертичного аммониевого основания (например, солянокислого пиридина. Фосфорную кислоту нейтрализуют раствором гидроокиси бария или лития и отфильтровывают в виде фосфата бария или лития. На колонке с катионитом в Н-форме разделяют затем 2 ,з-0-защищенный нуклеозид-5-монофосфат и соотве ствующйй нуклеозид. На 1 o6bej сорбента наносят 1 объем водного раствора разделяемой смеси. 2 ,3-0-изопропилиден нуклеозид-5-монофосфат элюируют водой. 2,3-0-Изопропилиденнукле.озид-5-монофосфат затем самопроизвольно разлагается на нуклеозид--5-монофосфорную кислоту и ацетон в течение 1-3 ч, рН полученного таким образом водным раствором щелочи доводят до 4. Рйствор концентрирую.т,, нейтрализуют (рН )раствором щелочи. Образовавшуюся соль высаживают этанолом, отфильтровывают и сушат. Получают . соли нуклеозид-5-монофосфорных кислот с выходом 60-80%. Полученные соли переводят в соответствующие кислоты, пропуская их через колонку с катиокйтом в И -форме. Элюат упаривают в вакууме. Выход нуклеозид-5-монофосфорных кислот в известном способе составляет 40-80%-. Недостатком известного способа явпяётся сложность цроцесса выделе- . ния, высокая кислотность элюата (рН l) , из которого целевые соединения получают в виде солей. Свободные нуклеозид-5 -монофосфорные кислоты известным способом можно получить только путем повторного .пропускания водного раствора соответствуищей соли .,1через коленку с катионитом в И форме и упаривания полученного водного раствора. Цель изобретения - упрощение процесса. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения / нуклеозид-5-монофосфатов из смеси, образующейся при фосфорилировании нуклеозидов галогенпроизводными фосфорных кислот в среде полярных растворителей, путем нанесения на колонку, заполненную катионитом в Н форме, с последующим элюирование водой и выделением целевого продукта упариванием элюата реакционную смесь непосредственнопосле фосфори лирования наносят на колонку, заполненную 3-25-кратным (по объему ; количеством катионита в Н -форме, предварительно уравновешенного поля ным растворителем, колонку элюируют водой при температуре 1-20 С. Нукле зид-5-монофосфорные кислоты вьщеляют из злюата упариванием.Ьыход составляет 80-90% в расчете на количес во целевого продукта, получившееся при фосфорилировании. Существенным отличием предлагаемого способа является то, что не производят обработку реакционной смеси водой, что позволяет в одной стадии-отделить целевые продукта ка от неорганических примесей, так и о непрореагировавших исходных нуклеоз дов. Поскольку элюентом является вода, на колонке происходит гидроли продуктов, содержащихся в реакционной смеси, с выделением большого количества тепла. Чтобы снизить скорость гидролиза и обеспечить отвод вьзделяющегося тепла, колонку охлаждают. Разделение проводят при температуре 1-20 С, При темпера турах ниже +1. С в случае больших объемных соотношений в начальном участке колонки при длительном промывании может образоваться лед. При температурах выше оптимальных резко увеличивается кислотность злюата (следствие усиления гидролиза что препятствует выделению нуклеозид-5-монофосфорных кислот. птимальные температурные интервалы для конкретных соединений имеют следующие значения: С Аденозин-5-монофЬсфат Инозин-5-монофосфат +10-+15 Цитидин--5-монофосфат +15-+20 Гуанозин-5-монофо.сфат +5-+10 Уридин-5-монофосфат +15-+20 Кроме того, раствор целевого продукта после элюирования имеет незначительную кислотность(рН 2-4), что позволяет исключить нейтрализацию и получать свободные нуклеозид5-монофос11 орные кислоты упариванием непосредственно злюата. Такая 134 кислотность обеспечивается большим объемным избытком{ 3-25-кратным) сорбента по сравнению с объемом исходной смеси. Оптимальные для получения свободных нуклеозид-5-монофосфорньгх кислот , объемные соотношения наносимой на; колонку пробы и сорбента установлены экспериментально. При соотношениях ниже оптимальных разделение компонентов (целевого продукта и галогенпроЧ Y изводных фосфорных кислотГ недостаточно эффективно, практически, зто выражается в том, что кислотность полученного раствора целевого продукта настолько высока, что из него невозможно выделить свободную нуклеозид-З-монофосфорную кислоту без дополнительной,обработки. При использовании объемных соотношений Bbmie оптимальных эффективность разделения достаточно высока, однако зто не имеет смысла, так как неоправданна увеличивается объем элюанта и размер хроматографической установки. Получены следующие оптимальные соотношения между объемами наносимой на колонку пробы и сорбента: .Аденозин-5-монофосфат I1:3-1:5 Инозин-5-монофосфат I 1-:5-1:10 Цнтйдир -5-монофосфат 1:10-1:15 Гуанозин-5-монофосфат1-10-1:15УрИДИн-5-монофосфат-1:20-1:25Кроме того, улучшения качества азделения достигают путем Уравноешивания сорбента перед нанесением еакционной смеси водой или поля.рным рганическим растворителем. Таким образом, процесс выделения УКлеозид-5-монофосфорных кислот согласно предлагаемому способу заключается в следующем. , Колонну с оболочкой для охлаждеия заполняют катионитом и уравноешивают полярным растворителем органическим или водой. Затем на олонку узкой зоной (объем наносимого ... 1 Г. аствора составляет -г- - объема орбента наносят реакционную смесь епосредственно после фосфорилироваия. 5 Колонку при включенном внешнем охлаждении промывают водой -с темпер турой + 1-+20С и собирают вытекающий при этом из колонки раствор. Первая фракция содержит частично. гидролйзовавшийся непрореагировавший фосфорилирующий. агент, растворенный в соответствуюш;ем поляр юм растворителе(в органическом иЛи в воде), Вторая фракция содержит нуклеозид-5-монофосфаторную кислоту рН эр.ой фракций 2-4. Раствор нуклеозид-5-монофосфорной кислоты/вторая фракция) концентрируют и из концентрированного раст вора выделяют целев.ой продукт. Получают препараты, содержащие 96-98% основного вещества. Выход нуклеозид-5-монофосфорных кислот составляет 80-90% в расчете на количество целевого продукта, образовавшегося в реакции фосфорил рования. Если необходимо получать соли нуклеозид-5-мон6фосфорных кислот, то элюат, содержащий эту кислоту, перед упариванием, нейтрализуют щелочью. Пример I. Хроматографическу колонку.с оболочкой(размеры колонк диаметр-2,5 см, высота-75 см запол няют катионитом КРС-4в Ы - форме. Объем катионита в колонке 300 мл. Колонку уравновешивают 300 мл триметилфосфата. Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосф рилированием 14,8 г аденозина 15,3 хлорокиси фосфора в 80 мл .триметилфосфата. Реакционная смесь содержи 16,9 г аденозин-5-монофосфата (определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения). Колонку элюируют водой с темпер турой + 1с(при этом также колонку ч.фез оболочку)и собирают вытекающий при этом из колонки рас вор. Первые 1-1,5 л раствора, содержа щие клорокись фосфора и триметилфо фат, отбрасывают. Последующие 2-2,5 л раствора (содержит целевой продукт 1 упарива при пониженном давлении дЪ появлен осадка. Суспензию,охлаящают и оставляют до полного осаждения.Зате осадок фильтруют и сушат. 13 Получают .16,3 г моногидрата аденозин-5-монофосфорной кислоты. Чистота. 98%. Выход. 90%. П р и м е р; 2. Хроматографическзю колонку с оболочкой(размеры колонки диаметр 4 см., высота 100, см) заполняют катионитом КРС-4 в Н -форме. Объем катионита в колонке 1000 мл. Колонку уравновешивают водой. Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 12,65 г натриевой соли гуанозина 12,5 мл хлорокиси фосфора в 85 мл триметилфосфата. Реакционная смесь содержит 14,1 гуанозин-5-монофосфата(определяют разделением образца с последующим измерением кол-ва целевого продукта спектрофотометрическим методом). . Колонку элюируют водой с температурой + 10с(при этом также охлаждают колонку через оболочку) и собирают вытекающий из -колонки раствор. Первые 5-8 л раствора отбрасывают. Последу ощие 4-5 л раствора упаривают при пониженном давлении и целевой продукт из полученного концентрированного раствора осаждают этиловым спиртом. Суспензию охлаждают до 4 С и оставляют до полного оседания осадка. Затем осадок фильтруют и сущат. Получают 12,8 г гуанозин-5-монофосфорной кислоты.моногидрата. Чистота.98%. Выход. 85%. Примерз. Хроматографическую колонку с оболочкой(размеры колонки: диаметр 4 см, высота 100 см)заполняют катионитом КУ-2 в Н -форме. Объем катионита в колонке 1000 мл.. Колонку уравновешивают 1000 мл ацетонитрила. Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной, фосфорилир.ованием 14,6 г инозина 21,6 мл хлорокиси фосфора в 54 мл ацетонитрила 21,3 мл пиридина и 2,7 мл воды. Реакционная смесь содержит 18 .г инозин-5-монофосфага (определяют хроматографическим разделением образца с последующим измерением количества целевого продукта спектрофотометрическим MeTQflOMJ. Колонку элюируют водой с температурой (при этом также охлаждакГт колонку через оболочку и собирают вытекающий из колонки раствор. Первые 5-8 л раствора отбрасывают. Последующие 4-5 л раствора упаривают при пониженном давлении и целе

1. СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-5-ШНОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ из смеси, образующейся при фосфорилировании нуклеозидов галогенпроизводными фосфорных кислот в полярном органическом растворителе, путем нанесения на колонку, заполненную катионитом в Н -форме, с последующим элзоированием водой и выделением целевого продукта, упариванием элюата, о тличающийся тем, что, .с целью упрощения процесса, реакционную смесь; непосредственно после фрсфорилирования наносят на 3-25кратный объем сорбента, предварительно уравнов|гшенного полярным растворителем, и элюируют при 1-20 С. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что при выделении аденози1н-5-монофрсфата используют 3-5-кратный объем .сорбента, а элюирование осуществляют-при 1-5 С. 3.Способ поп.1,отличающ и и с я тем, что при выделении шшзин-5-монофосфата испольэуют 510-кратный объем .сорбента, а элюирование осуществляют.при 10-15 С. 4.Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что при выделении цитидин-5-монофосфата используют 10-15-кратный объем сорбента, а элюирование осуществляют при 15(/) . 5.Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что при выделении гуанозин-5-монофосфата используют 10-15-кратный объем .сорбента, а элю- ирование осуществляют при 5-10 С. 6.Способ по п. 1., о т л и ч а ю щ и и с я тем, что при выделении уридин-5-монофосфата. используют 20-25-кратный объем сорбента, а элюирование осуществляют при 15-20 С.