СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ 5'-ТРИФОСФАТОВ ПРИРОДНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДЕЗОКСИРИБО- И РИБООЛИГОНУКЛЕОТИДОВ Российский патент 2009 года по МПК C07H1/00 C07H21/02 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к усовершенствованному способу получения солей 5'-трифосфатов природных и модифицированных дезоксирибо- и рибоолигонуклеотидов общей формулы

где В - гетероциклическое основание, природное или модифицированное;

полупрозрачные сферы обозначают места возможной

модификации олигонуклеотида;

n≥1.

5'-Трифосфаты природных и модифицированных дезоксирибо- и рибоолигонуклеотидов применяются в молекулярно-биологических и генно-инженерных исследованиях, однако коммерчески малодоступны из-за отсутствия универсального и эффективного способа синтеза этих соединений. Доступность 5'-трифосфатов природных и модифицированных дезоксирибо- и рибоолигонуклеотидов позволит широко использовать эти соединения при изучении процессов нуклеинового обмена (например, процессинга пре-мРНК).

Известен способ получения 5'-трифосфатов рибодинуклеотидов (Tomasz J., Simoncsits A., Kajtar M., Krug R.M., Shatkin A.J.//Nucleic Acids Res. 1978. V.5. P.2945-2957), заключающийся в обработке исходного рибодинуклеозид(3'-5')фосфата хлорокисью фосфора с последующей обработкой водным аммиаком (введение первого фосфата и образование активированного монофосфорилированного производного). Полученный 5'-моноамидофосфат рибодинуклеозид(3'-5')фосфата обрабатывают пирофосфатом с целью получения трифосфатного производного.

Недостатком этого способа является то, что при обработке исходного динуклеотида хлорокисью фосфора на первой стадии синтеза происходит полная изомеризация межнуклеотидной фосфодиэфирной связи с образованием смеси 2'(3')-5'-фосфодиэфирных связей, что снижает выход целевого соединения в 2 раза и усложняет процедуру его очистки. Кроме того, способ не позволяет синтезировать трифосфаты модифицированных олигонуклеотидов, содержащие активные функциональные группы (амино(ди)алкильные, тиоалкильные, оксиалкильные).

Известен также способ получения 2',5'-триаденилил-5'-трифосфата (Seto Y., Abe К., Itoh M., Sawai H. // 2002. Bioconjugate Chem. V. 13. P.303-308), заключающийся в полимеризации имидазолида 5'-аденилилфосфата в присутствии ионов Pb²⁺с последующим получением 5'-трифосфатного производного олигорибонуклеотида ферментативным путем.

Недостатком этого способа является то, что он не пригоден для получения 5'-трифосфатов олигорибонуклеотидов с природными 3'-5'-фосфодиэфирными связями. Кроме того, с помощью указанного способа можно синтезировать только производные аденозина.

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ получения 5'-трифосфатов дезоксиолигонуклеотидов (Lebedev A.V., Koukhareva I.I., Beck Т., Vaghefi M.M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2001. V. 20(4-7). P. 1403-1409), заключающийся в следующем. На первой стадии в дезоксиолигонуклеотид вводят первый фосфат с одновременным получением активированного монофосфорилированного производного дезоксиолигонуклеотида, для чего соответствующим образом защищенный дезоксиолигонуклеотид (защитные группы на гетероциклических основаниях нуклеозидов и межнуклеотидных фосфатных группах, свободная 5'-оксигруппа дезоксиолигонуклеотидной цепи), ковалентно связанный с носителем в процессе твердофазного синтеза олигонуклеотидов, обрабатывают раствором 2-хлоро-4Н1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в смеси 1,4-диоксана с пиридином. На второй стадии промежуточный активированный фосфитилированный продукт обрабатывают раствором бис-трибутиламмонийной соли пирофосфата в смеси ацетонитрила с пиридином. На третьей стадии трехвалентный атом фосфора в продукте окисляют в пятивалентный с помощью раствора йода, продукт отщепляют от твердого носителя и деблокируют. Целевой продукт очищают с помощью анионообменной ВЭЖХ. В результате получают pppdT₂, pppdT₃, pppdT₉, pppdT₁₅, pppd(ACTGT) и pppdC₂. Выходы продуктов после очистки составляют 15-30%.

Недостатками указанного способа являются следующие:

1) использование огромных избытков реагентов (до 3000-кратного для 2-хлоро-4Н1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она и до 6000-кратного для пирофосфата), а также больших объемов растворителей в расчете на 1 мкмоль исходного соединения;

2) низкие выходы целевых соединений (15-30%);

3) малое количество получаемого продукта, не превышающее 2-5 мкмоль (2-5 мг), и трудности в масштабировании процесса;

4) наличие значительных количеств побочных продуктов;

5) применение дорогостоящей анионообменной ВЭЖХ для очистки продукта.

Технической задачей изобретения является повышение выхода целевых продуктов, сокращение избытка используемых реагентов и растворителей, а также расширение функциональных возможностей способа за счет обеспечения возможности получения 5'-трифосфатов олигонуклеотидов не только природного строения дезокси- и риборяда, но также и содержащих различные модификации в сахарофосфатном остове и гетероциклических основаниях.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым новым способом получения 5'-трифосфатов природных и модифицированных олигонуклеотидов как дезоксирибо-, так и риборяда с формулой pppN(pN)_n, заключающимся в следующем.

На чертеже представлена схема синтеза 5'-трифосфатов природных и модифицированных дезоксирибо- и рибоолигонуклеотидов на примере синтеза 5'-трифосфата модифицированного дезоксидинуклеотида {2'-d-[цитидилил(3'-фосфо-5')-5-аминоаллилуридин]}-5'-трифосфата, где В=N4- бензоилцитозин, В'=5-трифторацетамидоаллилурацил, В²=цитозин, В³=5-(аминоаллил)урацил, R₁=O-n-хлорфенил, R₂=ацетил, R=R₃=Н, R₄=О-, Х=О; i), POCl₃; ii) [(С₄Н₉)₃N]₂Н₂Р₂O₇; iii) NH₃/H₂O.

Синтез осуществляют в три стадии в растворе при комнатной температуре. На первой стадии исходный реагент I - защищенный природный или модифицированный олигонуклеотид, имеющий свободной только одну функциональную группу - 5'-оксигруппу, дезокси- или риборяда, в виде 0,1-0,05 М раствора, монофосфорилируют в пиридине 2-3-кратным избытком хлорокиси фосфора в течение 10-15 мин с получением активированного производного 5'-монофссфата природного или модифицированного защищенного дезокси- или рибоолигонуклеотида. На второй стадии (ii) в раствор 10-15-кратного избытка бис-трибутиламмонийной соли пирофосфата в ацетонитриле и 20-кратного избытка третичного амина (преимущественно трибутиламина) добавляют раствор активированного монофосфорилированного производного в пиридине и выдерживают смесь в течение 15-30 минут. На третьей стадии (iii) производят разложение промежуточного триметафосфатного производного олигонуклеотида триэтиламмонийбикарбонатным буфером (ТЕАБ), рН 7,5, и удаление защитных групп с сахарофосфатного остова, гетероциклических оснований и других функциональных групп олигонуклеотида. Очистку целевого продукта II проводят с помощью обращено-фазовой хроматографии (ОФХ) после разложения реакционной смеси ТЕАБ на сорбенте Porasil С-18 (Waters, США) и повторной ОФХ на том же сорбенте после удаления защитных групп. Чистота полученных соединений более 95% по данным аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ЯМР-спектроскопии.

Исходные реагенты - защищенные природные и модифицированные олигонуклеотиды со свободной 5'-оксигруппой - могут быть получены в больших количествах (до несколько граммов) с помощью триэфирного метода синтеза олигонуклеотидов по одной из известных методик (например, Абрамова Т.В., Комарова Н.И., Мундус Д.А., Перебоева О.С.// Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук. 1990. Вып.5. Стр.45-51).

Целевые продукты получают в виде литиевых солей, поскольку они наиболее стабильны при хранении. Для этого после завершения очистки целевой продукт осаждают из водного раствора десятикратным объемом 6% раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок промывают ацетоном и серным эфиром и высушивают.

Выходы целевых 5'-трифосфатов природных и модифицированных дезокси- и рибоолигонуклеотидов после очистки составляют 45-92% в зависимости от нуклеотидной последовательности и длины олигонуклеотида. Количество получаемых продуктов составляет 10-100 мкмоль (10-100 мг) и выше.

Примеры модификаций, введенных в 5'-трифосфаты олигонуклеотидов (см. чертеж, соединения II, таблица 1), включают в себя модификации по гетероциклическому основанию (4-N-(аминоалкил)цитозин, в том числе 5-метилированный, 5-(3-аминоаллил)урацил, 5-(3-аминопропилоксиметил)урацил, 6-N-(аминоалкил)аденин), пример конкретного выполнения 1; модификации углеводного остатка (арабиноза вместо рибозы или дезоксирибозы, 2'-дезокси-2'-амино, 2'-азидо или 2'-метоксирибоза, стерически затрудненные 4'-СН₂-О-2'-locked-нуклеозиды, пример конкретного выполнения 2; получение химерных рибо-дезоксирибоолигонуклеотидов, пример конкретного выполнения 3; модификации остатка фосфорной кислоты (метилфосфоно, тиофосфаты), пример конкретного выполнения 4, а также не имеющие модификаций - природные, пример конкретного выполнения 5).

5'-Трифосфаты модифицированных дезокси- и рибоолигонуклеотидов, преимущественно в виде литиевых солей, полученные по заявляемому способу, приведены в табл.1 и табл.2, где ^а P-PhCl - n-хлорфенилфосфатная группа, ^б P-CNEt - цианоэтилфосфатная группа, ^в Tfa - трифторацетил, ^Г ае - аминоэтил, ^д аа - аминоаллил, ^е Lev - левулинил, ^ж LNA - стерически затрудненные 4'-СН₂-О-2'-locked-нуклеозиды.

Строение полученных соединений подтверждено с помощью ³¹Р- и масс-спектроскопии. Данные по некоторым соединениям приведены в табл.1 и табл.2.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа, являются следующие.

1. Синтез проводят в растворе, при этом в качестве исходного реагента используют 0.1-0.05 М раствор предварительно очищенного соответствующим образом защищенного природного или модифицированного динуклеозидфосфата, имеющего свободной только одну функциональную группу - 5'-оксигруппу, дезокси- или риборяда, что позволяет избежать высоких избытков реагентов, а также больших объемов растворителей в расчете на 1 мкмоль исходного реагента, а также легко масштабировать процесс, что обеспечивает получение больших (миллимолярных) количеств продукта. В прототипе получение продукта осуществляют в твердофазном варианте, а в качестве исходного реагента используют соответствующим образом защищенный дезоксиолигонуклеотид (защитные группы на гетероциклических основаниях нуклеозидов и межнуклеотидных фосфатных группах, свободная 5'-оксигруппа дезоксиолигонуклеотидной цепи), взятый непосредственно из реакционной смеси в процессе синтеза олигонуклеотида.

2. Исходный реагент активируют в пиридине 2-3-кратным избытком хлорокиси фосфора в течение 10-15 минут, что позволяет эффективно и быстро получить монофосфорилированное производное, так как использование соответствующим образом защищенных исходных реагентов исключает возможные побочные реакции с избытком хлорокиси фосфора, в то же время проведение активации в растворе позволяет избежать необходимости применения больших избытков фосфорилирующего агента.

В прототипе в качестве активирующего реагента используют 3000-кратный избыток 2-хлоро-4Н1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она.

3. Активированный монофосфорилированный олигонуклеотид обрабатывают 10-15-кратным избытком раствора бис-трибутиламмонийной соли пирофосфата в ацетонитриле и 20-кратным избытком третичного амина (преимущественно трибутиламина) и выдерживают реакционную смесь в течение 15-30 минут, что позволяет повысить выход целевого продукта и существенно сократить расход пирофосфата. В прототипе используют 6000-кратный избыток пирофосфата.

4. Очистку целевого продукта проводят с помощью двух обращенно-фазовых хроматографий, причем первую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят после разложения промежуточного триметафосфатного производного защищенного олигонуклеотида, а вторую - после удаления защитных групп. Применение двух последовательных обращенно-фазовых ВЭЖХ позволяет обеспечить полное отделение пирофосфата от целевого продукта в случае динуклеотидов, а также избежать применения дорогостоящих анионообменных сорбентов. В прототипе используют анионообменную ВЭЖХ для очистки целевого соединения.

Способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Получение pppd[TpA^(6-ae)], {2''-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')-6-(2-аминоэтил)аденозин]}-5'-трифосфата в виде трилитиевой соли.

В колбу вместимостью 25 мл загружают 0.340 г (0.4 ммоль) 5'-окси-2'-d-[тимидилил-(3'-n-хлорфенилфосфо-5')-6-(2-трифторацетиламиноэтил)-3'-O-ацетиладенозин]а и 5 мл сухого пиридина, реакционный сосуд охлаждают в ледяной бане. К раствору оксипроизводного (концентрация 0.08 М) при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 73 мкл (0.8 ммоль, двукратный избыток) хлорокиси фосфора. Реакционную смесь перемешивают 10 мин, затем переносят при интенсивном перемешивании в круглодонную колбу объемом 100 мл, в которой находятся 8 мл 0.5 М раствора бис-трибутиламмонийпирофосфата в ацетонитриле (4 ммоль, 10-кратный избыток), и 1.92 мл (8 ммоль, 20-кратный избыток) трибутиламина. Охлаждение убирают, перемешивание продолжают в течение 30 минут. По окончании реакции в реакционную смесь добавляют 40 мл 1 М триэтиламмонийбикарбоната, рН 7.5. Через 1 час реакционную смесь упаривают при пониженном давлении на ротационном испарителе, остаток растворяют в 10 мл воды и наносят на колонку (3×20 см) с обращенно-фазовой смолой Porasil С₁₈ (55-100 мкм, Waters, США). Элюцию проводят в градиенте этанола в воде от 0 до 50%. Фракции, содержащие трифосфатное производное, упаривают. К остатку добавляют 20 мл концентрированного водного аммиака для удаления защитных групп (ацильной, n-хлорфенильной, трифторацетильной). Реакционную смесь перемешивают 2 суток при комнатной температуре, затем упаривают. Остаток растворяют в 5 мл 1 М триэтиламмонийацетата (ТЭА-НОАс), рН 7.0, и наносят на колонку с обращенно-фазовой смолой LiChroprep C₁₈ (15-25 мкм, Merck, Германия). Элюцию проводят в градиенте ацетонитрила от 0 до 10% в 0.05 М ТЭА-НОАс, рН 7.0. Целевые фракции упаривают. Продукт - трилитиевую соль {2'-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')-6-(2-аминоэтил)аденозин]}-5'-трифосфата Li₃pppd[TpA^(6-ae)], растворяют в воде (5 мл) и осаждают добавлением 50 мл 6% раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированим или фильтрованием, промывают ацетоном и высушивают до постоянного веса в вакууме. Выход Li₃pppd[TpA^(6-ae)] 270.0 мг, 0.32 ммоль, 80%.

Пример 2.

Получение 5'-трифосфата [2'-d-2'-азидоарабиноаденозил(3'-фосфо-5')цитидин]а в виде трилитиевой соли Li₃pppd[А(2'-apaN₃)рС]

В колбу вместимостью 25 мл загружают 0.150 г (0.15 ммоль) 5'-окси-[2'-d-2'-азидоарабиноаденозил-(3'-n-хлорфенилфосфо-5')-2'-d-3'-O-ацетил-4-N-бензоилцитидин]а и 3 мл сухого пиридина, реакционный сосуд охлаждают в ледяной бане. К раствору оксипроизводного (концентрация 0.05 М) при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 41 мкл (0.45 ммоль, трехкратный избыток) хлорокиси фосфора. Реакционную смесь перемешивают 15 мин, затем переносят при интенсивном перемешивании в круглодонную колбу объемом 100 мл, в которой находятся 5 мл 0.5 М раствора бис-трибутиламмонийпирофосфата в ацетонитриле (2.25 ммоль, 15-кратный избыток), и 0.72 мл (3 ммоль, 20-кратный избыток) трибутиламина. Охлаждение убирают, перемешивание продолжают в течение 15 минут. По окончании реакции в реакционную смесь добавляют 30 мл 1 М триэтиламмонийбикарбоната, рН 7.5. Далее процесс осуществляют аналогично примеру 1. Из 0.15 г (0.150 ммоль) исходного соединения получают 0.1 г (0.12 ммоль, выход 80%) Li₃pppd[A(2'-apaN₃)рС].

Пример 3.

Получение 5'-трифосфата [уридилил(3'-фосфо-5')-2'-d-тимидин]а в виде трилитиевой соли проводят аналогично примеру 1 со следующими отличиями. В качестве исходного соединения применяют 5'-окси-[2'-O-трет-бутилдиметилсилилуридин(3'-(2-цианоэтил)фосфо-5')-2'-d-3'-O-ацетилтимидин]. Для удаления трет-бутилдиметилсилильной защитной группы после обработки аммиаком промежуточного продукта реакционную смесь упаривают, к остатку добавляют 10 мл 1 М раствора тетрабутиламмонийфторида в диоксане. Раствор перемешивают 1 сутки и упаривают. Из 0.05 г (0.050 ммоль) исходного соединения получают 18 мг (0.022 ммоль, выход 45%) Li₃pppUpdT].

Пример 4.

Получение 5'-трифосфата 2'-d-[цитидилил(3'-метилфосфоно-5')аденозин]а в виде дилитиевой соли Li₂pppd[С(рСН₃)А] проводят аналогично примеру 1 со следующими отличиями. В качестве исходного соединения берут 5'-окси-2'-d-[4-N-ацетилцитидилил-(3'-метилфосфоно-5')-6-(2-трифторацетиламиноэтил)-3'-O-ацетил-6-N-бензоиладенозин]. Удаление основнолабильных защитных групп проводят путем обработки водным аммиаком в течение 1 суток. Из 0.05 г (0.06 ммоль) исходного соединения получают 24 мг (0,03 ммоль, 50%) Li₂pppd[C(pCH₃)A].

Пример 5.

Получение 5'-трифосфата 2'-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')аденозин]а в виде трилитиевой соли Li₃pppd(TpA) проводят аналогично примеру 1 со следующими отличиями. В качестве исходного соединения берут 5'-окси-2'-d-[тимидилил-(3'-N-хлорфенилфосфо-5')-6-N-бензоил-3'-O-ацетиладенозин]. Из 0.1 г (0.1 ммоль) исходного соединения получают 75 мг (0.092 ммоль, 92%) Li₃pppd(TpA).

Пример 6.

Получение Na₃pppd[TpA^(6-ae)], {2'-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')-6-(2-аминоэтил)аденозин]}-5'-трифосфата в виде тринатриевой соли проводят аналогично примеру 1 со следующими отличиями. Монофосфорилирование защищенного исходного соединения проводят без охлаждения реакционного сосуда в ледяной бане. После очистки целевого соединения на колонке с обращенно-фазовой смолой LiChroprep С₁₈ (15-25 мкм, Merck, Германия) и упаривания целевых фракций продукт - тринатриевую соль {2'-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')-6-(2-аминоэтил)аденозин]}-5'-трифосфата Na₃pppd[TpA^(6-ae)], растворяют в воде (5 мл) и осаждают добавлением 50 мл 6% раствора перхлората натрия в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированим или фильтрованием, промывают ацетоном и высушивают до постоянного веса в вакууме. Выход Na₃pppd[TpA^(6-ae)] 280.0 мг, 0.31 ммоль, 78%.

Пример 7.

Получение (NH₄)₃pppd[TpA^(6-ae], {2'-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')-6-(2-аминоэтил)аденозин]}-5'-трифосфата в виде триаммониевой соли проводят аналогично примеру 1 со следующими отличиями. После очистки целевого соединения на колонке с обращенно-фазовой смолой LiChroprep С₁₈ (15-25 мкм, Merck, Германия) и упаривания целевых фракций продукт - триаммониевую соль {2'-d-[тимидилил(3'-фосфо-5')-6-(2-аминоэтил)аденозин]}-5'-трифосфата (NH₄)₃pppd[TpA^(6-ae)] получают пропусканием раствора трифосфата в воде (15 мл) через колонку (20 мл) со смолой ДЕАЕ-Сефадекс А-25 (Pharmacia, Швеция) в аммониевой форме и промывкой колонки 1.5 М NH₄НСО₃ 20% водным этанолом (40 мл) с последующим упариванием полученного раствора и высушиванием остатка до постоянного веса в вакууме. Выход (NH₄)₃pppd[TpA^(6-ac)] 275.0 мг, 0.33 ммоль, 82%.

Таким образом, разработан универсальный способ получения 5'-трифосфатов дезокси- и рибоолигонуклеотидов в милимолярных количествах с высокими выходами, меньшим избытком реагентов и объемов растворителей, необходимых при синтезе.

Изобретение относится к способу получения солей 5'-трифосфатов природных и модифицированных дезокси- и рибоолигонуклеотидов, заключающемуся в том, что исходный реагент - защищенный природный или модифицированный олигонуклеотид, дезокси- или риборяда, в виде 0,1-0,05 М раствора, монофосфорилируют в пиридине 2-3-кратным избытком хлорокиси фосфора в течение 10-15 минут, далее полученное активированное производное олигонуклеотида обрабатывают 10-15-кратным избытком раствора бис-трибутиламмонийной соли пирофосфата в ацетонитриле и 20-кратным избытком третичного амина и выдерживают реакционную смесь в течение 15-30 минут с последующим разложением промежуточного триметафосфатного производного олигонуклеотида триэтиламмонийбикарбонатным буфером, очисткой целевого продукта с помощью обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ), удалением защитных групп с функциональных групп олигонуклеотида и повторной очисткой целевого продукта с помощью ОФХ. Выходы целевых продуктов после очистки составляют 45-92%. Чистота полученных соединений более 95% по данным ВЭЖХ и ЯМР-спектроскопии. Данные соединения могут быть использованы в молекулярно-биологических и генно-инженерных исследованиях. 1 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ получения солей 5'-трифосфатов природных и модифицированных дезокси- и рибоолигонуклеотидов, заключающийся в том, что исходный реагент - защищенный природный или модифицированный олигонуклеотид, дезокси- или риборяда, в виде 0,1-0,05 М раствора, монофосфорилируют в пиридине 2-3-кратным избытком хлорокиси фосфора в течение 10-15 мин, далее полученное активированное производное олигонуклеотида обрабатывают 10-15-кратным избытком раствора бис-трибутиламмонийной соли пирофосфата в ацетонитриле и 20-кратным избытком третичного амина и выдерживают реакционную смесь в течение 15-30 мин с последующим разложением промежуточного триметафосфатного производного олигонуклеотида триэтиламмонийбикарбонатным буфером, очисткой целевого продукта с помощью обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ), удалением защитных групп с функциональных групп олигонуклеотида и повторной очисткой целевого продукта с помощью ОФХ.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве третичного амина используют трибутиламин.