НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ "РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ" Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6806 

Изобретение относится к области ветеринарии, биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции участков генов tetA, tetM, tetO, обеспечивающих устойчивость к тетрациклинам у бактерий, выявленных в результате ветеринарного мониторинга, с помощью детектирующего амплификатора.

Тетрациклины, представляют собой семейство антибиотиков, широкого спектра действия, проявляющими активность в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий. Применяются для лечения инфекций домашней птицы, крупного рогатого скота, овец и свиней. В некоторых случаях, например, для терапевтического лечения большого количества домашней птицы, выращиваемой на коммерческих фермах, антибиотики добавляют непосредственно в корм или воду или могут вводиться в виде аэрозолей. Тетрациклины используются в аквакультуре для борьбы с инфекциями у лосося, сома и омаров [1,2]. Их также распыляют на фруктовые деревья и другие растения для лечения заражения Erwinia amylovara, вводят в пальмы для лечения микоплазменных инфекций и используют для борьбы с заражением семян Xanthomonas campestis (черная гниль). Они также находят применение в лечении насекомых, имеющих коммерческую ценность; например, окситетрациклин используется для лечения гнильца медоносных пчел, который вызывается либо личинками Bacillus, либо Streptococcus pluton.

Устойчивость к тетрациклинам часто связана с приобретением новых генов, которые кодируют энергозависимый отток тетрациклинов или белок, защищающий бактериальные рибосомы от действия тетрациклинов. Большинство генов tet у бактерий связаны с мобильными плазмидами, транспозонами, конъюгативными транспозонами и интегронами (генными кассетами). Эти мобильные единицы позволили генам tet перемещаться от вида к виду и в широкий диапазон родов путем конъюгации. Гены грамотрицательных tet, впервые описанные у Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae, теперь обнаруживают также у Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Treponema и Vibrio [3]

Существуют различные методы идентификации и детекции генетических детерминант резистентности, основанные на использовании технологии ДНК-чипов (RU 2685188 C2, RU 2415932 C1, RU 2415937 C1) и нескольких разновидностей ПЦР: метод одноцепочечного конформационного полиморфизма (PCR-SSCP), анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP) (RU 2646107 C1). Также возможно использование лигазной цепной реакции (ЛЦР). Метод секвенирования является «золотым стандартом» для идентификации неизвестных продуктов амплификации, что позволяет определять новые варианты ферментов [4].

Молекулярно-генетические методы направлены на выявление генов, ассоциированных с резистентностью, и характеризуются: высокой чувствительностью, скоростью получения результатов, стандартизованностью и технологичностью исследования. Важной особенностью является отсутствие манипуляций с живыми бактериальными культурами, что способствует предотвращению распространения и циркуляции микроорганизмов внутри лечебно-диагностических и лабораторных учреждений.

ПЦР в реальном времени (PCR-RT) метод является наиболее практичным методом идентификации, который используется для выявления генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, включая гены устойчивости к тетрациклинам.

Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, используемой с целью выявления фрагментов генов устойчивости к тетрациклинам tetA, tetM и tetO из образцов продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также из чистых бактериальных культур.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов специфичных к последовательностям генов tetA, tetM и tetO, по которым осуществляется определение устойчивости анализируемого образца к тетрациклинам.

Преимуществом данного изобретения является экспресс-выявление генов резистентности, к антибиотикам, наиболее часто применяемых в ветеринарной практике и являющихся критически важным для клинической медицины.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что при проведении полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени», используют специальный оригинальный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления фрагментов генов устойчивости к тетрациклинам tetA, tetM и tetO, имеющий следующий нуклеотидный состав:

1) гена устойчивости к тетрациклинам tetA:

tetA-F CGGTCTTCTTCATCATGCAACT

tetA-R GAGTGAATGCAGAATGCCAAATG

tetA-Z ROX-TTTCGGCGAGGATCGCTTTCACT-BHQ2

2) гена устойчивости к тетрациклинам tetM:

tetM - F GGTACAACGAGGACGGATAATAC

tetM - R CCTGGCGTGTCTATGATGTT

tetM - Z ROX-ACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAG-BHQ2

3) гена устойчивости к тетрациклинам tetO:

tetO - F GAGCGTAGATGAAGGCACAA

tetO - R ATGGCCTGGCGTATCTATAATG

tetO - Z FAM-TCACTGCTGTCTGGATAGTGATTCCC-BHQ1

Согласно предлагаемому способу осуществляется идентификация трех генетических детерминант резистентности, чаще всего встречающихся в образцах продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.).

Олигонуклеотиды, входящие в набор, отличаются от известных из уровня техники тем, что имеют оригинальные олигонуклеотидные последовательности и позволяют специфическим образом детектировать и выявлять гены tetA, tetM и tetO, по которым осуществляется определение устойчивости анализируемого образца к тетрациклинам т.е. набор олигонуклеотидов является видоспецифичным.

Для выбора и анализа ДНК последовательностей генов резистентности были использованы базы данных ResFinder, Arg-ANNOT, CARD и NCBI BARRGD, а также последовательности геномов различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые были ранее получены в ФГБУ «ВГНКИ» методом полногеномного секвенирования.

Для выбора генов-мишеней при разработке методики выявления генов устойчивости к тетрациклинам были проанализированы литературные данные о встречаемости генов группы tet в бактериях ветеринарного и медицинского происхождения. Кроме того, учитывались данные ветеринарного мониторинга антибиотикорезистености в РФ, распространенность генов tet среди возбудителей, данные полногеномного секвенирования изолятов из различных регионов РФ.

Ген tetA кодирует белок, осуществляющий выведение (эффлюкс) тетрациклинов из бактериальной клетки путем активного транспорта. Данный механизм резистентности к тетрациклинам широко распространен среди энтеробактерий, выделяемых от животных, птиц и из пищевых продуктов. Гены tetM и tetO кодируют белки, взаимодействующие с 23S рибосомальной РНК и препятствующие связыванию тетрациклинов с рибосомой. Данный механизм резистентности к тетрациклинам («защита мишени») распространен как среди грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, выявляемых при ветеринарном мониторинге антибиотикорезистентности. Локализация tetM и tetА на мобильных генетических элементах способствует их горизонтальному переносу между микроорганизмами, в том числе таксономически и экологически отдаленными.

Подбор праймеров производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT). Для анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу «Ugene» и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool, оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast», расположенном на сайте NCBI.

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции гена tetA и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 1 и на рисунке 1 (Множественное выравнивание последовательностей гена tetА. Последовательность праймера tetA-R1 дана в виде «reverse-complement»).

Таблица 1
Характеристики праймеров и зонда для детекции гена tetA Наименование Последовательность Длина праймера, п.н. Tm,
°C GC% Длина ампликона, п.н. tetA-F CGGTCTTCTTCATCATGCAACT 22 62.9 45.5 134 tetA-Z ROX-TTTCGGCGAGGATCGCTTTCACT-BHQ2 23 68.1 52.2 tetA-R GAGTGAATGCAGAATGCCAAATG 23 62.8 43.5

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции гена tetM и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 2 и на рисунке 2 (Множественное выравнивание последовательностей гена tetM. Последовательность праймера tetM-R1 дана в виде «reverse-complement»).

Таблица 2
Характеристики праймеров и зонда для детекции гена tetM Наименование Последовательность Длина праймера, п.н. Tm,
°C GC% Длина ампликона, п.н. tetM-F GGTACAACGAGGACGGATAATAC 23 61.9 47.8 116 tetM-Z ROX-ACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAG-BHQ2 29 67.4 43.3 tetM-R CCTGGCGTGTCTATGATGTT 20 61.9 50

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции гена tetO и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 3 и на рисунке 3 (Множественное выравнивание последовательностей гена tetO).

Последовательности праймера tetO-R2 и зонда tetO-Z2 даны в виде «reverse-complement».

Таблица 3
Характеристики праймеров и зонда для детекции гена tetO Наименование Последовательность Длина праймера, п.н. Tm,
°C GC% Длина
ампликона, п.н. tetO-F GAGCGTAGATGAAGGCACAA 20 62.0 50 133 tetO-Z FAM-TCACTGCTGTCTGGATAGTGATTCCC-BHQ1 26 67.1 50 tetO-R ATGGCCTGGCGTATCTATAATG 22 61.9 45.5

Выбранные комплекты праймеров и зондов не предназначены для выявления других генов устойчивости к терациклинам, например tet(B), (K), (L), (S), tet(38) и др.

Выделение ДНК из образца, осуществляют с помощью набора реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ) или «PureLink Genomic DNA» (Invitrogen), или «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве отрицательного контроля выделения (Kв) используют 100 мм³ воды деионизованной. Срок хранения выделенной ДНК составляет при комнатной температуре не более 16 ч, при температуре (2-8) С - не более семи дней, при температуре не выше минус 16°С - не более шести месяцев.

Для приготовления соответствующих мастермиксов «ПЦР-смесь-1» в отдельных пробирках смешивают из расчета на одну реакцию (с учетом контролей выделения и ПЦР) следующие реагенты: растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров и зондов в необходимой концентрации, 0,2 мм³ смеси дНТФ (25 ммоль/дм³) и воды деионизованной до 5 мм³. Смесь с полимеразой для выявления целевых генов готовили в отдельной пробирке (из расчета на каждую реакцию с учетом контролей выделения и ПЦР), вносят по 10 мм³ «ПЦР-смеси-1», 0,5 мм³ ДНК-полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера с магнием. Затем вносят по 15 мм³ приготовленной смеси с полимеразой в тонкостенные пробирки и по 10 мм³ исследуемых или контрольных проб. Запускают на амплификаторе RotorGene соответствующие программы термоциклирования (табл. 4-5).

Таблица 4
Программа амплификации для выявления фрагментов гена tetA и tetM Стадия Температура Время Число циклов Детекция флуоресценции Удерживание 95°С 15 мин 1 - Циклирование 95°С 15 сек 35 - 62°С 45 сек По каналу Orange

Таблица 5
Программа амплификации для выявления фрагментов гена tetO Стадия Температура Время Число циклов Детекция флуоресценции Удерживание 95°С 15 мин 1 - Циклирование 95°С 15 сек 40 - 62°С 45 сек По каналу Green

При идентификации генов устойчивости к тетрациклинам tetA, tetO, tetM результаты интерпретируются в качественном формате на основании значения Ct. Учет результатов амплификации фрагментов генов начинают с оценки результатов амплификации положительных и отрицательных контролей в соответствии с таблицей 6. Результаты ПЦР исследования считаются достоверными, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей ПЦР и отрицательного контроля выделения ДНК.

Таблица 6
Необходимые показатели результатов анализа контролей Контролируемый
этап анализа Значение порогового цикла Сt по каналу, соответствующему фрагменту
гена tetA
(канал Orange) фрагменту гена tetM (канал Orange) фрагменту
гена tetO
(канал Green) Выделение ДНК, Кв Нет значений Нет значений Нет значений ПЦР, К- Нет значений Нет значений Нет значений ПЦР, K+ ≤ 27 ≤ 27 ≤ 31

В образце обнаружен ген устойчивости к тетрациклинам tetA, если в таблице результатов по каналу Orange определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 32, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 4.

В образце обнаружен ген устойчивости к тетрациклинам tetM, если в таблице результатов по каналу Orange определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 32, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 4.

В образце обнаружен ген устойчивости к тетрациклинам tetO, если в таблице результатов по каналу Green определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 35, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 6.

Изобретение имеет преимущество от известных из уровня техники методов возможностью экспресс-идентификации и высокой специфичностью. Для подтверждения специфичности изобретения готовили панель, содержащую ДНК, выделенную из различных чистых бактериальных культур коллекции ФГБУ «ВГНКИ». В качестве контрольных использовали изоляты, которые охарактеризованы полногеномно, с указанием на присутствие или отсутствие каких-либо из таргетных генов: tetA, tetO, tetM, а также отсутствие или присутствие других генов из группы tet (таблица 7).

Таблица 7
Результаты амплификации фрагментов генов tetA, tetM, tetO, выделенных из чистых культур бактерий пп Ожидаемый результат амплификации фрагментов генов Полученный результат
амплификации фрагмента гена Наименование образца Повтор1 Повтор2 1 - - - Salmonella enterica subsp. enterica, чувствительный к тетрациклинам 2 tetA, tetM tetA, tetM tetA, tetM Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis, резистентный к тетрациклинам, с генами tetA/tetR, tetM 3 tetA tetA tetA Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis, резистентный к тетрациклинам,
с генами tetA/tetR, tetB 4 tetA, tetA tetA E.coli, резистентный к тетрациклинам,
с генами tetA/tetR 5 tetO tetO tetO Enterococcus faecalis, резистентный
к тетрациклинам, с геном tetO 6 tetМ tetМ. tetМ, Enterococcus faecium, резистентный
к тетрациклинам, с геном tetМ 7 tetМ tetМ tetМ, Enterococcus faecalis, резистентный
к тетрациклинам, с геном tetМ 8 tetМ tetМ, tetМ, Enterococcus faecalis, резистентный
к тетрациклинам, с генами tetМ и tetL 9 tetO, tetO tetO Campylobacter jejuni, резистентный
к тетрациклинам, с геном tetO 10 tetO, tetO tetO Campylobacter coli, резистентный
к тетрациклинам, с геном tetO

В рамках предложенной панели системы идентификации и детекции генов резистентности показали 100% специфичность: наблюдается амплификация только фрагментов генов tetA, tetO, tetM.

Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.

Изобретение может быть использовано при выборе лекарственного препарата, режима лечения и с целью осуществления эпизоотического мониторинга.

Литературные источники

1. DePaola A, Hill W E, Harrell F M. Oligonucleotide probe determination of tetracycline-resistant bacteria isolated from catfish ponds. Mol Cell Probes. 1993;7:345-348.

2. Institute of Medicine, Division of Health Promotion and Disease Prevention. Report of a study. Human health risks with the subtherapeutic use of penicillin or tetracyclines in animal feed. Washington, D.C.: National Academy Press; 1998. [Google Scholar]

3. Morse S A, Johnson S J, Biddle J W, Roberts M C. High-level tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae due to the acquisition of the tetM determinant. Antimicrob Agents Chemother. 1986;30:664-670.

4. Chroma M., Kolar M. Genetic methods for detection of antibiotic resistance: focus on extended-spectrum β-lactamases. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 2010, 154(4): 289-296.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="НАБОР

ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ

ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО

ВРЕМЕНИ».xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-10-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022118597</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-07</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>02-10</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и

стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ

«ВГНКИ») (Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe uchrezhdenie

«Vserossiiskii gosudarstvennyi Tsentr kachestva i standartizatsii

lekarstvennykh sredstv dlia zhivotnykh i kormov» (FGBU «VGNKI»))

123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе д.5. (Rossiya, Moskva,

Zvenigorodskoye shosse d.5.)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBU VGNKI</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ

МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggtcttcttcatcatgcaact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagtgaatgcagaatgccaaatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttcggcgaggatcgctttcact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtacaacgaggacggataatac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctggcgtgtctatgatgtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgtcagagaggaattacaattcagacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagcgtagatgaaggcacaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggcctggcgtatctataatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcactgctgtctggatagtgattccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции участков генов tetA, tetM, tetO, обеспечивающих устойчивость к тетрациклинам у бактерий методом ПЦР в режиме «реального времени», для образцов, полученных из продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных, из объектов окружающей среды, без этапа выделения бактериальных изолятов, а также для чистых бактериальных культур. Набор содержит праймеры и зонды для выявления фрагментов генов резистентности к тетрациклинам tetA, tetM, tetO. 3 ил., 7 табл., 1 пр.

Набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции участков генов tetA, tetM, tetO у бактерий, обеспечивающих устойчивость к тетрациклинам методом ПЦР в режиме реального времени, характеризующийся тем, что имеет следующий нуклеотидный состав:

1) гена устойчивости к тетрациклинам tetA:

tetA–F CGGTCTTCTTCATCATGCAACT

tetA–R GAGTGAATGCAGAATGCCAAATG

tetA–Z ROX-TTTCGGCGAGGATCGCTTTCACT-BHQ2

2) гена устойчивости к тетрациклинам tetM:

tetM – F GGTACAACGAGGACGGATAATAC

tetM – R CCTGGCGTGTCTATGATGTT

tetM – Z ROX–ACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAG–BHQ2

3) гена устойчивости к тетрациклинам tetO:

tetO – F GAGCGTAGATGAAGGCACAA

tetO – R ATGGCCTGGCGTATCTATAATG

tetO – Z FAM-TCACTGCTGTCTGGATAGTGATTCCC-BHQ1