ПРОТИВОВИРУСНЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, СВЯЗАННЫХ С КОРОНАВИРУСАМИ Российский патент 2021 года по МПК A61K38/21 A61K31/352 A61K31/4375 A61K31/7056 A61P31/14 

Настоящее изобретение относится к композициям для их применения в лечении вирусных инфекций, связанных с коронавирусом MERS-CoV (от Middle-East Respiratory Syndrome, ближневосточный респираторный синдром), у человека и животных.

Коронавирус MERS-CoV представляет собой недавно появившийся вирус, идентифицированный в 2012 г. в Саудовской Аравии, ответственный за тяжелый острый респираторный синдром и почечную недостаточность. С момента его идентификации данный вирус был ответственен за более чем 1806 случаев инфекции в 26 странах, главным образом, на Ближнем Востоке. Он ответственен за 643 смерти, что близко к 35,6%-ной смертности согласно Всемирной организации здравоохранения (WHO Source, 28 сентября 2016 г.).

MERS-CoV принадлежит к порядку Nidovirales, семейству Coronaviridae и роду Betacoronavirus.

Коронавирусы представляют собой оболочечные вирусы, имеющие капсид, имеющий спиральную симметрию. Они имеют одноцепочечный положительно смысловой РНК-геном и способны инфицировать клетки из птиц и млекопитающих. Вирусы, которые являются членами данного очень большого семейства, известны за то, что они представляют собой возбудителей простуды (например, вирусы hCoV и ОС43), бронхиолита (например, вирус NL63) или даже некоторых форм нескольких видов пневмонии, таких как наблюдаемые во время эпидемии SARS (атипичная пневмония) (как, например, коронавирус атипичной пневмонии - SARS-CoV).

Несмотря на то, что они принадлежат к тому же самому семейству вирусов, между разными коронавирусами существуют значительные различия - как на генетическом, так и на структурном уровне - но также и в показателях биологии и чувствительности к противовирусным молекулам (см. для ссылки Dijkman & van der Hoek 2009; de Wit et al., 2016).

Несмотря на то, что большинство случаев MERS-CoV у человека приписываются к передаче от человека к человеку, верблюды, по-видимому, являются постоянным инфицированным MERS-CoV промежуточным животным и, таким образом, составляют главный животный источник инфекции для людей.

До настоящего момента нет профилактического или терапевтического решения для эффективного лечения данного эпидемического респираторного вирусного патогена, имеющего пандемический потенциал.

Недавно исследовали несколько терапевтических путей: применение рибавирина, интерферона или даже микофеноловой кислоты. Однако большинство из данных соединений не продемонстрировали достаточной эффективности при использовании у инфицированных пациентов (Al-Tawfiq et al., 2014) или в пределах объема профилактического лечения (de Wit et al., 2016).

Первой стратегией для идентификации активных соединений против MERS-CoV было проведение анализа, среди многочисленных известных противовирусных молекул, молекул, используемых для борьбы с SARS-CoV. Таким образом, ингибиторы вирусной репликации, такие как ингибиторы протеазы, ингибиторы хеликазы и ингибиторы проникновения вируса в клетки-мишени, были проанализированы in vitro (см. для обзора Adedeji & Sarafianos, 2014 и Kilianski & Baker, 2014).

Dyall et al. (Dyall et al., 2014) проанализировали разные категории лекарственных средств с целью идентификации противовирусных агентов, которые активны на коронавирусах SARS- и/или MERS-CoV. Среди разных проанализированных классов агентов было показано то, что некоторые противовоспалительные агенты ингибируют пролиферацию SARS-CoV, тогда как MERS-CoV ингибируется скорее некоторыми ингибиторами транспорта ионов, ингибиторами тубулина или ингибиторами апоптоза. Из 290 проанализированных соединений в культуре клеток было идентифицировано только 33 соединения, имеющих противовирусную активность на MERS-CoV.

Однако, многочисленные литературные данные указывают на то, что противовирусные соединения, которые являются эффективными на SARS-CoV, не являются систематически активными против MERS-CoV и наоборот; данные вирусы имеют различия как в показателях состава белков, так и функциональных взаимодействий с клеткой-хозяином. (Dijkman & van der Hoek 2009; Dyall et al., 2014).

Альтернативной стратегией для идентификации новых терапевтических молекул является анализ молекул, имеющих действие на клеточную сигнализацию, биогенез и метаболические пути, на которые нацелены вирусы и/или которые отклоняются их для их пользы для проведения их репликативного цикла до успешного завершения. Данная стратегия, изложенная в статье Josset et al. (Plos One, 2010), уже позволила идентифицировать молекулы, имеющие противовирусную активность против вирусов гриппа, такие как молекулы, изложенные в патентных заявках FR 2953410, FR 3033701 и FR 3049861.

С другой стороны, Josset et al. подчеркнули тот факт, что MERS-CoV индуцирует профиль экспрессии генов клеток-мишеней, которые он инфицирует, который является довольно отличным от профиля, индуцируемого SARS-CoV. Согласно данному исследованию глюкокортикоид и ингибиторы киназ могли бы быть фармацевтическими классами являющимися благоприятными для исследования активных противовирусных соединений на коронавирусе MERS-CoV. (Josset et al., 2013).

К настоящему времени отсутствуют или имеется очень мало терапевтических молекул, признанных и/или одобренных органами здравоохранения для борьбы с инфекциями вирусом MERS-CoV.

С другой стороны, на рынке отсутствует вакцина против вируса MERS-CoV. Некоторые кандидаты в настоящее время тестируются в клинических испытаниях фазы I (открытое исследование GLS-5300 фазы I по безопасности с варьированием дозы у здоровых добровольцев - полнотекстовый вид - ClinicalTrials.gov, доступ к которому получен 24 марта 2016 г., https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02670187?term=MERS+coronavirus&rank=7).

При данных условиях существует потребность в новых профилактических и/или терапевтических решениях против инфекций коронавирусом MERS-CoV.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В пределах объема настоящего изобретения выбрали и проанализировали несколько соединений в клеточном анализе вирусной инфекции. Посредством этого, несколько соединений имели неожиданное противовирусное влияние на коронавирус MERS-CoV.

Выбранные соединения были описаны ранее для других терапевтических применений. Неожиданно, теперь было показано то, что данные соединения, одни или в комбинации, имеют противовирусную активность против MERS-CoV и позволили лечить и/или предупреждать инфекции данным коронавирусом.

Данное изобретение относится к фармацевтическим или ветеринарным композициям для их применения в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV (ближневосточный респираторный синдром), отличающимся тем, что они содержат, по меньшей мере одно соединение, выбранное из апигенина и берберина, в подходящем фармацевтическом носителе.

Данное изобретение также касается фармацевтической или ветеринарной композиции для ее применения в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV (ближневосточный респираторный синдром), отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из апигенина, берберина и моненсина или комбинацию по меньшей мере двух данных соединений в подходящем фармацевтическом носителе.

Данные фармацевтические или ветеринарные композиции могут преимущестенно дополнительно содержать по меньшей мере другое противовирусное средство и/или антибактериальное средство. Для целей изобретения другое противовирусное средство представляет собой средство, отличное от апигенина, берберина и моненсина. Также для целей данного изобретения противовирусное средство представляет собой средство, отличное от апигенина, берберина и моненсина.

Другим предметом данного изобретения также являются фармацевтические или ветеринарные композиции, содержащие по меньшей мере одно противовирусное средство в комбинации с по меньшей мере одним соединением, выбранным из апигенина, берберина и моненсина, или в комбинации с двумя из данных соединений, или в комбинации трех данных соединений.

В частности, указанная композиция содержит в подходящем фармацевтическом носителе по меньшей мере два соединения, выбранных их:

(а) противовирусного средства; и

(б) соединения, выбранного из апигенина, берберина и комбинации обоих.

Другим предметом данного изобретения также являются фармацевтические или ветеринарные композиции, содержащие в подходящем фармацевтическом носителе комбинацию берберина и моненсина.

Согласно конкретному аспекту данного изобретения указанные композиции находятся в лекарственной форме, предназначенной для введения ингаляцией.

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Фиг. 1. Измерение инфекционных титров MERS-CoV в 24 часа после инфекции на обработанных клетках (моненсином, берберином или апигенином) по отношению к инфекционному титру инфицированных, необработанных контрольных клеток. Инфекционные титры были получены методикой предельного разведения инфекции и расчетом посредством способа Рида и Менча.

А) Результаты выражаются в log10 TCID (инфицирующая тканевая доза)/мл (доза заражения 50% культуры ткани).

Б) Результаты выражаются в TCID/мл.

Фиг. 2. Измерение IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) (концентрация, необходимая для получения 50% нормированной продукции вируса) проанализированных соединений (А - моненсин, Б - берберин, В - апигенин) на клетках VeroE6, инфицированных коронавирусом MERS-CoV. Инфекционные титры были получены методикой предельного разведения инфекции и расчетом посредством способа Рида и Менча.

Фиг. 3. Измерение противовирусной эффективности проанализированных соединений (А - моненсин, Б - апигенин, В - берберин) на клетках дыхательного эпителия человека А549, инфицированных коронавирусом MERS-CoV: инфекционные титры были получены методикой предельного разведения инфекции и расчетом посредством способа Рида и Менча. Нормированная продукция вируса измеряется параллельно жизнеспособности клеток, как функция концентрации используемых соединений.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтической или ветеринарной композиции для ее применения в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV (ближневосточный респираторный синдром), отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из апигенина и берберина, в подходящем фармацевтическом носителе.

Композиции согласно изобретению, в частности, предназначены для применения в лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV.

Под «инфекцией коронавирусом MERS-CoV» подразумевается то, что человеческий или животный организм имеет клетки, которые были инфицированы коронавирусом MERS-CoV. Данная инфекция, в частности, может быть установлена проведением выявления и/или титрования вируса из образцов дыхательной системы, или посредством анализа циркулирующих в крови антител, специфичных в отношении MERS-CoV. Выявление у индивидов, инфицированных данным конкретным вирусом, делается традиционными диагностическими способами, в частности, способами молекулярной биологии (ПЦР), которые хорошо известны специалистам в данной области.

Термин «лечение/осуществление лечения» обозначает борьбу с инфекцией коронавирусом MERS-CoV в человеческом или животном организме. Посредством введения по меньшей мере одной композиции по изобретению показатель вирусной инфекции (инфекционный титр) в организме будет снижаться, и предпочтительно вирус будет полностью исчезать из организма. Термин «лечение/осуществление лечения» также обозначает ослабление симптомов, ассоциированных с вирусной инфекцией (респираторный синдром, почечная недостаточность, лихорадка и т.д.).

Композиции согласно изобретению также предназначены для применения в предупреждении инфекции MERS-CoV.

Для целей данного изобретения термин «предупреждение/осуществление предупреждения» обозначает остановку или по меньшей мере уменьшение вероятности появления инфекции MERS-CoV в человеческом или животном организме. Посредством введения по меньшей мере одной композиции по изобретению человеческие или животные клетки указанного организма становятся менее пермиссивными для инфекции и, таким образом, с большей вероятностью не инфицируются указанным коронавирусом.

Композиции по изобретению могут быть фармацевтического типа, предназначенными для введения человеку, или ветеринарного типа, предназначенными для введения животным, не являющимся человеком.

В том, что касается животных, понятно то, что ветеринарные композиции для их применения в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV (ближневосточный респираторный синдром) предназначаются для введения животным, инфицированным данным коронавирусом. Данные композиции, в частности, предназначаются для млекопитающих, в частности, коммерческих животных, и, в частности, млекопитающих из семейства верблюдовые, и особенно конкретно - для верблюдов (род Camelus).

Согласно данному изобретению термин «подходящий фармацевтический носитель» обозначает носители или эксципиенты, которые представляют собой соединения, не имеющие особенного действия в отношении инфекции, рассматриваемой в данном документе. Данные носители или эксципиенты являются фармацевтически приемлемыми, что означает то, что они могут вводиться индивиду или животному без получения значительных вредных эффектов.

Согласно первому аспекту фармацевтическая или ветеринарная композиция для ее применения по изобретению содержит по меньшей мере одно эффективное количество апигенина.

Согласно второму аспекту фармацевтическая или ветеринарная композиция для ее применения по изобретению содержит по меньшей мере одно эффективное количество берберина.

Под «эффективным количеством» в целях данного изобретения подразумевается достаточное количество активного соединения для ингибирования пролиферации и/или репликации коронавируса, и/или развития вирусной инфекции в пределах организма. Данное ингибирование может быть подвергнуто количественной оценке, например, посредством измерения титра вируса, как показано в примерах настоящей заявки.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения указанная фармацевтическая или ветеринарная композиция для ее применения, как упомянуто выше, отличается тем, что она содержит комбинацию из по меньшей мере двух из следующих соединений: апигенин, берберин и моненсин.

Указанная фармацевтическая композиция, в частности, могла бы содержать одну из следующих комбинаций:

- апигенин и берберин;

- апигенин и моненсин;

- берберин и моненсин; или

- апигенин, берберин и моненсин.

Согласно конкретному аспекту данного изобретения фармацевтическая композиция для применения по изобретению будет состоять из одной из комбинаций соединений, как упомянуто выше, и адаптированного фармацевтического носителя.

Данные соединения известны для применения в других терапевтических применениях, главным образом, иррелевантных по отношению к противовирусной активности против коронавируса MERS-CoV, как изложено ниже.

Апигенин

Апигенин представляет собой природное соединение из семейства флавонов (флавоноидов), обнаруженное в петрушке, подорожнике, тысячелистнике, страстоцвете или даже в розмарине.

Его структурная химическая формула показана ниже:

Данная молекула известна за ее противовоспалительные свойства, хотя ее способ действия и не известен в подробностях. Некоторые работы показывают то, что апигенин действует посредством ингибирования цитохрома Р450.

Апигенин показал его эффективность против некоторых вирусов, таких как HVC (вирус гепатита С) (Shibata et al. 2014), энтеровирус 71 (Lv et al. 2014) или даже гаммагерпесвирус (WO 2016/013793).

Берберин

Берберин представляет собой природный алкалоид, обнаруженный во многих растениях.

Его структурная химическая формула показана ниже:

Данная молекула широко используется в азиатской фармакопее за ее противогрибковые, антибактериальные и противовоспалительные свойства.

Его механизм действия, хотя полностью и не выясненный, по существу относился бы к активации АМФ-киназы (протеинкиназа, активируемая аденозинмонофосфатом). Данный вездесущий фермент играет роль в клеточном энергетическом гомеостазе. Активация AMPK (протеинкиназа, активируемая аденозинмонофосфатом), главным образом, приводит к (i) стимулированию жирных кислот печени и кетогенеза, (ii) ингибированию синтеза холестерина, липогенезу и синтезу триглицеридов, (iii) стимулированию окисления жирных кислот в скелетных мышцах и поглощению глюкозы мышцами, и (iv) модулированию секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы.

Берберин имеет противовирусную активность на вирусе HSV (вирус простого герпеса) (Song et al. 2014) и на вирусах гриппа (Wu et al. 2011).

Кроме того, берберин мог бы иметь противовирусное действие против SARS-CoV (http://apps.who.int/medicinedocs/fr/d/Js6170e/ и WO 2013/185126), хотя экспериментальные данные и не доступны.

Моненсин

Моненсин представляет собой полиэфирный антибиотик, выделенный в бактерии из рода Streptomyces. Данная молекула очень широко используется в качестве добавки в корме для жвачных (под торговым наименованием Руменсин®) для предупреждения инфекций типа кокцидиоза.

Его структурная химическая формула показана ниже:

Моненсин действовал бы в качестве ионофора посредством нарушения внутриклеточного транспорта.

Известно, что данная молекула имеет значительную цитотоксичность при использовании в высоких концентрациях. У животных существуют очень значительные различия в LD50 (50%-ная летальная доза). Например, у лошадей LD50 в 100 раз меньше, чем у жвачных, что вызывает на некоторых фермах очень серьезные проблемы отравлений из-за перекрестного загрязнения кормов.

Возрастающее количество литературных данных также показывает антималярийную активность, а также противовирусную активность против нескольких вирусов: против вирусов гриппа (FR 3033701 и FR 3049861) и, более конкретно, против оболочечных вирусов, включающих некоторые вирусы, которые являются членами семейства коронавирусов.

В патентной заявке US 2009/0149545 упомянуты многие соединения, в частности, моненсин, за его терапевтическое действие против инфекции коронавирусом.

В патентной заявке WO 2015/157223, относящейся к исследованию соединений, имеющих противовирусную активность против коронавирусов, описывается то, что моненсин мог бы использоваться против MERS-CoV, однако, без наличия эксперментальных результатов, позволяющих сделать данное заключение.

Противовирусный агент

Для целей настоящего изобретения под терминами «противовирусный агент» или «противовирусное соединение» подразумеваются активные агенты, которые действуют на вирусную нагрузку (также именуемую инфекционным титром) посредством прямого или опосредованного ингибирования репликации и/или распространения инфекции коронавирусом MERS-CoV в пределах инфицированного организма.

Под «противовирусной активностью» или «противовирусным действием» подразумевается действие на вирус или на его клетки-мишени, в частности, действие по ингибированию цикла репликации вируса или его способности инфицировать и репродуцироваться в клетках-хозяевах, где данный противовирусный эффект может быть получен модулированием числа генов клеток-мишеней.

Под «клетками-мишенями» подразумеваются клетки, инфицированные коронавирусом, и/или которые вероятно будут инфицированы в ближайшем будущем из-за их тесной близости с инфицированными клетками.

Комбинация с другим активным агентом

Понятно то, что композиция для ее применения согласно данному изобретению содержит апигенин и/или берберин, и что она также может содержать другие активные соединения, помимо подходящего фармацевтического носителя.

В самом деле, апигенин, берберин и моненсин или их смеси могут использоваться в терапии одни или в комбинации с по меньшей мере одним другим активным агентом.

Он может представлять собой соединения, обеспечивающие улучшение активности данных соединений, или даже другие активные агенты, известные за конкретную активность.

Данные другие активные соединения могли бы быть выбраны из фармацевтических классов агентов, упомянутых в заявке WO 2015/157223, а именно из антибактериальных агентов, антипаразитарных агентов, ингибиторов нейропередачи, ингибиторов эстрогенового рецептора, ингибиторов синтеза и репликации ДНК, ингибиторов созревания белков, ингибиторов пути киназы, ингибиторов цитоскелета, ингибиторов метаболизма липидов, противовоспалительных агентов, ингибиторов ионных каналов, ингибиторов апоптоза и ингибиторов катепсинов.

Данные активные соединения, в частности, могли бы быть выбраны из антибактериальных агентов, ингибиторов ионных каналов, иммунодепрессивных агентов и противовирусных агентов. В частности, может быть упомянут противовирусный агент ацикловир.

Согласно конкретному аспекту изобретения фармацевтическая или ветеринарная композиция для ее применения в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV содержит, помимо апигенина и/или берберина, по меньшей мере один другой противовирусный агент.

Согласно другому конкретному аспекту изобретения фармацевтическая или ветеринарная композиция для применения в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV содержит, помимо комбинации по меньшей мере двух соединений, выбранных из апигенина, берберина и моненсина, по меньшей мере один другой противовирусный агент.

Понятно то, что данный противовирусный агент будет использоваться в необходимых дозах для того, чтобы иметь противовирусное действие, причем данная доза обозначается как «эффективная», причем данная дозировка возможно легко определяется специалистами в данной области.

Для целей данного изобретения противовирусный агент обозначает соединение, действующее на вирус, посредством ингибирования и/или замедления, и/или предупреждения ассоциированной вирусной инфекции.

Противовирусные агенты классифицируются в разных категориях, в зависимости от их способа действия. Они включают, в частности:

- нуклеотидные аналоги, которые препятствуют или останавливают синтез ДНК или РНК; а также ингибиторы ферментов, участвующих в синтезе ДНК или РНК (хеликаза, репликаза);

- соединения, которые ингибируют стадии созревания вируса во время его цикла репликации;

- соединения, которые препятствуют связыванию с клеточной мембраной или поступлению вируса в клетки-хозяева (ингибиторы слияния или поступления);

- агенты, которые предотвращают экспрессию вируса в клетке-хозяине после его поступления посредством блокирования его разборки в клетке;

- агенты, которые ограничивают распространение вируса в другие клетки.

В частности, можно упомянуть противовирусные агенты, хорошо известные специалистам в данной области, предназначенные для борьбы с РНК-вирусами, такие как ингибиторы протеаз, игибиторы хеликаз и ингибиторы поступления вируса MERS-CoV в клетки-мишени.

Среди противовирусных агентов, хорошо известных специалистам в данной области, более конкретно можно упомянуть рибавирин, аналог нуклеозида гуанозина с широким противовирусным спектром; а также интерферон, который действует посредством ингибирования вирусной репликации в клетках-хозяевах.

Согласно конкретному аспекту данного изобретения фармацевтическая или ветеринарная композиция отличается тем, что другой противовирусный агент выбран из следующих соединений: рибавирин, интерферон или комбинация обоих.

Для целей данного изобретения под «интерфероном» подразумевается соединение, принадлежащее к семейству интерферонов, которые представляют собой гликопротеины, секретируемые клетками иммунной системы.

Интерфероны представляют собой семейство маленьких белковых молекул с молекулярной массой от примерно 15000 до 21000 Дальтон. Было идентифицировано три главных класса интерферонов: альфа, бета и гамма. Данные 3 главных класса сами не являются гомогенными и могут включать несколько разных молекулярных видов интерферона. Идентифицировали более 14 генетически отличающихся человеческих интерферонов альфа.

Понятно то, что в фармацевтической или ветеринарной композиции по изобретению интерферон, который используется, будет представлять собой рекомбинантный полипептид, синтезированный в лаборатории.

В частности, интерферон, который используется, будет представлять собой рекомбинантный интерферон альфа-2b, эффективность которого во влиянии на вирусную репликацию in vivo и in vitro была продемонстрирована.

Такие противовирусные агенты имеются в продаже, и их условия применения описываются в справочниках, таких как Le Dictionnaire Vidal.

Таким образом, фармацевтическая композиция для применения согласно изобретению могла бы содержать одну из следующих комбинаций:

- апигенин, берберин и рибавирин;

- апигенин, берберин и интерферон;

- апигенин, берберин, интерферон и рибавирин;

- апигенин, моненсин и рибавирин;

- апигенин, моненсин и интерферон;

- апигенин, моненсин, интерферон и рибавирин;

- берберин, моненсин и рибавирин;

- берберин, моненсин и интерферон;

- берберин, моненсин, интерферон и рибавирин;

- апигенин, берберин, моненсин и рибавирин;

- апигенин, берберин, моненсин и интерферон;

- апигенин, берберин, моненсин, интерферон и рибавирин.

Согласно конкретному аспекту изобретения фармацевтическая композиция для ее применения по изобретению будет состоять из комбинации активных агентов, таких как упомянутые выше, и адаптированного фармацевтического носителя.

Способ введения фармацевтических или ветеринарных композиций Фармацевтические или ветеринарные композиции для применения по настоящему изобретению адаптированы для перорального, подъязычного, ингаляционного, подкожного, внутримышечного, внутривенного, чрескожного, глазного или ректального введения.

Согласно конкретному воплощению изобретения фармацевтическая или ветеринарная композиция для применения по изобретению отличается тем, что она находится в лекарственной форме, предназначенной для введения ингаляцией.

Ингаляция обозначает поглощение дыхательными путями. Она представляет собой конкретный способ поглощения соединений для терапевтических целей, из некоторых веществ в виде газа, микрокапель или суспендированного порошка.

Введение фармацевтической или ветеринарной композиции посредством ингаляции, то есть, посредством назальных и/или оральных дыхательных путей, хорошо известно специалистам в данной области.

Различают два типа введения посредством ингаляции:

- введение вдуванием, когда композиции находятся в виде порошков, и

- введение распылением, когда композиции находятся в виде аэрозолей (суспензий) или в виде растворов, например, водных растворов под давлением. Для введения фармацевтической или ветеринарной композиции, при этом, будет рекомендовано применение небулайзера или распылителя.

Лекарственная форма, рассматриваемая в данном документе, таким образом, выбрана из следующих: порошок, водный раствор капелек или раствор под давлением.

Комбинированный продукт

Настоящее изобретение также относится к комбинированному продукту, содержащему:

- композицию по изобретению, содержащую по меньшей мере одно соединение, выбранное из апигенина и берберина, возможно в присутствии моненсина, и

- по меньшей мере один противовирусный агент,

для одновременного, раздельного или последовательного применения для предупреждения и/или лечения инфекции коронавирусом MERS-CoV у человека или животных.

Такой комбинированный продукт мог бы использоваться в предупреждении и/или лечении инфекции коронавирусом MERS-CoV в пределах объема одновременного, раздельного или последовательного применения. Таким образом, по меньшей мере два активных агента, содержащихся в комбинированном продукте, могли бы вводиться одновременно, раздельно или последовательно.

Понятно то, что каждая из всех комбинаций из двух, трех или четырех активных соединений, упомянутых ранее, может находиться в виде комбинированного продукта, то есть два, три или четыре активных соединения могут вводиться одновременно, раздельно или последовательно для предупреждения и/или лечения инфекции коронавирусом MERS-CoV.

Данное изобретение также относится к терапевтическому способу предупреждения и/или лечения инфекции коронавирусом MERS-CoV у человека, где пациенту вводится эффективное количество соединения, выбранного из апигенина и берберина или смеси обоих, возможно в ассоциации с моненсином.

Данное изобретение также относится к терапевтическому способу предупреждения и/или лечения инфекции коронавирусом MERS-CoV у животных, где животному вводится эффективное количество соединения, выбранного из апигенина и берберина, возможно в ассоциации с моненсином.

Данное изобретение также относится к применению соединения, выбранного из апигенина и берберина, возможно в ассоциации с моненсином, для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения инфекции коронавирусом MERS-CoV.

Фармацевтические или ветеринарные композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или ветеринарной композиции, содержащей в подходящем фармацевтическом носителе, по меньшей мере два соединения, выбранных из:

(а) противовирусного агента; и

(б) соединения, выбранного из апигенина, берберина и комбинации обоих.

В частности, противовирусный агент предназначен для борьбы с инфекцией коронавирусом MERS.

Данный противовирусный агент, в частности, мог бы быть выбран из:

- нуклеотидных аналогов, которые препятствуют или останавливают синтез ДНК или РНК; а также ингибиторов ферментов, участвующих в синтезе ДНК или РНК (хеликаза, репликаза);

- соединений, которые ингибируют стадии созревания вируса во время его цикла репликации;

- соединений, которые препятствуют связыванию с клеточной мембраной или поступлению вируса в клетки-хозяева (ингибиторы слияния или поступления);

- агентов, которые предотвращают экспрессию вируса в клетке-хозяине после его поступления посредством блокирования его разборки в клетке;

- агентов, которые ограничивают распространение вируса в другие клетки.

В частности, можно упомянуть противовирусные агенты, хорошо известные специалистам в данной области, предназначенные для борьбы с РНК-вирусами, такие как ингибиторы протеаз, ингибиторы хеликаз и ингибиторы поступления вируса в клетку в клетках-хозяевах.

Среди противовирусных агентов, хорошо известных специалистам в данной области, более конкретно можно упомянуть рибавирин, аналог нуклеозида гуанозина с широким противовирусным спектром; а также интерферон, который действует посредством ингибирования репликации вируса в клетках-хозяевах.

Согласно конкретному аспекту данного изобретения данная композиция содержит, в качестве противовирусного агента, интерферон, рибавирин или комбинацию обоих.

Фармацевтическая композиция по изобретению также могла бы содержать моненсин.

Таким образом, фармацевтическая композиция по изобретению могла бы содержать одну из следующих комбинаций:

- апигенин и рибавирин;

- апигенин и интерферон;

- апигенин, интерферон и рибавирин;

- берберин и рибавирин;

- берберин и интерферон;

- берберин, интерферон и рибавирин;

- апигенин, берберин и рибавирин;

- апигенин, берберин и интерферон;

- апигенин, берберин, интерферон и рибавирин;

- апигенин, моненсин и рибавирин;

- апигенин, моненсин и интерферон;

- апигенин, моненсин, интерферон и рибавирин;

- берберин, моненсин и рибавирин;

- берберин, моненсин и интерферон;

- берберин, моненсин, интерферон и рибавирин;

- апигенин, берберин, моненсин и рибавирин;

- апигенин, берберин, моненсин и интерферон;

- апигенин, берберин, моненсин, интерферон и рибавирин.

Согласно конкретному аспекту изобретения фармацевтическая или ветеринаная композиция по изобретению будет состоять из комбинации активных агентов, как упомянуто выше, и адаптированного фармацевтического носителя.

Более конкретно, фармацевтическая или ветеринаная композиция по изобретению будет содержать по меньшей мере одну комбинацию интерферона, моненсина, апигенина и берберина в подходящем фармацевтическом носителе.

Такие композиции могли бы использоваться в любом виде терапевтического или профилактического применения и, в частности, будут использоваться в лечении и/или предупреждении вирусных инфекций.

Композиции согласно данному изобретению могут быть фармацевтического типа, предназначенного для введения человеку, или ветеринарного типа, предназначенного для введения животным, не являющимся человеком.

Что касается животных, ветеринарные композиции по изобретению, в частности, предназначены для млекопитающих, в частности, коммерческих животных, и, в частности, млекопитающих семейства верблюдовых, и, более конкретно, для верблюдов (род Camelus).

Однако следует отметить то, что моненсин имеет сильную токсичность у лошадей (род Equus), и что ветеринарные композиции по изобретению, содержащие моненсин, не предназначены для введения животным, принадлежащим к роду Equus.

Такие композиции могли бы, в частности, использоваться в лечении и/или предупреждении инфекций коронавирусом, и, особенно конкретно, инфекции коронавирусом MERS-CoV.

Согласно конкретному воплощению изобретения такие композиции могли бы находиться в лекарственной форме, предназначенной для введения ингаляцией.

Комбинация берберина и моненсина

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или ветеринарной композиции, содержащей, в подходящем фармацевтическом носителе, комбинацию берберина и моненсина.

Указанная композиция могла бы использоваться в любом виде терапевтического или профилактического применения и будет, в частности, использоваться в лечении и/или предупреждении вирусных инфекций.

Такая композиция, содержащая комбинацию берберина и моненсина, могла бы использоваться, в частности, в лечении и/или предупреждении инфекций коронавирусом и, особенно конкретно, коронавирусом MERS-CoV.

Согласно конкретному воплощению изобретения данная композиция могла бы находиться в лекарственной форме, предназначенной для введения ингаляцией.

ПРИМЕРЫ

Изложенные ниже примеры демонстрируют то, что вышеупомянутые соединения неожиданно имеют значительную противовирусную активность в отношении MERS-CoV in vitro на двух отличных моделях клеток млекопитающих при условиях умеренной цитотоксичности.

Во-первых, данные соединения были проанализированы in vitro в концентрации, традиционно используемой в литературе, в контексте инфекции клеток VERO-E6 штаммом MERS-CoV France-UAE/1612/2013, номер доступа Genbank KF745068.

Клетки VERO-E6 происходят от эпителиальных клеток почки обезьяны и являются чувствительными к инфекции MERS-CoV. Они составляют одну из клеточых моделей для исследования, широко используемую в литературе.

Параметры инфекции были определены заранее для того, чтобы получать лучшие условия для наблюдения возможного противовирусного эффекта.

Клетки VERO-E6 были инфицированы при MOI (множественность инфекции) 0,5 на протяжении 24 ч при 37°С при 5% CO₂ в присутствии или отсутствие анализируемых соединений.

После 24 ч инкубации инфекционные титры (log10 TCID50/мл или TCID50/мл) определяли в супернатантах культуры инфицированных клеток.

Инфекционные титры показаны в TCID50/мл (доза заражения 50% культуры ткани) на Фиг. 1А (log10 TCID50/мл) и Фиг. 1Б (TCID50/мл). Они были получены методикой предельного разведения инфекции и расчетом посредством способа Рида и Менча.

Анализ цитотоксичности и анализ количественного измерения коронавируса проводятся после 24 ч инкубации. Цитотоксичность разных соединений определяется в каждом анализе на чашке с неинфицированными клетками посредством анализа жизнеспособности (анализ MTS, Promega). Данный анализ основывается на измерении метаболической активности клеток, которая превращает субстрат (MTS тетразолий) в продукт (формазан), растворимый в среде, и оптическая плотность измеряется при 490 нм, которая пропорционально отражает число живых клеток. Отношение оптической плотности в каждой лунке к средней оптической плотности лунок контрольных клеток (не обработанных соединениями) рассчитывается и указывается на схемах как индекс жизнеспособности клеток (относительная жизнеспособность клеток).

Влияние на продукцию вируса in vitro измеряется определением инфекционных титров (TCID50/мл), осуществляемым на клетках VERO-E6, причем титры рассчитываются согласно методике Рида и Менча. Отношение инфекционного титра при каждом условии было выражено как функция инфекционного титра, измеренного при контрольных условиях (без обработки).

Результаты излагаются на Фиг. 1А (инфекционные титры, выраженные в log10 TCID50/мл) и 1Б (титры, выраженные в TCID50/мл).

Инфекционные титры, измеренные при экспериментальных условиях в присутствии анализируемых соединений, сильно уменьшаются по сравнению с контрольными условиями, где клетки инфицируются, но не обрабатываются.

В самом деле, моненсин (6 мкМ), берберин (12,5 мкМ) и апигенин (15 мкМ) обеспечивают уменьшение инфекционных титров на 97,8%, 78,4% и 97,8%, соответственно, относительно контроля (см. Фиг. 1).

Из данных результатов был проанализирован более широкий интервал концентрации для каждого из трех соединений на клетках Vero Е6 при таких же экспериментальных условиях для того, чтобы определять интервал эффективной концентрации и, таким образом, определять IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация), а именно необходимую дозу для получения 50%-ного ингибирования продукции вируса (см. Фиг. 2).

Было возможным определение значения IC50 для данных трех соединений:

- 1,25 мкМ для моненсина

- 3,8 мкМ для берберина и

- 1,7 мкМ для апигенина.

Данные значения IC50 являются относительно низкими по сравнению с обычными концентрациями, известными для данных соединений в их применениях из инфекционных областей. Данные значения являются очень далекими от цитотоксических концентраций (СС50).

Аналогичные результаты по эффективности также были получены для данных трех соединений в другой премиальной клеточной модели - модели линии клеток А549 человеческого дыхательного эпителия (Фиг. 3).

БИБЛИОГРАФИЯ

ПАТЕНТЫ

FR 2953410

FR 3033701

FR 3049861

WO 2016/013793

WO 2013/185126

US 2009/0149545

WO 2015/157223

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Emmie de Wit, Neeltje van Doremalen, Darryl Falzarano & Vincent J. Munster. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).

R. Dijkman, L. van der Hoek. Human coronaviruses 229E and NL63: close yet still so far. J Formos Med Assoc 108 (2009), pp.270-279

Dyall J, Coleman CM, Hart BJ, Venkataraman T, Holbrook MR, Kindrachuk J, Johnson RF, dinger GG Jr, Jahrling PB, Laidlaw M, Johansen LM, Lear-Rooney CM, Glass PJ, Hensley LE, Frieman MB. Repurposing of clinically developed drugs for treatment of Middle East respiratory syndrome coronavirus infection. Antimicrob Agents Chemother. 2014 Aug; 58(8): 4885-93.

Jaffar A. Al-Tawfiq er al., Ribavirin and Interferon Therapy in Patients Infected with the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus: An Observational Study. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of the International Society for Infectious Diseases 20 (March 2014): 42-46

Josset L, Menachery VD, Gralinski LE, Agnihothram S, Sova P, Carter VS, Yount BL, Graham RL, Baric RS, Katze MG. Cell host response to infection with novel human coronavirus EMC predicts potential antivirals and important differences with SARS coronavirus. MBio. 2013 Apr 30; 4

Adedeji AO, Sarafianos SG. Antiviral drugs specific for coronaviruses in preclinical development. Curr Opin Virol. 2014 Oct; 8: 45-53.

Kilianski A, Baker SC. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 2014 Jan; 101: 105-12.

Shibata C, Ohno M, Otsuka M, Kishikawa T, Goto K, Muroyama R, Kato N, Yoshikawa T, Takata A, Koike K. The flavonoid apigenin inhibits hepatitis С virus replication by decreasing mature microRNA122 levels. Virology. 2014 Aug; 462-463: 42-8.

Lv X, Qiu M, Chen D, Zheng N, Jin Y, Wu Z. Apigenin inhibits enterovirus 71 replication through suppressing viral IRES activity and modulating cellular JNK pathway. Antiviral Res. 2014 Jun 24; 109C: 30-41.)

Song S, Qiu M, Chu Y, Chen D, Wang X, Su A, Wu Z. Berberine down-regulates cellular JNK and NF-кВ activation and this may result in an inhibition of HSV replication. Antimicrob Agents Chemother. 2014 Jun 9.

Wu Y, Li JQ, Kim YJ, Wu J, Wang Q, Hao Y. In vivo and in vitro antiviral effects of berberine on influenza virus. Chin J Integr Med. 2011 Jun; 17(6): 444-52.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической или ветеринарной композиции для ее применения в предупреждении и/или лечении инфекции, вызванной коронавирусом ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из апигенина и берберина, или их комбинацию, или комбинацию берберина и моненсина, в подходящем фармацевтическом носителе. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Применение композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение, выбранное из апигенина и берберина, или их комбинацию, в предупреждении и/или лечении инфекции, вызванной 5 коронавирусом MERS-CoV (ближневосточного респираторного синдрома).

2. Применение по п. 1, где указанная композиция дополнительно содержит моненсин.

3. Применение по одному из пп. 1, 2, где указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере еще одно соединение, выбранное из рибавирина и интерферона, или их комбинацию.

4. Композиция для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной коронавирусом MERS-CoV (ближневосточного респираторного синдрома), содержащая комбинацию берберина и моненсина в подходящем фармацевтическом носителе.

5. Композиция для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной коронавирусом MERS-CoV (ближневосточного респираторного синдрома), содержащая комбинацию интерферона, моненсина, апигенина и берберина в подходящем фармацевтическом носителе.