ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Коронавирусы представляют собой РНК-вирусы с положительной цепью (+ оц РНК), покрытые липидной оболочкой, которые реплицируются в цитоплазме клетки. До 2002 года коронавирусы не считались значимыми патогенами человека. Другие человеческие коронавирусы, такие как HCoV-229E и HCoV-OC43, вызывали только легкие респираторные инфекции у здоровых взрослых. Однако в 2002 году в провинции Гуандун, Китай, появился коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). Хотя SARS-CoV преимущественно затронул Юго-Восточную Азию, со значительными вспышками в Китае, Гонконге, Тайване, Сингапуре и Вьетнаме, вирус распространился за пределы региона.
В 2012 году коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) был обнаружен у пациента с тяжелым респираторным заболеванием в Саудовской Аравии. Клинические признаки инфекции MERS-CoV у людей варьируются от бессимптомной до очень тяжелой пневмонии с потенциальным развитием острого респираторного дистресс-синдрома, септического шока и полиорганной недостаточности, приводящей к смерти. С момента сообщения о первом случае заражения MERS-CoV и выделения вируса был достигнут значительный прогресс в понимании эпидемиологии, экологии и биологии вируса. Было разработано и широко используется несколько анализов для выявления острой инфекции MERS-CoV методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ).
В 2019 году в мире появился новый коронавирус (nCoV), который, как теперь известно, вызывает коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19). COVID-19 - инфекционное заболевание, вызываемое коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS коронавирус-2 или SARS-CoV-2), вирусом, филогенетически тесно связанным с вирусом SARS. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила вспышку коронавируса в 2019-2020 годах чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение (PHEIC). У большинства пациентов COVID-19 начинается и заканчивается в легких, потому что коронавирусы в первую очередь вызывают респираторные заболевания.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в целом относится к областям вирусологии, инфекционных заболеваний и медицины. В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает новое применение ABC294640 в виде свободных оснований или их солей при приготовлении лекарственных препаратов для лечения коронавирусной инфекции у людей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванной вирусом SARS-CoV-2, который включает введение нуждающемуся в этом лицу эффективного количества ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли. В одном варианте осуществления ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида. В одном варианте осуществления ABC294640 используется в комбинации с фармацевтически приемлемым материалом-носителем. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый материал-носитель представляет собой буферный физиологический раствор. В одном варианте осуществления получают суспензию, которая включает гидрохлорид ABC294640, суспендированный в физиологическом буферном растворе, и введение включает использование зонда для доставки суспензии непосредственно в желудок. В одном варианте осуществления ABC294640 и необязательно фармацевтически приемлемый материал-носитель находятся в стандартной дозированной форме, подходящей для перорального введения. В одном варианте осуществления дозированная форма представляет собой твердую дозированную форму. В одном варианте осуществления твердая дозрованная форма представляет собой капсулу. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой вирус дикого типа. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой природный вариант коронавируса. В одном варианте осуществления стандартная дозированная форма, подходящая для перорального введения, представляет собой капсулу, содержащую 250 мг гидрохлорида ABC294640, при этом введение включает введение двух капсул два раза в день в течение по меньшей мере 10 дней до общей суточной дозы 1000 мг гидрохлорида ABC294640. В одном варианте осуществления введение эффективного количества ABC294640 приводит к снижению вирусной нагрузки по меньшей мере на 10%.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения, включающий введение эффективного количества ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли, человеку, имеющему коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19), вызванную вирусом SARS-CoV-2. В одном варианте осуществления ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида. В одном варианте осуществления ABC294640 используется в комбинации с фармацевтически приемлемым материалом-носителем. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый материал-носитель представляет собой буферный физиологический раствор. В одном варианте осуществления получают суспензию, которая включает гидрохлорид ABC294640, суспендированный в физиологическом буферном растворе, и введение включает использование зонда для доставки суспензии непосредственно в желудок. В одном варианте осуществления ABC294640 и необязательно фармацевтически приемлемый материал-носитель находятся в стандартной дозированной форме, подходящей для перорального введения. В одном варианте осуществления дозированная форма представляет собой твердую дозированную форму. В одном варианте осуществления твердая дозрованная форма представляет собой капсулу. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой вирус дикого типа. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой природный вариант коронавируса. В одном варианте осуществления стандартная дозированная форма, подходящая для перорального введения, представляет собой капсулу, содержащую 250 мг гидрохлорида ABC294640, при этом введение включает введение двух капсул два раза в день в течение по меньшей мере 10 дней до общей суточной дозы 1000 мг гидрохлорида ABC294640.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли для лечения коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли для применения в лечении коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли для применения в лечении коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли для производство лекарственного препарата для лечения коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусной инфекции, содержащая ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2, содержащая ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусной инфекции, содержащая ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2, содержащая ((пиридин-4-илметил)-амид 3-(4-хлорфенил)-адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан агент против коронавирусной инфекции, содержащий ABC294640,
,
в виде свободного основания или виде его соли.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан агент против коронавирусной инфекции, содержащий ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) в виде свободного основания или в виде его соли.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусной инфекции человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ABC294640 ((пиридин-4-илметил)-амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) или его фармацевтически приемлемой соли. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает диагностическое подтверждение того, что субъект инфицирован коронавирусом человека, до введения ABC294640. В одном варианте осуществления ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида. В варианте осуществления коронавирусная инфекция представляет собой коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2).
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, в течение по меньшей мере 10 дней одной или более терапевтически эффективных доз ABC294640 ((пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты) или его фармацевтически приемлемой соли. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает диагностическое подтверждение того, что субъект инфицирован SARS-CoV-2, до введения соединения. В одном варианте осуществления ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида. В одном варианте осуществления общая доза ABC294640 в день независимо выбрана в каждом случае от около 250 мг до около 1500 мг.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2), включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества ABC294640 ((пиридин-4-илметил)-амид 3-(4-хлор-фенил)-адамантан-1-карбоновой кислоты) или его фармацевтически приемлемой соли, ABC294640, имеющего способность воздействовать на фактор клетки-хозяина, сфингозинкиназу-2 (SK2), которая участвует как в репликации вируса внутри клетки, так и в последующих воспалительных/иммунных реакциях.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ модулирования репликации коронавируса в клетке-хозяине, инфицированной коронавирусом, включающий введение в клетку-хозяина ABC294640 в виде свободного основания или его соли в количестве, эффективном для модуляции репликации вирус.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение ABC294640 в виде свободного основания или в виде его соли при приготовлении лекарственных препаратов для лечения коронавирусной инфекции. В одном варианте осуществления коронавирус представляет собой новый коронавирус 2019 COVID-19. В варианте осуществления коронавирусная инфекция представляет собой коронавирусную пневмонию. В одном варианте осуществления ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида. В одном варианте осуществления ABC294640 активен в отношении фактора клетки-хозяина, сфингозининазы-2, который участвует как в репликации вируса внутри клетки, так и в последующих воспалительных/иммунных ответах.
В соответствии с проиллюстрированными в данном документе аспектами настоящее изобретение относится к упакованному фармацевтическому продукту. Упакованный фармацевтический продукт включает контейнер, множество стандартных дозированных форм ABC294640, подходящих для перорального введения, в контейнере и легенду (например, этикетку или вкладыш), связанную с контейнером и указывающую на применение ABC294640 для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает новое применение WX-671 в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей при приготовлении лекарственных препаратов для лечения коронавирусной инфекции у человека.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2, у человека, нуждающегося в этом, который включает введение эффективного количества WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или виде их солей. В одном варианте осуществления WX-671 присутствует в виде гидросульфата. В одном варианте осуществления WX-671 используется в комбинации с фармацевтически приемлемым материалом-носителем. В одном варианте осуществления WX-671 и необязательно фармацевтически приемлемый материал-носитель находятся в стандартной дозированной форме, подходящей для перорального введения. В одном варианте осуществления дозированная форма представляет собой твердую дозированную форму. В одном варианте осуществления твердая дозрованная форма представляет собой капсулу. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой вирус дикого типа. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой природный вариант коронавируса. В одном варианте осуществления 200 мг WX-671 вводят в одной капсуле человеку, нуждающемуся в этом, один раз в день в течение по меньшей мере 10 дней до общей суточной дозы 200 мг. В одном варианте осуществления 400 мг WX-671 вводят в виде двух капсул человеку, нуждающемуся в этом, один раз в день в течение по меньшей мере 10 дней до общей суточной дозы 400 мг. В одном варианте осуществления около 231 мг WX-671.1 (упамостата) вводят в одной капсуле человеку, нуждающемуся в этом, один раз в день в течение по меньшей мере 10 дней, при этом общая суточная доза эквивалентна 200 мг свободной формы. В одном варианте осуществления около 463 мг WX-671.1 (упамостата) вводят в виде двух капсул человеку, нуждающемуся в этом, один раз в день в течение по меньшей мере 10 дней, при этом общая суточная доза эквивалентна 400 мг свободной формы. В одном варианте осуществления введение эффективного количества WX-671 приводит к снижению вирусной нагрузки на по меньшей мере 10%.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения, включающий введение эффективного количества WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или их солей для человека, имеющего коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19), вызванную вирусом SARS-CoV-2. В одном варианте осуществления WX-671 присутствует в виде гидросульфата. В одном варианте осуществления WX-671 используется в комбинации с фармацевтически приемлемым материалом-носителем. В одном варианте осуществления WX-671 и необязательно фармацевтически приемлемый материал-носитель находятся в стандартной дозированной форме, подходящей для перорального введения. В одном варианте осуществления дозированная форма представляет собой твердую дозированную форму. В одном варианте осуществления твердая дозированная форма представляет собой капсулу. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 является вирусом дикого типа. В одном варианте осуществления вирус SARS-CoV-2 представляет собой природный вариант коронавируса. В одном варианте осуществления WX-671.1 (упамостат) вводят в виде одной капсулы, содержащей 200 мг свободного основания, и при этом одну капсулу вводят человеку, нуждающемуся в этом, один раз в день в течение по меньшей мере 10 дней в общей суточной дозе 200 мг. В одном варианте осуществления WX-671.1 (упамостат) вводят в виде двух капсул, каждая капсула содержит 200 мг, и при этом две капсулы вводят человеку, нуждающемуся в этом, один раз в день в течение по меньшей мере 10 дней, до общей суточной дозы 400 мг.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей для применения в лечении коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или виде их солей для применения в лечении коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в настоящем документе, раскрыт (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид) в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеры или (E/Z)-смеси, а также в виде свободных оснований или их солей для применения при лечении коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид) в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей для применения при лечении коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или их солей для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида) в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или виде их солей для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусной инфекции.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано применение (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида) в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусной инфекции, содержащая WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или виде их солей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2, содержащая WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или виде их солей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусной инфекции, содержащая (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид) в виде (L)- или (D)-энантиомеров, и в виде E- или (Z)-изомеров, или (E/Z)-смесей, и в виде свободных оснований или в виде их солей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описана фармацевтическая композиция для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2, содержащая (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид) в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан агент против коронавирусной инфекции, содержащий WX-671,
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или виде их солей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан агент против коронавирусной инфекции, содержащий (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид) в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусной инфекции человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, выбранного из одного из N-α(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид-гидрохлорида или его пролекарства N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида, при этом выбранное соединение может быть представлено в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает диагностическое подтверждение того, что субъект инфицирован человеческим коронавирусом, до введения соединения. В варианте осуществления коронавирусная инфекция представляет собой коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2). В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид в форме для перорального введения. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид-гидрохлорид в инъекционной форме для внутривенного или внутримышечного введения. В одном варианте соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид, присутствующий в виде сульфата или гидросульфата.
В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид, присутствующий в конформации L-стереоизомера. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида гидросульфат. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и должно вводиться в дозе 200 мг в день. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и должно вводиться в дозе 400 мг в день.
Согласно аспекту, проиллюстрированному в данном документе, раскрыт способ лечения коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, в течение по меньшей мере 14 дней одной или более терапевтически эффективных доз соединения, выбранного из одного из N-α(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид-гидрохлорида или его пролекарства N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид, где выбранное соединение может присутствовать в виде (L)- или (D)-энантиомеров, и в виде E- или (Z)-изомеров, или (E/Z)-смесей, и в виде свободных оснований или в виде их солей. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает диагностическое подтверждение того, что субъект инфицирован SARS-CoV-2, до введения соединения. В одном варианте осуществления общая доза соединения N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в день независимо выбирается в каждом случае от около 200 мг до около 400 мг. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазин гидросульфат.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ лечения коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2), включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически приемлемого количества соединения, выбранного из одного из N-α(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид-гидрохлорида или его пролекарства N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида, где выбранное соединение может присутствовать в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей, при этом соединение имеют способность связывать активирующие гемагглютинин (HA) трансмембранные сериновые протеазы II типа (TTSP), тем самым уменьшая репликацию коронавируса у человека после поражения коронавирусом. В одном варианте осуществления TTSP представляет собой член 2 S1 трансмембранной сериновой протеазы (TMPRSS2). В одном варианте осуществления TTSP представляет собой трансмембранную сериновую протеазу 11A (TMPRSS11(A)). В одном варианте осуществления способ дополнительно включает диагностическое подтверждение того, что субъект инфицирован SARS-CoV-2, до введения соединения. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида гидросульфат.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описан способ модулирования репликации коронавируса в клетке-хозяине, инфицированной коронавирусом, включающий введение в клетку-хозяин соединения, выбранного из одного из N-α(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидино-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид-гидрохлорида или его пролекарства N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида, где выбранное соединение может присутствовать в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей в количестве, эффективном для модуляции репликации вируса. В одном варианте осуществления соединение представляет собой N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида гидросульфат.
В соответствии с аспектами, проиллюстрированными в данном документе, описано приготовлении WX-671 в получении лекарственных средств для лечения коронавирусной инфекции. В одном варианте осуществления коронавирус представляет собой новый коронавирус 2019 COVID-19. В варианте осуществления коронавирусная инфекция представляет собой коронавирусную пневмонию. В одном варианте осуществления WX-671 активен в отношении ингибитора сериновой протеазы хозяина и блокирует управляемое шиповидным белком проникновение в клетки-хозяева.
В соответствии с проиллюстрированными в данном документе аспектами настоящее изобретение относится к упакованному фармацевтическому продукту. Упакованный фармацевтический продукт включает контейнер, множество стандартных дозированных форм WX-671, подходящих для перорального введения, в контейнере и легенду (например, этикетку или вкладыш), связанную с контейнером и указывающую на применение WX-671 для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Описанные в данном время варианты осуществления будут дополнительно объяснены со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Приведенные графические материалы не обязательно выполнены в масштабе, вместо этого основное внимание уделяется иллюстрации принципов описанных в данном документе вариантов осуществления.
На Фиг. 1 представлена модель культуры клеток EpiAirway™ человека, называемая в данном документе клетками бронхиального эпителия человека (HBEC).
На Фиг. 2 представлен график, демонстрирующий, что в обработанных опаганибом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3 дней инкубации наблюдалось дозозависимое снижение продукции инфекционного вируса при фармакологически значимых концентрациях.
На Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий, что в обработанных опаганибом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3-дневной инкубации наблюдалась ограниченная цитотоксичность в диапазоне доз, в котором наблюдаются мощные противовирусные эффекты.
На Фиг. 4A представляет собой график, демонстрирующий, что в обработанных WX-UK1 и обработанных упамостатом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3 дней инкубации наблюдалось дозозависимое снижение продукции инфекционного вируса при фармакологически релевантных концентрациях. Вирус титровали с помощью анализа TCID50 в апикальных смывах. Каждый символ представляет собой титр, усредненный из 3 протестированных повторностей.
На Фиг. 4B представлен график, демонстрирующий, что в обработанных упамостатом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3 дней инкубации наблюдалось дозозависимое снижение продукции инфекционного вируса при фармакологически релевантных концентрациях. Вирус титровали с помощью реакции нейтрализации бляшкообразования в апикальных смывах. Каждый символ представляет собой титр, усредненный из 3 протестированных повторностей.
На Фиг. 5 представлен график, демонстрирующий, что в обработанных WX-UK1 и обработанных упамостатом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3-дневной инкубации наблюдалась ограниченная цитотоксичность во всем диапазоне доз, в котором наблюдаются мощные противовирусные эффекты.
На Фиг. 6 представлена аппроксимированная по уравнению 1 кривая с относительной скоростью по оси ординат и концентрацией WX-UK1 по оси абсцисс. На графике показано, как WX-UK1 ингибирует активность TMPRSS2
На Фиг. 7 представлена аппроксимированная по уравнению 1 кривая с относительной скоростью по оси ординат и концентрацией WX-UK1 по оси абсцисс. На графике показано, как WX-UK1 ингибирует активность TMPRSS11A.
На Фиг. 8А и Фиг. 8B представлены графики, демонстрирующие ингибирование упамостатом и WX-UK1 управляемого SARS-2-S проникновения в клетки Calu-3 и клетки Vero-E6. На Фиг. 8A клетки Calu-3 или на Фиг. 8B клетки Vero-E6 предварительно инкубировали с указанными концентрациями упамостата, WX-UK1, мезилата камостата или хлорохина, а затем инокулировали псевдочастицами, содержащими белок S VSV-SARS-2. Проникновение псевдотипа анализировали путем определения активности люциферазы в клеточных лизатах. Показаны результаты одного эксперимента, проведенного с четырьмя образцами. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение (станд. откл.).
На Фиг. 9 представлен график, демонстрирующий ингибирование упамостатом и WX-UK1 индуцированного VSV-g проникновения в клетки Calu-3. Клетки Calu-3 предварительно инкубировали с указанными концентрациями упамостата, WX-UK1, мезилата камостата или хлорохина, а затем инокулировали псевдочастицами, содержащими белок VSV-g. Проникновение псевдотипа анализировали путем определения активности люциферазы в клеточных лизатах. Показаны результаты одного эксперимента, проведенного с четырьмя образцами. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение (станд. откл.).
На Фиг. 10 показана кривая Каплана-Мейера для времени до прекращения получения кислородной поддержки в течение по меньшей мере 24 часов (чувствительность mITT) после статистического анализа рандомизированного, двойного слепого, плацебо-контролируемого исследования фазы 2а опаганиба при пневмонии, вызванной COVID-19, описанного в Примере 7.
На Фиг. 11 показана кривая Каплана-Мейера для зависимости кумулятивной заболеваемости от времени до 50% снижения от начала получения кислородной поддержки на основе потока кислорода в л/мин (чувствительность mITT) после статистического анализа рандомизированного, двойного слепого, плацебо-контролируемого исследования фазы 2а опаганиба при пневмонии, вызванной COVID-19, описанной в Примере 7.
На Фиг. 12 показан точечный график общей потребности в кислородной поддержке (площадь под кривой) для процентного изменения по сравнению с исходным уровнем с использованием измерений суточного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день) после статистического анализа рандомизированного, двойного слепого плацебо-контролируемого исследования фазы 2а опаганиба при пневмонии COVID-19, описанного в Примере 7.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Используемый в данном документе термин «агент» относится к лекарственной субстанции, имеющей фармакологическую активность - эффект агента на индивида. Термины «агент», «активный ингредиент», «лекарственная субстанция» и «соединение» используются в данном документе взаимозаменяемо.
В данном документе термин ABC294640 относится к [(пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоте] в форме свободного основания или соли, либо в виде стереоизомерной или нестереоизомерной форме. В случае соединений, солей, пролекарств или сольватов, которые представляют собой твердые вещества, специалистам в данной области техники понятно, что соединения, соли и сольваты по изобретению могут существовать в различных кристаллических формах, все из которых входят в объем настоящего изобретения. Опаганиб, также известный как гидрохлорид ABC294640, представляет собой особую форму соли ABC294640.
Используемый в данном термин WX-671 относится к (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазиду) в виде (L)- или (D)-энантиомеров, а также в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей. В случае соединений, солей, пролекарств или сольватов, которые представляют собой твердые вещества, специалистам в данной области техники понятно, что соединения, соли и сольваты по изобретению могут существовать в различных кристаллических формах, все из которых входят в объем настоящего изобретения. WX-671.1 (упамостат) представляет собой специфическую форму кристаллической соли WX-671.
Используемый в данном документе термин «коронавирус» включает встречающийся в природе (например, дикий тип) коронавирус; встречающиеся в природе варианты коронавируса; и варианты коронавируса, созданные в лаборатории, включая варианты, полученные путем селекции, варианты, полученные путем химической модификации, и генетически модифицированные варианты (например, коронавирус, модифицированный в лаборатории методами рекомбинантной ДНК). В одном варианте осуществления субъект может быть протестирован на вирусную инфекцию в течение нескольких дней после появления симптомов или после лечения в соответствии с настоящим изобретением путем сбора носового секрета (мазки из носа или носоглотки (НГ)), мазка из зева (ротоглотки), образцы крови или других жидкостей организма и тестирование образца на обнаружение вирусных антигенов или РНК в крови и других жидкостях организма с использованием, например, иммуноферментного анализа с захватом антигена (ELISA), с использованием ELISA IgM (для определения у субъекта есть антитела IgM), с использованием ELISA IgG (чтобы определить, есть ли у субъекта антитела IgG), с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или путем выделения вируса. В одном варианте осуществления коронавирус выбран из группы, состоящей из ближневосточного респираторного синдрома (MERS), тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и SARS-CoV-2.
В контексте данного документа подразумевается, что термины «содержит (-ат)», «включает (-ют)», «имеющий», «имеет», «может» и их варианты являются открытыми переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможности наличия дополнительных действий или структур. Формы единственного числа включают отсылки к множественному числу, если иное четко не следует из контекста. В настоящем изобретении также предусмотрены другие варианты осуществления, «содержащие», «состоящие из» и «состоящие преимущественно из» представленных в данном документе вариантов осуществления или элементов, приведенных явным образом или нет.
Термины «совместное введение», «вводимое в сочетании» или «в комбинации» используются для описания введения соединения по настоящему изобретению в комбинации по меньшей мере с одним другим противовирусным активным агентом. Время совместного введения лучше всего определяет врач-специалист, лечащий пациента. Иногда желательно, чтобы агенты вводились одновременно. Альтернативно, лекарственные средства, выбранные для комбинированной терапии, можно вводить пациенту в разное время. Конечно, когда имеется более одной вирусной или другой инфекции или другого патологического состояния, соединения по настоящему изобретению можно комбинировать с другими агентами для лечения этой другой инфекции или патологического состояния по мере необходимости.
Что касается настоящего изобретения, термин «лечение», «процесс лечения» и т.п. определяется как предшествующее профилактическому введению соединений в способах, описанных в данном документе, до вирусной инфекции или ингибирование вирусной активности после того, как произошло инфицирование. В одном варианте осуществления термин «лечение» означает введение одного или более соединений по настоящему изобретению для заметного ингибирования репликации вируса in vitro или in vivo, для заметного снижения вирусной нагрузки в клетке in vitro или in vivo, или для уменьшения по меньшей мере одного симптома, связанного с наличием у пациента CoV-опосредованного заболевания. Желательно ингибирование репликации или снижение вирусной нагрузки по меньшей мере на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, как определено с помощью подходящего анализа. Анализы, которые отслеживают репликацию вирусов, включают, но не ограничиваются ими, анализы цитопатических вирусов, анализы репортерных вирусов и репортерных клеток, анализы вирусных репликонов и анализы вирусов, нацеленных на гены. Тестирование вирусной нагрузки можно проводить с использованием тестов на основе амплификации нуклеиновых кислот (NAT или NAAT) и тестов на основе ненуклеиновых кислот на образцах плазмы крови для определения количества вируса в заданном объеме, включая уровни вирусной РНК в плазме и тканях и общей ДНК вируса. В качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления лечение отмечается квалифицированным врачом как заметное или существенное облегчение симптомов у пациента с CoV-опосредованным заболеванием. Как правило, снижение репликации вируса достигается за счет снижения скорости полимеризации РНК, трансляции РНК, процессинга или модификации белка или за счет снижения активности молекулы, участвующей в любой стадии репликации вируса (например, белков или кодируемых геномом вируса или хозяина, важных для вирусной репликации). В варианте осуществления термин «лечить» относится к способности соединения или соединений по настоящему изобретению ингибировать или подавлять репликацию вируса, такого как РНК-содержащий вирус. В варианте осуществления термин «лечить» относится к способности соединения или соединений по настоящему изобретению ингибировать цитопатический эффект во время РНК-вирусной инфекции.
В некоторых вариантах осуществления «эффективное количество» или «иммуностимулирующее количество» соединения по изобретению представляет собой количество, которое при введении субъекту является достаточным для того, чтобы вызвать обнаруживаемый иммунный ответ. В других вариантах осуществления «защитно-эффективное количество» иммуногенной композиции представляет собой количество, которое при введении субъекту достаточно для обеспечения защитного иммунитета у субъекта. В других вариантах осуществления «количество с терапевтическим эффектом» соединения представляет собой количество, которое при введении субъекту достаточно для лечения вирусной инфекции, например, для увеличения клиренса вируса.
Агенты и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, такое как человек, или отличное от человека млекопитающее. При введении животному, такому как человек, агент предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, по меньшей мере один агент по изобретению с субстанцией или набором субстанций, которые можно комбинировать с по меньшей мере одним агентом. Используемый в данном термин «фармацевтически приемлемые материалы-носители» означает субстанцию или совокупность субстанций, которые можно комбинировать с агентом, подходящим для применения при контакте с тканями млекопитающих в целях терапевтического лечения млекопитающих в предполагаемых условиях воздействия. Фармацевтически приемлемые материалы-носители хорошо известны в данной области техники и включают, например, инертный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал. Фармацевтически приемлемые материалы-носители должны, конечно, иметь достаточно высокую чистоту и достаточно низкую токсичность, чтобы сделать их пригодными для введения человеку или низшему животному, подвергаемому лечению. Фармацевтическая композиция может быть в стандартной дозированной форме, такой как таблетка, капсула (включая вскрываемую капсулу и желатиновую капсулу), гранула, порошок, сироп, суппозиторий, инъекция или тому подобное.
Термин «иммунный ответ» означает ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка, макрофаг или полиморфонуклеоцит, на стимул, такой как антиген. Иммунный ответ может включать любую клетку организма, участвующую в защитном ответе хозяина, включая, например, эпителиальную клетку, секретирующую интерферон или цитокин. Иммунный ответ включает, но не ограничивается ими, врожденный иммунный ответ или воспаление. В данном контексте защитный иммунный ответ относится к иммунному ответу, который защищает субъекта от инфекции (предотвращает заражение или предотвращает развитие заболевания, связанного с инфекцией).
Под «более эффективным» понимается, что лечение демонстрирует более высокую эффективность или меньшую токсичность, большее удобство или меньшую стоимость по сравнению с другим лечением, с которым его сравнивают. Эффективность может измерить опытный практик, используя любой стандартный способ, подходящий для данного показания.
Используемый в данном документе термин «подходящий период времени» относится к периоду времени, начиная с момента, когда пациент начинает лечение для диагностики коронавирусной инфекции с использованием способа по настоящему изобретению, на протяжении всего лечения и до момента, когда пациент прекращает лечение либо в связи с уменьшением симптомов, связанных с коронавирусной инфекцией, либо в связи с лабораторным диагнозом, указывающим на то, что вирусная инфекция находится под контролем. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 1 (одну) неделю. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 1 (одной) недели до 2 (двух) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 2 (две) недели. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 2 (двух) недель до 3 (трех) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 3 (три) недели. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 3 (трех) недель до 4 (четырех) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 4 (четыре) недели. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 4 (четырех) недель до 5 (пяти) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 5 (пять) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 5 (пяти) недель до 6 (шести) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 6 (шесть) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 6 (шести) недель до 7 (семи) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 7 (семь) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет от 7 (семи) недель до 8 (восьми) недель. В одном варианте осуществления подходящий период времени составляет 8 (восемь) недель.
Используемый в данном документе термин «цитопатические эффекты» относится к изменениям в морфологии клеток вследствие вирусной инфекции.
Используемые в данном документе термины «цитопатогенез» или «патогенез» включают ингибирование экспрессии генов клетки-хозяина и включают другие клеточные изменения, которые способствуют вирусному патогенезу, в дополнение к тем изменениям, которые видны на микроскопическом уровне.
В данном документе термин «ингибитор» относится к молекуле, которая влияет на активность ферментов. Ингибиторы настоящего изобретения, являются обратимыми, что означает, что они образуют слабые взаимодействия со своим ферментом-мишенью и легко удаляются. Обратимый ингибитор вступает в кратковременное взаимодействие с ферментом. Сила связывания между ферментом и обратимым ингибитором определяется константой диссоциации (Kd). Чем меньше значение Kd, тем сильнее взаимодействие между ферментом и ингибитором и тем больше ингибирующий эффект. При упоминании Kd для ингибирования фермента ее называют Ki.
Используемый в данном документе термин «in vitro» относится к процедурам, выполняемым в искусственной среде, такой как, например, без ограничений, в пробирке или системе клеточных культур. Специалисту в данной области техники будет понятно, что, например, фермент изолята SK можно приводить в контакт с модулятором в среде in vitro. В альтернативном варианте осуществления изолированную клетку можно приводить в контакт с модулятором в среде in vitro.
Используемый в данном документе термин «in vivo» относится к процедурам, выполняемым внутри живого организма, такого как, без ограничений, человек, обезьяна, мышь, крыса, кролик, корова, лошадь, свинья, собака, кошка или примат.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение в целом относится к областям вирусологии, инфекционных заболеваний, и медицины. В настоящем изобретении представлены соединения, композиции, способы и наборы для лечения заболеваний, опосредованных CoV, например, вызванных SARS-CoV-2, SARS или MERS. В частности, изобретение относится к эффективным ингибиторам коронавирусов, которые могут лечить коронавирусы, включая новый коронавирус 2019. Данное изобретение обеспечивает новое применение соединений в качестве эффективных ингибиторов коронавирусов, в том числе нового коронавируса 2019, и их применение в приготовлении препаратов для лечения коронавирусной инфекции у людей.
ABC294640, [(пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты], представляет собой пероральный ингибитор сфингозинкиназы 2 («SphK2» или «SK2»). ABC294640 представлен следующей структурной формулой:
,
и может быть получен в виде свободного основания, в виде его солей и кристаллических модификаций. В патентах США № 7338961, 8063248, 8324237 и 8557800, которые включены в данный документ посредством ссылки, описаны эти соединения, применение и способы их получения.
ABC294640 в виде гидрохлорида получил международное непатентованное название (INN) опаганиб и представлен следующей структурной формулой:
Молекулярная формула опаганиба C23H25ClN2O·HCl с молекулярной массой 417,4 г/моль. Опаганиб представляет собой негигроскопичное твердое вещество от белого до почти белого цвета, практически нерастворимое в воде и этилацетате. В одном варианте осуществления лекарственный препарата готовят путем заполнения опаганибом твердых желатиновых капсул размера 1, которые дополнительно содержат по меньшей мере один из следующих эксципиентов: микрокристаллическую целлюлозу; коллоидный диоксид кремния; стеарат магния Vegetal; диоксид титана. В одном варианте осуществления капсулы опаганиба содержат 250 мг ABC294640 в виде гидрохлорида или 228,16 мг свободного основания ABC294640. В одном варианте осуществления капсулы опаганиба содержат 375 мг ABC294640 в виде гидрохлорида или 342,24 мг свободного основания ABC294640.
В одном варианте осуществления капсулы опаганиба по 250 мг содержат агент ABC294640 в виде гидрохлорида вместе с эксципиентами, инкапсулированными в желатин, белый непрозрачный корпус и колпачок, капсулы Coni-Snap, размер 1. В одном варианте осуществления капсулы опаганиба по 375 мг содержат агент ABC294640 в виде гидрохлорида вместе с эксципиентами, инкапсулированными в желатин, белый непрозрачный корпус и колпачок, капсулы Coni-Snap, размер 1.
Опаганиб для лечения коронавирусной инфекции, как правило, вводят в количестве от около 250 мг до около 1500 мг в день. В одном варианте осуществления 250 мг опаганиба вводят в виде двух капсул два раза в день до общей суточной дозы 1000 мг. В одном варианте осуществления 250 мг опаганиба вводят в виде двух капсул по 500 мг каждые 12 часов. В одном варианте осуществления пациенту с подтвержденной коронавирусной инфекцией даются инструкции принимать разовую дозу опаганиба 500 мг (в виде двух капсул по 250 мг) каждые 12 часов (то есть 1000 мг опаганиба в день), в общей сложности до 2 недель подряд или до 14 дней подряд.
Изобретатели открыли новое применение опаганиба после долгих исследований. Опаганиб продемонстрировал противовирусную, противовоспалительную и антитромботическую активность, воздействуя как на причину, так и на последствия COVID-19. Опаганиб нацелен на сфингозинкиназу-2, компонент клетки человека, участвующий в репликации вируса, а не на сам вирус. Растущее число случаев появления новых мутаций SARS-CoV-2, появляющихся во всем мире, подчеркивает важность этого уникального механизма, который потенциально сводит к минимуму риск резистентности вируса к терапии.
В данном документе представлены упакованные фармацевтические продукты, также известные как фармацевтические наборы, которые включают контейнер, множество лекарственных форм опаганиба, подходящих для перорального введения, в контейнере и легенду (например, этикетку или вкладыш), связанную с контейнером и указывающую на применение опаганиба для лечения коронавирусной инфекции. В варианте осуществления легенда включает инструкции по выполнению описанных выше способов и/или по применению набора. Инструкции, включенные в набор, могут быть прикреплены в виде этикетки к упаковочному материалу или могут быть включены в виде листка-вкладыша. Хотя инструкции, как правило, представляют собой письменные или печатные материалы, они не ограничиваются ими. Любой носитель информации, способный хранить инструкции и передавать их конечному пользователю, предусмотрен данным изобретением. Такие носители информации включают, но не ограничиваются ими, электронные носители данных (например, магнитные диски, ленты, картриджи), оптические носители (например, CD-ROM) и тому подобное. Используемый в данном документе термин «инструкции» может включать адрес интернет-сайта, который предоставляет инструкции.
WX-671, (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид), является перорально активным пролекарством мощного ингибитора сериновой протеазы WX-UK1 (N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидинофенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид). WX-671 представлен следующей структурной формулой:
и могут быть получены в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей.
WX-671 представляет собой пролекарство. Используемый в данном документе термин «пролекарство» относится к фармацевтической композиции, которая включает биологически неактивное соединение, которое метаболизируется in vivo с образованием активной формы лекарственного средства. WX-671 представляет собой соединение, которое in vivo превращается в WX-UK1. WX-UK1 можно вводить только внутривенно. WX-UK1 используется во многих описанных в данном документе экспериментальных примерах in vitro. Хотя в настоящем документе описано пероральное соединение WX-671 в качестве лекарственного препарата, следует понимать, что лекарственный препарат может быть получен путем внутривенной инфузии соединения WX-UK1, которое находится в пределах объема и сущности настоящего изобретения. В патентах США №6861435, 7247724, 7659396 и 9089532, которые включены посредством ссылки, описано WX-UK1 и способы его получения.
WX-671.1, гидросульфат N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида, также называемый этил-4-{3-[(E)-амино(гидроксиимино)метил]-N-[(2,4,6-триизопропилфенил)сульфонил]-L-фенилаланил}пиперазин-1-карбоксилат гидросульфат имеет молекулярную формулу C32H47N5O6S x H2SO4 и молекулярную массу 727,91 г/моль (свободное основание: 629,83 г/моль). В патентах США №№6624169, 7211670, 7247724, 7342018, 7608623, 7659396, 7713980, 7745441, 7807681, 7884206, 7951943, 8492385, 8692761 и RE46424, которые включены в данный документ посредством ссылки, описаны эти соединения, применение и способы их получения. Субстанции WX-671.1 присвоено международное непатентованное наименование (МНН) упамостат.
Структурная формула WX-671.1 (упамостат) выглядит следующим образом:
Упамостат представляет собой негигроскопичный порошок от белого до желтоватого цвета, свободно растворимый в диметилсульфоксиде и растворимый в этаноле. Лекарственная субстанция слабо растворима в воде или 0,1 М HCl. Твердые препараты для перорального введения могут быть приготовлены в виде таблеток, пилюль, порошка, гранул, капсул и т.д. Эти твердые препараты изготавливают путем добавления по меньшей мере одного эксципиента, такого как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза или желатин, к одному или более соединениям по настоящему изобретению. Кроме того, в дополнение к типичным эксципиентам можно использовать смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк.
В одном варианте осуществления лекарственный препарата готовят путем заполнения упамостатом твердых желатиновых капсул, которые дополнительно содержат по меньшей мере один из следующих эксципиентов: микрокристаллическую целлюлозу; гипромеллозу; этиловый спирт безводный; очищенную воду и стеарат магния Vegetal. В одном варианте осуществления капсулы упамостата содержат 231,26 мг гидросульфата упамостата (эквивалентно 200 мг свободного основания). После перорального приема упамостат превращается в активный WX-UK1, который ингибирует несколько сериновых протеаз. Поскольку упамостат может быть предоставлен в виде пероральной формы, он может устранить недостатки, связанные с внутривенным введением других препаратов, которые могут быть полезны для лечения коронавирусной инфекции.
Упамостат для лечения коронавирусной инфекции, как правило, вводят в количестве от около 200 мг до около 1000 мг в день. В одном варианте осуществления упамостат вводят в виде одной капсулы один раз в день до общей суточной дозы около 231,26 мг (эквивалентно 200 мг свободного основания). В одном варианте осуществления упамостат вводят в виде двух капсул один раз в день до общей суточной дозы около 462,52 мг (эквивалентно 400 мг свободного основания). В одном варианте осуществления пациент с подтвержденной коронавирусной инфекцией получает инструкции по приему одной капсулы упамостата каждый день (эквивалентно 200 мг свободного основания упамостата) в общей сложности в течение 2 недель подряд или 14 дней подряд. В одном варианте осуществления пациент с подтвержденной коронавирусной инфекцией получает инструкции по приему двух капсул упамостата каждый день, что эквивалентно 400 мг свободного основания упамостата, в общей сложности в течение 2 недель подряд или 14 дней подряд.
Изобретатели открыли новое применение упамостата после долгих исследований. Не ограничиваясь какой-либо теорией, считается, что ингибитор сериновой протеазы WX-UK1, активный препарат упамостата после его распада внутри организма, активен по меньшей мере против одной из сериновых протеаз, которые, по-видимому, ответственны за праймировании вирусного шиповидного (S) белка. Таким образом, применение ингибиторов протеазы, таких как WX-UK1 (или его пролекарство WX-671), может быть эффективным для снижения активации и распространения CoV, что приводит к эффективному профилактическому и терапевтическому лечению. Следовательно, WX-UK1 способен блокировать проникновение SARS-2-S в клетки и, таким образом, ингибировать репликацию коронавируса. В варианте осуществления, поскольку для инфекции необходима протеолитическая активация, которая облегчает взаимодействие вируса с рецепторами клетки-хозяина, тем самым повышая инфекционность и распространение, упамостат по настоящему изобретению при введении в терапевтически эффективных количествах и в течение подходящего периода времени будет защищать от коронавирусной инфекции.
В данном документе представлены упакованные фармацевтические продукты, также известные как фармацевтические наборы, которые включают контейнер, множество лекарственных форм упамостата, подходящих для перорального введения, в контейнере и легенду (например, этикетку или вкладыш), связанную с контейнером и указывающую на применение упамостата для лечения коронавирусной инфекции. В варианте осуществления легенда включает инструкции по выполнению описанных выше способов и/или по применению набора. Инструкции, включенные в набор, могут быть прикреплены в виде этикетки к упаковочному материалу или могут быть включены в виде листка-вкладыша. Хотя инструкции, как правило, представляют собой письменные или печатные материалы, они не ограничиваются ими. Любой носитель информации, способный хранить инструкции и передавать их конечному пользователю, предусмотрен данным изобретением. Такие носители информации включают, но не ограничиваются ими, электронные носители данных (например, магнитные диски, ленты, картриджи), оптические носители (например, CD-ROM) и тому подобное. Используемый в данном документе термин «инструкции» может включать адрес интернет-сайта, который предоставляет инструкции.
Комбинированная и альтернативная терапия
Соединения, описанные в данном документе, можно вводить в дополнение к текущему стандартному лечению пациентов с COVID или в комбинации или чередовать с любым другим соединением или терапией, которые поставщик медицинских услуг сочтет полезными для пациента. Комбинированная и/или альтернативная терапия может быть терапевтической, дополнительной или паллиативной. Когда способы включают введение пациенту более одного активного агента, агенты можно вводить в течение 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 дня; в пределах 24, 12, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 часа, в пределах 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 1 минуты; или по существу одновременно. Способы изобретения могут включать в себя введение одного или более агентов пациенту пероральным, системным, парентеральным, местным, внутривенным, ингаляционным или внутримышечным способом.
Было замечено, что пациенты с COVID могут проходить через различные стадии заболевания, и что стандартное лечение могут отличаться в зависимости от того, на какой стадии заболевания находится пациент. COVID примечателен развитием «перекрестных помех» между иммунной системой и системой свертывания крови. По мере прогрессирования заболевания у пациента может развиться чрезмерный ответ иммунной системы, что может привести к ряду серьезных последствий, включая цитокиновый шторм. Благодаря взаимодействию между иммунной системой и системой свертывания у пациента может начаться свертывание крови в различных частях тела, включая дыхательную систему, мозг, сердце и другие органы. У пациентов с COVID наблюдались множественные тромбы по всему телу, требующие антикоагулянтной терапии. Считается, что эти тромбы могут вызывать долгосрочные или даже необратимые повреждения, если их не лечить и не облегчать течение болезни.
В частности, COVID-19 был описан как прогрессирующий через три основные стадии болезни: стадия 1 (ранняя инфекция), стадия 2 (легочная фаза) и стадия 3 (фаза гипервоспаления/цитокинового шторма).
Стадия 1 характеризуется неспецифическими и часто слабовыраженными симптомами. Происходит репликация вируса, и целесообразно немедленно начать лечение описанными в данном документе соединениями и, возможно, в комбинации или чередовать с другой противовирусной терапией. Интерферон-бета можно также вводить для усиления врожденного иммунного ответа на вирус. Таким образом, в одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению используют в эффективном количестве в комбинации или чередуя с интерфероном-бета и/или дополнительным противовирусным лекарственным средством. Добавки цинка и/или витамин С также иногда назначают на этой стадии или по мере прогрессирования болезни.
2-я стадия COVID-19 - это легочная фаза, когда у пациентов может возникнуть острая гипоксическая дыхательная недостаточность. Фактически, первичная органная недостаточность при COVID-19 - это гипоксическая дыхательная недостаточность. Было показано, что умеренная иммуносупрессия с помощью стероидов, например, дексаметазона, может быть полезной для пациентов с острой гипоксической дыхательной недостаточностью и/или пациентами на искусственная вентиляция легких. В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению используют в эффективном количестве в сочетании с кортикостероидом, который может представлять собой глюкокортикоид. Неограничивающими примерами являются будесонид (Entocort EC), бетаметазон (Celestone), преднизолон (Prednisone Intensol), преднизолон (Orapred, Prelone), триамцинолон (Aristospan Intra-Articular, Aristospan Intralesional, Kenalog), метилпреднизолон (Medrol, Depo-Medrol, Solu-Medrol), гидрокортизон или дексаметазон (Dexamethasone Intensol, DexPak 10 Day, DexPak 13 Day, DexPak 6 Day).
Ингибитор NS5B Ремдесивир дал неоднозначные результаты при назначении пациентам с COVID-19. Его можно вводить только в условиях стационара и только внутривенно, как правило, три раза в день, что делает его неподходящим для пациентов с COVID-19 легкой и средней степени тяжести. В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или в порядке чередования с ремдесивиром для усиления общего противовирусного эффекта.
Стадия 3, заключительная стадия заболевания, характеризуется прогрессирующим диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови (ДВС-синдром), состоянием, при котором небольшие тромбы образуются по всему кровотоку. Эта стадия также может включать полиорганную недостаточность (например, вазодилататорный шок, миокардит). Также было замечено, что многие пациенты реагируют на эту тяжелую стадию инфекции COVID-19 «цитокиновым штормом». По-видимому, существует двунаправленная синергетическая связь между ДВС-синдромом и цитокиновым штормом. Для борьбы с ДВС-синдромом пациентам часто вводят антикоагулянт, который может быть, например, непрямым ингибитором тромбина или пероральным антикоагулянтом прямого действия («ПОАК»). Неограничивающими примерами являются низкомолекулярный гепарин, варфарин, бивалирудин (Angiomax), ривароксабан (Ксарелто), дабигатран (Pradaxa), апиксабан (Pradaxa) или эдоксабан (Lixiana). В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или в порядке чередования с антикоагулянтной терапией. В некоторых тяжелых случаях тромбообразования у пациентов с COVID можно вводить ТРА (активатор тканевого плазминогена).
Было отмечено, что высокие уровни цитокинового интерлейкина-6 (IL-6) являются предшественниками сердечной недостаточности и смерти у пациентов с COVID-19. Для лечения этого всплеска иммунного ответа, который может представлять собой цитокиновый шторм, пациентам можно вводить моноклональные антитела, нацеленные на IL-6, фармацевтические ингибиторы или деструкторы белка, такие как биспецифическое соединение, которое связывается с IL-6, а также с белком, способствующим деградации. Примеры антител включают тоцилизумаб, сарилумаб, силтуксимаб, олокизумаб и клазакизумаб. В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или в порядке чередования с тоцилизумабом или сарилумабом. Дополнительные неограничивающие примеры иммунодепрессантов, используемых для устранения чрезмерно реагирующей иммунной системы, включают ингибиторы Янус-киназы (тофацитиниб (Xeljanz)); ингибиторы кальциневрина (циклоспорин (Neoral, Sandimmune, SangCya)), такролимус (Astagraf XL, Envarsus XR, Prograf)); ингибиторы mTOR (сиролимус (Rapamune), эверолимус (Afinitor, Zortress)); и ингибиторы IMDH (азатиоприн (Azasan, Imuran), лефлуномид (Arava), микофенолат (CellCept, Myfortic)). Дополнительные антитела и биологические препараты включают абатацепт (Orencia), адалимумаб (Humira), анакинра (Kineret), цертолизумаб (Cimzia), этанерцепт (Enbrel), голимумаб (Simponi), инфликсимаб (Remicade), иксекизумаб (Taltz), натализумаб (Tysabri), ритуксимаб (Rituxan), секукинумаб (Cosentyx), тоцилизумаб (Actemra), устекинумаб (Stelara), ведолизумаб (Entyvio), базиликсимаб (Simulect) и даклизумаб (Zinbryta)).
IL-1 блокирует продукцию IL-6 и других провоспалительных цитокинов. Пациентов с COVID также иногда лечат с помощью анти-IL-1 терапии для уменьшения гипервоспалительного ответа, например, путем внутривенного введения анакинры. Анти-IL-1 терапия, как правило, может представлять собой, например, направленное моноклональное антитело, фармацевтический ингибитор или деструктор белка, такой как биспецифическое соединение, которое связывается с IL-1, а также с белком, который опосредует расщепление.
У пациентов с COVID часто развивается вирусная пневмония, которая может привести к бактериальной пневмонии. Пациенты с тяжелой формой COVID-19 также могут страдать от сепсиса или «септического шока». Лечение бактериальной пневмонии, вторичной по отношению к COVID или сепсису, включает введение антибиотиков, например макролидного антибиотика, включая азитромицин, кларитромицин, эритромицин или рокситромицин. Дополнительные антибиотики включают амоксициллин, доксициклин, цефалексин, ципрофлоксацин, клиндамицин, метронидазол, сульфаметоксазол, триметоприм, амоксициллин, клавуланат или левофлоксацин. В одном варианте осуществления, таким образом, соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или в порядке чередования с антибиотиком, например, азитромицином. Некоторые из этих антибиотиков, такие как азитромицин, обладают независимыми противовоспалительными свойствами. Такие препараты могут применяться как в качестве противовоспалительных средств для больных COVID, так и оказывать лечебное действие при вторичных бактериальных инфекциях.
Уникальной проблемой при лечении пациентов, инфицированных COVID-19, является относительно длительная потребность в седации, если пациентам требуется искусственная вентиляция легких, которая может длиться до 5, 10 или даже 14 дней или более. При продолжающейся боли во время этого лечения можно последовательно добавлять анальгетики, а при продолжающемся беспокойстве можно последовательно добавлять седативные средства. Неограничивающие примеры анальгетиков включают ацетаминофен, кетамин и опиоиды PRN (гидроморфон, фентанил и морфин). Неограничивающие примеры седативных средств включают мелатонин, атипичные нейролептики с преобладающими седативными свойствами (оланзапин, кветиапин), пропофол или дексмедетомидин, галоперидол и фенобарбитал. В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или в порядке чередования с болеутоляющим средством, таким как ацетаминофен, кетамин, гидроморфон, фентанил или морфин. В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или в порядке с седативным средством, таким как мелатонин, оланзапин, кветиапин, пропофол, дексмедетомидин, галоперидол или фенобарбитал.
Исследуемые препараты для лечения COVID-19 включают хлорохин и гидроксихлорохин. В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению вводят в комбинации или чередуя с хлорохином или гидроксихлорохином.
Также можно вводить ингибиторы протеазы, такие как лопинавир или ритонавир, ранее одобренные для лечения ВИЧ.
В одном варианте осуществления опаганиб вводят в комбинации с упамостатом для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2. В одном варианте осуществления опаганиб вводят в комбинации с упамостатом для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусной инфекции. В одном варианте осуществления опаганиб вводят в комбинации с упамостатом для производства лекарственного препарата для лечения коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Дополнительные лекарственные средства, которые могут быть использованы для лечения пациентов с COVID, включают, помимо прочего, фавипиравир, финголимод (Gilenya), метилпреднизолон, бевацизумаб (Avastin), актемру (тоцилизумаб), умифеновир, лозартан и комбинацию моноклональных антител REGN3048 и REGN3051 или рибавирин. Любое из этих лекарственных средств или вакцин можно использовать в комбинации или чередовать с активным соединением, предложенным в данном документе, для лечения восприимчивой к нему вирусной инфекции.
В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению используют в эффективном количестве в комбинации с противокоронавирусной вакциной, включая, помимо прочего, мРНК-1273 (Moderna, Inc.), AZD-1222 (AstraZeneca и Оксфордский университет), BNT162 (Pfizer и BioNTech), CoronaVac (Sinovac), NVX-CoV 2372 (NovoVax), SCB-2019 (Sanofi и GSK), ZyCoV-D (Zydus Cadila) и CoVaxin (Bharat Biotech). В другом варианте осуществления соединение по настоящему изобретению применяют в эффективном количестве в сочетании с пассивной терапией антителами или терапией реконвалесцентной плазмой.
В одном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению используется в эффективном количестве в сочетании с антагонистами рецептора 5-HT, которые могут облегчить определенные симптомы, которые могут присутствовать у пациента, инфицированного коронавирусом, такие как диарея.
SARS-CoV-2 постоянно мутирует, что увеличивает вирулентность и скорость передачи. Устойчивые к лекарственным средствам варианты вирусов могут появиться после длительного лечения противовирусным средством. Устойчивость к лекарственным средствам может возникнуть в результате мутации гена, кодирующего фермент, используемый для репликации вируса. Эффективность препарата против РНК-вирусной инфекции в определенных случаях может быть продлена, усилена или восстановлена введением соединения в комбинации или чередованием с другим, а возможно, даже с двумя или тремя другими противовирусными соединениями, вызывающими другую мутацию или действующими через путь, отличный от пути действия основного лекарственного средства.
Настоящее изобретение имеет множество аспектов, проиллюстрированных следующими неограничивающими примерами. Следующие ниже примеры предоставлены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Оценка противовирусной активности ABC294640 против SARS-CoV-2 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека
Мы разработали оценку in vitro в органотипической культуре воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) первичных клеток бронхиального эпителия человека (HBEC; EpiAirway™, MatTek), чтобы оценить, может ли опаганиб напрямую ингибировать инфекцию и распространение SARS-CoV-2. Эта модельная система культуры клеток человека была выбрана потому, что она содержит псевдомногослойный эпителиальный слой, который морфологически и функционально напоминает слой дыхательных путей человека, состоящий из реснитчатых и бокаловидных (продуцирующих слизь) клеток, подвергающихся воздействию воздуха из апикального слоя. Эти клетки действуют как первая линия защиты от вторжения вирусов и служат сайтами репликации. Имеющиеся данные также свидетельствуют о том, что клетки бронхиального эпителия человека экспрессируют факторы хозяина, на которые направлен опаганиб (сфингозинкиназа-2).
Исследуемое соединение:
Опаганиб -исследуемое соединение
Описание: Опаганиб [(пиридин-4-илметил)амид 3-(4-хлорфенил)адамантан-1-карбоновой кислоты, гидрохлорид] представляет собой пероральный ингибитор фермента сфингозинкиназы-2 (SK2). Растворитель: ДМСО
Ремдесивир (GS-5734) - положительный противовирусный контроль
Описание: Ремдесивир является противовирусным пролекарством, аналогом нуклеотидов. Он проявляет противовирусную активность против нескольких вариантов EBOV со значением EC50 в диапазоне 0,06-0,14 мкМ в клеточных анализах и противовирусной активностью широкого спектра действия in vitro против других патогенных РНК-вирусов, включая SARS-CoV. Растворитель: ДМСО 100 мг/мл (166,0 мМ)
Блеомицин (сульфат) - положительный цитотоксический контроль
Описание: Блеомицин является химиотерапевтическим агентом, как правило, используемым для лечения лимфомы Ходжкина и эмбриональной карциномы. Широкий спектр блеомицин-индуцированной легочной токсичности хорошо описан как осложнение такой терапии, наиболее распространенным вариантом которого является блеомицин-индуцированный пневмонит (BIP) (Sleijfer et al., 2001). Блеомицин (BLM) выбран как наиболее изученный индуктор микроядер (МЯ) в лимфоцитах человека с различными механизмами генотоксичности. Растворитель: ДМСО 16,67 мг/мл (11,2 мМ)
Способы:
Культивирование клеток-дифференцированные клетки бронхиального эпителия человека (HBEC)
Нормальные клетки бронхиального эпителия человека (HBEC) были дифференцированы компанией MatTek Corporation (Ashland, MA) и поставлялись в наборах с 12- или 24-луночными вставками каждый. Клетки HBEC выращивали на дисках с ячейками 6 мм2 во вставках Transwell. За три дня до отправки ткани переносили в среду без гидрокортизона. При транспортировке ткани стабилизировали на листе агарозы, который удаляли при получении. По оценкам, одна вставка содержит примерно 1,2×106 клеток. Наборы клеточных вставок (EpiAirway™ AIR-100) были получены от одного донора №9831, 23-летнего здорового некурящего мужчины европеоидной расы. Клетки обладают уникальными свойствами в формировании слоев, апикальная сторона которых открыта только воздуху, что создает муциновый слой. По прибытии клеточные вставки Transwell были немедленно перенесены в отдельные лунки 6-луночного планшета в соответствии с инструкциями производителя, и 1 мл запатентованной культуральной среды MatTek (AIR-100-MM) был добавлен на базолатеральную сторону, тогда как апикальная сторона находилась во влажной среде с 5% CO2. Клетки культивировали при 37°С в течение суток до начала эксперимента. После 16-18-часового периода уравновешивания слой муцина, секретируемый с апикальной стороны клеток, удаляли путем промывания 400 мкл предварительно подогретого буфера TEER. Культуральную среду пополняли после этапа промывки. Изображение культуральных вставок и ткани EpiAirway представлено на Фиг. 1.
Обработка исследуемыми соединениями:
Исследуемые соединения серийно разбавляли исходным раствором (содержащим ДМСО) в среде для анализа (AIR-ASY-100, MatTek) и помещали при комнатной температуре. Разведения исследуемых соединений приведены ниже (конечный ДМСО <0,5%). Культуры HBEC промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали при 37°C с ремдесивиром (2 мкМ), сульфатом блеомицина (75,6 и 151 мкг/мл) и опаганибом (6 концентраций в диапазоне от 0,05 до 11,25 мкг/мл), разведенных в среде для анализа (AIR-100-ASY, MatTek) за 1 ч до заражения. Для контрольных лунок используйте среду для анализа с ДМСО (конечный ДМСО <0,5%; контроль) и только контроль вируса (только среда для анализа) добавляли за 1 час до инфицирования. Соединения добавляли к каждой вставке на апикальный слой (0,15 мл) и базальный слой (0,85 мл) в трех повторностях.
Вирусная инфекция и обработка образцов:
После 1 ч инкубации с соединениями апикальную сторону культур промывали, а затем инфицировали клиническим изолятом SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) при MOI=0,1 БОЕ/клетка в течение 1 ч при 37°С, в присутствии соединения или контрольной среды для анализа. Через 1 час вирусной инкубации вирус удаляли с апикальной стороны и культуры однократно промывали PBS для удаления любого несвязавшегося вируса. Затем культуры инкубировали при 37°С в течение 72 ч со свежим соединением. Через 24 ч и 48 ч после инфицирования среду из базолатерального слоя заменяли 1 мл свежей среды, содержащей соответствующие соединения.
Через 72 часа после заражения ткани и среду собирали для обработки. Апикальный слой промывали 0,4 мл буфера TEER (PBS с Mg2+ и Ca2+) и собирали для оценки титра вируса с помощью анализа TCID50 (50% инфицирующая доза для культуры ткани). Восьмикратные серийные разведения концентраций образцов супернатанта апикального слоя добавляли в 96-луночные планшеты для анализа, содержащие клетки Vero E6 (20000 на лунку). Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 и относительной влажности 95%. Через 3 дня (72±4 ч) инкубации планшеты окрашивали кристаллическим фиолетовым для измерения цитопатического эффекта (CPE). Титры вируса рассчитывали по методу Рида и Мюнча (Reed et al., 1938). Значения TCID50 определяли из трех образцов.
Для оценки состояния клеток HBEC после воздействия опаганиба, контрольных соединений и вирусной инфекции был проведен анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Среду из базолатерального слоя вставок для тканевых культур удаляли через 72 часа после инфицирования и разводили в буфере для хранения ЛДГ в соответствии с инструкциями производителя (Promega). Образцы дополнительно разбавляли буфером ЛДГ и инкубировали с равным объемом реагента для обнаружения ЛДГ. Люминесценцию регистрировали через 60 минут инкубации при комнатной температуре. Контроль без клеток был включен в качестве отрицательного контроля для определения фона культуральной среды, а блеомицин был включен в качестве положительного цитотоксического контроля. Сообщалось о люминесценции, при этом фоновые уровни находились в пределах допустимого диапазона люминесценции (диапазон 1000-10000).
Кроме того, собирали апикальный слой тканей HBEC, добавляя Trizol LS (Invitrogen) в каждую культуральную вставку и несколько раз пипетируя вверх и вниз для лизиса и сбора клеток и хранения при -80°C для будущего анализа экспрессии РНК и белка.
Результаты:
Опаганиб обладает высокой активностью против SARS-CoV-2 в культурах HBEC
В этом исследовании нормальные клетки бронхиального эпителия человека (HBEC) предварительно обрабатывали в трех повторностях 6 различными концентрациями опаганиба (в диапазоне от 11,25 до 0,05 мкг/мл) как на апикальной, так и на базолатеральной стороне каждой культуры. После предварительной обработки HBEC подвергали воздействию SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) в течение 1 часа, апикальный слой промывали для удаления несвязавшегося вируса, а затем культуру инкубировали в течение 3 дней с соединением. Через 3 дня после инфицирования апикальный слой промывали и оценивали вирусную нагрузку с помощью анализа TCID50. Среду из базолатерального слоя собирали и оценивали на наличие лактатдегидрогеназы (ЛДГ), которая высвобождается из поврежденных клеток и служит индикатором гибели/жизнеспособности клеток.
Опаганиб продемонстрировал мощную противовирусную активность, при этом репликация вируса ингибировалась дозозависимым образом без существенного ущерба для жизнеспособности клеток. В обработанных опаганибом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3 дней инкубации наблюдалось дозозависимое снижение продукции инфекционного вируса с полным ингибированием, начиная с опаганиба 1 мкг/мл (фармакологически значимая концентрация). Эти результаты выгодно отличаются от показателей ремдесивира, положительного контроля в исследовании. Жизнеспособность клеток, оцененная в анализе высвобождения ЛДГ. Чтобы продемонстрировать противовирусную активность опаганиба против SARS-CoV-2 в системе первичной культуры эпителия человека, мы провели антивирусные анализы в культурах HBEC, которые выращиваются на границе воздух-жидкость и воспроизводят клеточную сложность и физиологию дыхательных путей человека. В обработанных опаганибом культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, после 3 дней инкубации наблюдалось дозозависимое снижение продукции инфекционного вируса с полным ингибированием, начиная с опаганиба 1 мкг/мл (фармакологически значимая концентрация) (Фиг. 2). Эти результаты выгодно отличаются от показателей ремдесивира, положительного контроля в исследовании.
Опаганиб не вызывал цитотоксичности в культурах HBEC во всем диапазоне концентраций, в котором проявляются мощные противовирусные эффекты (Фиг. 3). В совокупности эти данные демонстрируют, что опаганиб обладает мощным противовирусным действием против SARS-CoV-2 в первичных культурах легких человека без нарушения целостности клеточной мембраны, показателя жизнеспособности клеток и безопасности лекарственного средства, что еще раз демонстрирует многообещающий потенциал опаганиба для лечения пациентов с COVID-19.
В протестированном диапазоне концентраций не было достигнуто ни 50% ингибирования, ни 50% цитотоксичности. При самой низкой протестированной концентрации, 0,05 мкг/мл, было достигнуто более чем 90% ингибирование продукции инфекционного вируса. При самой высокой протестированной концентрации, 11,25 мкг/мл, клетки оставались жизнеспособными на протяжении всего эксперимента. При использовании диапазона высоких и низких концентраций из этого эксперимента для расчета индекса селективности (SI), отношения, которое измеряет окно между цитотоксичностью и противовирусной активностью путем деления значения противовирусной активности (AVA) на значение токсичности (TOX) (AVA/TOX), значение SI равно 225. Ожидается, что значение SI будет выше, если тестируется более широкий диапазон концентраций.
Пример 2: Оценка противовирусной активности упамостата и WX-UK1 против SARS-CoV-2 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека
Мы разработали оценку in vitro в органотипической культуре воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) первичных клеток бронхиального эпителия человека (HBEC; EpiAirway™, MatTek), чтобы оценить, могут ли инфекция и распространение SARS-CoV-2 напрямую ингибироваться упамостатом и WX-UK1. Эта модельная система культуры клеток человека была выбрана потому, что она содержит псевдомногослойный эпителиальный слой, который морфологически и функционально напоминает слой дыхательных путей человека, состоящий из реснитчатых и бокаловидных (продуцирующих слизь) клеток, подвергающихся воздействию воздуха из апикального слоя. Эти клетки действуют как первая линия защиты от вторжения вирусов и служат сайтами репликации. Имеющиеся данные также свидетельствуют о том, что клетки бронхиального эпителия человека экспрессируют факторы хозяина, на которые нацелен упамостат (например, TMPRSS2).
Исследуемое соединение:
Упамостат - исследуемое соединение
Описание: Упамостат- этил 4-{3-[(Е)-амино(гидроксиимино)метил]-N-[(2,4,6-триизопропилфенил)сульфонил]-L-фенилаланил}-пиперазин-1-карбоксилат гидросульфат.
Растворитель: ДМСО
WX-UK1- исследуемое соединение
Описание: WX-UK1-этил 4-[(25)-3-(3-карбамимидоилфенил)-2-[(2,4,6-триизопропилфенил)сульфониламино]пропаноил]пиперазин-1-карбоксилат.
Растворитель: ДМСО
Камостат мезилат - исследуемое соединение
Описание: Камостата мезилат (CM) метансульфонат 2-(диметиламино)-2-оксоэтилового эфира 4-[[4-[(аминоиминометил)амино]бензоил]окси]бензолуксусной кислоты; FOY 305; FOY-S 980; Мезилат фоипана. Камостат представляет собой синтетическую перорально биодоступную сериновую протеазу.
Растворитель: ДМСО
Блеомицин (сульфат) - положительный цитотоксический контроль
Описание: Блеомицин является химиотерапевтическим агентом, как правило, используемым для лечения лимфомы Ходжкина и эмбриональной карциномы. Широкий спектр блеомицин-индуцированной легочной токсичности хорошо описан как осложнение такой терапии, наиболее распространенным вариантом которого является блеомицин-индуцированный пневмонит (BIP) (Sleijfer et al., 2001). Блеомицин (BLM) выбран как наиболее изученный индуктор микроядер (МЯ) в лимфоцитах человека с различными механизмами генотоксичности.
Растворитель: ДМСО 16,67 мг/мл (11,2 мМ)
Способы:
Культивирование клеток-дифференцированные клетки бронхиального эпителия человека (HBEC)
Нормальные клетки бронхиального эпителия человека (HBEC) были дифференцированы компанией MatTek Corporation (Ashland, MA) и поставлялись в наборах с 12- или 24-луночными вставками каждый. Клетки HBEC выращивали на дисках с ячейками 6 мм2 во вставках Transwell. За три дня до отправки ткани переносили в среду без гидрокортизона. При транспортировке ткани стабилизировали на листе агарозы, который удаляли при получении. По оценкам, одна вставка содержит примерно 1,2×106 клеток. Наборы клеточных вставок (EpiAirway™ AIR-100) были получены от одного донора №9831, 23-летнего здорового некурящего мужчины европеоидной расы. Клетки обладают уникальными свойствами в формировании слоев, апикальная сторона которых открыта только воздуху, что создает муциновый слой. По прибытии клеточные вставки Transwell были немедленно перенесены в отдельные лунки 6-луночного планшета в соответствии с инструкциями производителя, и 1 мл запатентованной культуральной среды MatTek (AIR-100-MM) был добавлен на базолатеральную сторону, тогда как на апикальной стороне находился во влажной среде с 5% CO2. Клетки культивировали при 37°С в течение суток до начала эксперимента. После 16-18-часового периода уравновешивания слой муцина, секретируемый с апикальной стороны клеток, удаляли путем промывания 400 мкл предварительно подогретого буфера TEER. Культуральную среду пополняли после этапа промывки. Изображение культуральных вставок и ткани EpiAirway представлено на Фиг. 1.
Обработка исследуемыми соединениями:
Исследуемые соединения серийно разбавляли исходным раствором (содержащим ДМСО) в среде для анализа (AIR-ASY-100, MatTek) и помещали при комнатной температуре. Разведения исследуемых соединений приведены ниже (конечный ДМСО <0,5%). Культуры HBEC промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали при 37°C с сульфатом блеомицина (75,6 и 151 мкг/мл), упамостатом (6 концентраций от 0,12 до 30,00 мкг/мл), WX-UK1 (3,33, 10 и 30,00 мкг/мл) или камостатом (0,5, 5 и 25 мкг/мл), разведенными в среде для анализа (AIR-100-ASY, MatTek) за 1 ч до заражения. Для контрольных лунок используйте среду для анализа с ДМСО (конечный ДМСО <0,5%; контроль) и только контроль вируса (только среда для анализа) добавляли за 1 час до инфицирования. Соединения добавляли к каждой вставке на апикальный слой (0,15 мл) и базальный слой (0,85 мл) в трех повторностях.
Вирусная инфекция и обработка образцов:
После 1 ч инкубации с соединениями апикальную сторону культур промывали, а затем инфицировали клиническим изолятом SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) при MOI=0,1 БОЕ/клетка в течение 1 ч при 37°С, в присутствии соединения или контрольной среды для анализа. Через 1 час вирусной инкубации вирус удаляли с апикальной стороны и культуры однократно промывали PBS для удаления любого несвязавшегося вируса. Затем культуры инкубировали при 37°С в течение 72 ч со свежим соединением. Через 24 ч и 48 ч после инфицирования среду из базолатерального слоя заменяли 1 мл свежей среды, содержащей соответствующие соединения.
Через 72 часа после заражения ткани и среду собирали для обработки. Апикальный слой промывали 0,4 мл буфера TEER (PBS с Mg2+ и Ca2+) и собирали для оценки титра вируса с помощью анализа TCID50 (50% инфицирующая доза для культуры ткани). Восьмикратные серийные разведения концентраций образцов супернатанта апикального слоя добавляли в 96-луночные планшеты для анализа, содержащие клетки Vero E6 (20000 на лунку). Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 и относительной влажности 95%. Через 3 дня (72±4 ч) инкубации планшеты окрашивали кристаллическим фиолетовым для измерения цитопатического эффекта (CPE). Титры вируса рассчитывали по методу Рида и Мюнча (Reed et al., 1938). Значения TCID50 определяли из трех образцов. Для подтверждения результатов анализа TCID50 был проведена реакция нейтрализации бляшкообразования. Вкратце, 10-кратные серийные разведения концентраций образцов супернатанта апикального слоя добавляли в 24-луночные планшеты для анализа, содержащие клетки VeroE6 (100000 клеток/лунку), для реакции нейтрализации бляшкообразования. Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 и относительной влажности 95%. Через 3 дня (72±4 ч) инкубации планшеты фиксировали 5% нейтральным забуференным формалином и окрашивали кристаллическим фиолетовым для визуализации бляшек. Титр рассчитывали в БОЕ/мл по следующей формуле: Титр (БОЕ/мл) = количество подсчитанных бляшек ×10^подсчитанное разведение × 10 (чтобы получить мл, потому что мы добавили 100 мкл разведенного образца). Анализ проводили дважды, при этом второй анализ проводили на вирусе + ДМСО и 0,2 мкг/мл упамостата для оценки дополнительных разведений образца.
Для оценки состояния клеток HBEC после воздействия опаганиба, контрольных соединений и вирусной инфекции был проведен анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Среду из базолатерального слоя вставок для тканевых культур удаляли через 72 часа после инфицирования и разводили в буфере для хранения ЛДГ в соответствии с инструкциями производителя (Promega). Образцы дополнительно разбавляли буфером ЛДГ и инкубировали с равным объемом реагента для обнаружения ЛДГ. Люминесценцию регистрировали через 60 минут инкубации при комнатной температуре. Контроль без клеток был включен в качестве отрицательного контроля для определения фона культуральной среды, а блеомицин был включен в качестве положительного цитотоксического контроля. Сообщалось о люминесценции, при этом фоновые уровни находились в пределах допустимого диапазона люминесценции (диапазон 1000-10000).
Кроме того, собирали апикальный слой тканей HBEC, добавляя Trizol LS (Invitrogen) в каждую культуральную вставку и несколько раз пипетируя вверх и вниз для лизиса и сбора клеток и хранения при -80°C для будущего анализа экспрессии РНК и белка.
Результаты:
Упамостат и WX-UK1 являются сильнодействующими противовирусными ингибиторами SARS-CoV-2 в культурах эпителиальной ткани бронхов человека.
В этом исследовании нормальные клетки бронхиального эпителия человека (HBEC) были предварительно обработаны в трех повторностях 6 различными концентрациями упамостата (в диапазоне от 0,12 до 30,0 мкг/мл) и 3 различными концентрациями WX-UK1 (в диапазоне от 3,33 до 30,0 мкг/мл) как на апикальной, так и на базолатеральной стороне каждой культуры. После предварительной обработки HBEC подвергали воздействию SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) и инкубировали с соединением в течение 3 дней. Через 3 дня после инфицирования апикальный слой промывали и оценивали вирусную нагрузку с помощью анализа TCID50. Среду из базолатерального слоя собирали и оценивали на наличие лактатдегидрогеназы (ЛДГ), которая высвобождается из поврежденных клеток и служит индикатором гибели/жизнеспособности клеток. Для сравнения были включены 3 концентрации камостата (в диапазоне от 0,5 до 25,0 мкг/мл), известного ингибитора TMPRSS2.
Как упамостат, так и WX-UK1 продемонстрировали мощную противовирусную активность, при этом репликация ингибировалась дозозависимым образом без существенного ущерба для жизнеспособности клеток (за исключением самой высокой дозы каждого соединения). 3-log и 4-log снижение вирусной нагрузки наблюдалось по TCID50 при самой низкой концентрации упамостата (0,12 мкг/мл) и WX-UK1 (3,33 мкг/мл), соответственно. И упамостат, и WX-UK1 показали одинаковое снижение титра вируса через 3 дня после инфицирования. Жизнеспособность клеток, оцененная в анализе высвобождения ЛДГ, была бескомпромиссной во всех случаях, кроме максимальных концентраций для упамостата и WX-UK1.
Чтобы продемонстрировать противовирусную активность упамостата и WX-UK1 против SARS-CoV-2 в системе первичной культуры эпителия человека, мы провели антивирусные анализы в культурах HBEC, которые выращиваются на границе воздух-жидкость и воспроизводят клеточную сложность и физиологию дыхательных путей человека. В культурах HBEC, инфицированных SARS-CoV-2, обработанных упамостатом и WX-UK1, при фармакологически значимых концентрациях после 3 дней инкубации наблюдалось дозозависимое снижение продукции патогенного вируса, подтвержденное с помощью анализа TCID50 и реакции нейтрализации бляшкообразования (Фиг. 4А и Фиг. 4В). Эти результаты выгодно отличаются от камостата, известного ингибитора TMPRSS2.
Мы рассчитали значение EC50 по результатам реакции нейтрализации бляшкообразования. При самой высокой тестируемой концентрации ингибирование продукции вируса превышало 50%. Используя графическую панель, EC50 оценивали по имеющимся данным. Расчетная EC50 составила 0,02 мкг/мл. Мы использовали следующую формулу для расчета % ингибирования после преобразования значений TCID в расчетные значения БОЕ, как описано ниже:
% ингибирования = ((значение - среднее значение для клеточного контроля)/ (среднее значение для клеточного контроля - среднее значение для вирусного контроля) *100)
Затем значения % ингибирования анализировали с помощью GraphPad, следуя этим инструкциям:
- Значения X представляют собой концентрации упамостата.
- Значения Y являются ответами.
- Выбор «Кривая зависимости дозы от ответа»\
- Выбрав «Анализ», нелинейную регрессию и набор уравнений доза-ответ (стимуляция), выберите [Доза] и ответ - вариабельный угловой коэффициент. Все остальные значения по умолчанию были приняты. Полученное значение EC50 было рассчитано равным 0,02 мкг/мл.
Репликация вируса ингибировалась упамостатом, WX-UK1 и камостатом без значительного снижения жизнеспособности клеток (за исключением самой высокой исследуемой концентрации), измеренной по высвобождению ЛДГ. Для измерения ЛДГ, высвобождаемой из нежизнеспособных клеток, среду из базолатерального слоя вставок для тканевых культур удаляли через 72 часа после инфицирования и разводили в буфере для хранения ЛДГ в соответствии с инструкциями производителя (Promega). Образцы дополнительно разбавляли буфером ЛДГ и инкубировали с равным объемом реагента для обнаружения ЛДГ. Люминесценцию регистрировали через 60 минут инкубации при комнатной температуре. Контроль без клеток был включен в качестве отрицательного контроля для определения фона культуральной среды, а также в качестве положительного контроля цитотоксичности, блеомицина (151 мкг/мл). Данные нанесены на график с использованием значений люминесценции за вычетом контроля без клеток (среднее значение люминесценции 6936). Эти данные, полученные с использованием физиологически значимой модели респираторной ткани человека, демонстрируют способность упамостата сильно ингибировать репликацию вируса SARS-CoV-2 с ограниченной цитотоксичностью в культурах HBEC во всем диапазоне доз, при котором наблюдаются мощные противовирусные эффекты (Фиг. 5), что еще раз демонстрирует многообещающий потенциал упамостата для лечения пациентов с COVID-19. Цитотоксическую концентрацию для 50% клеточной культуры (CC50) рассчитывали на основе имеющихся данных для определения концентрации соединения, необходимой для снижения поглощения для обработанных клеток на 50% по сравнению с контрольными клетками. Рассчитанное значение CC50 для упамостата с использованием данных люминесценции, полученных с помощью анализа МТТ, составило 46,37 мкМ (или 29,2 мкг/мл). При этой концентрации CC50 концентрация EC50 ниже 4,6 мкМ (или 2,9 мкг/мл) приведет к значению SI (CC50/EC50) >10.
Пример 3: Оценка in vivo эффективности ABC294640 против тромбоза, индуцированного ОРДС
В этом исследовании оценивалась эффективность ABC294640 для снижения частоты неблагоприятных тромбоэмболических явлений in situ при остром респираторном дистресс-синдроме (ОРДС) с использованием модели венозного застоя у крыс. Этот анализ предназначен для измерения тромботических рисков после повреждения легких, индуцируемого ЛПС. Повреждение легких, индуцируемое ЛПС, является одной из наиболее часто используемых моделей ОРДС у грызунов, и было описано, что оно имитирует нейтрофильный воспалительный ответ, наблюдаемый у пациентов с ОРДС. Механизм индуцируемого ЛПС ОРДС основан на повреждении эндотелиальных клеток и системной воспалительной реакции.
Тест на венозный застой (Весслера) у животных широко используется уже более 40 лет в качестве лабораторного показателя гиперкоагуляции in vivo. Он оказался бесценным для оценки тромбогенности различных продуктов крови.
Исследуемое соединение вводили через желудочный зонд через 3 часа после инстилляции и через 24, 48 и 72 часа после инстилляции в дозе 250 мг/кг. Соответствующее количество ЛПС из E.coli (O55:B5) разбавляли физиологическим раствором до получения конечной концентрации 400 мкг/мл. Этот раствор вводили интратрахеально (0,5 мл/кг). Носитель состоял из PBS pH 7,4±0,1. ABC294640 взвешивали и переносили в носитель (PBS, 0,375%, pH 7,4) с получением конечного раствора с концентрацией 25 мг/мл. Перед дозированием раствор ABC294640 перемешивают в течение 10 минут при комнатной температуре. Этот раствор вводили через желудочный зонд (250 мг/кг, 10 мл/кг).
Для этого исследования использовали крыс Спрег-Доули (самцов) весом от 275 до 400 г. Руководителем исследования случайным образом распределялись животные по группам лечения. Еду и воду давали ad libitum. Наблюдение за поведением и общим состоянием здоровья проводилось до умерщвления. Массу тела регистрировали до инстилляции и через 24, 48 и 72 часа после инстилляции.
Насыщение артериальной крови кислородом (SpO2) и частоту сердечных сокращений регистрировали с помощью пульсоксиметра с датчиком с манжетой для мыши, установленного на находящейся в сознании мыши (система MouseOx Plus, Starr Life Sciences) до инстилляции и через 24, 48 и 72 часа после инстилляции. Крыс также вводили в среду камеры плетизмографа по тому же графику, что и SpO2. Функциональные респираторные параметры оценивали с помощью общего плетизмографа (VivoFlow, SCIREQ). Анализируемые функциональные респираторные параметры включали; частоту дыхания, PenH (индекс застоя в легких) и измерение времени вдоха/выдоха. Образец крови также был взят до процедуры умерщвления для полного анализа крови и оценки уровня цитокинов.
В этом исследовании ОРДС вызывали интратрахеальной инстилляцией ЛПС. На протяжении всего процесса индукции и развития ОРДС животным через пероральный зонд вводили носитель или ABC294640 (через 3 часа, 24 часа, 48 и 72 часа после инстилляции). После 72-часовых измерений в сознании крыс подвергали анестезии и создавали венозный застой в нижней полой вене (через 4 часа после введения через желудочный зонд в 72-часовую временную точку). Застой сохранялся в течение 30 минут. Затем сегмент иссекали и оценивали его содержимое. После этого животное было умерщвлено путем обескровливания.
После обескровливания была проведена трахеотомия и вскрыта грудная полость для обнажения легких. Затем трахею соединяли с канюлей перфузионной системы. В левое легкое, пережатое в холодном состоянии, вводили раствор 1X PBS, 1X ингибитора протеазы через трахею для получения жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) правых долей легких и собирали для дальнейшего анализа. Определение общего количества клеток с лейкоцитарной формулой и общего содержания белка выполняли в образцах ЖБАЛ. Аликвоту ЖБАЛ сохраняли для количественного определения уровней хемокинов/цитокинов в ЖБАЛ.
Левая доля легкого иссечена. Свежеполученную левую долю взвешивали во влажном состоянии для определения массы левого легкого и индекса левого легкого (масса левого легкого/масса тела x 100). Нижнюю часть левой доли использовали для определения отношения влаги к сухости левого легкого, индикатора отека легких. Оставшуюся часть левого легкого гомогенизировали и делили на аликвоты для количественного определения содержания белка.
Индукция повреждения легких при помощи ЛПС:
1. Перед инстилляцией LPS или солевого раствора функциональные респираторные параметры всех крыс оценивали с помощью общей плетизмографии, а SpO2 оценивали на крысах в сознании с помощью пульсоксиметра с датчиком с манжетой. Крысу сначала акклиматизировали в камере плетизмографа перед физиологической оценкой. Анализировали частоту дыхания, Penh и измерения времени вдоха/выдоха.
2. Крыс анестезировали 2,5% изофлураном USP (Abbot Laboratories, Монреаль, Канада) в кислороде. Затем крыс интубировали и вводили ЛПС или физиологический раствор путем интратрахеальной инстилляции.
3. Крысы восстанавливались после анестезии и возвращались в соответствующую клетку.
4. Через три часа после инстилляции первую дозу ABC294640 вводили через желудочный зонд (см. Таблицу 1 ниже).
5. Крыс периодически оценивали, чтобы убедиться в их благополучии (общее поведение и ежедневное измерение массы тела).
6. Животным также вводили дозу через желудочный зонд через 24, 48 и 72 часа после инстилляции.
7. Также оценивали SpO2 и проводили общую плетизмографию через 24, 48 и 72 часа после инстилляции.
8. Образец крови был взят из яремной вены перед процедурой создания венозного застоя для полного анализа крови и измерения уровня цитокинов.
9. Через четыре часа после последней дозы крыс подвергали анестезии 2,5% изофлураном USP (Abbot Laboratories, Монреаль, Канада) в кислороде. Процедуру проводили на гомеотермическом одеяле для контроля температуры тела.
10. Обнажали нижнюю полую вену крысы и накладывали два (2) свободных шва на расстоянии 1 см друг от друга. Любые коллатеральные сосуды выделенного сегмента были перевязаны.
11. Застой поддерживали in situ в течение 30 минут.
12. Сегмент с венозным застоем извлекали, вскрывали в продольном направлении, опорожняли на фильтровальную бумагу и фотографировали. Любые имеющиеся тромбы удаляли и промокали на фильтровальной бумаге. Тромбы измеряли, взвешивали и оценивали по шкале от 0 до 4 (см. Таблицу 2).
13. После венозного застоя животных умерщвляли путем обескровливания и из правого легкого собирали бронхоальвеолярный лаваж. Для этого перед выполнением трахеотомии отсекали мышцу над трахеей. Грудную полость вскрывали, чтобы обнажить легкие, и трахею соединяли с канюлей перфузионной системы. Левое легкое пережимали, в то время как 15 мл (3×5 мл) холодного раствора 1X PBS, 1X ингибитора протеазы вводили в трахею для получения жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) в правой доле легких. ЖБАЛ собирали для дальнейшего анализа. Определение общего количества клеток с лейкоцитарной формулой выполняли для образцов ЖБАЛ. Аликвоту ЖБАЛ сохраняли для количественного определения уровней хемокинов/цитокинов в ЖБАЛ.
14. Затем извлекали левое легкое и взвешивали для определения массы левого легкого и расчета индекса левого легкого. Отек легочной ткани оценивали с помощью расчета отношения сырая/сухая. Нижнюю часть левого легкого взвешивали отдельно (сырая масса) и использовали для определения отношения сырого/сухого легкого. После сушки при 60°С в течение по меньшей мере 24 часов его повторно взвешивали (сухая масса).
Каждый параметр (перечисленный ниже) был составлен для каждой группы и представлен в виде гистограмм с соответствующим статистическим анализом.
1 - Изменение массы тела
2 - Сатурация (SpO2) и частота сердечных сокращений (уд/мин)
3 - Респираторные параметры: Время вдоха/выдоха
Дыхательный и выдыхаемый объем
Частота дыхания
PenH
4 - Общее количество клеток в ЖБАЛ с лейкоцитарной формулой
5 - Уровни цитокинов/хемокинов в ЖБАЛ
6 - Масса и индекс левого легкого
7 - Соотношение сырых/сухих легких
8 - Содержание общего белка легких в гомогенате легких
ЛПС вызывает значительное увеличение массы легких, ассоциированные с воспалением и летаргическим состоянием. Это увеличение связано с сильным отеком, на что указывает существенное увеличение отношения W/D. Увеличение массы легких было больше в группе, получавшей ЛПС-носитель, по сравнению с группой, получавшей ЛПС-носитель, через 4 часа после введения через зонд или через 72 часа. ABC294640, введенный в дозе 250 мг/кг, продемонстрировал снижение тромбоза, о чем свидетельствует уменьшение длины сгустка крови, массы и общего количества тромбов.
Пример 4: Оценка TMPRSS2 и TMPRSS11(A) в качестве мишеней для ингибирования WX-UK1
Некоторые ферменты, относящиеся к разным семействам протеаз, могут быть захвачены S-белками CoV для праймирования. pH-зависимая цистеиновая протеаза катепсин L, TMPRSS2, TMPRSS11A, а также сериновая протеаза фурин могут активировать S-белки во время проникновения вируса в клетку-мишень. Мы провели анализ, включая моделирование/прогнозирование структуры, структурный анализ и обзор соответствующей литературы, чтобы определить, является ли какой-либо из TTSP подходящей целью ингибирования упамостатом.
Системы экспрессии млекопитающих TMPRSS2 и TMPRS11A были приобретены у MyBioSource (MBS1193731 и MBS1345824, соответственно). Белки были восстановлены до 1 мг/мл в соответствии с инструкциями производителя, и мы использовали гель с восстановленными белками. Готовили свежий исходный раствор WX-UK1 (100 мМ WX-UK1 в 100% ДМСО). Концентрированный исходный раствор разбавляли до 1 мМ в буфере HBS перед дальнейшим разбавлением в анализах.
Ингибиторы ферментов могут взаимодействовать с ферментами и/или комплексами фермент-субстрат несколькими различными способами, чтобы уменьшить скорость реакции, катализируемой ферментом. Для каждого режима ингибирования можно рассчитать константу диссоциации Ki для ингибитора, которая отражает силу взаимодействия между ферментом и ингибитором. Ki для ингибитора аналогичен Km для субстрата; маленькое значение Ki отражает прочное связывание ингибитора с ферментом, тогда как большее значение Ki отражает более слабое связывание. Точная формула, используемая для расчета Ki, зависит от способа ингибирования, который может быть определен экспериментально путем сравнения «кажущихся» значений Vmax и Km для фермента в присутствии ингибитора со значениями Vmax и Km в отсутствие любого ингибитора (уравнение 2 ниже).
Хромогенным субстратом, выбранным для этих исследований, был субстрат S-2288. Значения Ki определяли путем измерения влияния WX-UK1 на расщепление человеческой сериновой протеазой хромогенных субстратов. Для определения значений Ki серию концентраций WX-UK1 предварительно инкубировали с целевой человеческой сериновой протеазой, после чего добавляли хромогенный субстрат для инициирования реакции. Скорости реакции определяли по наклонам графиков линейной регрессии и нормализовали по значениям для неингибированной реакции. По нормализованным значениям активности строили график зависимости от концентрации WX-UK1, а затем получали значения Ki методом нелинейной регрессии с использованием уравнения 1.
Уравнение 1:
vi/v0 представляет собой отношение начальной скорости с ингибитором и без него, которое описывается как функция концентрации ингибитора [I] и концентрации субстрата [S].
Параметр КМ получали при помощи стандартной кинетики Михаэлиса - Ментен. Сериновую протеазу добавляли к подходящей серии концентраций субстрата, достаточно высоких, чтобы получить экспериментальное значение Vmax. Затем строили график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, а затем получали значение KM с использованием уравнения Михаэлиса - Ментен (2).
Уравнение 2:
Все эксперименты проводили по меньшей мере в трех повторностях при 37°C в HBS (30 мМ буфер HEPES, pH=7,4; 150 мМ NaCl; 0,5% БСА). Реакции отслеживали с частотой 2 сканирования/мин в течение по меньшей мере 45 мин при 405 нм. Поскольку соединение WX-UK1 было растворено в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО), во все эксперименты включали контроль ДМСО без ингибитора, чтобы исключить нежелательное влияние ДМСО на активность протеазы.
Ингибирование человеческой TMPRSS2 под действием WX-UK1
На Фиг. 6 представлена аппроксимированная по уравнению 1 кривая с относительной скоростью по оси y и концентрацией WX-UK1 по оси x. На графике показано, как WX-UK1 ингибирует активность TMPRSS2. Было определено, что Ki составляет 2,9±0,04 (3) мкМ.
Ингибирование человеческой TMPRSS11a под действием WX-UK1
На Фиг. 7 представлена аппроксимированная по уравнению 1 кривая с относительной скоростью по оси y и концентрацией WX-UK1 по оси x. На графике показано, как WX-UK1 ингибирует активность TMPRSS11A. Было определено, что Ki составляет 0,39 ± 0,01 (3) мкМ.
В таблице 3 перечислены константы ингибирования, значения Ki, для WX-UK1 по сравнению с панелью протеаз:
Пример 5: Оценка влияния упамостата и WX-UK1 на проникновение, опосредованное шиповидным белком SARS-CoV-2
Было проведено исследование для оценки ингибирующего действия как упамостата, так и WX-UK1 на проникновение в клетки дефектных по репликации частиц вируса везикулярного стоматита (VSV) с однократным циклом, псевдотипированных шиповидным белком SARS-CoV-2 (VSVpp+SARS-2-S Δ18) или гликопротеином вируса везикулярного стоматита (VSV) в качестве контроля. Δ18 относится к делеции 18 С-концевых аминокислот белка S, что повышает эффективность псевдотипирования, не влияя на использование ACE2 или TMPRSS2. Проникновение псевдотипа и его ингибирование оценивали на клетках Calu-3 и Vero-E6. Клетки Calu-3, которые представляют собой линию раковых клеток человека, полученную из легких, допускают управляемое S SARS-CoV-2 проникновение зависимым от TMPRSS2 образом. Ожидается, что агенты, ингибирующие TMPRSS2, включая камостат, известный ингибитор TMPRSS2, который, как было показано, ингибирует инфекцию SARS-CoV-2 в культивируемых клетках легких (Hoffmann et al., 2020), будут ингибировать S-управляемое проникновение в этой модели. Клетки Vero, которые представляют собой клеточную линию почек зеленой мартышки, допускают управляемое шипом SARS-CoV-2 проникновение независимым от TMPRSS2 и зависимым от катепсина L образом. Ожидается, что агенты, повышающие pH кислых внутриклеточных эндосом, включая хлорохин, будут ингибировать проникновение в этой модели. Проникновение, управляемое G-белком вируса везикулярного стоматита (VSV), служило в качестве контроля специфичности (проникновение, управляемое VSV-G, зависит от низкого pH и, таким образом, является хлорохиновым, но не чувствительным к камостату).
Способы:
Для псевдотипирования был создан псевдотип вируса везикулярного стоматита (VSVpp) в соответствии с опубликованным протоколом (Berger Rentsch and Zimmer, 2011). Вкратце, 293T, трансфицированные для экспрессии исследуемого поверхностного гликопротеина вируса, инокулировали вектором VSV с дефицитом репликации, который содержит кассеты экспрессии для eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) и люциферазу светлячка вместо открытой рамки считывания VSV-G, VSV*DG- fLuc (любезно предоставлено Гертом Циммером, Институт вирусологии и иммунологии, Миттельхойзерн, Швейцария). После периода инкубации в течение 1 часа при 37°C инокулят удаляли и клетки промывали PBS перед добавлением в среду антител к VSV-G (I1, супернатант мышиной гибридомы из CRL-2700; ATCC) добавляли для нейтрализации остаточного введенного вируса (к клеткам, экспрессирующим VSV-G, антитела не добавляли). Псевдотипированные частицы собирали через 16 ч после инокуляции, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования и использовали для экспериментов.
Для трансдукции клетки-мишени выращивали в 96-луночных планшетах до тех пор, пока они не достигали 50-75% конфлюентности, прежде чем их инокулировали соответствующими псевдотипами. В экспериментах с ингибиторами протеаз клетки-мишени обрабатывали соответствующим химическим веществом за 2 часа до трансдукции. Эффективность трансдукции количественно оценивали через 16 ч после трансдукции путем измерения активности люциферазы светлячка в клеточных лизатах с использованием коммерческого субстрата (Beetle-Juice, PJK) и планшетного люминометра Hidex Sense (Hidex). В анализе трансдукции определяется проникновение вируса везикулярного стоматита (VSV) одного цикла, несущего шип SARS-CoV-2.
Результаты:
Способность упамостата и WX-UK1 ингибировать проникновение псевдотипов, несущих SARS-2-S и VSV-G, оценивали на клетках Calu-3 (клетки рака легкого человека) и Vero-E6. Клетки Calu-3, которые представляют собой линию раковых клеток человека, полученную из легких, допускают управляемое шипом SARS-CoV-2 проникновение зависимым от TMPRSS2 образом и, следовательно, чувствительным к камостату образом. Клетки Vero, которые представляют собой линию клеток почки, полученную из африканской зеленой мартышки, допускают управляемое шипом SARS-CoV-2 проникновение зависимым от катепсина L образом и чувствительным к хлорохину образом. Проникновение, управляемое G-белком вируса везикулярного стоматита (VSV), служило в качестве контроля специфичности (проникновение, управляемое VSV-G, зависит от низкого pH и, таким образом, является хлорохиновым, но не чувствительным к камостату).
Упамостат и WX-UK1 ингибируют опосредованное S-белком SARS-CoV-2 проникновение в клетки рака легкого человека (Calu-3) и клетки почек зеленой обезьяны (Vero E6) с умеренной эффективностью.
При тестировании против VSVpp+SARS-2-S Δ18 в клетках Calu-3 как WX-UK1, так и упамостат продемонстрировали умеренную ингибирующую активность, хотя и меньшую, чем камостат, другой ингибитор сериновой протеазы (Фиг. 8A). При тестировании на клетках Vero-E6, не имеющих поверхностного TMPRSS2, умеренная ингибирующая активность все же отмечалась для упамостата и WX-UK1; камостат был неактивен в этой ситуации, в то время как самая высокая концентрация хлорохина сильно ингибировала управляемое белком S проникновение (Фиг. 8B). WX-UK1 и упамостат умеренно ингибировали проникновение VSV-G в клетки Calu-3, что указывает на более широкий спектр активности упамостата (Фиг. 9). Все три соединения, кроме хлорохина, оказались неактивными при тестировании против VSV-G в клетках Vero76. В целом, эти результаты демонстрируют, что WX-UK1 и упамостат ингибируют проникновение вируса SARS-CoV-2 в клетки Calu-3 и Vero с умеренной эффективностью. Из-за характера модели конкретная экстраполяция на фактические ингибирующие концентрации in vitro или in vivo невозможна.
Пример 6: Лечение COVID-19 с пневмонией опаганибом
В этом стационарном исследовании оценивались пациенты с диагнозом COVID-19, у которых развилась пневмония и которым не требуется искусственная вентиляция легких или которые находились на искусственной вентиляции легких не более 24 часов.
Первичные цели:
1) Оценить безопасность и переносимость опаганиба в дозе 500 мг каждые 12 часов у пациентов, госпитализированных с инфекцией COVID-19
Оценить шеддинг вируса при лечении опаганибом
Вторичные/исследовательские цели могут включать один или более из следующих элементов:
1) Оценить показатели жизненно важных функций у пациентов, госпитализированных с инфекцией COVID-19, получающих лечение опаганибом
2) Оценить клиническое улучшение у пациентов, госпитализированных с инфекцией COVID-19, при лечении опаганибом
3) Оценить потребность в искусственной вентиляции легких при лечении опаганибом у пациентов, не находившихся на искусственной вентиляции легких в начале исследования
4) Оценить улучшение показателей гипоксии по соотношению SpO2/FiO2 или PaO2/FiO2, а также SpO2 на комнатном воздухе. Возврат к комнатному воздуху или определенная сатурация SpO2 в условиях комнатного воздуха.
Оценка изменений вирусной нагрузки во время лечения, а также изменений уровней D-димера, сердечного тропонина, ЛДГ и ферритина.
Дизайн исследования:
Это исследование включало одну группу активного лечения; открытое исследование опаганиба по 500 мг каждые 12 часов два раза в день для всех пациентов, соответствующих критериям участия, госпитализированных с пневмонией, вызванной COVID-19, которые либо не нуждаются в искусственной вентиляции легких, либо которым проводили искусственную вентиляцию легких в течение < 24 часов. Пациентов включали в период скрининга до 1 недели. Пациентов, соответствующих критериям участия, включали в период лечения до 2 недель. Все участники наблюдались в течение 2 недель после приема последней дозы исследуемого препарата, в конце 2-недельного периода лечения или после того, как у них были 2 последовательных ежедневных отрицательных мазка на вирус COVID-19, или после преждевременного прекращения приема препарата до 14 дня. Максимальная продолжительность участия в исследовании составила 35 дней (7 недель). Участники исследования получали опаганиб, 2 капсулы по 250 мг (500 мг) каждые 12 часов, ежедневно в течение 14 дней (2 недели) или до тех пор, пока 2 последовательных ежедневных мазка из носоглотки не дали отрицательный результат на COVID-19, в зависимости от того, что наступит раньше. Опаганиб вводили во время еды (после легкого или умеренного приема пищи), а затем запивая 240 мл (8 жидких унций) воды. Если пациент мог принимать опаганиб только через назогастральный зонд, содержимое капсулы суспендировали в 20 мл физиологического раствора, пропускали через назогастральный зонд и тщательно промывали стерильной водой. Если пациент находился на зондовом питании, опаганиб вводили вскоре после получения (примерно через 15-30 минут) зондового питания.
Ключевые критерии включения:
1. Взрослый мужчина или женщина в возрасте от ≥18 до ≤75 лет включительно
2. Подтвержденная инфекция COVID-19 и пневмония, не требующие искусственной вентиляции легких или находящиеся на искусственной вентиляции не более 24 часов на момент получения информированного согласия
3. Пациент, опекун или законный представитель подписал письменное информированное согласие, утвержденное ЭСО.
Ключевые критерии невключения:
1. Класс III или IV согласно Нью-Йоркской кардиологической ассоциации, заболевание сердца, инфаркт миокарда в течение последних 6 месяцев, нестабильная аритмия или признаки ишемии на ЭКГ
2. Любое сопутствующее заболевание, которое, по мнению исследователя, может увеличить риск лечения.
3. Беременные (положительный сывороточный анализ) или кормящие женщины
4. Нежелание или неспособность соблюдать процедуры, требуемые в этом протоколе.
5. АСТ (SGOT) или АЛТ (SGPT) > 2,5 x верхнего предела нормы (ВПН)
6. Билирубин >1,5x ВПН (за исключением случаев, когда повышение билирубина связано с синдромом Жильбера)
7. Креатинин сыворотки >2,0 х ВПН
8. Абсолютное количество нейтрофилов <1000 клеток/мм3
9. Количество тромбоцитов <75000/мм3
10. Гемоглобин <8,0 г/дл
11. В настоящее время принимает варфарин, апиксабан, аргатробан или ривароксабан
12. Имеющаяся наркотическая или алкогольная зависимость
Оценки в исследовании:
Ежедневно будет контролироваться следующее (см. Таблицу 4):
- Обзор сопутствующих лекарственных препаратов
- Нежелательные явления
- Физикальное обследование
- Показатели жизненно важных функций (температура, артериальное давление, частота пульса, частота дыхания и насыщение кислородом по данным пульсоксиметра)
- Клинические симптомы (кашель, одышка, тошнота, рвота, диарея)
- Мазок из носоглотки на вирусы
- Биохимический анализ сыворотки
- Общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы
- Рентгенограмма грудной клетки
- Анализ мочи
График проведения оценок; другие возможные оценки, не упомянутые ниже, включают сбор образцов крови и стула и определение уровней РНК SARS-CoV-2 с использованием количественного анализа методом ОТ-ПЦР. Ежедневные оценки вирусной нагрузки, пока субъекты продолжают выделять вирусную РНК.
1 ежедневные оценки до 14-го дня или ранее, если 2 раза в день подряд отрицательные мазки на вирус на SARS-CoV-2
2 оценить температуру, артериальное давление, частоту пульса, частоту дыхания и сатурацию с помощью пульсоксиметра
3 оценить кашель, одышку, тошноту, рвоту, диарею
4 женщины детородного возраста; анализ крови на беременность должен быть отрицательным в течение 3 дней до рандомизации
Лекарственные формы и способы введения:
Опаганиб поставлялся в виде капсул по 250 мг, содержащих 250 мг опаганиба вместе с эксципиентами в белых непрозрачных твердых желатиновых капсулах.
Опаганиб вводили перорально (или, при необходимости, через назогастральный зонд) в виде двух капсул (500 мг) каждые 12 часов на срок до 2 недель. Каждую дозу вводят с пищей или через 15-30 минут после кормления через зонд, если это целесообразно.
Конечные точки исследования:
Основные конечные точки безопасности:
1) Нежелательные явления, лабораторные анализы, физикальное обследование и показатели жизненно важных функций
2) Процент пациентов с 2 отрицательными последовательными ежедневными мазками из носоглотки к 14-му дню лечения опаганибом
Вторичные/поисковые конечные точки:
1) Процент пациентов, демонстрирующих улучшение основных показателей жизнедеятельности (на основе улучшения одного или более из следующих параметров: температуры, частоты сердечных сокращений, частоты дыхания, сатурации)
2) Процент пациентов, демонстрирующих клиническое улучшение (на основе улучшения одного или более из следующих симптомов: кашель, одышка, тошнота, рвота, диарея)
Процент пациентов, которые не находились на искусственной вентиляции легких в момент включения в исследование, которым не требуется искусственная вентиляция легких к концу 2-недельного наблюдения за приемом препарата вне исследования
Результаты:
Были получены результаты от семи пациентов, для которых было одобрено применение препарата из соображений гуманности. У этих пациентов была пневмония, связанная с COVID-19, от умеренной до тяжелой степени с гипоксией на кислородной поддержке. Пациентам назначали опаганиб в сочетании со стандартной терапией, включая гидроксихлорохин (HCQ) в качестве фоновой терапии у шести из семи пациентов.
Как видно из таблицы 5, за исключением пациента № 7, который лечился только 1 день из-за диареи, которая могла быть связана или не быть связана с опаганибом (пациенту также давали HCQ и азитромицин), при этом состояние всех 6 пациентов со средней и тяжелой степенью тяжести значительно улучшилось, при этом 5 пациентов вернулись к дыханию комнатным воздухом, а 3 пациента были выписаны из больницы.
Все шесть пациентов продемонстрировали снижение уровня С-реактивного белка (CRP), все шесть пациентов также продемонстрировали измеримое клиническое улучшение, включая снижение дополнительной оксигенации и более высокое количество лимфоцитов.
Все пациенты начинали в течение первых 3 дней с 250 мг опаганиба каждые 12 часов, а затем увеличили дозу до 500 мг опаганиба каждые 12 часов.
Несмотря на то, что эти предварительные результаты были получены только у шести пациентов, они демонстрируют клиническое улучшение у первых пациентов с COVID-19, получавших опаганиб, и обеспечивают предварительное подтверждение переносимости использования опаганиба у пациентов с COVID-19.
Тяжелое течение в начале, высокая скорость OptiFlow на 19.04.20; на HCQ и азитромицин <24 часов на момент начала лечения опаганибом. Диарея на следующий день, все 3 препарата были отменены, затем ухудшение одышки, на 75% OptiFlow. Только на стероидах по состоянию на 24.04.20
* Состояние улучшилось через день после начала терапии, выписана на комнатном воздухе без повторного анализа крови.
КВ- комнатный воздух, d/C- выписан, SOB -одышка
В анализ были включены пять пациентов, и для целей сравнения мы использовали контрольную группу с пациентами того же пола с одинаковой степенью тяжести болезни (характеристики на момент включения в исследование). Одномерные сравнения между группами были выполнены с помощью критерия хи-квадрат для категориальных переменных и t-критерия или U-критерия Манна-Уитни для непрерывных переменных, в зависимости от ситуации. Временные переменные сравнивались с помощью пропорциональной регрессии рисков Кокса с поправкой на возраст и фоновые заболевания. Изменения в уровнях CRP и лимфоцитов сравнивали с использованием общей линейной модели для повторных измерений с поправкой Бонферрони для множественного сравнения.
У пациентов, получавших опаганиб, наблюдалось значительно более быстрое увеличение числа лимфоцитов. Все остальные клинические исходы имели статистически незначимую тенденцию в пользу группы лечения: среднее время до отлучения от высокопоточной назальной канюли (HFNC) составляло 10 и 15 дней в случаях по сравнению с контрольной группой (ОР=0,3, 95% ДИ: 0,07-1,7, p=0,2), время пребывания на комнатном воздухе составило 13 против 14,5 дней (ОР=0,4, 95% ДИ: 0,15-1,5), ни в одном из случаев не потребовалась искусственная вентиляция легких по сравнению с 33% в контроле. В этой небольшой группе пациентов с тяжелым течением COVID-19 опаганиб был безопасным и хорошо переносился с улучшением как клинических, так и лабораторных показателей у всех получавших лечение пациентов. Эффективность опаганиба при инфекции COVID-19 следует дополнительно проверить в рандомизированных плацебо-контролируемых исследованиях.
Пример 7: Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы 2а опаганиба при пневмонии COVID-19
Первичная цель:
Для оценки общей потребности в кислородной поддержке (площадь под кривой) с использованием суточного дополнительного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день)
Вторичные цели:
1) Оценить время до 50% снижения от начала получения кислородной поддержки на основе потока кислорода в л/мин
2) Оценить долю пациентов, которым больше не требуется кислородная поддержка в течение по меньшей мере 24 часов к 14-му дню
3) Оценить долю пациентов без лихорадки на 14-й день
4) Оценить время до получения отрицательных мазков на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР
5) Оценить долю пациентов с отрицательными мазками на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР на 14-й день
6) Оценить необходимость интубации и ИВЛ к 14 дню
7) Оценить время до ИВЛ
8) Оценить долю пациентов, по меньшей мере с одним определением лихорадки на момент включения в исследование (определяется как температура >38,0°C [100,4°F]), у которых нет лихорадки (определяется как температура <37,2°C [99°F]) на 14-й день
9) Для оценки смертности через 30 дней с момента включения в исследование
Поисковые цели:
Для оценки изменения системных маркеров воспаления (D-димер, сердечный тропонин, С-реактивный белок [CRP], лактатдегидрогеназа [ЛДГ] и ферритин)
Цели безопасности:
Оценить безопасность и переносимость опаганиба при пероральном введении в дозе 500 мг каждые 12 часов в течение 14 дней у пациентов с пневмонией, вызванной COVID-19
Популяция для исследования:
Исследуемая популяция будет состоять из пациентов с диагнозом COVID-19, у которых развилась пневмония, определяемая как рентгенографические затемнения на рентгенограмме грудной клетки, и которым требуется кислородная поддержка. Пациенты должны быть госпитализированы, по меньшей мере, во время скрининга и на момент включения в исследование (1 день).
Дизайн и описание исследования:
Это была фаза 2а, проверка концепции, многоцентровое рандомизированное двойное слепое параллельное плацебо-контролируемое исследование. После получения информированного согласия пациенты проходили фазу скрининга продолжительностью не более 3 дней для определения соответствия требованиям. 42 пациента, соответствующих критериям участия, рандомизировали для получения либо опаганиба, добавленного к стандартному лечению, либо соответствующего плацебо, добавленного к стандартному лечению, в соотношении рандомизации 1:1. Распределение в группы лечения оставались закрытыми для пациента, исследователя и персонала больницы, а также для спонсора. Поскольку не было достигнуто консенсуса в отношении окончательного лечения, специально нацеленного на вирус SARS-CoV-2, вызывающий COVID-19 (Wilson, 2020), стандартное лечение относилось к региональным, институциональным или врачебным методам лечения, которые применялись во время пандемии COVID-19.
Участники исследования получали либо опаганиб 2 капсулы по 250 мг (500 мг) каждые 12 часов, либо соответствующее плацебо в дополнение к стандартному лечению (фармакологическому и/или поддерживающему). Исследуемый препарат нужно было вводить каждый день в течение 14 дней (с 1-го по 14-й день), если только пациент не был выписан из больницы без потребности в кислородной поддержке, в этом случае исследуемое лекарственное средство вводили только на 10-й день.
Все участники наблюдались в течение 4 недель после приема последней дозы исследуемого лекарственного средства, что могло произойти в конце 2-недельной фазы двойного слепого лечения или после преждевременного прекращения приема исследуемого лекарственного средства по решению пациента или врача. Максимальная продолжительность участия в исследовании составила до 45 дней (включая до 3 дней скрининга; 2-недельная фаза лечения DB и 4-недельное наблюдение за приемом вне исследования)
Стратификация:
Пациенты были стратифицированы на основе алгоритма минимизации с учетом следующих трех параметров: возраст на момент скрининга, ≥70 лет (да или нет); HbA1c при скрининге ≥6,5 (да или нет); потребность в кислородной поддержке на момент включения в исследование, требующая неинвазивной вентиляции с положительным давлением (например, через BIPAP, CPAP) (да или нет).
Критерии отбора:
Включение:
1. Взрослый мужчина или женщина в возрасте от ≥18 до ≤80
2. Подтвержденная инфекция COVID-19 по результатам анализа ОТ-ПЦР образца из глотки (из носоглотки или ротоглотки) и пневмония, определяемая как рентгенографические затемнения на рентгенограмме грудной клетки
3. Пациенту требуется кислородная поддержка на момент включения в исследование
4. Пациент, опекун или законный представитель подписал письменное информированное согласие, утвержденное ЭСО
Невключение:
1. Любое сопутствующее заболевание, которое, по мнению исследователя, может увеличить риск лечения.
2. Требуется интубация и искусственная вентиляция легких
3. Сатурация кислородом >95% в условиях комнатного воздуха
4. Любое ранее существовавшее респираторное заболевание, требующее прерывистой или постоянной амбулаторной оксигенотерапии до госпитализации
5. По клинической оценке исследователя, пациент вряд ли проживет более 72 часов
6. Беременные (положительный результат анализа сыворотки крови в течение 3 дней до рандомизации) или кормящие женщины
7. Нежелание или неспособность соблюдать процедуры, требуемые в этом протоколе.
8. Скорректированный интервал QT (QTc) на электрокардиограмме (ЭКГ) >470 мс для женщин или >450 мс для мужчин, рассчитанный по формуле Fredericia (QTcF)
9. АСТ (SGOT) или АЛТ (SGPT) > 2,5 x верхнего предела нормы (ВПН)
10. Билирубин >1,5x ВПН (за исключением случаев, когда повышение билирубина связано с синдромом Жильбера)
11. Креатинин сыворотки >2,0 х ВПН
12. Абсолютное количество нейтрофилов <1000 клеток/мм3
13. Количество тромбоцитов <75000/мм3
14. Гемоглобин <8,0 г/дл
15. В настоящее время принимает лекарственные препараты, чувствительные к субстратам CYP3A4, CYP2C9 или CYP2C19 и имеющие узкий терапевтический индекс
16. В настоящее время принимает лекарственные средства, которые являются сильными индукторами или ингибиторами CYP2D6 и CYP3A4 17. В настоящее время принимает варфарин, апиксабан, аргатробан или ривароксабан
18. Имеющаяся наркотическая или алкогольная зависимость
19. В настоящее время участвует в клиническом исследовании по оценке фармакологического лечения, включая противовирусные исследования
Количество субъектов:
Всего в исследовании было обследовано 49 пациентов, из которых 42 пациента были рандомизированы (23 в группу опаганиба, 19 в группу плацебо), а 7 пациентов не прошли скрининг. Два пациента были рандомизированы в каждую группу, но не получали лечения. 19 пациентов с опаганибом и 16 пациентов, получавших плацебо, завершили лечение (14 день). 3 пациента с опаганибом и 2 пациента с плацебо преждевременно прекратили лечение. У двух пациентов в группе опаганиба наблюдались нежелательные явления, в связи с чем прием исследуемого лекарственного препарата был прекращен, а у одного пациента, получавшего плацебо, лечение прекращали из-за нежелательного явления.
Скрининг/Исходная оценка:
Подписанное информированное согласие
Определение соответствия требованиям
Полный медицинский анамнез (включая появление симптомов COVID-19)
Оценка сопутствующих лекарственный препаратов
Исследование систем организма на момент включения в исследование
Физикальное обследование
Показатели жизненно важных функций (температура, артериальное давление, частота пульса, частота дыхания и насыщение кислородом по данным пульсоксиметра)
Масса, если пациент амбулаторный
Потребность в кислородной поддержке (л/мин)
Электрокардиограмма в 12 отведениях
Рентгенограмма грудной клетки
Мазок из носоглотки или ротоглотки для ПЦР-теста на SARS-CoV-2
Биохимический анализ сыворотки
CRP, D-димер, ЛДГ, ферритин, сердечный тропонин
HbA1c
Общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы
Анализ мочи
Анализ крови на беременность (для женщин детородного возраста) в течение 3 дней до начала лечения
Оценки в исследовании:
В рамках стандартного лечения ежедневно контролировались и документировались следующее:
Сопутствующие лекарственные препараты
Нежелательные явления
Промежуточное физикальное обследование
Показатели жизненно важных функций (температура, артериальное давление, частота пульса, частота дыхания и насыщение кислородом по данным пульсоксиметра)
Потребность в кислородной поддержке (л/мин)
Следующие показатели будут контролироваться реже в рамках стандартного лечения и везде, где это возможно:
Для пациентов, одновременно получающих гидроксихлорохин, электрокардиограмма в 12 отведениях (если это разрешено правилами лечения в стационаре в связи с COVID-19) примерно через 3 часа после первого введения исследуемого лекарственного средства в 1-й день, в любое время во 2-й и 4-й дни и снова в конце лечения (на 10-й, 14-й день или при досрочном прекращении приема исследуемого лекарственного средства). Если пациенты находятся на мониторинге (включая телеметрию или мониторы Холтера), исследователям рекомендуется собирать данные об интервале QT
Мазок из носоглотки или ротоглотки для ПЦР-теста на SARS-CoV-2 каждые 1-3 дня
Биохимический анализ сыворотки один раз в неделю
Сывороточный CRP, D-димер, ЛДГ, ферритин, сердечный тропонин один раз в неделю
Общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы один раз в неделю
Рентгенограмма грудной клетки по решению врача
Конечные точки исследования:
Первичная
Общая потребность в кислородной потребность (площадь под кривой) с использованием суточного дополнительного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день)
Вторичные
1) Время до 50% снижения от начала получения кислородной поддержки на основе потока кислорода в л/мин
2) Процент пациентов, которые больше не получают дополнительный кислород в течение по меньшей мере 24 часов к 14-му дню
3) Время до двух последовательных отрицательных мазков на SARS-CoV-2 методом ПЦР с интервалом не менее 24 часов
4) Процент пациентов с как минимум двумя последовательными отрицательными мазками, за которыми следуют постоянные отрицательные мазки на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР на 14-й день
5) Процент пациентов, которым требуется интубация и искусственная вентиляция легких к концу 2-недельного наблюдения за приемом препарата вне исследования
6) Время до интубации и ИВЛ
7) Процент пациентов с хотя бы одним определением лихорадки на момент включения в исследование (определяемой как температура >38,0°C [100,4°F]), у которых нет лихорадки (определяется как температура <37,2°C [99°F]) на 14-й день
8) Смертность по любой причине на 30-й день
Поисковые
1) Среднее изменение системных маркеров воспаления (D-димер, сердечный тропонин, С-реактивный белок [CRP], прокальцитонин [PCT], лактатдегидрогеназа [ЛДГ] и ферритин) по сравнению с исходным уровнем на 14-й день
Безопасность
1) Частота всех НЯ, возникших в ходе лечения, (НЯВЛ) и СНЯ
2) Оценка показателей жизненно важных функций
3) Оценка лабораторных параметров (биохимия и гематология)
4) Оценка электрокардиограмм (ЭКГ)
Статистические методы:
Основная цель исследования эффективности представляла собой оценку влияние опаганиба на общую потребность в дополнительном кислороде (площадь под кривой) с использованием измерений суточного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день). Первичная конечная точка эффективности рассчитывалась для каждого пациента как площадь под кривой потребности в дополнительном кислороде до 14-го дня с использованием правила трапеций после вычитания исходной потребности в кислородной поддержке каждый день. Дни, когда дополнительный кислород не требовался, записывали как 0. Если в какой-то день регистрируется несколько значений потребности в кислородной поддержке (л/мин), для первичного анализа бралось наибольшее из этих значений. В первичном анализе для пациентов, которые умерли до 14-го дня или нуждались в интубации и искусственной вентиляции легких, отсутствующие суточные значения соответствовали максимальной потребности в дополнительном потоке кислорода 8 л/мин. Для пациентов, выписанных из больницы на дополнительном кислороде до 14 дня, если никакие значения не были собраны на месте после выписки, потребность в кислороде (л/мин) в день выписки впоследствии должна была быть назначена в течение каждого дня до 14 дня.
Первичный анализ был основан на модифицированной совокупности пациентов с назначенным лечением (mITT), которая состоит из всех пациентов, которые были рандомизированы и получали по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного препарата (популяция включала в общей сложности 40 субъектов, 22 в группе опаганиба и 18 в группе плацебо). Описательная статистика AUC с поправкой на исходный уровень представлена по группам вместе с 95% доверительным интервалом для каждой группы и для разницы в средних значениях между группами. Потребность в дополнительном кислороде до 14-го дня отмечали, даже если пациент прекратил лечение до 14-го дня, но продолжал участвовать в исследовании до 14-го дня. Кроме того, предполагалось, что потеря для последующего наблюдения, такая как отсутствие жизненного статуса до 14-го дня, маловероятна. Поэтому в первичном анализе предполагалось, что в случае отсутствия всех значений дополнительного кислорода после прекращения лечения последнее значение переносится вперед - до 14-го дня или до смерти, если она наступила раньше. Анализ чувствительности к описанному выше подходу к обработке отсутствующих данных был выполнен с использованием подхода сводной статистики AUC, в котором AUC групп рассчитывается на основе оценочных параметров модели повторных измерений.
В когорте mITT два субъекта отозвали свое согласие из-за нежелательных явлений со стороны желудочно-кишечного тракта 1 степени. Кроме того, одному субъекту не требовался какой-либо дополнительный кислород на момент включения в исследования до начала лечения, и он был исключен из нескольких анализов в соответствии с требованиями плана статистического анализа (SAP). Таким образом, из популяции апостериорного анализа активности («чувствительность mITT») исключили этих трех пациентов из анализа и включили 37 субъектов, 19 из группы опаганиба и 18 из группы плацебо. Результаты как для популяции mITT (которая включала этих 3 субъектов), так и для популяции чувствительности mITT показали сходные тенденции активности.
Результаты:
Главные результаты исследования показали, что опаганиб безопасен, при этом существенных различий в безопасности между группами лечения опаганибом и плацебо не было. В целом, меньше пациентов страдали от серьезных нежелательных явлений (СНЯ) в группе лечения опаганибом, чем в группе плацебо. В этой небольшой выборке было мало случаев интубации или летального исхода, и они были сбалансированы между двумя группами.
Группа, получавшая опаганиб, продемонстрировала устойчивую тенденцию к большему улучшению в отношении снижения потребности в кислородной поддержке к концу лечения на 14-й день по ключевым первичным и вторичным результатам эффективности, которая коррелировала с клиническим улучшением, как определено по порядковой шкале Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ):
Более значительное улучшение в доле пациентов, достигших условий комнатного воздуха и больше не нуждающихся в кислородной поддержке, к 14 дню по сравнению с контрольной группой (52,6% против 22,2%). На Фиг. 10 показана кривая Каплана-Мейера для времени до прекращения получения кислородной поддержки в течение по меньшей мере 24 часов (чувствительность mITT).
Более значительное улучшение в доле пациентов с 50% снижением в отношении кислородной поддержки к 14 дню по сравнению с контрольной группой (89,5% против 66,7%). На Фиг. 11 показана кривая Каплана-Мейера для зависимости кумулятивной заболеваемости от времени до 50% снижения от начала получения кислородной поддержки на основе потока кислорода в л/мин (чувствительность mITT).
Более высокая доля пациентов, выписанных на 14-й день, по сравнению с контрольной группой (73,7% против 55,6%).
Большее снижение средней общей потребности в кислородной поддержке (AUC) по сравнению с моментом включения в исследование в течение 14 дней (68,0% против 46,7%). На Фиг. 12 показан точечный график общей потребности в кислородной поддержке (площадь под кривой) для процентного изменения по сравнению с исходным уровнем с использованием измерений суточного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день).
Пример 8: Рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое международное исследование фазы 2/3 - Опаганиб при пневмонии, вызванной COVID-19
Первичная цель:
Оценить долю пациентов, которым требуется интубация и искусственная вентиляция легких к 14 дню.
Вторичные цели:
1) Оценить изменения по порядковой шкале ВОЗ в отношении клинического улучшения
2) Оценить время до интубации и ИВЛ
3) Оценить время перехода к низкому потоку кислорода через назальную канюлю, например, от высокого потока кислорода через назальную канюлю или CPAP, если высокий поток кислорода недоступен
4) Оценить долю пациентов, которым больше не требуется кислородная поддержка в течение по меньшей мере 24 часов к 14-му дню
5) Для оценки общей потребности в кислородной поддержке (площадь под кривой) с использованием суточного дополнительного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день)
6) Оценить время до двух последовательных отрицательных мазков на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР
7) Оценить долю пациентов с двумя последовательными отрицательными мазками на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР на 14-й день
8) Оценить долю пациентов, по меньшей мере с одним измерением лихорадки на момент включения в исследование (определяется как температура >38,0°C [100,4°F]), у которых нет лихорадки (определяется как температура <37,2°C [99°F]) на 14-й день
9) Для оценки смертности через 30 дней с момента включения в исследование
Поисковые цели:
Оценить изменение системных маркеров воспаления (D-димер, сердечный тропонин, С-реактивный белок [CRP], лактатдегидрогеназу [ЛДГ] и ферритин) в течение 14-дневного периода лечения.
Цели безопасности:
Оценить безопасность и переносимость опаганиба перорально при 500 мг каждые 12 часов до 14 дней у пациентов с тяжелой формой пневмонии, вызванной COVID-19.
Популяция для исследования:
Исследуемая популяция будет состоять из пациентов с диагнозом инфекция COVID-19, которая определяется как тяжелая на основании критериев отбора в соответствии с текущими диагностическими рекомендациями для конкретного региона. В частности, у пациентов будет как минимум пневмония, вторичная по отношению к SARS-CoV-2, рентгенологические признаки пневмонии на рентгенограмме грудной клетки или компьютерной томографии, и им потребуется поддержка кислородом с высоким потоком кислорода через носовую канюлю или CPAP, если высокий поток кислорода недоступен. Пациенты должны быть госпитализированы по меньшей мере во время скрининга и на момент включения в исследование (1 день).
Дизайн и описание исследования:
Это многоцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы 2/3 с параллельными группами с адаптивным дизайном, в котором будет использоваться оценка отсутствия целесообразности. Исследование планируется провести в Италии, других странах ЕС, России, Бразилии, Мексике и США примерно в 40 клинических центрах.
После получения информированного согласия пациенты включаются в фазу скрининга продолжительностью не более 3 дней, чтобы определить соответствие требованиям. Приблизительно 270 соответствующих критериям пациентов будут рандомизированы и получат либо опаганиб, добавленный к стандартному лечению, либо соответствующее плацебо, добавленное к стандартному лечению, в соотношении рандомизации 1:1. Распределение в группы лечения останутся закрытыми для пациента, исследователя и персонала больницы, а также для спонсора. Поскольку утверждение и/или руководство по лечению COVID-19 находится в процессе доработки, для данного протокола стандартного лечения будет определяться рекомендуемыми схемами лечения в зависимости от степени тяжести заболевания на основании местных диагностических и руководящих документов, таких как Temporary Methodic Recommendations: Prophylactic, Diagnostics and Treatment of New Corona Virus Infection (COVID-19); Комиссией ЕС, Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), руководителями медицинских агентств (HMA) и FDA, а также в соответствии с самой последней версией рекомендаций.
Участники исследования будут получать либо опаганиб 2 капсулы по 250 мг (500 мг) каждые 12 часов, либо соответствующее плацебо в дополнение к стандартному лечению (фармакологическому, как определено выше, и/или поддерживающему) в любом конкретном учреждении. Исследуемое лекарственное средство будет вводиться каждый день в течение 14 дней (с 1 по 14 день). Все участники будут находиться под наблюдением в течение 28 дней после получения последней дозы исследуемого лекарственного средства, что может произойти на 14-й день или после преждевременного прекращения приема исследуемого лекарственного средства по решению пациента или врача.
Стратегия рандомизации:
Поскольку лечебные мероприятия в рекомендуемых схемах лечения в зависимости от степени тяжести заболевания могут различаться, исходя из местных диагностических и методических документов, таких как Temporary Methodic Recommendations: Prophylactic, Diagnostics and Treatment of New Corona Virus Infection (COVID-19); Комиссией ЕС, Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), руководителями медицинских агентств (HMA) и FDA, стандарты лечения пациентов могут различаться в зависимости от учреждения. Чтобы обеспечить баланс стандартных схем лечения в обеих группах лечения, рандомизация будет проводиться на уровне отдельных центров.
Адаптивный промежуточный анализ целесообразности:
Неослепленный промежуточный анализ отсутствия целесообразности будет проводиться, когда приблизительно 100 субъектов (примерно 50 субъектов из каждой группы) будут оценены в отношении первичной конечной точки, чтобы определить вероятность отклонения нулевой гипотезы об отсутствии эффекта, и будет ли целесообразно продолжать исследование. Критерии будут определены на перспективу и задокументированы в окончательной версии Плана статистического анализа (SAP) до проведения промежуточного анализа.
Комитет по мониторингу данных о безопасности:
Независимый комитет по мониторингу данных (DSMB) будет созван для надзора за безопасностью исследования с целью обеспечения безопасности участников исследования. Встречи DSMB для рассмотрения данных о безопасности будут запланированы после того, как 25%, 50% и 75% или когда примерно 70, 135 и 200 рандомизированных пациентов, соответственно, достигнут 7-го, а затем 14-го дня. DSMB также будет нести ответственность за передачу спонсору результатов анализа отсутствия целесообразности, проведенного независимым специалистом по статистике без ослепления (бесполезно/целесообразно).
Стратификация:
Пациенты будут стратифицированы на основе соответствия трем или более клиническим параметрам высокого риска для исходов COVID-19 на момент включения в исследование (да или нет). Параметры: 1) возраст на момент скрининга ≥60 лет (да или нет); 2) мужчина, (да или нет); 3) HbA1c при скрининге ≥6,5 (да или нет); 4) гипоксемия без соразмерного увеличения работы, затрачиваемой на дыхание, (определяется как учащение дыхания, раздувание носа и/или увеличение использования дыхательных мышц, включая диафрагму [да или нет]; 5) известное основное хроническое заболевание легких (да или нет); 6) известное сердечно-сосудистое заболевание или гипертония (да или нет); 7) ИМТ ≥ 28,0 кг/м2 (да или нет); 8) известное заболевание почек (да или нет).
Лечение и введение:
Опаганиб 500 мг каждые 12 часов или соответствующее плацебо. Опаганиб или плацебо в виде суспензии можно вводить через назогастральный зонд в желудок пациента.
Продолжительность исследования:
Максимальная продолжительность участия в исследовании составит до 45 дней (в том числе до 3 дней скрининга; до 14 дней двойного слепого лечения и 28 дней наблюдения за приемом препарата вне исследования).
Критерии отбора:
Включение:
1. Взрослый мужчина или женщина в возрасте от ≥18 до ≤80
2. Подтвержденная инфекция COVID-19 по результатам анализа методом ОТ-ПЦР образца из глотки (из носоглотки или ротоглотки) и пневмония, определяемая как рентгенологические затемнения на рентгенограмме грудной клетки или КТ
3. Пациенту на момент включения в исследование требуется кислородная поддержка с высоким потоком или CPAP, если вариант с высоким потоком кислорода недоступен.
4. Пациент соглашается использовать соответствующие методы контрацепции во время исследования и через 3 месяца после последней дозы исследуемого лекарственного средства
5. Пациент или его законный представитель подписал письменное информированное согласие, одобренное ЭСО/Комитетом по этике
Невключение:
1. Любое сопутствующее заболевание, которое, по мнению исследователя, может увеличить риск лечения.
2. Требуется интубация и искусственная вентиляция легких
3. Сатурация кислородом >95% в условиях комнатного воздуха
4. Любое ранее существовавшее респираторное заболевание, требующее прерывистой или постоянной амбулаторной оксигенотерапии до госпитализации
5. По клинической оценке исследователя, пациент вряд ли проживет более 72 часов
6. Беременные (положительный результат анализа сыворотки или мочи в течение 3 дней до рандомизации) или кормящие женщины.
7. Нежелание или неспособность соблюдать процедуры, требуемые в этом протоколе.
8. Скорректированный интервал QT (QTc) на электрокардиограмме (ЭКГ) >470 мс для женщин или >450 мс для мужчин, рассчитанный по формуле Fredericia (QTcF)
9. АСТ (SGOT) или АЛТ (SGPT) > 2,5 x верхнего предела нормы (ВПН)
10. Общий билирубин >1,5x ВПН (за исключением случаев, когда повышение билирубина связано с синдромом Жильбера)
11. Креатинин сыворотки >2,0 х ВПН
12. Абсолютное количество нейтрофилов <1000 клеток/мм3
13. Количество тромбоцитов <75000/мм3
14. Гемоглобин <8,0 г/дл
15. В настоящее время принимает лекарственные препараты, чувствительные к субстратам CYP3A4, CYP2C9 или CYP2C19 и имеющие узкий терапевтический индекс
16. В настоящее время принимает лекарственные препараты, которые являются сильными индукторами или ингибиторами CYP2D6 и CYP3A4
17. В настоящее время принимает варфарин, апиксабан, аргатробан или ривароксабан из-за лекарственного взаимодействия, основанного на метаболизме CYP450
18. Имеющаяся наркотическая или алкогольная зависимость
19. В настоящее время участвует в клиническом исследовании по оценке фармакологического лечения, включая противовирусные исследования
Скрининг/Исходная оценка:
Подписанное информированное согласие пациента или законного представителя
Определение соответствия требованиям
Полный медицинский анамнез (включая появление симптомов COVID-19)
Оценка сопутствующих лекарственный препаратов
Исследование систем организма на момент включения в исследование
Физикальное обследование
Показатели жизненно важных функций (температура, артериальное давление, частота пульса, частота дыхания и насыщение кислородом по данным пульсоксиметра)
Масса, если пациент амбулаторный
Потребность в кислородной поддержке (л/мин)
FiO2 (оценочный)
Электрокардиограмма в 12 отведениях
Рентгенограмма грудной клетки или компьютерная томография
Мазок из носоглотки или ротоглотки для ПЦР-теста на SARS-CoV-2
Биохимический анализ сыворотки
CRP, D-димер, ЛДГ, ферритин, сердечный тропонин
HbA1c
Общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы
Анализ мочи
Тест сыворотки или мочи на беременность (для женщин детородного возраста) в течение 3 дней до лечения
Оценки в исследовании:
Следующее будет контролироваться и документироваться ежедневно в рамках стандарта медицинской помощи:
Сопутствующие лекарственные препараты
Нежелательные явления
Промежуточное физикальное обследование
Показатели жизненно важных функций (температура, артериальное давление, частота пульса, частота дыхания и насыщение кислородом по данным пульсоксиметра)
Установки расхода кислорода (л/мин)
FiO2 (оценочный или известный, если пациент находится на искусственной вентиляции легких)
Следующие показатели будут контролироваться реже в рамках стандартного лечения и везде, где это возможно:
Для пациентов, одновременно получающих хлорохин/гидроксихлорохин/мефлохин, электрокардиограмма в 12 отведениях (если это разрешено правилами лечения в стационаре в связи с COVID-19) примерно через 3 часа после первого введения исследуемого лекарственного средства в 1-й день, в любое время во 2-й и 4-й дни и снова в конце лечения (либо на 14-й день, либо при досрочном прекращении приема исследуемого лекарственного средства). Если пациенты находятся на мониторинге (включая телеметрию или мониторы Холтера), исследователям рекомендуется собирать данные об интервале QT
Мазок из носоглотки или ротоглотки для ПЦР-теста на SARS-CoV-2 каждые 3 дня
Биохимический анализ сыворотки один раз в неделю
Сывороточный CRP, D-димер, ЛДГ, ферритин, сердечный тропонин один раз в неделю
Общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы один раз в неделю
Рентгенограмма грудной клетки или компьютерная томография по решению врача
Конечные точки исследования:
Первичная
Процент пациентов, которым требуется интубация и искусственная вентиляция легких к 14 дню
Вторичные
1) Процент пациентов с улучшением ≥2 категории по порядковой шкале ВОЗ в отношении клинического улучшения
2) Время до интубации и ИВЛ
3) Время до снижения потока кислорода через назальную канюлю, т.е. от высокого потока кислорода через назальную канюлю или CPAP, если высокий поток кислорода недоступен
4) Процент пациентов, которые больше не получают дополнительный кислород в течение как минимум 24 часов к 14-му дню
5) Общая потребность в кислородной поддержке (площадь под кривой) с использованием суточного дополнительного потока кислорода (л/мин) в течение 14 дней (с 1 по 14 день)
6) Время до двух последовательных отрицательных мазков на SARS-CoV-2 методом ПЦР с интервалом не менее 24 часов
7) Процент пациентов с по меньшей мере чем двумя последовательными отрицательными мазками на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР на 14-й день
8) Процент пациентов с хотя бы одним определением лихорадки на момент включения в исследование (определяется как температура >38,0°C [100,4°F]), у которых нет лихорадки (определяется как температура <37,2°C [99°F]) на 14-й день
9) Смертность по любой причине на 30-й день от момента включения в исследование
Поисковые
Среднее изменение системных маркеров воспаления (D-димер, сердечный тропонин, С-реактивный белок [CRP], прокальцитонин [PCT], лактатдегидрогеназа [ЛДГ] и ферритин) по сравнению с исходным уровнем на 14-й день
Безопасность
1) Частота всех НЯ, возникших в ходе лечения, (НЯВЛ) и СНЯ
2) Оценка показателей жизненно важных функций
3) Оценка лабораторных параметров (биохимия и гематология)
4) Оценка электрокардиограмм (ЭКГ)
Запрещенные лекарственные препараты во время исследования:
Во время исследования, включая 28-дневный период последующего наблюдения, запрещены следующие лекарственные препараты:
Лекарственные, которые чувствительны к субстратам CYP3A4, CYP2C9 или CYP2C19 и имеют узкий терапевтический индекс, запрещены
Сильные индукторы или ингибиторы CYP2D6 и 3A4 запрещены
Варфарин, апиксабан, аргатробан и ривароксабан запрещены из-за лекарственного взаимодействия, основанного на метаболизме CYP450
Правила прекращения лечения:
В любое время в ходе исследования участники прекратят прием исследуемого лекарственного средства, если будет установлено, что они испытали какое-либо из следующих нежелательных явлений (с использованием критериев классификации, определенных в пересмотренной Общей терминологии NCI для нежелательных явлений [CTCAE v.5.0])
Любые нейропсихиатрические нежелательные явления 3 степени тяжести
Галлюцинации любой степени тяжести (любой степени)
Тошнота 3 степени тяжести
Рвота 3 степени тяжести
Повышение креатинина 2 степени тяжести
Статистические методы:
Первичный анализ будет основан на бинарной переменной неудачи (Да/Нет), указывающей, нуждался ли субъект в интубации и искусственной вентиляции легких или умер к 14-му дню исследования.
В редких случаях, когда результат лечения пациента неизвестен (пациент выбыл из-под наблюдения), это также будет учитываться как неэффективность лечения при первичном анализе. Если пациент начинает новую исследуемую терапию COVID-19 в течение 14 дней, это также будет расцениваться при первичном анализе как неэффективность лечения.
Количество и процент субъектов с неудачей будут занесены в таблицу для каждой группы лечения. Для каждой пропорции будет построен 95% доверительный интервал. Критерий Кохрана - Мантеля - Хенселя (CMH) обеспечивает сравнение доли неудач между двумя группами с использованием факторов стратификации исследования, используемых для рандомизации, и соответствующая оценка разницы рисков будет представлена с 95% доверительным интервалом. При необходимости будут использоваться точные доверительные интервалы.
Уровень значимости для этого критерия будет двусторонним 5%. В случае небольшого количества событий (менее 5 событий в любой группе исследования) будет использоваться точный критерий Фишера.
Количество и процент каждого типа неудачи (интубация и искусственная вентиляция легких) будут описаны по группам.
Первичный анализ будет основываться на модифицированной совокупности пациентов с назначенным лечением (mITT), состоящей из всех пациентов, которые были рандомизированы и получали по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства.
Оценка отсутствия целесообразности DSMB
В январе 2021 года независимый комитет по мониторингу данных (DSMB) единогласно рекомендовал продолжить исследование после заранее запланированного обзора отсутствия целесообразности неослепленных данных об эффективности первых 135 пациентов, прошедших лечение в исследовании, и данных о безопасности первых 175 пациентов.
Пример 9: Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы 2/3 опаганиба, ингибитора сфингозинкиназы-2 (SK2) или плацебо для лечения заболевания COVID-19
В этом исследовании будет оцениваться активность опаганиба по сравнению с плацебо для лечения пациентов с COVID-19, которые, по мнению исследователя, не нуждаются в госпитализации.
Первичные цели:
Сравнение опаганиба и плацебо по времени до устойчивого выздоровления от болезни. Пациент считается выздоровевшим, если он соответствует следующим критериям:
1) отсутствие лихорадки (внутренняя температура <38,0°С) не менее 48 часов без применения жаропонижающих средств;
2) все симптомы исчезли или вернулись к уровням, предшествовавшим до заболевания (например, если у пациента до начала заболевания COVID-19 была исходная дыхательная недостаточность), за исключением следующего:
а. утомляемость, аносмия, агевзия или дисгевзия, которые могут сохраняться на уровне, аналогичном таковому при остром заболевании, т. е. на том же уровне согласно симптоматическому опроснику;
b. боль в груди, кашель или одышка, которые, если они постоянны, должны быть по меньшей мере на одну степень ниже, чем в начале лечения, и не хуже, чем степень 1 (легкая).
Устойчивое выздоровление - это восстановление, согласно приведенному выше определению, сохраняющееся в течение по меньшей мере 28 дней или до конца исследования, в зависимости от того, что наступит раньше.
Вторичные цели:
Сравнение между группой активного лечения и плацебо:
1) Доля пациентов с отрицательным результатом согласно анализу методом ПЦР на 8, 15, 29 и 57 день от начала лечения (ориентировочные анализы);
2) время до разрешения отдельных симптомов, связанных с заболеванием, присутствующих на момент включения в исследование;
3) Развитие новых симптомов, связанных с заболеванием, во время исследования;
4) число вновь регистрируемых случаев пневмонии во время исследования среди пациентов без пневмонии на момент включения в исследование (диагностированной клинически);
5) Изменения лабораторных маркеров степени тяжести заболевания, т. е. сатурации, уровня CRP, количества лимфоцитов, уровней сердечного тропонина и D-димера, относительно момента включения в исследование до моментов времени, в которые они измерялись в ходе исследования;
6) Нежелательные явления;
7) Госпитализация в течение 8 недель после получения первой дозы исследуемого лекарственного препарата в целом и по показаниям, связанным с COVID-19;
8) Смертность через 30 дней после первой дозы исследуемого лекарственного препарата;
Поисковые
1) Процент пациентов, сообщающих о бытовых контактах, у которых развился симптоматический, подтвержденный ПЦР COVID-19 к 57-му дню;
2) Уровни сывороточных антител IgM и IgG к SARS-CoV-2 через 57 дней от начала лечения.
Безопасность:
На протяжении всего исследования за пациентами будет осуществляться наблюдение на предмет нежелательных явлений, включая клинические и лабораторные события.
В частности, токсичность, приводящая к снижению дозы или прекращению терапии, будет отслеживаться и заноситься в таблицу.
Популяция:
Критерии включения:
1. Пациенты с симптоматическим, диагностически подтвержденным COVID-19 согласно анализу методом ОТ-ПЦР образца из дыхательных путей.
2. У пациента должны появиться симптомы или положительный результат ОТ-ПЦР в течение 3 дней, в зависимости от того, что больше, после рандомизации.
3. Мужчины и женщины ≥18 лет.
4. На момент включения в исследование перечисленные ниже лабораторные параметры не хуже, чем NCI CTCAE v5.0, класс 2, за исключениями, указанными ниже:
- Билирубин ≤ 1,5 раза выше верхней границы нормы (ВПН; только степень 1)
- АСТ (SGOT), АЛТ (SGPT) ≤ 5,0 x ВПН,
- креатинин сыворотки ≤ 1,5 X ВПН (степень 1)
- Альбумин ≥ 2,0 г/дл
5. Приемлемый гематологический статус:
- Абсолютное количество нейтрофилов ≥1000 клеток/мм3
- Количество тромбоцитов ≥50000 тромбоцитов/мм3
- Гемоглобин ≥ 8,0 г/дл
6. Клинически приемлемый контроль уровня сахара в крови по мнению исследователя.
7. INR и частичное тромбопластиновое время (ЧТВ) ≤ 1,5 X ВГН (т. е. степень 1), если только пациент не принимает дабигатран или гепарин.
8. Сатурация по пульсоксиметру ≥92% в условиях комнатного воздуха
9. Отрицательный тест на беременность (если женщина детородного возраста).
10. Женщины детородного возраста и мужчины с партнершами детородного возраста должны дать согласие на использование приемлемых методов контрацепции во время исследования и в течение по меньшей мере двух месяцев после приема последней дозы исследуемого лекарственного препарата.
11. Возможность самостоятельно заполнять дневник для ежедневного заполнения.
12. Пациент должен дать информированное согласие.
Критерии невключения:
1. Пациент нуждается в неотложной госпитализации по оценке врача.
2. Беременные или кормящие женщины.
3. Нежелание или неспособность соблюдать процедуры, требуемые в этом протоколе.
4. Пациенту требуется кислородная поддержка
5. Пациент в настоящее время получает, получал в течение последних 7 дней или должен получить в ходе исследования ремдесивир, хлорохин, гидроксихлорохин, азитромицин или другую специфическую противовирусную терапию для лечения COVID-19 или системный кортикостероид, эквивалентный ≥ 0,20 мг преднизолона в день /3 мг дексаметазона в день.
6. Пациент в настоящее время получает или получал в течение 30 дней до скрининга любой другой исследуемый агент по любому показанию, включая одобренные препараты, назначаемые по исследовательским показаниям (например, лечение антицитокинами).
7. Пациент в настоящее время принимает или должен начать принимать варафин, апиксабаин (Eliquis) или ривароксабан (Xarelto). Пациенты могут принимать или начинать исследование дабигатрана (Pradaxa), стандартного или низкомолекулярного гепарина.
Дизайн:
Это рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование опаганиба в параллельных группах по сравнению с плацебо у пациентов с симптомами COVID-19, которым не требуется стационарное лечение. Исследование будет включать промежуточный анализ на предмет досрочного прекращения из-за отсутствия целесообразности или увеличения размера выборки, как указано в первоначальных результатах.
Методология:
Часть В: Участники исследования будут получать либо опаганиб по 2 капсулы по 250 мг (500 мг) каждые 12 часов, либо соответствующее плацебо. Пациенты будут стратифицированы по количеству следующих ситуаций (ни одной, одной или более чем одной): возраст ≥65 лет, наличие следующих заболеваний: гипертония, хроническое заболевание легких, ожирение [ИМТ≥30], диабет, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, тромботические явления (в настоящее время или в анамнезе), почечная недостаточность. Пациенты также будут стратифицированы по регионам, в которых они лечатся (США и отличный от США регион). Затем они будут рандомизированы в соотношении 1:1 к активному лекарственному средству или плацебо. Пациенты будут заполнять ежедневные анкеты о симптомах, включая нежелательные явления, показатели жизненно важных функций, включая температуру и пульсоксиметрию, а также журнал принимаемых лекарственных препаратов ежедневно в течение первых 4 недель исследования и три раза в неделю после этого. Мазки на вирус и кровь для лабораторных и фармакодинамических маркеров безопасности будут получены медицинским персоналом при визите на дом. После завершения лечения пациенты будут наблюдаться в течение 57 дней после рандомизации.
Запрещенные лекарственные препараты во время исследования:
Во время исследования, включая 28-дневный период последующего наблюдения, запрещены следующие лекарственные препараты:
Лекарственные, которые чувствительны к субстратам CYP3A4, CYP2C9 или CYP2C19 и имеют узкий терапевтический индекс, запрещены
Сильные индукторы или ингибиторы CYP2D6 и 3A4 запрещены
Варфарин, апиксабан, аргатробан и ривароксабан запрещены из-за лекарственного взаимодействия, основанного на метаболизме CYP450
Пример 10: Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы 2/3 упамостата, ингибитора сериновой протеазы или плацебо для лечения заболевания COVID-19
В этом исследовании будет оцениваться активность упамостата по сравнению с плацебо для лечения пациентов с COVID-19, которые, по мнению исследователя, не нуждаются в госпитализации.
Первичные цели:
Часть A исследования: определение безопасности и переносимости двух уровней доз и решение относительно дозы упамостата для части B. Будут оцениваться изменения в маркерах степени тяжести заболевания, но они не будут основным фактором при принятии решения о том, какую дозу выбрать. Также будет рассчитано время до выздоровления, хотя, учитывая небольшой размер выборки и ожидаемую изменчивость результатов, клинически значимая разница может быть не видна.
Часть B исследования: сравнение упамостата и плацебо по времени до устойчивого выздоровления от болезни. Пациент считается выздоровевшим, если он соответствует следующим критериям:
1) отсутствие лихорадки (внутренняя температура <38,0°С) не менее 48 часов без применения жаропонижающих средств;
2) все симптомы исчезли или вернулись к уровням, предшествовавшим до заболевания (например, если у пациента до начала заболевания COVID-19 была исходная дыхательная недостаточность), за исключением следующего:
c. утомляемость, аносмия, агевзия или дисгевзия, которые могут сохраняться на уровне, аналогичном таковому при остром заболевании, т. е. на том же уровне согласно симптоматическому опроснику;
d. боль в груди, кашель или одышка, которые, если они постоянны, должны быть по меньшей мере на одну степень ниже, чем в начале лечения, и не хуже, чем степень 1 (легкая).
Устойчивое выздоровление - это восстановление, согласно приведенному выше определению, сохраняющееся в течение по меньшей мере 28 дней или до конца исследования, в зависимости от того, что наступит раньше.
Вторичные цели:
Сравнение между группой активного лечения и плацебо:
1) Доля пациентов с отрицательным результатом согласно анализу методом ПЦР на 8, 15, 29 и 57 день от начала лечения (ориентировочные анализы);
2) время до разрешения отдельных симптомов, связанных с заболеванием, присутствующих на момент включения в исследование;
3) Развитие новых симптомов, связанных с заболеванием, во время исследования;
4) число вновь регистрируемых случаев пневмонии во время исследования среди пациентов без пневмонии на момент включения в исследование (диагностированной клинически);
5) Изменения лабораторных маркеров степени тяжести заболевания, т. е. сатурации, уровня CRP, количества лимфоцитов, уровней сердечного тропонина и D-димера, относительно момента включения в исследование до моментов времени, в которые они измерялись в ходе исследования;
6) Нежелательные явления;
7) Госпитализация в течение 8 недель после первой дозы исследуемого лекарственного препарата, в целом и по показаниям, связанным с COVID-19;
8) Смертность через 30 дней после первой дозы исследуемого лекарственного препарата;
Поисковые
1) Процент пациентов, сообщающих о бытовых контактах, у которых развился симптоматический, подтвержденный ПЦР COVID-19 к 57-му дню;
2) Уровни сывороточных антител IgM и IgG к SARS-CoV-2 через 57 дней от начала лечения.
Безопасность:
На протяжении всего исследования за пациентами будет осуществляться наблюдение на предмет нежелательных явлений, включая клинические и лабораторные события.
В частности, токсичность, приводящая к снижению дозы или прекращению терапии, будет отслеживаться и заноситься в таблицу.
Популяция:
Критерии включения:
1. Пациенты с симптоматическим, диагностически подтвержденным COVID-19 согласно анализу методом ОТ-ПЦР образца из дыхательных путей.
2. У пациента должны появиться симптомы или положительный результат ОТ-ПЦР в течение 3 дней, в зависимости от того, что больше, после рандомизации.
3. Мужчины и женщины ≥18 лет.
4. На момент включения в исследование перечисленные ниже лабораторные параметры не хуже, чем NCI CTCAE v5.0, класс 2, за исключениями, указанными ниже:
- Билирубин ≤ 1,5 раза выше верхней границы нормы (ВПН; только степень 1)
- АСТ (SGOT), АЛТ (SGPT) ≤ 5,0 x ВПН,
- креатинин сыворотки ≤ 1,5 X ВПН (степень 1)
- Альбумин ≥ 2,0 г/дл
5. Приемлемый гематологический статус:
- Абсолютное количество нейтрофилов ≥1000 клеток/мм3
- Количество тромбоцитов ≥50000 тромбоцитов/мм3
- Гемоглобин ≥ 8,0 г/дл
6. Клинически приемлемый контроль уровня сахара в крови по мнению исследователя.
7. INR и частичное тромбопластиновое время (ЧТВ) ≤ 1,5 X ВГН (т. е. степень 1), если только пациент не принимает дабигатран или гепарин.
8. Сатурация по пульсоксиметру ≥92% в условиях комнатного воздуха
9. Отрицательный тест на беременность (если женщина детородного возраста).
10. Женщины детородного возраста и мужчины с партнершами детородного возраста должны дать согласие на использование приемлемых методов контрацепции во время исследования и в течение по меньшей мере двух месяцев после приема последней дозы исследуемого лекарственного препарата.
11. Возможность самостоятельно заполнять дневник для ежедневного заполнения.
12. Пациент должен дать информированное согласие.
Критерии невключения:
1. Пациент нуждается в неотложной госпитализации по оценке врача.
2. Беременные или кормящие женщины.
3. Нежелание или неспособность соблюдать процедуры, требуемые в этом протоколе.
4. Пациенту требуется кислородная поддержка
5. Пациент в настоящее время получает, получал в течение последних 7 дней или должен получить в ходе исследования ремдесивир, хлорохин, гидроксихлорохин, азитромицин или другую специфическую противовирусную терапию для лечения COVID-19 или системный кортикостероид, эквивалентный ≥ 0,20 мг преднизолона в день /3 мг дексаметазона в день.
6. Пациент в настоящее время получает или получал в течение 30 дней до скрининга любой другой исследуемый агент по любому показанию, включая одобренные препараты, назначаемые по исследовательским показаниям (например, лечение антицитокинами).
7. Пациент в настоящее время принимает или должен начать принимать варафин, апиксабаин (Eliquis) или ривароксабан (Xarelto). Пациенты могут принимать или начинать исследование дабигатрана (Pradaxa), стандартного или низкомолекулярного гепарина.
Дизайн:
Это рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование упамостата в параллельных группах по сравнению с плацебо у пациентов с симптомами COVID-19, которым не требуется стационарное лечение. В исследовании будет использоваться методология c беспрерывным переходом между фазами 2/3 для выбора дозы (часть A) и независимое подтверждающее исследование фазы 3 (часть B). Фаза 3 будет включать промежуточный анализ на предмет досрочного прекращения на предмет отсутствия целесообразности или увеличения размера выборки, как указано в первоначальных результатах.
Методология:
Часть А: После квалификации для участия в исследовании пациенты будут стратифицированы по возрасту: <65 или ≥65 лет. Затем они будут рандомизированы 1:1:1 в одну из следующих групп лечения:
1. Упамостат 200 мг по две капсулы 1 раз в день (n=20);
2. Упамостат 200 мг по одной капсуле и соответствующее плацебо по одной капсуле 1 раз в день (n=20)
3. Плацебо по две капсулы один раз в день (n=20).
Чтобы сохранить ослепление, пациентам будут давать два флакона с лекарственным препаратом и будут инструктировать принимать по одной таблетке из каждого флакона каждый день. Обе таблетки следует принимать одновременно.
Лекарственный препарат следует принимать с водой и независимо от приема пищи.
Пациенты должны принимать лекарства в течение 14 дней или до тех пор, пока не произойдет одно из следующих событий:
Нежелательные явления, связанные или не связанные с исследуемым лекарственным препаратом, которые, по мнению исследователя, требуют прекращения лечения;
Пациент или исследователь решают, что в интересах пациента прекратить лечение.
Промежуточный анализ будет выполнен независимым комитетом по мониторингу данных (DSMB) после того, как 60 пациентов завершат часть A.
Если DSMB определит, что безопасность обеих схем одинакова, то для дозы 400 мг один раз/день продолжится набор участников в часть B.
Если безопасность более благоприятна при схеме 200 мг один раз в день, то для дозы 200 мг один раз/день продолжится набор участников в часть B.
Часть В: На основании результатов по безопасности, полученных в части А, будет выбрана схема лечения 200 мг или 400 мг (т. е. одна или две капсулы по 200 мг). Пациенты, включенные в часть В, будут стратифицированы по количеству следующих ситуаций (ни одной, одной или более чем одной): возраст ≥65 лет, наличие следующих заболеваний: гипертония, хроническое заболевание легких, ожирение [ИМТ≥30], диабет, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, тромботические явления (в настоящее время или в анамнезе), почечная недостаточность. Пациенты также будут стратифицированы по регионам, в которых они лечатся (США и отличный от США регион). Затем они будут рандомизированы в соотношении 3:2 к активному лекарственному средству или плацебо по графику, выбранному на основе части А. Всего в часть В исследования будет включено примерно 250 дополнительных пациентов, 150 из которых будут получать активное лекарственное средство, а 100 - плацебо. Таким образом, объединяя обе части исследования, в общей сложности 170 пациентов получат активное лекарственное средство в дозе, выбранной в части А, а 120 получат плацебо. Однако анализы будут выполняться независимо для частей A и B.
Пациенты будут заполнять ежедневные анкеты о симптомах, включая нежелательные явления, показатели жизненно важных функций, включая температуру и пульсоксиметрию, а также журнал принимаемых лекарственных препаратов ежедневно в течение первых 4 недель исследования и три раза в неделю после этого. Мазки на вирус и кровь для лабораторных и фармакодинамических маркеров безопасности будут получены медицинским персоналом при визите на дом. После завершения лечения пациенты будут наблюдаться в течение 57 дней после рандомизации.
Статистика:
В части А этого исследования будут проверены два уровня доз активного лекарственного средства и плацебо. На основании частоты и тяжести токсичности в каждой активной группе, общей оценки безопасности DSMB будет выбран режим для части B исследования. При отсутствии заметных различий в токсичности между двумя группами, получающими активное лекарственное средство, выбором по умолчанию для продолжения лечения в части В будет схема 400 мг в день.
Данные об эффективности частей A и B будут проанализированы отдельно.
Общий размер выборки может быть увеличен на основе промежуточных результатов исследования.
Размер выборки определялся на основе первичной конечной точки, времени до устойчивого выздоровления от болезни COVID-19, как определено в первичной цели. Было подсчитано, что для определения отношения рисков=1,5 при сравнении активной группы с группой плацебо с соотношением распределения 3:2 требуется в общей сложности 201 событие выздоровления, чтобы обеспечить 80% мощности с использованием логарифмического рангового теста при двустороннем уровне значимости 0,05. Предполагая 80% устойчивое выздоровление к концу периода наблюдения (при одинаковом периоде наблюдения для всех включенных в исследование пациентов), минимальное количество пациентов, включенных в часть B, составит всего 250 человек, 150 человек в группе, получающей активное лекарственное средство по схеме, принятой в части В исследования, и 100 в группе плацебо.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Настоящее изобретение относится к агенту против коронавируса, содержащему в качестве активного ингредиента соединение, представленное:
,
в виде свободного основания или в виде его соли, агенту против SARS, включающему агент против коронавируса, и способу лечения SARS с применением агента против коронавируса. Настоящее изобретение позволяет лечить заболевания, вызванные коронавирусами, особенно коронавирусом, ассоциированным с SARS.
Настоящее изобретение относится к агенту против коронавируса, содержащему в качестве активного ингредиента соединение, представленное:
,
в виде (L)- или (D)-энантиомеров и в виде E- или (Z)-изомеров или (E/Z)-смесей, а также в виде свободных оснований или в виде их солей, агенту против SARS, включающему агент против коронавируса, и способу лечения SARS с применением агента против коронавируса. Настоящее изобретение позволяет лечить заболевания, вызванные коронавирусами, особенно коронавирусом, ассоциированным с SARS.
Все патенты, патентные заявки и опубликованные ссылки, цитируемые в данном документе, полностью включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных композиций и способов изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области молекулярной биологии, медицины, иммунологии, фармакологии, вирусологии или смежных областей, входят в объем изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ КОРОНАВИРУСНОЙ И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ | 2022 |
|
RU2794315C1 |
| МЕФЛОХИН И ЕГО КОМБИНАЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ | 2020 |
|
RU2763024C1 |
| Способ лечения коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 | 2021 |
|
RU2775966C1 |
| СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ КОРОНАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ | 2021 |
|
RU2825648C1 |
| ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ПРОТИВ КОРОНАВИРУСА, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ЭКСТРАКТ ELAEOCARPUS SYLVESTRIS | 2021 |
|
RU2780346C1 |
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ COVID-19 С ПОМОЩЬЮ ПРИМЕНЕНИЯ АГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРА OX40 (CD134) | 2020 |
|
RU2826983C2 |
| ФИЛЛИРИН И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ БЕЛКА 3CLPRO И БОРЬБЫ С ВИРУСОМ COVID-19 | 2021 |
|
RU2804307C1 |
| Средство для снижения риска и облегчения симптомов заражения бета-коронавирусной инфекцией | 2021 |
|
RU2747890C1 |
| СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ КОРОНАВИРУСОМ | 2021 |
|
RU2772701C1 |
| Пептиды с противовирусной активностью | 2024 |
|
RU2834861C1 |
Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и раскрывает способ лечения коронавирусного заболевания, в том числе вызванного SARS-CoV-2, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ABC294640 в виде свободного основания или в виде его соли. Использование изобретения позволяет эффективно лечить коронавирусные заболевания. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 10 пр.
1. Способ лечения коронавирусного заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коронавирусное заболевание представляет собой коронавирусное заболевание 2019 года (COVID-19), вызванное вирусом SARS-cov-2.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида.
4. Способ по п. 1, причем ABC294640 находится в стандартной дозированной форме, подходящей для перорального введения, вместе с фармацевтически приемлемым материалом-носителем.
5. Способ по п. 3, причем гидрохлорид ABC294640 находится в стандартной дозированной форме, подходящей для перорального введения, вместе с фармацевтически приемлемым материалом-носителем.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что дозированная форма представляет собой твердую дозированную форму.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что дозированная форма представляет собой твердую дозированную форму.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что твердая дозированная форма представляет собой капсулу.
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что твердая дозированная форма представляет собой капсулу.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вирус SARS-cov-2 является вирусом дикого типа.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вирус SARS-cov-2 представляет собой встречающийся в природе вариант коронавируса.
12. Способ по п. 3, отличающийся тем, что вирус SARS-cov-2 является вирусом дикого типа.
13. Способ по п. 3, отличающийся тем, что вирус SARS-cov-2 представляет собой встречающийся в природе вариант коронавируса.
14. Способ по п. 5, отличающийся тем, что стандартная дозированная форма, подходящая для перорального введения, представляет собой капсулу, содержащую 250 мг гидрохлорида ABC294640, и где введение включает введение двух капсул два раза в день в течение по меньшей мере 10 дней до общей суточной дозы 1000 мг гидрохлорида ABC294640.
15. Способ по п. 3, включающий введение гидрохлорида ABC294640 вместе с фармацевтически приемлемым материалом-носителем, причем фармацевтически приемлемый материал-носитель представляет собой буферный физиологический раствор.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что получают суспензию, которая включает гидрохлорид ABC294640, суспендированный в физиологическом буферном растворе, и при этом введение включает использование зонда для доставки суспензии непосредственно в желудок.
17. Применение ABC294640,
,
в виде свободного основания или в виде его соли для лечения коронавирусного заболевания.
18. Применение по п. 17, отличающееся тем, что коронавирусное заболевание представляет собой коронавирусное заболевание 2019 года (COVID-19), вызванное вирусом SARS-cov-2.
19. Применение по п. 17, отличающееся тем, что ABC294640 присутствует в виде гидрохлорида.
20. Применение по п. 17, отличающееся тем, что вирус SARS-cov-2 представляет собой встречающийся в природе вариант коронавируса.
21. Применение по п. 17, отличающееся тем, что вирус SARS-cov-2 является вирусом дикого типа.
| Hoffmann, Markus et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Cell vol | |||
| Водяные лыжи | 1919 |
|
SU181A1 |
| Xia, Chuan et al | |||
| Transient inhibition of sphingosine kinases confers protection to influenza A virus infected mice | |||
| Antiviral research, vol | |||
| Система механической тяги | 1919 |
|
SU158A1 |
| Dong, Liying et | |||
