СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РНК В СОСТАВЕ РНК-СОДЕРЖАЩЕГО КОМПОНЕНТА БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2004 года по МПК G01N21/59 C07H21/02 A61K31/7105 

Изобретение относится к медицине, медицинской и пищевой промышленности, а именно к методам определения содержания нуклеиновых кислот и нуклеотидов в лекарственных биологических препаратах, биологически активных добавках (БАД) к питанию и пищевых модулях.

Количественное определение нуклеиновых кислот и их производных в поликомпонентных биосистемах, которые все шире используются в качестве биологически активных ингредиентов лекарственных препаратов и БАД, является важной задачей не только научно-исследовательских лабораторий, но также биотехнологии, пищевой и фармацевтической промышленности.

Известен способ определения рибонуклеиновой кислоты (РНК) в растворах - "орциновый" метод [Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс, Мир, (пер. с англ.), 1991, с.467], заключающийся в том, что вначале проводят гидролиз РНК концентрированной соляной кислотой на кипящей водяной бане в течение 25 мин в присутствии смеси реагентов, проявляющих РНК (водных растворов орцина и FеСl₃•6Н₂O), после чего раствор охлаждают и спектрофотометрически определяют его оптическую плотность в УФ-спектре при λ 660 нм. Рабочий диапазон методики 0-200 мкг РНК.

Недостатком метода является его определенная сложность, необходимость специальных условий для проведения кислотного гидролиза при высокой температуре, использование концентрированной соляной кислоты.

Известно, что существующие спектрофотометрические методы непосредственного определения нуклеиновых кислот основаны на измерении специфического поглощения ими УФ-лучей за счет содержащихся в их составе азотистых соединений. Нуклеиновые кислоты и их производные не экстрагируются водой, и для их растворения применяют различные солевые растворы, в которых растворяются также белки, поэтому обычно требуются дополнительные этапы для их депротеинизации.

В качестве ближайшего аналога по технической сущности принята модификация спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот в животных тканях, предложенная А.А. Спириным [Практикум по биохимии / под ред. Н.П. Мешковой и С.Е. Северина, "Московский Университет", 1979, с.158]. В основе метода лежит экстракция нуклеиновых кислот из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 нм и 290 нм. Измельченную на холоду навеску ткани помещают в центрифужную пробирку с охлажденным раствором хлорной кислоты; после перемешивания осадок отделяют центрифугированием при 3000 g 10 мин. Осадок повторно обрабатывают хлорной кислотой в пробирках с воздушным холодильником при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Гидролизаты охлаждают, центрифугируют и проводят спектрофотометрическое определение фосфора нуклеиновых кислот (Ф_н):
С_мкг,Фн=(D₂₇₀-D₂₉₀)/0,19 (1)
Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются пересчетным коэффициентом 10.3:
C_мкг,Нк=С_мкг,Фн•10,3 (2)
Однако известный способ является трудоемким, многостадийным, требует специального оборудования и непригоден для количественного определения РНК в биопрепаратах и композициях с относительно высоким содержанием белков и/или живых микроорганизмов.

Задачей изобретения является создание простого и доступного способа определения количества РНК в РНК-содержащем компоненте биологических бактерийных препаратов, а также других поликомпонентных биологических систем и материалов, содержащих белки и/или живые клетки.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе количественного определения РНК в составе РНК-содержащего компонента биологического препарата, включающем перевод РНК в раствор и измерение оптической плотности полученного раствора, испытуемый препарат обрабатывают 0,4 М раствором сульфата аммония, выдерживают 5-20 мин при комнатной температуре, при необходимости центрифугируют, измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 260 нм и рассчитывают количество РНК по разности оптической плотности в опытном и контрольном образце, который содержит все компоненты, кроме определяемого.

Отличительной особенностью является использование в качестве растворителя 0,4 М водного раствора сульфата аммония (NH₄)₂SO₄.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат:
Впервые разработан метод, позволяющий быстро, одноэтапно, без предварительного разделения проводить количественное определение РНК в РНК-содержащем компоненте поликомпонентных биологических систем, например в комбинированных биопрепаратах пробиотиков и монопрепаратах, содержащих соли рибонуклеиновых кислот.

Предложенный метод не уступает известным по точности определения нуклеиновых кислот, прост в исполнении, не требует специальной подготовки, исключает работу с концентрированными кислотами и нагревание, позволяет проводить измерение при длинах волн, доступных для любых УФ-спектрофотометров.

Способ может быть использован в любой лаборатории и на производстве для количественного определения РНК и ее солей в РНК-содержащих биопрепаратах и других биологических системах.

Технический результат достигается за счет подбора растворителя (0,4 М водного раствора сульфата аммония), который способствует переходу нуклеиновых кислот, содержащихся в поликомпонентных системах, из связанного состояния в раствор.

Способ осуществляется следующим образом.

К образцу исследуемого сухого вещества (точная навеска 5-500 мг) или жидкости (1-10 мл) добавляют до 100 мл 0,4 М раствор сульфата аммония и оставляют на 5-20 мин при комнатной температуре, затем содержимое тщательно перемешивают и используют в качестве исходного раствора. При необходимости проводят центрифугирование проб при 3000 об/мин в течение 10-15 мин и используют надосадочную жидкость как исходный раствор. Из исходного раствора делают рабочие растворы в разведении 1:10; 1:50; 1:100; 1:1000 в зависимости от предполагаемого или расчетного содержания РНК и/или ее солей. В рабочих растворах определяют концентрацию РНК, измеряя оптическую плотность в УФ-спектре при длине волны λ 260 нм.

Рассчитывают суммарное содержание РНК в опытном образце (препарате) по формуле:
SN=D•E*•Р•V, (3)
где SN - суммарное содержание РНК в образце, мг;
D - оптическая плотность рабочего раствора, усл.ед.;
Р - кратность разведения исходного раствора при приготовлении рабочего раствора;
V - объем исходного раствора препарата, мл;
Е* - коэффициент экстинкции РНК или ее соли (коэффициент поглощения при концентрации 1 мг/мл).

Для стандартной РНК Е=24,0 [Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс, Мир, (пер. с англ.), 1991, с.467].

В поликомпонентных биосистемах содержание нуклеиновых кислот в пробе (SN) складывается из внесенного РНК-содержащего компонента, а также свободных нуклеиновых кислот, содержащихся в биологическом материале. Количество внесенной РНК рассчитывают по разности оптической плотности в опытном и контрольном образце, содержащем все компоненты, кроме определяемого. Расчет производят по формуле:
S_x=SN-S_к (4)
где S_x - содержание внесенного РНК-содержащего компонента в опытном образце, мг;
SN - суммарное содержание РНК в образце, мг;
S_К - содержание РНК-содержащих веществ в контрольном образце, мг.

Пример 1. Определение натрия нуклеината в официальном препарате.

Натрия нуклеинат (ФС 42-1781-97) представляет собой натриевую соль РНК, получаемую из пекарских дрожжей путем гидролиза с последующей очисткой. Препарат характеризуется высокой степенью чистоты, не содержит аминосахаров и полисахаридов, имеет примесь около 1,5-1,6% белка и 2% ДНК, в связи с чем его количественное определение можно проводить по содержанию РНК. Авторами установлено, что для раствора натрия нуклеината 1 мг/мл коэффициент экстинкции Е составляет 22, т.е. близок к показателю для чистой РНК.

Для определения навеску препарата 5 мг растворяли в 100 мл 0,4 М раствора сульфата аммония, выдерживали при комнатной температуре 5 мин, затем разбавляли аналогичным растворителем 1: 10 и получали рабочий раствор для исследования. Оптическая плотность раствора в УФ-спектре при λ 260 нм составила 0,11.

Подставляя значения в формулу (3), получили содержание натрия нуклеината в исследуемой навеске препарата:
D=0,11; E=22; Р=10; V=100 мл.

SN_HH=D:Е_НН • Р • V=0,11:22 • 10 • 100=5 мг.

Это является подтверждением того, что растворение натрия нуклеината в 0,4 М растворе сульфата аммония не искажает результаты определения РНК.

Пример 2. Определение содержания натрия нуклеината в пищевом модуле.

Пищевой модуль для обогащения лечебно-диетического питания имеет в своем составе лизоцим и натрия нуклеинат в соотношении 1:1. Для определения содержания натрия нуклеината точную навеску (10,0 мг) порошка пищевого модуля растворяли в 100 мл 0,4 М раствора сульфата аммония, инкубировали 15 мин при комнатной температуре, после чего исходный раствор препарата разводили в 10 раз аналогичным раствором и определяли оптическую плотность полученного рабочего раствора, которая при исследовании в УФ-спектре при длине волны λ 260 нм составила 0,11. Величина Е_НН, как указывалось в примере 1, равна 22.

При расчетах по формуле (3) исходили из следующих данных:
D=0,11; Е_НН=22; Р=10; V=100 мл.

SN_НН=D: Е_НН • Р • V=0,11:22 • 10 • 100=5,0 (мг), что соответствует количеству натрия нуклеината, внесенному при выработке модуля.

Контрольный образец готовили следующим образом: 5 мг лизоцима растворяли в 100 мл 0,4 М раствора сульфата аммония, проводили вышеописанные операции и определяли оптическую плотность полученного раствора. Средняя величина оптической плотности не превышала 0,003. Это доказывает, что белок в раствор не переходит и присутствие белка (лизоцим) не влияет на точность определения РНК.

Пример 3. Определение содержания натрия нуклеината в суспензии.

Для экспериментальных исследований приготовлено 10 мл водной суспензии, в составе которой 10 мг натрия нуклеината, 350 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 20 мг адсорбента (силиконизированные стеклянные шарики с удельной поверхностью 152 см²/г).

При разбавлении суспензии водой до общего объема 100 мл РНК (натрия нуклеинат) спектрофотометрически не обнаруживается, т.е. не элюируется в водную фазу: D_cуcп=0,002; D_контр=0,0018; D_cусп-D_контр=0,0002.

К 10 мл исследуемой суспензии добавляли до 100 мл 0,4 М раствор сульфата аммония, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин., затем разбавляли исходный раствор в 10 раз (рабочий раствор), анализировали его, как указано в примере 1, и проводили расчет при D_cуcп=0,22; E_НН=22; Р=10; V= 100 мл.

SN_НН= D_cуcп: Е_НН • Р • V=0,22:22 • 10 • 100=10,0 (мг), что соответствует внесенному количеству натрия нуклеината.

Оптическая плотность контроля (10 мл водной суспензии, содержащей 350 мг БСА и 20 мг указанного адсорбента) не превышала 0,0025 усл.ед.

Пример 4. Определение количества РНК в препарате Бифилиз.

Бифилиз сухой представляет собой лиофилизированный биопрепарат, содержащий лизоцим и биомассу живых бифидобактерий в среде культивирования с добавлением сахарозо-желатино-молочной среды (патент РФ 20711339). Препарат выпускается в герметичных стеклянных флаконах по 5 доз для перорального применения.

Во флакон с препаратом вносили 10 мл 0,4 М раствора сульфата аммония, инкубировали 10 мин при комнатной температуре, после чего полученную взвесь переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, в которую добавляли до метки аналогичный раствор сульфата аммония, включая порции, полученные после трехкратного отмывания остатков препарата из флакона, перемешивали и оставляли еще на 10 мин в тех же условиях. Полученный исходный раствор препарата тщательно перемешивали, разводили в 10 раз 0,4 М раствором сульфата аммония и определяли оптическую плотность этого рабочего раствора в УФ-спектре при длине волны λ 260 нм. Оптическая плотность составила 0,50 усл.ед.

Расчет проводили по формуле (3), исходя из следующих данных:
D_БФ=0,50; Е_РНК=24; Р=10; V=100 мл.

SN_БФ=D_БФ: Е_РНК • Р • V=0,50:24 • 10 • 100=20,8 (мг).

Таким образом, во флаконе (5 дозах) биопрепарата Бифилиз количество РНК, обусловленное присутствием бактериальной массы, питательной и стабилизирующей сред, составляет 20,8 мг, т.е. в одной дозе препарата - 4,16 мг.

Пример 5. Определение содержания натрия нуклеината в препарате "Нуклибиф".

Нуклибиф - лиофилизированный биопрепарат, представляющий собой собой сочетание бифилиза (пример 4) и натрия нуклеината. Во флаконе 5 доз препарата с содержанием в одной дозе 10^7-8 КОЕ живых бифидобактерий, 10 мг лизоцима и 10 мг натрия нуклеината.

При определении содержания нуклеината натрия в нуклибифе первым этапом явилось определение в препарате суммарного содержания РНК (SN_НБФ). Содержимое флакона растворяли в 100 мл 0,4 М раствора сульфата аммония, приготовив исходный раствор, как указано в примере 4. Для получения рабочего раствора исходный раствор оставляли на 10 мин при комнатной температуре, тщательно перемешивали, разбавляли раствором сульфата аммония из расчета 1:10 и измеряли оптическую плотность раствора, которая при λ 260 нм составила 1,55 усл. ед. Учитывая, что внесенным РНК-содержащим компонентом в нуклибифе является натрия нуклеинат, при расчете использовали значение Е для этого препарата. Расчет проводили по формуле (3) при следующих условиях:
D_НБФ=1,55; Е_НН=22; Р=10, V=100 мл.

SN_НБФ=D_НБФ: Е_НН • Р • V=1,55:22 • 10 • 100=70,45 мг.

На втором этапе количественного определения натрия нуклеината в нуклибифе проводили определение содержания РНК в бифилизе (SN_БФ), как указано в примере 4. SN_БФ=20,83 мг.

На третьем этапе проводили расчет содержания натрия нуклеината (S_НН) в нуклибифе по формуле (4):
S_HH=SN_НБФ-SN_БФ=70,45-20,83=49,62 мг.

Таким образом, в образце нуклибифа, содержащего 5 доз препарата, количество натрия нуклеината составило 49,62 мг. Следовательно, в одной дозе нуклибифа содержание натрия нуклеината составило 9,92 мг, т.е. разница между реальным и внесенным количеством этого компонента составила 0,8%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание натрия нуклеината в препарате нуклибиф, определяемое предлагаемым методом, соответствует внесенному количеству этого биологически активного компонента. Результаты повторных определений этого показателя в нескольких сериях препарата показали, что ошибка метода не превышает 5%.

Способ прошел лабораторные испытания в проблемной научно-исследовательской лаборатории медицинской цитологии Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ при контроле образцов лабораторных и экспериментально-производственных партий Нуклибифа и промышленных серий Бифилиза, изготовленных ООО Фирмой "Фермент" и АОЗТ "Биомед" им. И.И. Мечникова, натрия нуклеината производства 000 "Биосинтез" (г. Пенза) и экспериментально-производственных образцов пищевого модуля, выработанного в ГНУ НИИ детского питания РАСХН.

Исследовано: 5 серий нуклибифа, 3 серии натрия нуклеината,
5 серий бифилиза, 3 партии образцов пищевого модуля.

Установлена высокая достоверность и воспроизводимость метода.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в фармацевтической, медико-биологической и пищевой промышленности для контроля количества РНК и ее солей в производственных сериях РНК-содержащих препаратов. Предложен способ количественного определения РНК в составе поликомпонентного препарата, предусматривающий его обработку 0,4 М раствором сульфата аммония при комнатной температуре в течение 5-20 мин, при необходимости осветление полученного раствора центрифугированием, измерение его оптической плотности при 260 нм и расчет содержания РНК в испытуемом препарате по разности значений оптической плотности в опытном и контрольном образце, включающем все компоненты, кроме определяемого. Применение данного способа обеспечивает возможность быстрого и достаточно точного определения количества РНК в бактериальных препаратах и других поликомпонентных биологических системах и материалах, содержащих белки и/или живые клетки.

Способ количественного определения РНК в составе РНК-содержащего компонента биологического препарата, включающий перевод РНК в раствор и измерение оптической плотности полученного раствора, отличающийся тем, что испытуемый препарат обрабатывают 0,4 М раствором сульфата аммония, выдерживают 5-20 мин при комнатной температуре, при необходимости центрифугируют, измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 260 нм и рассчитывают количество РНК по разности оптической плотности в опытном и контрольном образце, который содержит все компоненты, кроме определяемого.