СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ РЕАКЦИИ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУНИТЕТА У ПРИВИТЫХ ПРОТИВ ЧУМЫ ЛЮДЕЙ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОМЕТРИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к иммунологии и предназначено для регистрации реакции антиген-антитело у привитых против чумы людей с помощью технологии проточной цитометрии.

К настоящему времени в серологической диагностике используются различные способы детекции специфических антител в исследуемом материале (чаще сыворотке крови), основанные на классических методах твердофазного иммуноферментного (ТИФА), иммунофлуоресцентного (МФА) или иммунохроматографического (ИХА) анализов.

Большинство серологических тестов традиционно базируется на использовании стандартизированных антигенных диагностикумов, сорбированных на различных подложках - стеклянных пластинках, полистирольных плашках, нитроцеллюлозных мембранах и т.д. Заявленный в заявке на патент RU 2010119821 (Опубл. 27.11.2011, Бюл. №33) «Способ оценки иммунного статуса человека по определению естественных антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа» предполагает проведение ТИФА по традиционной схеме с использованием антивидовых антител, меченных ферментом. Аналогичный способ детекции антител с использования ТИФА описан в патенте RU 2465601 (Опубл. 27.10.2012, Бюл. №30) «Способ количественного определения уровня естественных аутоантител в биологических жидкостях человека». В патенте RU 2300769 (Опубл. 10.06.2007, Бюл. №16) «Способ одновременного обнаружения антигенов и антител против инфекционного микроорганизма» для детекции иммунных комплексов с использованием меченых детектирующих антител, и/или меченых детектирующих антигенов используется ИФА. Одним из вариантов ИФА является клеточный иммуноферментный анализ, лежащий в основе способа определения продукции антител на поверхности лимфоцитов, описанного в патенте RU 2021616 «Способ определения антител».

Высокопроизводительным и экспрессным методом серодиагностики является ИХА, эффективно используемый при проведении массового скрининга специфических антител в сыворотке крови у вакцинированных людей. Для детекции иммунных комплексов при серодиагностике с использованием ИХА наиболее часто используют конъюгат коллоидного золота с антигеном, а в аналитической зоне тест-полосок иммобилизуется реагент для связывания антивидовых антител (патент RU 2545909 (Опубл. 10.04.2015, Бюл. №10) «Способ определения специфических антител»).

К недостаткам выше приведенных классических методов детекции иммунных комплексов можно отнести необходимость использования дорогостоящих видоспецифичных вторичных антител и ферментов, а также многоэтапность выполнения анализов.

Востребованным инструментарием визуализации иммунных комплексов являются биологические микрочипы, технология которых позволяет анализировать множество параметров одновременно с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью. (Assis R 2021; Уткин Д.В., 2019). В патенте RU 2796820 (Опубл. 29.05.2023, Бюл. №16) «Способ детекции чумного микроба и набор реагентов для его осуществления» предложен набор реагентов, включающий в себя иммуномагнитные частицы - конъюгаты моноклональных антител к поверхностным антигенам Y. pestis. Способ предполагает осуществление магнитоуправляемой сепарации бактериальных клеток и определение их видовой принадлежности методом петлевой изотермической амплификации. Заявленное изобретение позволяет с высокой специфичностью детектировать наличие возбудителя чумы, но отличается трудоемкостью и многоэтапностью.

Еще одним методом детекции и высокоточной характеристики иммунных комплексов является фотонная корреляционная спектроскопия, или динамическое рассеяние света. Метод основан на измерения размеров наночастиц и использовался при разработке описанных в патенте RU 2634861 (Опубл. 07.11.2017, Бюл. №31) способов определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости и их применение при терапии и диагностике. Представленная методика отличается высокой точностью, однако предполагает многоэтапность выполнения исследования, а также подбор и стандартизацию параметров измерения.

В качестве альтернативного метода для определения специфических антител в сыворотке крови предложено использовать иммунофлуоресцентое окрашивание с последующей регистрацией иммунных комплексов на проточном цитометре (FC). Данная технология отличается высокой скоростью выполнения анализа, возможностью определения параметров любых клеток и клеточных структур в одном образце, а также высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции) (Битанова Э.Ж., Тарабаева А.С. Проточная цитометрия - преимущества метода и области применения // Вестник КазНМУ №4-2017. Стр. 465-467). В патенте RU 2488114 (Опубл. 20.07.2013, Бюл. №20) «Способ определения аутоантител к тромбоцитам» с помощью технологии проточной цитометрии осуществляется детекция и определение процентного содержания иммуноглобулинов G и М на поверхности тромбоцитов. Заявленный способ позволяет повысить точность диагностики иммунной тромбоцитопении, однако его использование предполагает обязательное использование дорогостоящих моноклональных антител.

Разработаны методы детекции специфических антител в сыворотках крови с использованием культур клеток, временно или стабильно трансфицированных векторами, кодирующим целевой антиген. (Emmerich Р2021; Grzelak 2020; Homdler L 2021: Lapuente 2020). Преимуществом данных способов обнаружения сывороточных антител является отсутствие этапов выделения, очистки и стандартизации антигенов и быстрота выполнения анализа с использованием цитометрической техгологии, однако для стабильной экспрессии целевых белков используются дорогостоящие клеточные линии, требующие особых условий для культивирования, что увеличивает стоимость и трудоемкость и проведения анализа. Проточная цитометрия также применяется на этапе контроля уровня антирабических иммуноглобулинов при производстве иммунобиологических антирабических препаратов (Генералов С.В., Кравцов А.Л., Кожевников В.А., Гаврилова Ю.К., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К. Проточная цитометрия при анализе вируснейтрализующей активности антирабических сывороток и иммуноглобулина // Инфекция и иммунитет.2019. Т. 9, №1. С. 107-114. doi: 10.15789/2220-7619-2019-1-107-114). Авторами разработан метод измерения уровня флуоресценции окрашенного флуоресцеин-5-изотиоцианатом (FITC) антигена в клеточной цитоплазме линии Vero при его взаимодействии с изучаемыми иммуноглобулинами. Преимущество метода заключается в высокой чувствительности, специфичности и скорости получения результата. Однако использование клеточной линии увеличивает стоимость и трудоемкость и проведения анализа.

В последнее время широкое применение многопараметровых проточных цитофлуориметров-анализаторов начинает вытеснять флуоресцентную микроскопию при проведении иммунологических исследований за счет более высокой производительности цитометрических исследований, быстроты анализа и меньших трудозатрат. (Хайдуков С.В. Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» (проект) // Медицинская иммунология 2012, Т. 14, №3, стр. 255-268). Описанный в патенте RU 2464571 (Опубл. 20.10.2012, Бюл. №29) «Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вируса кори и краснухи» позволяет проводить количественную оценку CD8 клеток, меченных флуорохромом в исследуемых субпопуляциях Т-клеток в присутствии специфического антигена и может быть применен для оценки инфекционного и вакцинного иммунитета против вирусов кори и краснухи. К недостаткам способа можно отнести необходимость выделения и длительной инкубации в стерильных условиях мононуклеарной фракции CD8+Т-клеток, а также использование при анализе коммерческих моноклональных антител.

Совершенствование инструментальных средств серодиагностики в значительной степени опирается на развитие концепции биосенсоров - портативных устройств, привлекающих своей мобильностью, доступностью, дешевизной и предназначенных для скрининга биологически важных компонентов, в т.ч. антител. (Higson S. Biosensors for medical applications. 2012 Woodhead Publishing Limited. 337 р.) Разработаны методы и системы для ускоренной детекции и идентификации аналитов без меток, в том числе с использованием оптических систем, как описано в патенте US20130005604, используемые в медицинской диагностике. Наиболее близкий к заявляемому нами экспрессному способу детекции иммунных комплексов является заявленный в патенте RU 2753856 (Опубл. 24.08.2021, Бюл. №24) Способ детекции антител в биоматериале с использованием стеклянных микроструктурных волноводов, позволяющий определять наличие антител у привитых людей в режиме реального времени. Недостатком способа является отсутствие сертифицированного оборудования для детекции иммунных комплексов.

В последние годы для оценки эффективности вакцинации применяют антиген-стимулированные клеточные тесты in vitro с использованием технологии проточно-цитометрического анализа. Примером является описанный в патенте RU 2647468 (Опубл. 15.03.2018, Бюл. №8) «Способ анализа клеточно-опосредованного иммунного ответа с повышенной чувствительностью», включающий в себя методику определения статуса активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Однако эти методические подходы пока не адаптированы для оценки формирования поствакцинального противочумного иммунитета. Способ, предусматривающий применение антигенов чумного микроба при оценке уровня противочумного иммунитета описан в патенте RU 2725872 (Опубл. 07.07.2020, Бюл. №19) «Способ применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба для оценки уровня противочумного иммунитета». Авторами предложен алгоритм применения тестов оценки Т-клеточного иммунного ответа in vitro, однако предложенная методика включает в себя оценку динамики показателей только клеточного звена иммунитета. Кроме того, способ подразумевает использование коммерческих моноклональных антител.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, не выявил сведения о способах прямой детекции реакции антител с антигенами, конъюгированными с флуорохромами с помощью технологии проточной цитометрии.

Задача изобретения заключается в разработке способа, позволяющего в короткие сроки с высокой точностью регистрировать в биологическом материале (сыворотка крови) реакцию взаимодействия специфических антител с меченными флуорохромом (флуоресциин 5 - изотиоцианад FITC) антигеном (капсульный антиген F1 чумного микроба) с использованием проточного цитофлуориметра, регистрирующего в режиме реального времени изменение интенсивности флуоресценции образующихся иммунных комплексов.

Технический результат заключается в реализации указанного назначения, а также в снижении себестоимости проведения анализа по детекции иммунных комплексов при оценки иммунитета у привитых против чумы людей.

Технический результат достигается способом регистрации реакции антиген-антитело для оценки иммунитета у привитых против чумы людей с помощью цитометрической технологии, который предусматривает добавление в исходные образцы сыворотки крови препарата капсульного антигена (F1), конъюгированного с FITC и последующим построением для полученой смеси в режиме реального времени на проточном цитофлуориметре гистограмм флуоресценции, характеризующих количественные параметры образующихся иммунных комплексов в условных единицах интенсивности флуоресценции mean FITC-А.

Специфическую реакцию антиген-антитело у привитых против чумы лиц учитывали по смещению пиков на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции в образцах, взятых до и через месяц после прививки вакциной чумной живой (ВЧЖ) по значению коэффициента интенсивности связывания (К), выраженного в условных единицах по формуле:

К - коэффициент интенсивности связывания;

А - среднее значение показателя флуоресценции (mean FITC-A) образца сыворотки крови добровольца через месяц после вакцинации ВЧЖ;

В - среднее значение показателя флуоресценции (mean FITC-A) образца сыворотки крови добровольца до вакцинации ВЧЖ.

Коэффициент интенсивности связывания более 1 (К>1) свидетельствует о формировании иммунного ответа на вакцинацию ВЧЖ.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

В пробирку типа Эппендорф помещают 5 мкл исследуемой сыворотки крови и снимают гистограмму интенсивности флуоресценции свечения (фоновое свечение исследуемого образца) с помощью проточного цитометра BD Accuri С6 plus при возбуждении 495 нм и эмиссии 519 нм.

В отдельную пробирку помещают 20 мкл водного раствора антигена F1, выделенного из штамма Y.pestis EV с концентрацией F1 300 мкг/мл (Andrews G.P., Heath D.G., Anderson G.W., Welkos S.L., Friedlander A.M. Fraction 1 capsular antigen (Fl) purification from Yersinia pestis C092 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge. Infect. Immun., 1996, vol. 64, no. 6, pp. 2180-2187), конъюгированного с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (FITC) (Fl/FITC) по стандартной методике (Meslin, F.X. Laboratory techniques in rabies / edited by F.X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski. - 4 th ed. - Geneva: WHO, 1996. - 469 p.). Для образца Fl/FITC снимают гистограмму интенсивности флуоресценции (свечение антигена) в канале FITC при возбуждении 495 нм и эмиссии 519 нм. Затем к образцу F1/FITC добавляют 5 мкл исследуемой сыворотки крови и снимают показатели интенсивности флуоресценции смеси (свечение исследуемой смеси) в канале FITC при возбуждении 495 нм и эмиссии 519 нм в режиме реального времени без этапа предварительной инкубации смеси.

Специфические антитела, в случае их присутствия в аналите, избирательно связываются с молекулами антигена, образуя иммунные комплексы, регистрируемые по интенсивности их флуоресценции на гистограммах. На Фиг.1. Гистограммы образцов, содержащих:

а - образец Fl/FITC;

б - смесь Fl/FITC и сыворотки, содержащей специфические антитела;

в - смесь Fl/FITC и контрольной сыворотки без специфических антител;

г - образец сыворотки крови без добавления F1/FITC.

Образование иммунных комплексов антиген-антитело обусловливает изменение исходной формы пика образца F1/FITC (рис. 1а) на конфигурацию, характерную для смеси Fl/FITC с сывороткой и смещение пика на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции на порядок влево по отношению к исходному свечению антигена Fl/FITC (фиг.1б).

В качестве отрицательного контроля используют смесь F1/FITC и сыворотку крови, не содержащую искомых антител (фиг.2ж).

В качестве контроля фонового свечения используют сыворотку крови без добавления F1/FITC (фиг.1г).

Порядок применения формулы определения коэффициента связывания приведен в примере 2.

Пример 1

Для оценки специфичности заявляемого способа регистрации реакции антиген-антитело, согласно изобретению, снимают показатели интенсивности флуоресценции в образцах, содержащих 20 мкл антигена F1/FITC и 5 мкл одного из препаратов сывороток, содержащих антитела против антигенов псевдотуберкулеза, холеры, туляремии, бруцеллеза и чумы, а также препарата сыворотки, не содержащей антител (отрицательный контроль). Анализируемые антитела, содержащиеся в препарате сыворотки против антигенов чумы, избирательно связываются с молекулами антигена F1/FITC, о чем свидетельствует смещение и изменение конфигурации пиков на гистограмме. (Фиг.2. Гистограммы образцов содержащих: д- препарат Fl/FITC (1) и смесь F1/FITC с сывороткой (2), содержащей специфические антитела к F1/FITC (положительный контроль); е - препарат Fl/FITC (1) и смеси Fl/FITC с сыворотками (2), содержащими антитела к псевдотуберкулезу, холере, туляремии, бруцеллезу; ж - препарат Fl/FITC (1) и смесь F1/FITC с сывороткой (2), не содержащей антитела (отрицательный контроль).

Для смеси, содержащей специфические антитела к Fl/FITC, область свечения образца на гистограмме незначительно отклонялась от области свечения Fl/FITC (фиг.2д) и показатели интенсивности флуоресценции (mean FITC-A) анализируемой смеси были приближены к исходным значениям для антигена F1/FITC (фиг.1а). Для смесей, не содержащих специфических антител к Fl/FITC было характерным значительное снижение интенсивности флуоресценции (таблица 1) и смещение пика на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции (гистограмма) на два порядка влево (фиг.2е,ж) по отношению к исходному свечению антигена F1/FITC.

Пример 2

Оценку формирования иммунного ответа у людей после вакцинации ВЧЖ проводили путем анализа результатов оценки смещения пиков на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции в образцах сывороток, взятых от людей через месяц после прививки (фиг.3и) относительно пиков флуоресценции в образцах сывороток от тех же людей до вакцинации (фиг.3к). О наличии иммунного ответа на вакцинацию судили по изменению показателя коэффициента интенсивности связывания (К), отражающего отношение разницы между значениями mean FITC-A образцов сыворотки, взятых после и до вакцинации к образцу сыворотки, взятой до вакцинации. При значении К>1 иммунный ответ на вакцинацию считали положительным (таблица 2 Показатели mean FITC-A образцов сывороток от людей до и после вакцинации с определением коэффициента интенсивности связывания (К)).

Образец расчета коэффициента интенсивности связывания (К) по формуле (1) для вакцинируемого №5:

В данном случае значение К больше единицы, что свидетельствует об образовании специфических иммунных комплексов у данного человека через месяц после вакцинации ВЖЧ и формировании у него поствакцинального иммунного ответа.

Таким образом, предлагаемый способ регистрации реакции антиген-антитело для оценки иммунитета у привитых против чумы людей с помощью цитометрической технологии, отличающийся быстротой, отсутствием необходимости применения дорогостоящих коммерческих коньюгатов антител, минимальным количеством необходимого оборудования и расходных материалов, позволяет количественно охарактеризовать поствакцинальный иммунитет у лиц, привитых ВЧЖ.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и предназначено для регистрации реакции антиген-антитело у привитых против чумы людей с помощью технологии проточной цитометрии. Предложен способ, позволяющий в короткие сроки с высокой точностью регистрировать в сыворотке крови реакцию взаимодействия специфических антител с меченным FITC капсульным антигеном F1 чумного микроба с последующим определением иммунитета по смещению пиков на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции в образцах сыворотки крови по значению коэффициента интенсивности связывания, рассчитанного по формуле: где К - коэффициент интенсивности связывания; А - среднее значение показателя флуоресценции (mean FITC-А) образца сыворотки крови через месяц после вакцинации ВЧЖ; В - среднее значение показателя флуоресценции (mean FITC-А) образца сыворотки крови до вакцинации ВЧЖ; значение коэффициента больше единицы свидетельствует о формировании иммунного ответа на вакцинацию ВЧЖ. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ регистрации реакции антиген-антитело для оценки иммунитета у привитых против чумы людей с помощью цитометрической технологии, предусматривающий добавление в исходные образцы сыворотки крови препарата капсульного антигена F1, конъюгированного с флуорохромом FITC, и последующее построение для полученной смеси в режиме реального времени на проточном цитофлуориметре гистограмм флуоресценции, характеризующих количественные параметры образующихся иммунных комплексов в условных единицах интенсивности флуоресценции mean FITC-А, с последующим определением иммунитета по смещению пиков на логарифмической шкале интенсивности флуоресценции в образцах сыворотки крови, взятых до и через месяц после вакцинации, по значению коэффициента интенсивности связывания, рассчитанного по формуле:

где

К - коэффициент интенсивности связывания;

А - среднее значение показателя флуоресценции (mean FITC-А) образца сыворотки крови через месяц после вакцинации ВЧЖ;

В - среднее значение показателя флуоресценции (mean FITC-А) образца сыворотки крови до вакцинации ВЧЖ,

значение коэффициента больше единицы свидетельствует о формировании иммунного ответа на вакцинацию ВЧЖ.