НАБОР ЗОНДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ОБРАЗЦОВ ДНК И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Эта заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке № 62/220746, поданной 18 сентября 2015 года, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Уровень техники

Внеклеточная ДНК («вкDNA») может быть проанализирована для получения прогноза, проведения диагностики или прогнозирования реакции на лечение различных заболеваний и состояний, включая различные виды рака, успешную или неуспешную трансплантацию, воспалительные заболевания, инфекционные заболевания и эмбриональную анеуплоидию.

В крови беременной женщины присутствует внеклеточная фетальная (эмбриональная) ДНК (вкфДНК). Это открытие привело к возможности проведения неинвазивного пренатального тестирования (NIPT) плода с использованием пробы крови беременной женщины. Инвазивные пренатальные тесты (например, амниоцентез или биопсия хориона (CVS)) могут быть источником стресса для матери, и некоторые считают, что такие процедуры могут увеличить риск выкидыша. NIPT может предоставлять информацию, связанную с различными генетическими дефектами, включая синдром Дауна (трисомия хромосомы 21), синдром Патау (трисомия 13) и синдром Эдвардса (трисомия 18). Такие методы должны быть очень надежными, поскольку ложно-позитивный результат может привести к ненужным медицинским процедурам, а ложно-негативный результат может лишить будущую мать понимания доступных медицинских вариантов.

Существует множество технических препятствий, связанных с внедрением неинвазивного пренатального теста в клинических масштабах. Например, многие усилия NIPT были сосредоточены на анализе вкфДНК для определения изменений числа копий определенных последовательностей (например, последовательностей из хромосомы 21). Однако такие методы трудно реализовать надежным способом, поскольку, в частности, подавляющее большинство вкДНК в образце крови является материнским по происхождению и во многих случаях имеется лишь очень небольшое количество (например, в среднем ~10% и вплоть до около 3%) ДНК плода. Например, наличие или отсутствие дополнительной копии хромосомы (такой как хромосома 21) у плода может быть определено путем сравнения количества копий последовательностей, соответствующих хромосоме 21, с количеством копий последовательностей, соответствующих аутосомной хромосоме. Хотя такие методы кажутся привлекательными, они на самом деле сложны, потому что фракционная концентрация ДНК плода по отношению к материнской ДНК в материнской крови в минимальном случае может достигать 3%. Таким образом, для каждых 1000 последовательностей, соответствующих хромосоме 21, которые находятся в материнском кровотоке, только небольшой процент этих последовательностей (например, 30 последовательностей, если фракция плода составляет 3%), являются последовательностями плода. Таким образом, дополнительная копия хромосомы у плода приведет только к относительно небольшому увеличению числа последовательностей, соответствующих этой хромосоме в материнском кровотоке. Например, если фракция плода равна 4, трисомия плода 21 приведет только к увеличению на 1,5% количества фрагментов, соответствующих хромосоме 21 в материнском кровотоке. В результате этой проблемы статистическая точность может быть достигнута только путем подсчета большого количества последовательностей, соответствующих хромосомной области, которая, как предполагается, имеет изменение в количестве копий (например, по меньшей мере, 1000 и иногда, по меньшей мере, 5000 или более последовательностей) и сравнения этого числа с аналогичным числом для другой хромосомной области, которая, как считается, не имеет изменения в количестве копий. Способность последовательно и точно подсчитывать фрагменты имеет первостепенное значение для успеха многих методов NIPT.

Некоторые методы NIPT используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации ДНК. ПЦР широко используется, но она имеет ряд различных ограничений, которые могут отрицательно повлиять на точность результатов. ПЦР может привносить артефакты последовательностей и создавать погрешность амплификации в образце. Артефакты последовательности ПЦР представляют собой ошибки, внесенные в последовательность ДНК амплифицируемого ПЦР-продукта при проведении ПЦР-реакции. Артефакты последовательности ПЦР могут быть вызваны различными событиями, такими как образование химерных молекул (например, две разные части ДНК, комплементарно соединенные между собой), образование гетеродуплексной ДНК (например, гибридизация двух разных молекул ДНК между собой) и ошибками, внесенными ферментом амплификации (например, ДНК-полимеразой Taq, помещающей несогласованный нуклеотид на матрицу ДНК). Изменение последовательности при проведении ПЦР является искажением распределения продуктов ПЦР по сравнению с исходным образцом. Изменение последовательности ПЦР-последовательности может быть вызвано различными событиями, такими как внутренние различия в эффективности амплификации матриц или ингибирование амплификации из-за самоотжигания матриц ДНК. Ошибки ПЦР приводят к неравномерной амплификации различных молекул ДНК, так что амплифицированный образец больше не является репрезентативным для исходного образца. ПЦР также, как известно, чувствительна к экзогенному загрязнению ДНК из окружающей среды. Из-за экспоненциальной амплификации ДНК при проведении ПЦР даже очень небольшое количество экзогенного загрязнения ДНК в ПЦР-пробе может приводить к очень неточным результатам. Экзогенное загрязнение ДНК может быть внесено аэрозольными каплями, плавающими в воздухе, или может быть внесено в пробу с загрязненным оборудованием.

Использование амплификации по типу катящегося кольца (RCA) для анализа вкДНК в материнской крови позволяет избежать многих проблем, связанных с ПЦР. Тем не менее, продукты RCA довольно сложно оценить количественно таким образом, чтобы обеспечить статистическую надежность. На практическом уровне, хотя абсолютное количество продуктов в реакции RCA может быть достаточно высоким для обеспечения статистической надежности, различные продукты RCA могут быть амплифицированы и обнаружены с разной эффективностью и, таким образом, последовательное обнаружение десятков или сотен тысяч продуктов RCA с одинаковой эффективностью было сложной задачей.

Краткое описание сущности изобретения

Среди прочего, в данном документе описана система зондов для анализа образца нуклеиновой кислоты. Зонды могут быть сконструированы таким образом, чтобы их можно было лигировать с целевыми фрагментами геномной ДНК (также упоминаемыми в данном документе как «целевые последовательности» или просто «фрагменты») из разных локусов (например, разных хромосом) для образования кольцевых молекул ДНК. Кольцевые молекулы ДНК, даже если они содержат фрагменты из разных хромосом, содержат одну и ту же «основную» последовательность. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения все кольцевые молекулы ДНК, которые содержат фрагмент из того же локуса, содержат одну и ту же специфическую для локуса идентифицирующую последовательность, то есть специфичный для локуса ДНК-баркод. В этих вариантах реализации изобретения кольцевые молекулы ДНК могут быть амплифицированы с использованием праймера, который гибридизуется с последовательностью в основной цепи, и локус, из которого получен клонированный фрагмент, может быть обнаружен путем гибридизации продуктов RCA с меченым олигонуклеотидом, который гибридизуется с локус-специфической идентифицирующей последовательностью. Очевидно, этот вариант реализации способа может быть мультиплексирован с использованием множества специфичных для локуса идентифицирующих последовательностей и различно меченых олигонуклеотидов, которые гибридизуются с этими последовательностями. Поскольку все кольцевые продукты имеют одинаковую основную цепь и отличаются друг от друга только последовательностью клонированного фрагмента и специфическим для локуса ДНК-баркодом, продукты RCA, амплифицированные из этих продуктов, последовательно амплифицируются, и локус, которому соответствуют эти продукты RCA, может быть точно идентифицирован. Также предлагается способ, в котором используется система зондов, а также набор для его применения.

Как будет рассмотрено более подробно ниже, в некоторых случаях этот способ может быть использован для обнаружения хромосомных аномалий (например, трисомии 21) у плода с использованием образца вкДНК женщины, беременной этим плодом.

Предлагается система зондов для анализа образца нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может содержать: (a) набор идентифицирующих олигонуклеотидов последовательности B; (b) набор фиксирующих олигонуклеотидов формулы X'-A'-B'-Z ', где: внутри набора: (i) последовательности A' и B' варьируют, и (ii) последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются переменными; и в каждом фиксирующем олигонуклеотиде: (i) последовательность А' комплементарна геномному фрагменту образца нуклеиновой кислоты и (ii) последовательность В' комплементарна, по меньшей мере, одному члену набора идентифицирующих олигонуклеотидов; и (c) одну или более зондовых последовательностей, содержащих X и Z, где последовательности X и Z не являются переменными и гибридизуются с последовательностями X' и Z'; где каждый фиксирующий олигонуклеотид способен гибридизоваться с: (i) зондовыми последовательностями, (ii) членом набора идентифицирующих олигонуклеотидов и (iii) геномным фрагментом, в результате чего образуется лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z. В некоторых вариантах реализации изобретения различные идентифицирующие олигонуклеотиды и их комплементарные последовательности В' идентифицируют разные хромосомы, например хромосомы 21, 18 и 13.

В некоторых вариантах реализации изобретения набор идентифицирующих олигонуклеотидов может содержать, по меньшей мере, два (например, два, три или четыре или более) различных идентифицирующих олигонуклеотидов последовательности В и в наборе фиксирующих олигонуклеотидов имеется, по меньшей мере, 100 различных последовательностей A' и при по меньшей мере две различные последовательности В', которые являются комплементарными, по меньшей мере, двум различным идентифицирующим олигонуклеотидам.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность B' в фиксирующем олигонуклеотиде может соответствовать фрагменту генома.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность B' в фиксирующем олигонуклеотиде может указывать на локус в геноме, из которого получен геномный фрагмент.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность B' в фиксирующем олигонуклеотиде может указывать на хромосому, из которой получен геномный фрагмент.

В некоторых вариантах реализации изобретения геномный фрагмент представляет собой фрагмент генома млекопитающих.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность B' в фиксирующем олигонуклеотиде может идентифицировать одну или несколько из следующих хромосом: хромосома 21, хромосома 18 и хромосома 13.

В некоторых вариантах реализации изобретения геномный фрагмент может быть рестрикционным фрагментом.

В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более зондовых последовательностей (c) могут дополнительно содержать олигонуклеотид, содержащий последовательность Y, причем лигируемый комплекс является линейным.

В некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать пару ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с одним или несколькими зондами (c).

В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более зондовых последовательностей (c) могут содержать основной зонд формулы X-Y-Z, где Y содержит олигонуклеотидную последовательность, так что лигируемый комплекс представляет собой кольцевой лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z-Y, причем последовательность Y соединяет последовательности X и Z.

В некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде.

В некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать (А) праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде; и (b) до четырех различно меченых олигонуклеотидов для детекции, причем каждый из различно меченых олигонуклеотидов для детекции гибридизуется с последовательностью В'.

Также предлагается способ анализа образцов. В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать: (а) гибридизацию любого из вариантов системы зондов, описанных выше, с исследуемым геномным образцом, который содержит геномные фрагменты для получения лигируемых комплексов формулы X-A-B-Z; (b) лигирование лигируемых комплексов с получением молекул ДНК продукта формулы X-A-B-Z; и (c) подсчет молекул ДНК продукта, соответствующих каждому локусовому идентификатору последовательности B.

В некоторых вариантах реализации изобретения подсчет может быть осуществлен путем секвенирования молекул ДНК-продукта или их продуктов амплификации для получения данных о последовательностях и подсчета количества считываемых последовательностей, содержащих каждую последовательность В или ее комплементарную последовательность.

В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы ДНК-продукта могут быть кольцевыми, и подсчет может включать амплификацию молекул ДНК-продукта путем амплификации по типу катящегося кольца и подсчет количества продуктов амплификации, содержащих каждую последовательность В или ее комплементарную последовательность. В этих вариантах реализации изобретения способ может включать маркировку продуктов RCA с использованием различных меченых зондов, которые гибридизуются с последовательностью B', а подсчет выполняется путем подсчета количества продуктов RCA для каждой различной метки.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ может содержать: i. размещение продуктов RCA на плоской поверхности; и ii. подсчет количества отдельных меченых продуктов RCA на области поверхности. В этих вариантах реализации изобретения поверхность может быть, например, стеклянным слайдом или пористой прозрачной капиллярной мембраной.

В некоторых вариантах реализации изобретения различные последовательности B и их комплементарные последовательности B' идентифицируют разные хромосомы, и способ дополнительно включает в себя сравнение количества молекул ДНК-продукта, включающих первую последовательность B или B', с числом молекул ДНК-продукта, содержащего вторую последовательность B или B', чтобы определить, имеет ли геномный образец анеуплоидию.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать сравнение результатов подсчета на этапе (c) с результатами подсчета, полученными для одного или нескольких референтных образцов.

В некоторых вариантах реализации изобретения исследуемый геномный образец может быть взят у пациента, который подозревается на наличие или подвергается риску заболевания или состояния, а результаты подсчета на стадии (c) указывают на то, имеет ли больной или его плод болезнь или состояние.

В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или состояние могут быть раком, инфекционным заболеванием, воспалительным заболеванием, отторжением трансплантата или трисомией.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты являются рестрикционными фрагментами.

Краткое описание графических материалов

Специалист в данной области техники поймет, что графические материалы, описанные ниже, предназначены только для иллюстративных целей. Графические материалы ни в коем случае не предназначены и не должны рассматриваться для ограничения сферы применения данного изобретения.

На Фиг. 1 схематично показаны некоторые особенности данной системы зондов.

На Фиг. 2 схематично показано, как последовательность В служит для идентификации локуса последовательности А.

На Фиг. 3 схематично показаны некоторые примерные конфигурации системы зондов.

На Фиг. 4 схематично показаны некоторые особенности варианта реализации описанного способа.

На Фиг. 5 схематично показаны некоторые особенности одного варианта реализации описанного способа.

На Фиг. 6 схематично показана конструкция систем зондов.

На Фиг. 7 показаны данные, полученные с использованием двух различных систем зондов.

На Фиг. 8 показаны данные, полученные при анализе клинических образцов.

Определения

Прежде чем более подробно описывать примерные варианты реализации изобретения, изложены следующие определения, иллюстрирующие и определяющие смысл и объем терминов, используемых в данном документе.

Числовые диапазоны содержат числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записываются слева направо в 5'-3' ориентации; и аминокислотные последовательности записываются слева направо в N-C ориентации соответственно.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится данное изобретение. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) предоставляют специалисту в области общее значение многих терминов, используемых в данном документе. Тем не менее, некоторые термины определены ниже для ясности и удобства ссылок.

Следует отметить, что, как используется в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, термины в единственном числе могут использоваться как таковые, которые также имеют значение соответствующих терминов во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Например, термин «праймер» относится к одному или нескольким праймерам, то есть к одному праймеру и нескольким праймерам. Кроме того, следует отметить, что пункты формулы могут быть составлены для исключения любого необязательного элемента. Таким образом, это определение предназначено для использования в качестве предшествующей основы для использования такой исключающей терминологии, как «исключительно», «только» и т. п. в связи с изложением элементов заявки или использованием «отрицательного» ограничения.

Термин «нуклеотид» включает те соединения, которые содержат не только известные пуриновые и пиримидиновые основания, но и другие гетероциклические основания, которые были модифицированы. Такие модификации включают метилированные пурины или пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины, алкилированные рибозы или другие гетероциклические соединения. Кроме того, термин «нуклеотид» включает в себя те соединения, которые содержат гаптен или флуоресцентные метки и могут содержать не только обычные рибозные и дезоксирибозные сахара, но и другие сахара. Модифицированные нуклеозиды или нуклеотиды также включают модификации сахарного фрагмента, например, где одна или несколько гидроксильных групп замещены атомами галогена или алифатическими группами, функционализированы в виде простых эфиров, аминов или тому подобного.

Термин «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в данном документе взаимозаменяемо для описания полимера любой длины, например, более чем около 2 основания, более чем около 10 оснований, более чем около 100 оснований, более чем около 500 оснований, более чем 1000 оснований, до около 10 000 или более оснований, состоящих из нуклеотидов, например дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, и могут быть получены ферментативно или синтетически (например, ПНК, как описано в патенте США № 5,948,902 и цитированных в нем ссылках), которые могут комплементарно гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами естественного происхождения, аналогично реакции двух естественных нуклеиновых кислот, например, могут участвовать в спаривании оснований Уотсона-Крика. Нуклеотиды естественного происхождения включают гуанин, цитозин, аденин, тимин, урацил (G, C, A, T и U соответственно). ДНК и РНК имеют дезоксирибозный и рибозный сахарный скелет соответственно, тогда как основная цепь ПНК состоит из повторяющихся звеньев N- (2-аминоэтил)-глицина, связанных пептидными связями. В ПНК различные пуриновые и пиримидиновые основания связаны с основной цепью метиленкарбонильными связями. Закрытая нуклеиновая кислота (ЗНК), часто называемая недоступной РНК, представляет собой модифицированный РНК-нуклеотид. Рибозный фрагмент нуклеотида ЗНК модифицируют с формированием дополнительного мостика, соединяющего кислород в положении 2' и углерод в положении 4' . Эта связь «блокирует» рибозу в конформации 3'-эндо (N-конформация), которая часто встречается в дуплексах A-формы. ЗНК-нуклеотиды могут быть смешаны с остатками ДНК или РНК в олигонуклеотиде, когда это необходимо. Термин «неструктурированная нуклеиновая кислота» или «ННК» представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую ненатуральные нуклеотиды, которые связываются друг с другом с пониженной стабильностью. Например, неструктурированная нуклеиновая кислота может содержать остаток G' и остаток C', где эти остатки соответствуют неприродным формам, т.е. аналогам G и C, которые образуют пару друг с другом с пониженной стабильностью, но сохраняют способность основывать пару с естественно встречающимися остатками C и G соответственно. Неструктурированная нуклеиновая кислота описана в патенте US20050233340, который включен в данное описание посредством ссылки для описания ННК.

Используемый в данном документе термин «олигонуклеотид» обозначает одноцепочечный мультимер нуклеотидов длиной от около 2 до около 200 нуклеотидов, вплоть до 500 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть синтетическими или могут быть получены ферментативно и в некоторых вариантах реализации изобретения имеют длину от 30 до 150 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут содержать рибонуклеотидные мономеры (то есть могут быть олигорибонуклеотидами) или дезоксирибонуклеотидные мономеры. Олигонуклеотид может содержать, например, от 10 до 20, от 21 до 30, от 31 до 40, от 41 до 50, от 51 до 60, от 61 до 70, от 71 до 80, от 80 до 100, от 100 до 150 или от 150 до 200 нуклеотидов.

Используемый в данном документе термин «праймер» относится к олигонуклеотиду, который способен действовать как точка инициации синтеза при помещении в условиях, когда индуцируется синтез продукта элонгации праймера, который является комплементарным нити нуклеиновой кислоты, т.е., в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и рН. Праймер может быть одноцепочечным и должен быть достаточно длинным, чтобы обеспечить синтез желаемого продукта элонгации в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймера будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и использования способа. Например, для диагностических применений, в зависимости от сложности целевой последовательности или фрагмента, олигонуклеотидный праймер обычно содержит 15-25 или более нуклеотидов, хотя он может содержать и меньшее количество нуклеотидов. Праймеры в данном документе выбраны так, чтобы быть по существу комплементарными различным цепям конкретной последовательности ДНК-мишени. Это означает, что праймеры должны быть достаточно комплементарными для гибридизации с их соответствующими цепями ДНК. Следовательно, последовательность праймеров не должна отражать точную последовательность матрицы. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'-концу праймера, причем остальная часть праймерной последовательности является комплементарной по отношению к цепи ДНК. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут находиться внутри последовательности праймера при условии, что последовательность праймера имеет достаточную комплементарность с последовательностью цепи для гибридизации с ней и тем самым может формировать матрицу для синтеза продукта элонгации.

Термин «гибридизация» или «гибридизуется» относится к процессу, в котором цепь нуклеиновой кислоты отжигается и образует стабильный дуплекс, либо гомодуплекс, либо гетеродуплекс, в условиях нормальной гибридизации со второй комплементарной цепью нуклеиновой кислоты и не образует стабильный дуплекс с некомплементарными молекулами нуклеиновой кислоты при тех же нормальных условиях гибридизации. Образование дуплекса осуществляют путем отжига двух дополнительных цепей нуклеиновой кислоты в реакции гибридизации. Реакцию гибридизации можно сделать высокоспецифичной путем корректировки условий гибридизации (часто называемой жесткостью гибридизации) при которой происходит реакция гибридизации, так что гибридизация между двумя цепями нуклеиновой кислоты не образует стабильного дуплекса, например, дуплекс, который сохраняет область двухцепочечности в нормальных условиях жесткости только если две цепи нуклеиновых кислот не содержат определенное количество нуклеотидов в определенных последовательностях, которые являются по существу или полностью комплементарными. «Нормальная гибридизация или нормальные условия жесткости» легко определяются для любой рассматриваемой реакции гибридизации. См., Например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York или Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Используемый в данном документе термин «гибридизация» относится к любому процессу, посредством которого цепочка нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью путем спаривания оснований.

Нуклеиновая кислота считается «селективно гибридизующейся» с референтной нуклеотидной последовательностью, если две последовательности специфически гибридизуются друг с другом при условиях гибридизации и промывания от умеренных до жестких. Известны умеренные и высокожесткие условия гибридизации (см., например, Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons 1995 and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.). Один пример условий высокой жесткости включает гибридизацию при температуре около 42°C в 50% формамиде, 5X SSC, 5X растворе Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированного ДНК-носителя с последующей промывкой два раза в 2X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре и два дополнительных раза в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при температуре 42^oC.

Термин «баркод-последовательность» или «молекулярный баркод», как используется в данном документе, относится к уникальной последовательности нуклеотидов, используемых для а) идентификации и/или отслеживания источника полинуклеотида в реакции и/или б) подсчета количества раз, сколько начальная молекула была секвенирована (например, в тех случаях, когда по существу каждая молекула в образце помечена с помощью другой последовательности, а затем образец амплифицируется). Баркод-последовательность может быть на 5'-конце, 3'-конце или в середине олигонуклеотида. Баркод-последовательности могут сильно различаться по размеру и составу; следующие ссылки служат руководством для выбора наборов баркод-последовательностей, подходящих для конкретных вариантов реализации изобретения: Casbon (Nuc. Acids Res. 2011, 22 e81), Brenner, U.S. Pat. No. 5,635,400; Brenner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 1665-1670 (2000); Shoemaker et al, Nature Genetics, 14: 450-456 (1996); Morris et al, European patent publication 0799897A1; Wallace, U.S. Pat. № 5,981,179; и тому подобные. В конкретных вариантах реализации изобретения баркод-последовательность может иметь длину в диапазоне от 4 до 36 нуклеотидов или от 6 до 30 нуклеотидов или от 8 до 20 нуклеотидов.

Используемый здесь термин «секвенирование» относится к способу, с помощью которого будет получена последовательность, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов (например, идентичность, по меньшей мере, 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере, 100 или, по меньшей мере, 200 или более последовательных нуклеотидов) полинуклеотида.

Термин «секвенирование следующего поколения» относится к так называемым параллельным схемам секвенирования во время синтеза или секвенирования во время лигирования, которые в настоящее время используются, например, Illumina, Life Technologies и Roche и т. д. Методы секвенирования следующего поколения могут также включать в себя методы секвенирования с помощью нанопор или методы на основе электронного детектирования, такие как, например, технология Ion Torrent, коммерциализируемая Life Technologies.

Используемый в данном документе термин «дуплекс» или «дуплексный» описывает два комплементарных полинуклеотида, которые могут спаривать основания, т.е. гибридизуются вместе.

Термины «определение», «измерение», «оценка», «установление», и «анализ» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения форм измерения и включают определение наличия или отсутствия какого-либо элемента. Эти термины включают как количественные, так и качественные определения. Оценка может быть относительной или абсолютной.

Термин «аффинная метка», как используется в данном документе, относится к фрагменту, который может быть использован для отделения молекулы, к которой прикреплена аффинная метка от других молекул, которые не содержат аффинной метки. «Аффинная метка» является членом определенной пары связывания, то есть двух молекул, где одна из молекул посредством химических или физических средств специфически связывается с другой молекулой. Дополнительный член специфической пары связывания, называемый в данном документе «агентом захвата», может быть иммобилизован (например, на хроматографической подложке, шариках или плоской поверхности) с получением аффинной хроматографической подложки, которая специфически связывает аффинную метку. Другими словами, «аффинный маркер» может связываться с «агентом захвата», причем аффинный маркер специфически связывается с агентом захвата, тем самым облегчая отделение молекулы, к которой прикреплен аффинный маркер от других молекул, которые не содержат афинный маркер.

Используемый в данном документе термин «биотиновый фрагмент» относится к аффинному агенту, который содержит биотин или аналог биотина, такой как дестиобиотин, оксибиотин, 2'-иминобиотрин, диаминобиотин, биотинсульфоксид, биоцитин и т. д. Биотиновые фрагменты связываются со стрептавидином с аффинностью, по меньшей мере, 10^-8M. Аффинный агент с биотином может также содержать линкер, например ─LC-биотин, ─LC-LC-биотин, ─ SLC-биотин или ─PEG_n-биотин, где n равно от 3 до 12.

Термин «терминальный нуклеотид», используемый в данном документе, относится к нуклеотиду на 5'- или 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть в двухцепочечной форме (то есть дуплексирована) или в одноцепочечной форме.

Используемый в данном документе термин «лигирование» относится к ферментативно катализируемому соединению концевого нуклеотида на 5'-конце первой молекулы ДНК с концевым нуклеотидом на 3'-конце второй молекулы ДНК.

Термины «множество», «набор» и «популяция» используются взаимозаменяемо в целях ссылки на то, что содержит не менее 2 элементов. В некоторых случаях множество может иметь, по меньшей мере, 10, по меньшей мере 100, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 10000, по меньшей мере, 100 000, по меньшей мере 10⁶, по меньшей мере, 10⁷, по меньшей мере 10⁸ или, по меньшей мере, 10⁹ или более элементов.

Термин «расщепление» предназначен для обозначения процесса, посредством которого нуклеиновая кислота расщепляется рестрикционным ферментом. Чтобы расщепить нуклеиновую кислоту, рестрикционный фермент и нуклеиновую кислоту, содержащую сайт узнавания для рестрикционного фермента, подвергают контактированию в условиях, подходящих для работы фермента рестрикции. Условия, пригодные для обеспечения активности коммерчески доступных рестрикционных ферментов, известны и предоставляются с этими ферментами при покупке.

Термин «сайт связывания олигонуклеотидов» относится к сайту, с которым олигонуклеотид гибридизуется в целевом полинуклеотиде или фрагменте. Если олигонуклеотид «предоставляет» сайт связывания для праймера, то праймер может гибридизоваться с этим олигонуклеотидом или его комплементарной цепью.

Термин «разделение», как используется в данном документе, относится к физическому разделению двух элементов (например, по размеру или аффинности и т. д.), а также к деградации одного элемента, оставив другой неповрежденным.

Используемый в данном документе термин «референтная хромосомная область» относится к хромосомной области, имеющей известную нуклеотидную последовательность, например хромосомной области, последовательность которой, например, депонирована в базе данных Genbank NCBI или в других базах данных.

Используемый в данном документе термин «цепь» относится к нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидов, ковалентно связанных друг с другом ковалентными связями, например фосфодиэфирными связями.

В клетке ДНК обычно существует в двухцепочечной форме и, как таковая, имеет две комплементарные цепи нуклеиновой кислоты, обозначенные здесь как «верхняя» и «нижняя» цепи. В некоторых случаях комплементарные цепи хромосомной области могут упоминаться как «плюс» и «минус» цепи, «первая» и «вторая» цепи, «кодирующие» и «некодирующие» цепи, «Уотсон» и «Крик», или «смысловые» и «антисмысловые» цепи. Обозначение цепи как верхней или нижней цепи является произвольным и не подразумевает какой-либо конкретной ориентации, функции или структуры. Нуклеотидные последовательности первой цепи нескольких примеров хромосомных областей млекопитающих (например, ВАС, сборки, хромосомы и т. д.) известны и могут быть найдены, например, в базе данных Genbank NCBI.

Используемый в данном документе термин «верхняя цепь» относится к любой цепи нуклеиновой кислоты, но не к двум цепям нуклеиновой кислоты. Когда олигонуклеотид или праймер связывается или отжигается «только до верхней цепи», то он связывается только с одной цепью, но не с другой. Термин «нижняя цепь», как используется в данном документе, относится к цепи, которая комплементарна «верхней цепи». Когда олигонуклеотид связывается или отжигается «только с одной цепью», то он связывается только с одной цепью, например, с первой или второй цепью, но не с другой цепью.

Термин «ковалентное связывание» относится к образованию ковалентной связи между двумя отдельными молекулами, например, верхней и нижней цепями двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Лигирование является типом ковалентного связывания.

Используемый в данном документе термин «денатурация» относится к расхождению, по меньшей мере, части пар оснований дуплекса нуклеиновой кислоты путем инкубирования дуплекса в подходящих денатурирующих условиях. Денатурирующие условия хорошо известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения, для денатурирования дуплекса нуклеиновой кислоты дуплекс может подвергаться воздействию температуры, которая выше температуры плавления дуплекса, тем самым высвобождая одну цепь дуплекса от другой. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота может быть денатурирована подвергаясь воздействию температуры, по меньшей мере, 90^oC в течение подходящего времени (например, по меньшей мере 30 секунд, до 30 минут). Нуклеиновые кислоты также могут быть денатурированы химически (например, с использованием мочевины или NaOH).

Используемый в данном документе термин «маркер» относится к любому атому или молекуле, который(-ая) может быть использован(-а) для обеспечения определения (предпочтительно количественно) и который(-ая) может быть присоединен(-а) к нуклеиновой кислоте или белку. Маркеры включают, но не ограничиваются ими, красители и радиоактивные метки, такие как ³²P; связывающие фрагменты, такие как биотин; гаптены, такие как дигоксигенин; люминогенные, фосфоресцирующие или флуорогенные фрагменты; и флуоресцентные красители сами по себе или в комбинации с фрагментами, которые могут подавлять или сдвигать спектры излучения посредством флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). Маркеры могут обеспечивать сигналы, детектируемые флуоресценцией, радиоактивностью, колориметрией, гравиметрией, дифракцией или поглощением рентгеновских лучей, магнетизмом, ферментативной активностью и т.п. Маркер может представлять собой фрагмент определенного заряда (положительный или отрицательный заряд) или, альтернативно, может иметь нейтральный заряд. Маркеры могут содержать или состоять из нуклеиновой кислоты или белковой последовательности, если последовательность, содержащая маркер, детектируется.

Термины «меченый олигонуклеотид» и «меченый зонд», используемые в данном документе, относятся к олигонуклеотиду, который имеет аффинную метку (например, биотиновый фрагмент), олигонуклеотид, модифицированный атомами или группами, обеспечивающий разделение или детектирование (например, бромдезоксиуридин, или коллоидные частицы золота, придающие другую плотность), и олигонуклеотид, модифицированный с помощью оптически детектируемого маркера (например, флуоресценция или другой тип светоизлучающего маркера). Олигонуклеотиды, которые содержат только природные нуклеотиды, не являются мечеными олигонуклеотидами.

Термин «элонгация», как используется в данном документе, относится к наращиванию праймерной последовательности путем добавления нуклеотидов с использованием полимеразы. Если праймер, который отжегся с нуклеиновой кислотой, элонгируется, нуклеиновая кислота действует как матрица для реакции элонгации.

Используемый в данном документе термин «соответствующие концы» во фразе «лигирование первого и второго олигонуклеотидов к соответствующим концам фрагмента» означает, что один олигонуклеотид присоединяется к одному концу фрагмента, а другой олигонуклеотид присоединяется к другому концу целевого фрагмента.

Используемый в данном документе термин «соединены с возможностью лигирования» в контексте двух олигонуклеотидных последовательностей, которые соединены с возможностью лигирования друг с другом, означает, что между двумя олигонуклеотидами нет промежуточных нуклеотидов, и они могут быть лигированы друг с другом.

Используемый в данном документе термин «фиксирующий олигонуклеотид», относится к олигонуклеотиду, который при гибридизации с двумя или более другими полинуклеотидами действует как «фиксатор», чтобы расположить полинуклеотиды рядом друг с другом, так что они могут быть лигированы вместе, как показано на Фиг. 1.

Используемый в данном документе термин «кольцевая молекула нуклеиновой кислоты» относится к цепи, которая находится в форме замкнутого кольца, который не имеет свободных 3' или 5' концов.

Термин «соответствует» и грамматические эквиваленты, например «соответствующие», как используется в данном документе, относится к конкретной взаимосвязи между элементами, к которым относится этот термин. Например, RCA, которая соответствует последовательности в геноме, содержит ту же нуклеотидную последовательность, что и последовательность в геноме.

Определенные полинуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть описаны формулой (например, «X'-A'-B'-Z '»). Если не указано иное, полинуклеотиды, определенные формулой, могут быть ориентированы в направлении от 5' до 3' или в направлении от 3' до 5'. Например, полинуклеотиды, определенные формулой «X'-A'-B'-Z '», могут быть «5'-X'-A'-B'-Z'-3'" или "3'-X'- А'-B'-Z '5' ». Компоненты формулы, например, «А», «Х» и «В» и т. д., относятся к отдельно определяемым последовательностям нуклеотидов внутри полинуклеотида, где, если они не определяются контекстом (например, в случае "лигируемого» комплекса конкретной формулы), последовательности последовательно связаны ковалентно, так что полинуклеотид, описываемый формулой, представляет собой одну молекулу. Во многих случаях компоненты формулы непосредственно примыкают друг к другу в одной молекуле. Следуя соглашению, комплементарная цепь последовательности, показанной в формуле, будет обозначаться одинарной кавычкой (') таким образом, что комплементарная цепь последовательности «А» будет «А'». Более того, если не указано иное или неявно из контекста, полинуклеотид, определенный формулой, может иметь дополнительную последовательность, сайт связывания праймера, молекулярный баркод, промотор или спейсер и т. д. на своем 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах 3' и 5'. Если полинуклеотид, определенный формулой, описывается как кольцевой, то концы таких молекул соединяются вместе, непосредственно или опосредованно. Например, в случае кольцевых комплексов формулы X-A-B-Z-Y, 5'-конец молекулы соединяется, непосредственно или опосредованно, с 3'-концом молекулы для образования кольцевой молекулы. Очевидно, что различные последовательности компонентов полинуклеотида (например, A, B, C, X, Y, Z и т. д.) могут независимо иметь любую желаемую длину до тех пор, пока они способны выполнять желаемую функцию (например, гибридизации с другой последовательностью). Например, различные последовательности компонентов полинуклеотида могут независимо иметь длину в диапазоне 8-80 нуклеотидов, например, 10-50 нуклеотидов или 12-30 нуклеотидов.

Термин «лигируемый комплекс», например, формулы X-A-B-Z, относится к комплексу, в котором различные олигонуклеотиды соединены друг с другом с возможностью лигирования (в круговой или линейной форме), удерживаемые вместе фиксирующим олигонуклеотидом, как показано на Фиг. 1.

Термин «лигируемый кольцевой комплекс», например, формулы X-A-B-Z-Y, относится к кольцевому комплексу, в котором различные олигонуклеотиды непосредственно связаны друг с другом по кругу, удерживаемые вместе фиксирующим олигонуклеотидом.

Термины «локус», «геномный локус», используемые в данном документе, относятся к определенной области генома, например, к геному животного или растения, например, к геному человека, обезьяны, крысы, рыбы или насекомых, или растений. Локус может быть участком хромосомы, который имеет размер от около 100 кБ и до размеров хромосомного плеча или целой хромосомы.

Термины «первый локус» и «второй локус» относятся к разным локусам, т. е. к различным областям в геноме, например, к различным хромосомным плечам или к различным хромосомам.

Термин «фрагменты локуса» относятся к набору определенных фрагментов (которые могут быть получены с использованием рестрикционного фермента или путем перепрограммирования эндонуклеазы, ориентированной на РНК, такой как CAS9) конкретного локуса. Не все фрагменты локуса необходимо анализировать. Поскольку были опубликованы последовательности различных геномов, разработка олигонуклеотидов, которые гибридизуются с фрагментом локуса, является рутинной.

Термин «комплементарный фрагменту» относится к последовательности, которая комплементарна по отношению к цепи (либо верхней, либо нижней цепи) фрагмента.

Термин «геномная последовательность», как используется в данном документе, относится к последовательности, которая находится в геноме.

Термин «вариабельная» в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые являются вариабельными, относится к двум или более нуклеиновым кислотам, которые имеют разные последовательности нуклеотидов относительно друг друга. Другими словами, если полинуклеотиды набора имеют вариабельную последовательность или определенная последовательность «варьирует», то нуклеотидная последовательность молекул полинуклеотидов набора изменяется от молекулы к молекуле. Термин «вариабельная» не следует понимать в том смысле, что каждая молекула в наборе имеет индивидуальную отличительную последовательность по сравнению другими молекулами в наборе.

Если две нуклеиновые кислоты (например, последовательности A и A') являются «комплементарными», они гибридизуются друг с другом в условиях высокой жесткости. Во многих случаях две последовательности, которые являются комплементарными, имеют, по меньшей мере, 10, например, по меньшей мере 12, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20 или, по меньшей мере, 25 комплементарных нуклеотидов и в некоторых случаях могут иметь одно, два или три некомплементарных основания.

Термин «идентифицирует» в контексте последовательности, которая идентифицирует локус, относится к молекулярному баркоду, уникальному для локуса. Такая последовательность не относится к самому локусу, а скорее к молекулярному баркоду, обычно имеющему последовательность, которая отсутствует в исследуемом образце и которая добавляется к фрагментам локуса, которые анализируются, и который идентифицирует эти фрагменты как имеющиеся в локусе. Например, если фрагменты из первого локуса лигируются с первой идентифицирующей последовательностью, а фрагменты из второго локуса лигируются со второй идентифицирующей последовательностью, то источник этих фрагментов (локус, которым они соответствуют) может быть определен путем определения идентифицирующей последовательности, которая была лигирована с этими фрагментами.

Термин «инвертированная ориентация» в контексте двух последовательностей, которые гибридизуются с другими последовательностями в инвертированной ориентации, относится к структуре, в которой 5' и 3' концы одной из последовательностей гибридизуются с другой таким образом, что концы обращены друг к другу, как показано в верхней части Фиг. 3В.

Используемый в данном документе термин «амплификация по типу катящегося кольца» или «RCA» для краткости относится к изотермической амплификации, которая производит линейные конкатенированные копии круговой матрицы нуклеиновой кислоты с использованием полимеразы, вытесняющей цепочку. RCA хорошо известен в области молекулярной биологии и описан в различных публикациях, включая, но не ограничиваясь ими, Lizardi et al (Nat. Genet. 1998 19:225-232), Schweitzer et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 97:10113-10119), Wiltshire et al (Clin. Chem. 2000 46:1990-1993) and Schweitzer et al (Curr. Opin. Biotech 2001 12: 21-27), которые включены в данный документ в качестве ссылки.

Как используется в данном документе, термин «продукты амплификации катящегося кольца» относится к конкатенированным продуктам реакции амплификации по типу катящегося кольца. Используемый в данном документе термин «флуоресцентно меченые продукты амплификации по типу катящегося кольца» относится к продуктам амплификации по типу катящегося кольца, которые флуоресцентно мечены, например, путем гибридизации флуоресцентно меченного олигонуклеотида с продуктами амплификации по типу катящегося кольца или другими способами (например, путем включения флуоресцентного нуклеотида в продукт во время амплификации).

Используемый в данном документе термин «область» в контексте области подложки или области изображения относится к прилегающей или неприлегающей области. Например, если метод включает подсчет количества помеченных продуктов RCA в области, область, в которой подсчитываются продукты RCA, может представлять собой одну область, прилегающую область или несколько неприлегающих областей.

Используемый в данном документе термин «получение изображения» относится к процессу, посредством которого оптические сигналы с поверхности объекта детектируются и хранятся в виде данных, связанных с местоположением (то есть в виде «пикселей»). Из этих данных можно восстановить цифровое изображение объекта. Область подложки может быть отображена с использованием одного изображения или одного или нескольких изображений.

Используемый в данном документе термин «отдельные маркированные продукты RCA» относится к отдельным молекулам RCA, которые помечены (маркированы).

Используемый в данном документе термин «подсчет» относится к определению количества отдельных объектов в большом наборе. «Подсчет» требует обнаружения отдельных сигналов от отдельных объектов во множестве объектов (не общего сигнала от множества объектов), а затем определения количества объектов, присутствующих во множестве, путем подсчета отдельных сигналов. В контексте данного способа «подсчет» осуществляется путем определения количества отдельных сигналов в массиве сигналов.

Используемый в данном документе термин «массив» применительно к набору продуктов RCA относится к набору одиночных продуктов RCA на плоской поверхности, где продукты RCA пространственно отделены друг от друга на плоскости поверхности (до степени, определенной распределением Пуассона, если массив действительно случайный). «Случайный» массив представляет собой массив, в котором элементы, например, продукты RCA, распределены на поверхности подложки в положениях, которые не определены заранее. В некоторых случаях распределение продуктов RCA на случайном массиве может быть описано распределением Пуассона, так что, например, распределение расстояний между продуктами RCA случайного массива аппроксимируется распределением Пуассона.

Другие определения терминов могут быть даны в тексте данного документа.

Подробное описание сущности изобретения

Прежде чем описывать различные варианты реализации изобретения, следует понимать, что идеи данного изобретения не ограничены конкретными описанными вариантами реализации изобретения, которые, могут, разумеется, быть изменены. Следует также понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения объема изобретения, поскольку объем данного изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описанный предмет каким-либо образом. Хотя данное изобретение описано в сочетании с различными вариантами реализации, не предполагается, что данное изобретение ограничивается такими вариантами его реализации. Напротив, данное изобретение охватывает различные альтернативы, модификации и эквиваленты, что будет понятно специалистам в данной области техники.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, также могут быть использованы в практике или испытаниях данного изобретения, описаны некоторые примеры способов и материалов.

Ссылка на любую публикацию предназначена для ее описания до даты подачи заявки и не должна толковаться как признание того, что данная заявка не имеет права датировать такую публикацию более ранним числом в силу предшествующего изобретения. Кроме того, даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут быть независимо подтверждены.

Как будет очевидно специалистам в данной области техники после прочтения этого описания, каждый из отдельных вариантов реализации изобретения, описанных и проиллюстрированных в данном документе, имеет дискретные компоненты и признаки, которые могут быть легко выделены или объединены с признаками любого из нескольких других вариантов без отхода от объема или смысла данного изобретения. Любой описанный способ может быть использован в порядке описанных действий или в любом другом порядке, который логически возможен.

Все патенты и публикации, включая все последовательности, описанные в таких патентах и публикациях, упоминаемые в данном документе, явно включены с помощью ссылки.

Композиции зондов

Некоторых варианты реализации системы зондов могут содержать: (a) набор идентифицирующих олигонуклеотидов последовательности B; (b) набор фиксирующих олигонуклеотидов формулы X'-A'-B'-Z ', где: внутри набора: (i) последовательности A' и B' варьируют, и (ii) последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются переменными; и в каждом фиксирующем олигонуклеотиде: (i) последовательность А' комплементарна геномному фрагменту образца нуклеиновой кислоты и (ii) последовательность В' комплементарна, по меньшей мере, одному члену набора идентифицирующих олигонуклеотидов; и (c) одну или более зондовых последовательностей, содержащих X и Z, где последовательности X и Z не являются переменными и гибридизуются с последовательностями X“ и Z'; где каждый фиксирующий олигонуклеотид способен гибридизоваться с: (i) зондовыми последовательностями, (ii) членом набора идентифицирующих олигонуклеотидов и (iii) геномным фрагментом, в результате чего образуется лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z. Как будет описано более подробно ниже, в некоторых вариантах реализации изобретения различные идентифицирующие олигонуклеотиды и их комплементарные последовательности В' идентифицируют разные хромосомы, например, хромосомы 21, 18 и 13.

На Фиг. 1 показан лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z, структура которого характеризует описанную систему зондов. Как показано на Фиг. 1, в комплексных последовательностях X, A, B и Z соединены друг с другом возможностью лигирования, удерживаемые в положении с помощью фиксирующего олигонуклеотида. Как показано на Фиг. 1, последовательность А представляет собой фрагмент-мишень генома (например, цепь рестрикционного фрагмента), а последовательность В идентифицирует локус (например, конкретную область на хромосоме, конкретное плечо хромосомы или конкретную хромосому и т. д.), из которой получена примыкающая последовательность А. Связь между последовательностями А и В проиллюстрирована на Фиг. 2, которая иллюстрирует простой набор зондов, гибридизованный с различными геномными фрагментами (от A₁ до A₆). Как показано на Фиг. 2, геномные фрагменты в трех верхних комплексах (последовательности A₁, A₂, и A₃) имеют происхождение из первого локуса (например, хромосомы 21), а геномные фрагменты в нижних трех комплексах (последовательности A₄, A₅ и A₆) из второго локуса (например, хромосомы 18). Локус, из которого получены геномные фрагменты в трех верхних комплексах, идентифицируется одной последовательностью (B₁), а локус, из которого получены геномные фрагменты в нижних трех комплексах, идентифицируется другой последовательностью (B₂). Последовательность X и Z одинакова во всех иллюстрированных комплексах.

Очевидно, что набор фиксирующих олигонуклеотидов может быть настолько большим, насколько это необходимо, и в некоторых вариантах реализации изобретения последовательность А' может иметь разнообразность, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10 000 или, по меньшей мере, 50 000 или более того, это означает, что фиксирующие олигонуклеотиды могут в совокупности гибридизоваться с, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10 000 или, по меньшей, мере 50 000 или более фрагментами геномной ДНК. Последовательность B' в наборе фиксирующих олигонуклеотидов может быть гораздо менее разнообразной, поскольку она просто служит идентификатором локуса. Таким образом, в наборе фиксирующих олигонуклеотидов последовательность В' может иметь разнообразность, по меньшей мере, 2, например, 3 или 4, хотя последовательность В' может иметь разнообразность, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 100 или, по меньшей мере, 1000 в некоторых вариантах реализации. Очевидно, что поскольку последовательность В' является комплементарной по отношению к последовательности В, разнообразность набора локус-специфических олигонуклеотидов может быть такой же, как разнообразность последовательности В'. Например, если имеется три идентифицирующих олигонуклеотида, могут быть три различные последовательности В'. Количество фиксирующих олигонуклеотидов в наборе может сильно варьироваться в зависимости от длины локуса и количества фрагментов-мишеней. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый набор фиксирующих олигонуклеотидов может содержать, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 500, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10 000 или, по меньшей мере, 50 000 различных фиксирующих олигонуклеотидов.

Например, в некоторых вариантах реализации изобретения набор фиксирующих олигонуклеотидов может содержать: (i) первую группу фиксирующих олигонуклеотидов, которые содержат, по меньшей мере, 100 А' последовательностей, например набор A_{1, X}’, x=1-100+, которые являются комплементарными различным фрагментам первого локуса (например, фрагментам хромосомы 21 или, например, набор A_1,X, x=1-100+), где каждый из этих поднаборов фиксирующих олигонуклеотидов имеет одинаковую B' последовательность, например, B₁’; (ii) вторую группу фиксирующих олигонуклеотидов, которые содержат, по меньшей мере, 100 A’ последовательностей, например набор A_{2, X}’, x=1-100+, которые комплементарны различным фрагментам второго локуса (например, фрагменты хромосому 18 или, например, набор A_{2 X}, x=1-100+), где каждая из этих групп фиксирующих олигонуклеотидов имеет одинаковую последовательность B’, например B₂’, которая отличается от последовательности B' первой (или любой другой) группы; (iii) третью группу фиксирующих олигонуклеотидов, которые содержат, по меньшей мере, 100 A’ последовательностей, например набор A_3,X’, x=1-100+, которые являются комплементарными к различным фрагментам третьего локуса (например, фрагментам хромосомы 18 или, например, набор A_{3 X}, x=1-100+), где каждая из этих групп фиксирующих олигонуклеотидов имеет одинаковую последовательность B’, например B₃’, которая отличается от последовательности B' любой другой группы; (iv) необязательную четвертую группу фиксирующих олигонуклеотидов, которые содержат, по меньшей мере, 100 А' последовательностей, например набор A_{4 X}’, x=1-100+, которые являются комплементарными к различным фрагментам четвертого локуса (например, фрагментам другой хромосомы или, например, набор A_{4, X}, x=1-100+), где каждая из этих групп фиксирующих олигонуклеотидов имеет последовательность B', например B₄’, которая отличается от последовательности B' любой другой группы.

Как показано на Фиг. 3, система зондов может быть сконфигурирована различными способами в зависимости от того, как она будет использоваться. Например, как показано на Фиг. 3A, В и Г, последовательности X и Z могут находиться в разных молекулах, и в результате лигируемый комплекс является линейным. В этих вариантах реализации изобретения один или более зондов, которые содержат последовательности X и Y, могут содержать первый олигонуклеотид, содержащий последовательность X и второй олигонуклеотид, содержащий последовательность Y. В этих вариантах реализации изобретения первый и второй олигонуклеотиды не нуждаются в дополнительных свободных последовательностях (хвостах), как показано на Фиг. 1А. В этих вариантах реализации изобретения после лигирования продукты лигирования можно амплифицировать, используя, например, описанные праймеры ПЦР, которые гибридизуются с последовательностями X и Z. В некоторых вариантах реализации изобретения (как показано на фиг. 3В и 3Г) первый и/или второй олигонуклеотиды могут сами иметь дополнительную свободную последовательность (хвост), для обеспечения сайта связывания праймера, чтобы облегчить амплификацию и подсчет. В некоторых вариантах реализации изобретения хвост может содержать молекулярный маркер (например, случайную последовательность), который позволяет подсчитать количество исходных продуктов лигирования после того, как эти молекулы были амплифицированы и секвенированы. В альтернативных вариантах реализации изобретения и, как показано на фиг. 3Б, один или более зондов, которые содержат последовательности X и Y, могут представлять собой одиночный основной зонд формулы X-Y-Z. В этих вариантах реализации изобретения, как показано, лигируемый комплекс представляет собой кольцевой лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z-Y, где последовательность Y объединяет последовательности X и Z. В другом варианте реализации изобретения, проиллюстрированном на фиг. 3Д, один или более зондов, которые содержат последовательности X и Z, могут быть частью самого фиксирующего олигонуклеотида. В этих вариантах реализации изобретения продукт лигирования может представлять собой «гантель», как показано на фиг. 3Д.

В этих вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать пару праймеров ПЦР, которые гибридизуются с одним или несколькими зондами, которые содержат последовательности X и Z, тем самым позволяя центральной части продукта лигирования (то есть часть, которая содержит последовательности A и B) быть амплифицированной. В некоторых вариантах реализации изобретения, например, в варианте реализации изобретения, показанном на фиг. 3Б, система зондов может дополнительно содержать праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде, тем самым облегчая амплификацию этих продуктов путем амплификации по типу катящегося кольца. В некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может содержать праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью основного зонда и до четырьмя различно мечеными олигонуклеотидами, причем каждый из различно меченых олигонуклеотидов гибридизуется с комплементарной цепью последовательности B'. Это будет объяснено более подробно ниже.

По существу, некоторые варианты реализации системы зондов могут включать в себя фиксирующие олигонуклеотиды, основной зонд и один или несколько локус-специфических олигонуклеотидов. Система зондов может также содержать один или несколько праймеров для амплификации, таких как праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде или пару праймеров ПЦР, которые гибридизуются с сайтами в основном зонде и, необязательно, один или несколько меченых зондов, которые гибридизуются с комплементарной цепью локус-специфического олигонуклеотида.

Как отмечено выше, последовательность А' варьирует между различными членами набора, и каждая из последовательностей А' является комплементарной к другому фрагменту-мишени генома. Последовательности А' могут независимо варьировать по длине и последовательности и в некоторых случаях могут иметь длину в диапазоне от 8 до 80 нуклеотидов, например, от 10 до 60 нуклеотидов, в зависимости от длины и последовательности фрагментов-мишеней. Последовательность B' идентифицирует локус, из которого получен соседний фрагмент (например, конкретная хромосома, такая как хромосома 18 или 21 и т. д.). Последовательность B' может иметь любую подходящую длину, но в некоторых вариантах реализации она находится в диапазоне от 8 до 30 нуклеотидов. В каждом отдельном исследовании последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются вариабельными. Последовательность X' и Z' может иметь любую подходящую длину, но в некоторых вариантах реализации изобретения они независимо имеют длину в пределах от 8 до 30 нуклеотидов в длину, хотя могут использоваться более длинные или более короткие последовательности. Общая длина фиксирующих олигонуклеотидов может находиться в диапазоне от 50 до 200 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фиксирующие олигонуклеотиды могут быть биотинилированы, что позволяет отделять продукты лигирования (обсуждаемые ниже) от других, не лигированных продуктов, перед амплификацией. Очевидно, что последовательности X и Z (которые могут иметь любую подходящую длину, но в некоторых вариантах реализации изобретения они независимо находятся в диапазоне от 8 до 30 нуклеотидов) не являются вариабельными и гибридизуются с последовательностями X' и Z'. Локус-специфический олигонуклеотид имеет последовательность В, которая, опять же, может иметь любую подходящую длину, например, в пределах от 8 до 30 нуклеотидов в длину.

Как отмечено выше, комплексы, полученные с использованием описанной выше системы зондов, могут быть линейными или кольцевыми (как показано на Фиг. 3). На Фиг. 4 показаны некоторые особенности кольцевого варианта реализации, показанного на Фиг. 3Б.

Как показано на Фиг. 4, в некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может содержать набор фиксирующих олигонуклеотидов 2 (формулы X'-A'-B'-Z', который может находиться в 5'-3' или 3'-5' ориентации), основной зонд 6 формулы X-Y-Z, где последовательности X и Z не являются вариабельными и гибридизуются с последовательностями X' и Z' в инвертированной ориентации (т. е. чтобы концы остова были направлены навстречу друг другу, как показано), и набор локус-специфических олигонуклеотидов 8 последовательности B. Последовательность Y в основном зонде может быть любой удобной длины, например, от 20 до 100 нуклеотидов. Общая длина основного зонда 6 может находиться в диапазоне от 50 до 300 нуклеотидов в длину или больше в некоторых случаях.

Как показано на Фиг. 4, набор зондов характеризуется тем, что различные олигонуклеотиды могут гибридизоваться с геномными фрагментами с получением первого набора кольцевых лигируемых комплексов 10 (то есть, комплекс, в котором концы основной цепи зонда 6, локус-специфический олигонуклеотид 8 и геномный фрагмент 4 соединены друг к другу с возможностью лигирования и удерживаются в таком положении (с возможностью лигирования) с помощью фиксирующего олигонуклеотида 2). Как показано на проиллюстрированном примере, основной зонд 6, локус-специфический олигонуклеотид 8 и фрагмент 4 гибридизуются с первыми фиксирующими олигонуклеотидами 2 для получения набора лигируемых кольцевых комплексов 10 формулы X-A-B-Z-Y, где последовательность Y объединяет последовательности X и Z. Фрагменты 4, которые присутствуют в этом наборе лигируемых кольцевых комплексов 10, могут быть фрагментами, по меньшей мере, 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере, 10 или, по меньшей мере, 50 или более различных локусов (например, разных хромосом), и идентификация локуса, из которого получен соседний фрагмент (например, конкретные хромосомы) происходит с помощью локус-специфического олигонуклеотида 8, который имеет одну и ту же последовательность для каждого локуса. В этом примере последовательности A и A' (которые соответствуют последовательностям разных геномных фрагментов) варьируют, B и B' (идентификатор локуса) варьируют, а последовательности X, Y и Z не меняются.

Как будет описано более подробно ниже, в этом варианте реализации изобретения система зондов (которая содержит первый набор фиксирующихи олигонуклеотидов 2, основной зонд 6 и локус-специфический олигонуклеотид 8), может быть гибридизована с образцом, который содержит геномные фрагменты 4 для получения первого набора лигируемых кольцевых комплексов формулы X-A-B-Z-Y 10, как показано. После лигирования лигируемых кольцевых комплексов для получения первого набора кольцевых молекул ДНК 12 формулы X-A-B-Z-Y первый набор кольцевых молекул ДНК может быть ампилифицирован путем амплификации по типу катящегося кольца (RCA) для получения первого набора продуктов RCA 16. RCA может выполняться с использованием праймера 14 для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде 6, как показано на Фиг. 4, или праймеры ПЦР, которые гибридизуются с сайтами, которые фланкируют лигированный фрагмент. По существу, в некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать праймер 14 для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизируется с последовательностью в основном зонде 6 или пару ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с сайтами, которые фланкируют лигированный фрагмент. После RCA «источник» клонированного фрагмента в конкретном продукте RCA 16 (т. е. локус, например, конкретная хромосома, из которой получен клонированный геномный фрагмент) затем может быть определен путем гибридизации первого меченого олигонуклеотида 18 с комплементарной к последовательности B цепью (т. е. B') или путем секвенирования. Как видно, меченый олигонуклеотид 18 может содержать, по меньшей мере, часть последовательности В. В частности, в некоторых вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать меченый олигонуклеотид, который гибридизуется с комплементарной цепью первого локус-специфического олигонуклеотида 8.

Очевидно, что если последовательности из двух или более разных локусов должны быть обнаружены в одной и той же реакции, система зондов может содержать дополнительные индивидуально различимые маркированные олигонуклеотиды, по одному для каждого идентификатора B локуса, так что оба набора продуктов RCA могут быть идентифицированы одновременно. В этих вариантах реализации изобретения система зондов может дополнительно содержать до четырех индивидуально различимых меченых олигонуклеотидов (например, B₁, B₂, B₃, B₄), где каждый из различимых меченых олигонуклеотидов гибридизуется с комплементарной цепью последовательности B' (например, B₁’, B₂’, B₃’, B₄’).

Очевидно, что фрагменты, с которыми гибридизуются фиксирующие олигонуклеотиды, являются рестрикционными фрагментами анализируемого генома. Кроме того, любой из зондов, олигонуклеотидов или праймеров, описанных выше (например, основной зонд), может содержать молекулярный баркод (например, индексирующую последовательность, например случайную или полуслучайную последовательность), так что каждая кольцевая молекула ДНК может быть определена комбинацией клонированного фрагмента и баркода, тем самым позволяя подсчитать, сколько начальных молекул было секвенировано даже после того, как молекулы были амплифицированы (см., например, Casbon et al).

Способы

Также в данном документе предлагается способ, включающий: (а) гибридизацию системы зондов, как описано выше, с исследуемым геномным образцом, который содержит фрагменты генома для получения лигируемых комплексов формулы X-A-B-Z; (b) лигирование лигируемых комплексов с получением молекул ДНК-продукта формулы X-A-B-Z; и (c) подсчет молекул ДНК продукта, соответствующих каждому идентификатору локуса последовательности B. В некоторых вариантах реализации изобретения подсчет может быть осуществлен путем секвенирования молекул ДНК-продукта или их продуктов амплификации для получения последовательных чтений и подсчета числа считанных последовательностей, содержащих каждую последовательность B.

В вариантах реализации изобретения, в которых молекулы ДНК продукта являются кольцевыми, подсчет может включать в себя амплификацию молекул ДНК-продукта путем амплификации по типу катящегося кольца и подсчет количества продуктов амплификации, содержащих каждую последовательность B. В этих вариантах реализации изобретения способ может включать маркировку продуктов RCA с использованием различимых меченых зондов, которые гибридизуются с последовательностью B', а подсчет выполняется путем подсчета количества продуктов RCA для каждой отличимой метки. Общие принципы одного варианта реализации этого метода показаны на Фиг. 4. Очевидно, что фрагменты, с которыми гибридизуются фиксирующие олигонуклеотиды, могут быть (независимо) верхними или нижними цепями рестрикционных фрагментов анализируемого генома. Эти фрагменты могут быть получены путем расщепления генома одним или несколькими рестрикционными ферментами (например, комбинацией ферментов, которые имеют последовательность распознавания длиной 4 основания), а затем денатурацией расщепленного образца. Таким образом, клонированные фрагменты имеют определенные концы, что позволяет конструкции фиксирующих олигонуклеотидов клонировать эти фрагменты. Существуют и другие способы создания фрагментов, которые имеют определенные концы (например, способы, которые используют FEN (flap endonuclease), экзонуклеазу, заполнение пропусков (gap-fill) и т. д.).

Как указано выше, этот способ может быть мультиплексирован, чтобы обеспечить способ анализа двух или более различных локусов, как показано на Фиг. 5. Проиллюстрированный на Фиг. 5 образец, содержащий фрагменты геномной ДНК 40, может быть: а) гибридизован с системой зондов 42, содержащей: (i) первый набор фиксирующих зондов, как описано выше; (ii) специфичный к первому локусу олигонуклеотид, как описано выше; (iii) второй набор фиксирующих зондов, как описано выше; (iv) второй локус-специфичный олигонуклеотид, как описано выше; и (v) основной зонд, как описано выше, для получения смеси 44, содержащей первый набор лигируемых кольцевых комплексов формулы X-A-B-Z-Y (которые содержат фрагменты из первого локуса, например из первой хромосомы, а также фрагменты из второго локуса, например, их второй хромосомы). Затем способ включает (b) лигирование лигируемых кольцевых комплексов с получением смеси кольцевых молекул ДНК 46 (которая содержит первый и второй наборы кольцевых молекул ДНК) и после обработки образца экзонуклеазой для удаления молекул линейной нуклеиновой кислоты, (c) амплификацию кольцевых молекул ДНК 46 путем амплификации по типу катящегося кольца с использованием одного праймера, который гибридизуется с основным зондом, для получения продуктов RCA 48. Локус, из которого происходит каждый из фрагментов, содержащихся в каждом продукте RCA, затем может быть идентифицирован путем гибридизации продуктов RCA с различно мечеными первым и вторым олигонуклеотидными зондами, которые гибридизуются с комплементарной цепью локус-специфического олигонуклеотида, который присутствует в каждом из продуктов , для получения меченого образца 50. В этих вариантах реализации изобретения способ может включать: (г) отдельное детектирование: (i) продуктов RCA, которые содержат фрагменты из первого локуса с использованием меченого зонда, который гибридизуется с идентификацирующей последовательностью первого локуса, и (ii) продуктов RCA, которые содержат фрагменты из второго локуса с использованием меченого зонда, который гибридизуется с идентификацирующей последовательностью второго локуса, причем меченые зонды различно маркированы. Как отмечено выше, после лигирования, если фиксирующие олигонуклеотиды биотинилированны, кольцевые продукты могут быть выделены из нелигированных продуктов, используя, например, гранулы стрептавидина. В любом случае лигированный образец может быть обработан экзонуклеазой, тем самым удаляя из реакции линейные молекулы ДНК. Этот принцип можно расширить для подсчета количество продуктов лигирования, полученных для любого количества локусов (например, 3, 4, до 10 или до 100 или более локусов).

В некоторых вариантах реализации изобретения этап детектирования может (г) содержать: (i) осаждение продуктов RCA на подложку; и (ii) отдельный подсчет количества отдельных меченных продуктов RCA, которые маркированы одной меткой и количества отдельных меченных продуктов RCA, которые маркированы другой меткой в области подложки. Следует понимать, что гибридизацию меченых олигонуклеотидов можно провести до того, как продукты RCA будут распределены на подложке или после того, как продукты RCA будут распределены на подложке.

Другими словами, количество продуктов амплификации по типу катящегося кольца, соответствующих каждому локусу, можно оценить, например, путем распределения продуктов RCA на поверхности подложки (слайда или пористой мембраны), гибридизации продуктов RCA с использованием меченых олигонуклеотидов (например, флуоресцентно меченых олигонуклеотидов), а затем подсчета числа дискретных сигналов в области подложки, например, с использованием флуоресцентного считывателя. Маркировка может быть выполнена до или после того, как продукты были распределены по подложке, и, поскольку каждый продукт RCA содержит тысячи копий одних и тех же последовательностей, должны быть тысячи сайтов связывания для меченных олигонуклеотидов, тем самым увеличивая уровень сигнала. В мультиплексных вариантах реализации изобретения (например, в которых исследуются продукты RCA, соответствующие двум различным локусам), продукты RCA, соответствующие одному локусу, могут быть помечены одним флуорофором, а продукты RCA, соответствующие другому локусу, могут быть помечены другим флуорофором, позволяя провести подсчет различных продуктов RCA.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ может содержать (а) фильтрацию жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (RCA) через пористую прозрачную капиллярную мембрану, тем самым концентрируя продукты RCA и создавая массив продуктов RCA на мембране; (b) флуоресцентное маркирование продуктов RCA до или после стадии (а); и (c) подсчет количества отдельных меченных продуктов RCA в области мембраны, тем самым обеспечивая оценку количества меченных продуктов RCA в образце. В некоторых вариантах реализации изобретения пористая прозрачная капиллярная мембрана может представлять собой пористую анодную мембрану из оксида алюминия. В этих вариантах реализации изобретения этап маркировки (b) может быть осуществлен путем гибридизации флуоресцентно меченных олигонуклеотидов с продуктами RCA до или после стадии (а). В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать визуализацию области мембраны для получения одного или нескольких изображений и подсчет количества отдельных меченных продуктов RCA на одном или на нескольких изображениях. Примеры таких способов описаны в PCT/IB2016/052495, поданной 2 мая 2016 года, которая включена в данный документ посредством ссылки.

Количественное определение сигналов от отдельных продуктов RCA является важным и значимым, потому что во многих применениях (например, при неинвазивной пренатальной диагностике путем анализа вкДНК) необходимо точно и без искажений определить количество фрагментов, соответствующих конкретным хромосомам (например, хромосоме 21). Типичные методы анализа используют ПЦР, которая, как известно, является очень неточной процедурой, поскольку некоторые последовательности амплифицируются с гораздо более высокой эффективностью, нежели другие. Это делает стратегии на основе ПЦР непрактичными для многих диагностических целей.

В конкретных вариантах реализации изобретения образец может содержать множество групп продуктов RCA (например, две, три или четыре или более групп продуктов RCA, например, первую группу маркированных продуктов RCA и вторую группу продуктов RCA), где различные группы продуктов RCA отличаются маркировкой, что означает, что отдельные представители каждой из групп меток продуктов RCA могут быть независимо детектированы и подсчитаны, даже если популяции смешаны. Подходящие различимые пары флуоресцентных маркеров, полезные в предлагаемых способах, включают, например, Cy-3 и Cy-5 (Amersham Inc., Piscataway, NJ), Quasar 570 и Quasar 670 (Biosearch Technology, Novato CA), Alexafluor555 и Alexafluor647 (Molecular Probes, Eugene, OR), BODIPY V-1002 и BODIPY V1005 (Molecular Probes, Eugene, OR), POPO-3 и TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR) и POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Eugene, OR). Другие подходящие различимые детектируемые маркеры могут быть найдены, например, в Kricka et al. (Ann Clin Biochem. 39:114-29, 2002). Например, продукты RCA могут быть маркированы любой комбинацией ATTO, ALEXA, CY или димерных цианиновых красителей, таких как YOYO, TOTO и т. д. Могут также использоваться другие маркеры.

В некоторых случаях группу продуктов RCA можно различить, маркируя ее несколькими ярлыками, тем самым увеличивая возможности мультиплексирования. Например, в некоторых случаях группа может быть помечена двумя различимыми красителями (например, Cy3 и Cy5), которые при считывании будут отличаться от групп, которые помечены одиночными красителями (например, Cy3 или Cy5). В некоторых вариантах реализации изобретения первая группа продуктов RCA представляет собой «тестовую» группу маркированных продуктов RCA, а вторая группа продуктов RCA представляет собой «референтную» группу продуктов RCA, с которой можно сравнить число первых продуктов RCA. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения первая группа продуктов RCA может соответствовать первой хромосомной области (например, первой хромосоме, например хромосоме 21), а вторая группа продуктов RCA может соответствовать второй хромосомной области (например, второй хромосоме, такой как, например, хромосома 13 или 18, или другому участку первой хромосомы), и количество представителей первой группы продуктов RCA и второй группы продуктов RCA можно подсчитать и сравнить, чтобы определить, существует ли разница в количестве копий регионов (указывает на то, что существует удвоение или делеция исследуемой области). В некоторых вариантах реализации изобретения образец содержит, по меньшей мере, первую группу продуктов RCA и вторую группу продуктов RCA, причем первая и вторая группа меченых продуктов RCA различимо маркируются на этапе маркировки (этап (b)). В этих вариантах реализации изобретения способ включает в себя подсчет количества первых меченых продуктов RCA в области мембраны и подсчет количества вторых меченых продуктов RCA в области (той же области или в другой области) мембраны, тем самым обеспечивая оценку числа первых и вторых популяций продуктов RCA в образце. Этот вариант реализации изобретения может дополнительно включать в себя сравнение количества первых продуктов RCA в образце с количеством вторых продуктов RCA в образце.

В некоторых из этих вариантов реализации способа способ может включать визуализацию первой и второй групп меченных продуктов RCA для получения одного или нескольких изображений (например, первого изображения и второго изображения соответственно) и, необязательно, (i) подсчет количества меченных продуктов RCA в одном или нескольких изображениях, тем самым обеспечивая оценку количества представителей первой и второй групп меченных продуктов RCA в образце. Первую и вторую группу маркированных продуктов RCA можно детектировать отдельно с использованием известных способов (например, с использованием соответствующих фильтров и т. д.). Эти варианты реализации способа могут дополнительно включают сравнение количества первых меченных продуктов RCA в образце с количеством вторых меченых продуктов RCA в образце. Этот этап способа может включать в себя подсчет, по меньшей мере, 1000 (например, по меньшей мере 5000, по меньшей мере, 10 000, по меньшей мере, 20 000, по меньшей мере, 50 000, по меньшей мере 100 000, по меньшей мере 500 000, до 1М или более) меченных продуктов RCA в первой группе, по меньшей мере, 1000 (например, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10 000, по меньшей мере, 20 000 или, по меньшей мере, 50 000, по меньшей мере, 100 000, по меньшей мере, 500 000, до 1М или более) меченных продуктов RCA в области мембраны и подсчет, тем самым определяя, что разница в количестве копий может быть вызвана со статистической строгостью.

В альтернативных вариантах реализации изобретения клонированные фрагменты в молекулах ДНК (и, необязательно, любая индексирующая последовательность в кольцевых молекулах ДНК) могут быть амплифицированы с помощью ПЦР с использованием ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с или являются такими же, как сайты, которые фланкируют эти последовательности. В этом варианте реализации изобретения ПЦР-продукт может быть амплифицирован с использованием праймеров. В этом варианте реализации изобретения количество продукта может быть количественно определено любым подходящим qPCR исследованием, например, TaqMan анализом или тому подобным. В другом варианте реализации изобретения продукт может быть секвенирован (с амплификацией или без нее). В этих вариантах реализации изобретения количество кольцевых молекул, соответствующих каждому локусу, может быть оценено путем подсчета числа считываемых последовательностей, соответствующих локусу (например, подсчетом количества считываний последовательностей, которые имеют конкретную локус-специфичную баркод-последовательность). В некоторых вариантах реализации изобретения, если используется индексирующая последовательность, число кольцевых молекул, соответствующих каждому локусу, можно подсчитать, определяя, сколько различных последовательностей молекулярного баркода связано с каждой локус-специфичной последовательностью

Очевидно, что в этом варианте реализации изобретения используемые праймеры могут содержать последовательности, которые совместимы с использованием, например, метода обратимого терминатора Illumina, метода пиросеквенирования Роша (454), секвенирования Life Technologies путем лигирования (платформа SOLiD) или платформы Life Technologies’ Ion Torrent. Примеры таких способов описаны в следующих ссылках: Margulies et al (Nature 2005 437: 376–80); Ronaghi et al (Analytical Biochemistry 1996 242: 84–9); Shendure (Science 2005 309: 1728); Imelfort et al (Brief Bioinform. I2009 10: 609-18); Fox et al (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Appleby et al (Methods Mol Biol. 2009;513:19-39) и Morozova (Genomics. 2008 92: 255-64), которые включены посредством ссылки для общих описаний способов и конкретных этапов способов, включая все исходные продукты, реагенты и конечные продукты для каждого из этапов.

Исследуемый геномный образец может быть получен от пациента, который подозревается в наличии или подвергается риску заболевания или состояния, а результаты этапа (c) указывают на наличие или отсутствие у пациента или его плода заболевания или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или состояние могут быть раком, инфекционным заболеванием, воспалительным заболеванием, отторжением трансплантата или хромосомным дефектом, таким как трисомия.

Как отмечено выше, в некоторых случаях образец, исследуемый с использованием этого способа, может быть образцом вкДНК, полученным из крови, например, из крови беременной женщины. В этих вариантах реализации изобретения способ может быть использован для обнаружения хромосомных аномалий у развивающегося плода (как описано выше) или, например, для вычисления доли эмбриональной ДНК в образце.

Иллюстративные аномалии числа копий, которые могут быть обнаружены с использованием этого способа, включают, но не ограничиваются ими, трисомию 21, трисомию 13, трисомию 18, трисомию 16, XXY, XYY, XXX, моносомию X, моносомию 21, моносомию 22, моносомию 16 и моносомию 15. Дополнительные аномалии числа копий, которые могут быть обнаружены с использованием данного способа, перечислены в следующей таблице.

Способ, описанный в данном документе, может быть использован для анализа геномной ДНК практически из любого организма, включая, но не ограничиваясь ими, растения, животных (например, рептилий, млекопитающих, насекомых, червей, рыб и т. д.), образцов тканей, бактерий, грибов (например, дрожжей), фагов, вирусов, трупной ткани, археологических/древних образцов и т. д. В некоторых вариантах реализации изобретения геномная ДНК, используемая в способе, может быть получена от млекопитающего, причем в некоторых вариантах реализации изобретения млекопитающим является человек. В примерах вариантов реализации изобретения геномный образец может содержать геномную ДНК из клетки млекопитающего, такой как клетка человека, мыши, крысы или обезьяны. Образец может быть получен из культивируемых клеток или клеток клинического образца, например, биопсии ткани, соскобов или смывов, или клеток судебно-медицинского образца (т. е. клеток образца, собранного на месте преступления). В конкретных вариантах реализации изобретения образец нуклеиновой кислоты может быть получен из биологического образца, такого как клетки, ткани, физиологические жидкости и фекалии. Указанные биологические жидкости включают, но не ограничиваются ими, кровь, сыворотку, плазму, слюну, слизь, мокроту, спинномозговую жидкость головного мозга, плевральную жидкость, слезы, жидкость лактационного канала, лимфу, мокроту, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость, мочу, амниотическую жидкость, и сперму. В конкретных вариантах реализации изобретения образец может быть получен от субъекта, например, человека. В некоторых вариантах реализации изобретения исследуемый образец может быть образцом вкДНК, полученным из крови, например, из крови беременной женщины.

Например, в некоторых вариантах реализации изобретения может быть получен образец ДНК, и образец подвергается расщеплению одним или несколькими рестрикционными ферментами (или эндонуклеазой с РНК, такой как cas9), для получения предсказуемых фрагментов (средний размер которых может находиться в диапазоне 20-100 оснований). Описанный выше способ может быть применен к расщепленной ДНК, а количество фрагментов, соответствующих одному локусу (например, одной хромосоме), можно сравнить с количеством фрагментов, соответствующих другому локусу (например, другой хромосоме), используя способ, описанный в данном документе. Как отмечено, способ может использоваться для идентификации различий в количестве копий, например, хромосомных анеуплоидий, которые связаны с заболеванием или состоянием.

Как отмечено выше, в некоторых случаях анализируемая проба может быть образцом вкДНК, полученной из крови, например, из крови беременной женщины. В этих вариантах реализации изобретения способ может быть использован для обнаружения хромосомных аномалий у развивающегося плода или, например, для вычисления доли эмбриональной ДНК в образце.

Наборы

Кроме того, данное изобретение предлагает наборы для применения указанных способов, описанных выше. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может содержать: (a) набор фиксирующих олигонуклеотидов формулы X'-A'-B'-Z ', где: внутри набора: (i) последовательность A' и B' варьируют, и (ii) последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются переменными; и внутри каждой молекулы: (i) последовательность А' комплементарна фрагменту генома, и (ii) последовательность В' идентифицирует локус, из которого выделен геномный фрагмент, который гибридизуется с соседней последовательностью А'; (b) один или несколько зондов, содержащих последовательности X и Z, где: i. последовательности X и Z не являются переменными и гибридизуются с последовательностью X' и Z'; а также

(и) набор локус-специфических олигонуклеотидов последовательности B; и причем: каждый фиксирующий олигонуклеотид (а) способен гибридизоваться с (i) последовательностями зонда (b); (ii) локус-специфический олигонуклеотид (c); и (iii) геномный фрагмент (а) для получения лигируемого комплекса формулы X-A-B-Z, в котором последовательность B идентифицирует локус соседней последовательности A. В некоторых вариантах реализации изобретения один или несколько зондов (b) содержат первый олигонуклеотид, содержащий последовательность X и второй олигонуклеотид, содержащий последовательность Y. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно содержать пару праймеров ПЦР, которые гибридизуются с одним или несколькими зондами, содержащими последовательности X и Y. В некоторых вариантах реализации изобретения один или несколько зондов (b) являются основными зондами формулы X-Y-Z, а лигируемый комплекс представляет собой кольцевой лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z-Y, где последовательность Y объединяет последовательности X и Z, а последовательность B идентифицирует локус соседней последовательности A. В этих вариантах реализации изобретения набор может кроме того, содержать праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде. В этих вариантах реализации изобретения набор может содержать множество различно меченых олигонуклеотидов, где каждый из различно меченых олигонуклеотидов гибридизуется с комплементарной цепью последовательности B'. Набор может дополнительно содержать лигазу и/или полимеразу, вытесняющую цепочку для выполнения амплификации по типу катящегося кольца.

Различные компоненты набора могут присутствовать в отдельных емкостях или некоторые совместимые компоненты (например, первый и второй наборы фиксирующих зондов и первый и второй локус-специфические зонды) могут быть предварительно объединены в одну емкость, если это необходимо.

В дополнение к вышеупомянутым компонентам, указанный набор может дополнительно содержать инструкции по использованию компонентов набора для практического применения указанного способа.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены в целях предоставления специалистам в данной области техники дополнительного объяснения и описания того, как реализовывать и использовать данное изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением, и они не рассматриваться в том ключе, что приведенные ниже эксперименты являются всеми или единственными выполненными экспериментами.

ПРИМЕР I

Метод проверки исходных данных

Цель этого эксперимента состоит в том, чтобы сравнить способы, которые используют основные олигонуклеотиды, которые являются хромосом-специфическими (например, основной олигонуклеотид, используемый для захвата фрагментов из первой хромосомы, например хромосомы 21, отличается от основного олигонуклеотида, используемого для захвата фрагментов из второй хромосомы, например хромосомы 18, как описано в WO2015083001 и WO2015083002) со способами, в которых один и тот же основной олигонуклеотид используется для всех исследуемых хромосом. Это показано на Фиг. 6. Как показано, в «новой» конструкции источник клонированного фрагмента определяют с использованием хромосом-специфической последовательности (например, A или B), которая клонируется в тот же кольцевой продукт, что и целевой фрагмент. В новом способе используется один основной олигонуклеотид (по сравнению с множественными основными олигонуклеотидами в предшествующем способе), и клонированные фрагменты из всех хромосом могут быть амплифицированы с использованием того же RCA-праймера или одной пары ПЦР-праймеров.

Клеточную ДНК (10 нг) расщепляли, денатурировали и гибридизовали с «старыми» и «новыми» конструкциями зондов. После гибридизации и лигирования реакционные смеси после лигирования подвергали обработке экзонуклеазой для удаления любой некольцевой ДНК в растворе. Оставшиеся кольцевые продукты служили матрицами в реакции RCA, в результате чего были получены конкатемерные копии кольцевых продуктов. Эти продукты RCA были помечены флуоресцентно мечеными олигонуклеотидами, комплементарными к «фиксирующей» последовательности, и осаждались на твердую подложку для детектирования.

Тринадцать образцов вкДНК беременных женщин подвергали такой же обработке, как описано выше.

Для всех реакций количество отдельных объектов (продуктов RCA) подсчитывалось для каждого цвета. Отношение количества объектов цвета A/B было рассчитано для каждого образца, а коэффициент вариации был рассчитан как показатель точности анализа. Низкий коэффициент вариации позволяет точно измерять образцы с низкой фракцией плода. Это было проиллюстрировано добавлением образцов, содержащих малое количество контрольного образца из клеточной линии с трисомией 21.

Согласно данным, показанным на Фиг. 7, новая конструкция обеспечивает более низкое CV для ДНК клеточной линии и вкДНК, что позволяет более точно измерять фетальную ДНК с хромосомными аномалиями.

Не желая быть привязанными к какой-либо конкретной теории, считается, что этот способ может быть менее чувствительным к примесям в образце.

ПРИМЕР II

Анализ клинических образцов

Были получены образцы вкДНК от 26 нормальных беременных и 4 женщин с плодом с трисомией 21. Кровь (10 мл) от каждого пациентов центрифугировали для отделения плазмы от эритроцитов и лейкоцитарного слоя. Соответствующую плазму (~3-5 мл/пациент) подвергали протоколу экстракции ДНК на основе шариков (bead-based DNA extraction), в результате чего экстрагировали вкДНК, разбавленную в 50 мкл буфера.

Затем вкДНК обрабатывали описанным выше способом и анализировали с помощью цифрового подсчета продуктов амплификации по типу катящегося кольца с использованием флуоресцентного микроскопа. Все 4 положительных случая были обнаружены, для которых z-оценка составляла выше 3. CV нормальных образцов был рассчитан на уровне 0,49%, демонстрируя высокую точность анализа.

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлена система зондов для анализа образца нуклеиновой кислоты, содержащая: (а) набор идентифицирующих олигонуклеотидов последовательности B; (b) набор фиксирующих олигонуклеотидов формулы X'-A'-B'-Z', где в пределах набора: (i) последовательности A' и B' варьируют, и (ii) последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются переменными; а также, где в пределах каждого фиксирующего олигонуклеотида: (i) последовательность А' комплементарна геномному фрагменту образца нуклеиновой кислоты и (ii) последовательность В' комплементарна по меньшей мере одному из членов набора идентифицирующих олигонуклеотидов; где каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность B' в фиксирующем олигонуклеотиде идентифицирует (i) локус в геноме, из которого получен геномный фрагмент, или (ii) хромосому, из которой получен геномный фрагмент; а также (c) одну или более зондовых последовательностей, содержащих X и Z, где последовательности X и Z не являются переменными и гибридизуются с последовательностями X' и Z'; где каждый фиксирующий олигонуклеотид способен гибридизоваться с: (i) последовательностями зонда, (ii) членом набора идентифицирующих олигонуклеотидов и (iii) геномным фрагментом, в результате чего образуется лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z. Система зондов может использоваться, например, для идентификации хромосомной аннеуплоидии во внеклеточной ДНК. 17 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

1. Система зондов для анализа образца нуклеиновой кислоты, содержащая:

(а) набор идентифицирующих олигонуклеотидов последовательности B;

(b) набор фиксирующих олигонуклеотидов формулы X'-A'-B'-Z',

где в пределах набора: (i) последовательности A' и B' варьируют и (ii) последовательности X' и Z' отличаются друг от друга и не являются переменными; а также

где в пределах каждого фиксирующего олигонуклеотида: (i) последовательность А' комплементарна геномному фрагменту образца нуклеиновой кислоты и (ii) последовательность В' комплементарна по меньшей мере одному из членов набора идентифицирующих олигонуклеотидов;

где каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность B' в фиксирующем олигонуклеотиде идентифицирует (i) локус в геноме, из которого получен геномный фрагмент, или (ii) хромосому, из которой получен геномный фрагмент; а также

(c) одну или более зондовых последовательностей, содержащих X и Z, где последовательности X и Z не являются переменными и гибридизуются с последовательностями X' и Z';

где каждый фиксирующий олигонуклеотид способен гибридизоваться с: (i) последовательностями зонда, (ii) членом набора идентифицирующих олигонуклеотидов и (iii) геномным фрагментом, в результате чего образуется лигируемый комплекс формулы X-A-B-Z.

2. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что набор идентифицирующих олигонуклеотидов содержит по меньшей мере два различных идентифицирующих олигонуклеотида последовательности В, и в наборе фиксирующих олигонуклеотидов присутствуют по меньшей мере 100 различных последовательностей А'; и по меньшей мере две различные последовательности B', которые являются комплементарными по меньшей мере двум различным идентифицирующим олигонуклеотидам.

3. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность В' в фиксирующем олигонуклеотиде соответствует геномному фрагменту.

4. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что каждый идентифицирующий олигонуклеотид или его комплементарная последовательность В' в фиксирующем олигонуклеотиде идентифицирует одно или более из следующего: хромосома 21, хромосома 18 и хромосома 13.

5. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что геномный фрагмент представляет собой рестрикционный фрагмент.

6. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что одна или несколько зондовых последовательностей (c) дополнительно содержат олигонуклеотид, содержащий последовательность Y, причем лигируемый комплекс является линейным.

7. Система зондов по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пару ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с одним или несколькими зондами (c).

8. Система зондов по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что одна или более зондовых последовательностей (c) содержат основной зонд формулы X-Y-Z, где Y содержит олигонуклеотидную последовательность, так что лигируемый комплекс является кольцевым лигируемым комплексом формулы X-A-B-Z-Y, причем последовательность Y соединяет последовательности X и Z.

9. Система зондов по п. 8, дополнительно содержащая праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде.

10. Система зондов по п. 8, дополнительно содержащая:

(A) праймер для амплификации по типу катящегося кольца, который гибридизуется с последовательностью в основном зонде; и

(B) до четырех различно меченых детектирующих олигонуклеотидов, причем каждый из различно меченых детектирующих олигонуклеотидов гибридизуется с последовательностью В'.

11. Способ анализа образца нуклеиновой кислоты с использованием системы зондов по любому из предыдущих пунктов, который включает:

(а) гибридизацию системы зондов по любому из предыдущих пунктов с исследуемым геномным образцом, который содержит геномные фрагменты, для получения лигируемых комплексов формулы X-A-B-Z;

(b) лигирование лигируемых комплексов с получением молекул ДНК-продукта формулы X-A-B-Z и

(c) подсчет молекул ДНК-продукта, соответствующих каждой последовательности B или B'.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что молекулы ДНК-продукта являются кольцевыми, а подсчет включает в себя амплификацию молекул ДНК-продукта путем амплификации по типу катящегося кольца и подсчет количества продуктов амплификации, содержащих каждую последовательность В или B'.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что он включает маркировку продуктов амплификации по типу катящегося кольца (RCA) с использованием различно меченых зондов, которые гибридизуются с последовательностью B', и подсчет производится путем подсчета количества продуктов RCA для каждой отдельной метки.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что он дополнительно включает: i) размещение продуктов RCA на плоской подложке и ii) подсчет количества отдельных меченых продуктов RCA в области подложки.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что подложка представляет собой пористую прозрачную капиллярную мембрану.

16. Способ по любому из пп. 11-15, отличающийся тем, что различные последовательности B и их комплементарные последовательности B' идентифицируют разные хромосомы и способ дополнительно включает в себя сравнение количества молекул ДНК-продукта, содержащих первую последовательность B или B', с числом молекул ДНК-продукта, содержащих вторую последовательность B или B', для определения наличия или отсутствия в геномном образце анеуплоидии.

17. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что он включает сравнение результатов подсчета на этапе (c) с результатами подсчета, полученными для одного или нескольких референтных образцов.

18. Способ по любому из пп. 11-17, отличающийся тем, что исследуемый геномный образец получен от пациента, который подозревается в наличии или подвергается риску заболевания или состояния, и результаты подсчета на стадии (c) дают указание на то, имеет ли пациент или его плод заболевание или состояние.