СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО АНТИГЕНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНТРОЛЬНОЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ НАБОРА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЖИВОТНЫХ, ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 G01N33/531 

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, может быть использовано для выявления сибиреязвенных антител в сыворотках крови вакцинированных животных с целью оценки поствакцинального иммунитета.

При ведении современного животноводства необходимо учитывать проведение плановых мероприятий по профилактике инфекционных заболеваний.

Сибирская язва относится к группе сапронозов. В связи с ее широким распространением в прошлом сейчас существует множество выявленных и незарегистрированных ее почвенных очагов. Для обеспечения благополучия по сибирской язве в Российской Федерации поголовно вакцинируют сельскохозяйственных животных. Массовая вакцинация снижает заболеваемость, но не устраняет постоянную угрозу новых вспышек. Одними из возможных причин заболевания, считают пропуски при вакцинации и недостаточную напряженность индуцируемого противосибиреязвенного иммунитета. За последние десять лет в РФ ежегодно регистрируется от 4 до 10 спорадических вспышек заболевания сибирской язвы. В связи с этим правомерно возникает вопрос об эффективности вакцинации. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о попытках как отечественных, так и зарубежных ученых разработать методы оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета с использованием серологических реакций на основе биотестирования сывороток крови иммунизированных животных на лабораторных моделях (превентивные свойства сыворотки), аллергических тестов. После открытия Smith Н. и Keppie J. (1955) сибиреязвенного токсина и установления его роли в формировании иммунитета, ученые предлагали внутрикожную реакцию гашения токсина иммунной сывороткой на кроликах или морских свинках, реакцию диффузной преципитации (РДП) для выявления антител с использованием стандартного сибиреязвенного протективного антигена (ПА) и др. Но реакции, основанные на применении сибиреязвенного ПА, не нашли широкого применения в практике в следствии трудностей препаративного получения высокоактивного антигена и его физико-химической лабильности, а серологическими реакциями, как правило, выявляется комплекс антител, большинство из которых не связано с защитой животных от заражения сибирской язвой [2, 3, 5, 7, 10].

Таким образом, до настоящего времени, общепризнанным методом оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета считают заражение сельскохозяйственных или лабораторных животных вирулентными культурами референс-заражающих штаммов Bacillus anthracis, что с практической и экономической точек зрения неприемлемо при мониторинговых исследованиях эффективности мероприятий по специфической профилактике сибирской язвы. Также для выявления инфицированности организма и оценки поствакцинального иммунитета как за рубежом, так и в РФ используется реакция преципитации.

С учетом вышеизложенного, с целью определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, нами был проведен серомонитрринг в отношении данной инфекции путем исследования в реакции преципитации 1031 сыворотки крови, полученной из хозяйств Республики Татарстан. Результаты исследований показали, что титры антител составлял от 1:2 до 1:128, что считается достаточным для защиты животных от заражения.

В настоящее время ветеринарная служба РФ нуждается в более активных, специфичных и экономичных диагностикумах для серологического мониторинга в отношении сибиреязвенной инфекции.

Из существующих на данный момент серологических методов наиболее перспективным является реакция непрямой гемагглютинации, которая позволяет получить данные о наличии группового иммунитета и проведении профилактической вакцинации. Поэтому проблема ее создания стала весьма актуальной.

Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам показал отсутствие сведений об отечественных наборах для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции непрямой агглютинации. Таким образом, существует потребность в создании недорогого, чувствительного и специфичного набора для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, позволяющего проводить широкомасштабные исследования сывороток крови животных.

Известна реакция преципитации, открытая Р. Краусом в 1897 г. для определения напряженности поствакцинального иммунитета, набором препаратов для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в РП (Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. - М.: Агропромиздат, 1986, с. 111-112).

Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных.

Сущность реакции преципитации (РП) - формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.

Компоненты реакции:

- стандартный сибиреязвенный антиген;

- испытуемая сыворотка;

- нормальная сыворотка лошади;

- физиологический раствор;

- преципитирующая сибиреязвенная сыворотка.

Реакцию преципитации проводят в узких преципитационных пробирках Уленгута (диаметр 4 мм). Делают разведения исследуемых сывороток и разливают пастеровской пипеткой в количестве 0,2-0,3 мл. Затем медленно наслаивают 0,1-0,2 мл стандартного сибиреязвенного антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется. Компоненты реакции должны быть прозрачными.

Недостатками этого способа серологической диагностики сибиреязвенной инфекции являются:

- нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании;

- влияние присутствия антител, не обладающих свойствами преципитинов, к числу которых относятся неполные антитела и некоторые другие, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов;

- сравнительно невысокая чувствительность реакции, что затрудняет выявление низких концентраций антител;

- трудоемкость, что ограничивает возможность одновременного исследования большого количества образцов сывороток крови;

- частые расхождения результатов РП при исследовании одних и тех же сывороток в разных лабораториях из-за различия в процедуре постановки и учета реакции;

- значительные материальные затраты и время, поэтому используют выборочный метод (10-12% от всего поголовья) исследования.

Современная диагностика должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы, которые позволили бы получать воспроизводимые и достоверные результаты в пределах способа, не требующих сложного инструментального оснащения, обеспеченные стандартными реагентами и признанные пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических и ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает реакция непрямой гемагглютинации.

Задачей предлагаемого изобретения является создание набора позволяющего быстро, просто определить антитела в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в РНГА, предназначенного для контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в повышении чувствительности и специфической активности набора для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, и достоверности.

Предлагаемый набор содержит антиген, представляющий собой 2,5%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных инактивированным антигеном сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, контрольную положительную сыворотку с активностью в РНГА 1:2048, полученную путем гипериммунизации кроликов культурой сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, контрольную отрицательную сыворотку.

До настоящего времени в качестве положительного контроля использовали преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, которую получают от лошадей в возрасте 4-10 лет массой не менее 350 кг. Гипериммунизацию проводят штаммами 916-1, Ш-15, 94 и матрикс 2-й вакцины Ценковского. Лошадей гипериммунизируют поочередным введением каждого из указанных выше четырех штаммов внутривенно в концентрации 2-3 млрд м.к./мл. Интервал между введениями три дня. Всего делают 16-17 инъекций антигена, постепенно увеличивая дозы с 5 до 70 мл. Кровь берут через 9-10 дней после последнего введения антигена. Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринизацией плазмы, которую затем концентрируют 0,5% фенола (Ветеринарные препараты. - М.: Колос. - 1981. - С. 172).

Недостатками вышеизложенного способа являются:

- применение нескольких антигенов, для изготовления которых требуются значительные материальные затраты и время;

- длительность гипериммунизации;

- трудоемкость выполнения.

Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом с достижением единого технического результата.

Технический результат достигается в способе получения отрицательного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотки крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации, включающей предварительное получение фильтрата, помещение его в диализный мешочек, хранение в висячем положении в холодильнике при температуре +4°С до концентрации ¹/₄ от первоначального объема, подготовку 2,5%-ной суспензии формалинизированных эритроцитов, предусматривающую отбор крови интактных баранов во флаконы со стеклянными шарами, перемешивание в течение 15 минут, разведение 1:1 фосфатно-буферным раствором pH 6,4, добавление смеси из расчета 100 мл разведенной крови на 20 мл нейтрального формалина и 20 мл фосфатно-буферного раствора pH 7,2, помещение в термостат на 2 часа при температуре +37°C с постоянным перемешиванием и последующим центрифугированием со скоростью 1500 об/мин в течение 15 минут, 4-кратное отмывание осевших эритроцитов и ресуспендирование в 400-500 мл фосфатно-буферном растворе pH 7,2, помещение эритроцитарно взвеси в холодильник при температуре +4°С, удаление через 48 часов надосадочной жидкости, 4-кратное отмывание осадка фосфатно-буферным раствором pH 7,2, разведение полученного осадка фосфатно-буферным раствором pH 6,4, приготовление 2,5%-ной суспензии, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации, предварительное 3-кратное отмывание полученной 2,5%-ной суспензии фосфатно-буферным раствором pH 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое с последующим смешиванием в равных объемах с танином, 20-минутной выдержкой в водяной бане при температуре +37°С, 3-кратным отмывом на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждый, дальнейшим удалением надосадочной жидкости и заливом осадка фосфатно-буферным раствором pH 7,2, а после окончания отмывания разбавление осевших эритроцитов фосфатно-буферным раствором pH 6,4 из расчета получения 2,5% взвеси эритроцитов, консервирование формалином до его 1% концентрации и дальнейшее 3-кратное отмывание на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое фосфатно-буферным раствором pH 7,2, добавление к полученным из расчета 100 мг отмытым формалинизированным эритроцитам 5 мл фильтрата, сенсибилизацию в течение 2 часов на водяной бане при температуре +37°С в присутствии 0,2% глутарового альдегида, 3-4-кратное отмывание фосфатно-буферным раствором pH 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое с добавлением 0,5%-ной инактивированной нормальной лошадиной сыворотки и приготовление из осадка 2,5%-ной взвеси эритроцитов, после чего полученный эритроцитарный сибиреязвенный антиген консервируют 1%-ным формалином, расфасовывают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре +4°С.

А приготовление фильтрата осуществляют путем выращивания штамма 55-ВНИИВВиМ Bacillus anthracis на МПА в матровых колбах в течение трех суток, смывания выросшей культуры 0,85% раствором хлорида натрия и доведения до концентрации 20 млрд м.кл. в 1 мл суспензии, инактивирования ее путем автоклавирования в течение 30 минут при 1 атм, фильтрования в горячем виде, помещения фильтрата в диализный мешочек.

Технический результат достигается также в способе получения контрольной положительной сыворотки для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции непрямой гемагглютинации путем гипериммунизации кроликов 3-суточной агаровой культурой из штамма 55 ВНИИВВиМ Bacillus anthracis, смытой 0,85% раствором хлорида натрия с концентрацией 100 млн м.кл., а введение осуществляют в краевую ушную вену 3-кратно: первое введение в дозе 0,5 мл, второе - 1 мл, третье - 2 мл с интервалом между введениями 3-4 суток, а через семь дней после последнего введения кроликов обескровливают и полученную сыворотку проверяют на активность в РНГА, сыворотку считают годной с титром антител не ниже 1:2048, расфасовывают во флаконы по 1 мл, лиофилизируют и хранят в холодильнике при температуре +4°С.

Технический результат достигается также тем, что создан набор для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации, который содержит эритроцитарный сибиреязвенный антиген, контрольную положительную сыворотку, контрольную отрицательную сыворотку.

Необходимые компоненты для проведения РНГА:

- полистироловые планшеты с лунками объемом 0,5 мл;

- одно- и многоканальные пипетки на 0,05-0,2 мл со сменными наконечниками;

- колбы мерные;

- физиологический раствор, содержащий 1% нормальной кроличьей сыворотки крови;

- эритроцитарный сибиреязвенный антиген;

- контрольная положительная сыворотка;

- контрольная отрицательная сыворотка.

Приготовление компонентов для проведения РНГА

1. Приготовление рабочих растворов

Физиологический раствор предназначен для разведения контрольных и испытуемых сывороток. 8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. После полного растворения соли раствор фильтруют, добавляют 5 мл нормальной кроличьей сыворотки, перемешивают и хранят при +4°С в холодильнике.

Полученные контрольные положительную и отрицательную сыворотки достают из холодильника и инактивируют на водяной бане при 56-58°С в течение 30 минут.

2. Приготовление эритроцитарного антигена

Штамм 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis является природно-ослабленным бескапсульным, спорообразующим, выделенным из организма свиньи [1], вакцинным, принят заявителем в качестве производственного, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, отличается высокой продуктивностью культивирования на питательных средах, признан пригодным для изготовления высокочувствительных и специфичных диагностикумов.

Пример 1. В заявляемом наборе сибиреязвенный антиген готовят следующим образом: штамм 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, выращивают на МПА в матровых колбах в течение трех суток. Выросшую культуру с агара смывают 0,85% раствором хлорида натрия и доводят до концентрации 20 млрд микробных клеток в 1 мл суспензии. Смытую культуру инактивируют путем автоклавирования в течение 30 минут при 1 атм, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. Полученный фильтрат помещают в стерильный диализный мешочек и хранят при температуре +4°С в холодильнике (в висячем положении) для концентрации до ¹/₄ от первоначального объема.

Подготовка эритроцитов к нагрузке антигенного комплекса

Кровь у интактных баранов отбирают во флаконы со стеклянными бусами, перемешивают путем встряхивания в течение 15 минут.

После дефибринирования ее разводят 1:1 фосфатно-буферным раствором pH 6.4. К 100 мл разведенной крови быстро добавляют смесь, состоящую из 20 мл нейтрального формалина (37-38%) и 20 мл фосфатно-буферного раствора pH 7.2, помещают в термостат при температуре 37°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке в течение 2-х часов. После этого смесь центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут. Осевшие эритроциты 4-кратно отмывают и ресуспендируют в 400-500 мл фосфатно-буферного раствора pH 7.2. Эритроцитарную взвесь помещают в холодильник при температуре 4°С. Через 48 часов надосадочную жидкость удаляют, а осадок отмывают 4 раза фосфатно-буферным раствором pH 7.2. Полученный остаток разбавляют фосфатно-буферным раствором pH 6.4 и готовят 2,5% суспензию, консервируют, добавляя при перемешивании, по каплям формалин до его 1%-ной концентрации.

2,5% взвесь формалинизированных эритроцитов, предварительно отмытых фосфатно-буферным раствором pH 7.2 трехкратно при 1500 об/мин по 10 минут, смешивают в равных объемах с танином (20 мг танина растворяют в к 100 мл дистиллированной воды, 1:20000), выдерживают 20 минут в водяной бане при температуре +37°С. Обработанные танином эритроциты трижды отмывают на центрифуге. С этой целью в центрифужные стаканы наливают эритроцитарную взвесь, обработанную танином, и центрифугируют каждый раз по 10 минут со скоростью 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость удаляют, осадок заливают фосфатно-буферным раствором pH 7.2. По окончании отмывания осевшие эритроциты заливают фосфатно-буферным раствором pH 6.4 из расчета получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов и консервируют формалином до его 1%-ной концентрации.

К 100 мл трижды отмытым путем центрифугирования со скоростью 1500 об/мин каждый раз по 10 минут фосфатно-буферным раствором pH 7.2, 2,5%-ным формалинизированным эритроцитам добавляют концентрированный фильтрат в объеме 5 мл и сенсибилизируют в течение двух часов на водяной бане при температуре +37°С в присутствии 0,2% глутарового альдегида. По истечении указанной экспозиции взвесь эритроцитов с антигеном центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут. Осадок отмывают 3-4 раза фосфатно-буферным раствором pH 7,2 с добавлением 0,5% инактивированной нормальной лошадиной сыворотки. Затем из осадка готовят 2,5% взвесь эритроцитов. Полученный таким образом сибиреязвенный эритроцитарный антиген консервируют 1% формалином, расфасовывают и хранят в холодильнике при температуре +4°С

Приготовление контрольных сывороток

Пример 2. Для получения положительной сыворотки используют кроликов весом 2,5-3 кг, которых иммунизируют трехсуточной агаровой культурой из штамма 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, смытой 0,85% раствором хлорида натрия, трехкратно в концентрации 100 млн м.кл. в краевую ушную вену. 1-е введение - 0,5 мл, 2-е - 1 мл, 3-е - 2 мл. Интервал между введениями 3-4 суток. Через 7 дней после последнего введения, кроликов тотально обескровливают. Полученную сыворотку проверяют на активность в РНГА. Сыворотка считается годной с титром антител не ниже 1:2048, ее расфасовывают во флаконы по 1 мл, лиофилизируют и хранят в холодильнике при температуре +4°С.

Пример 3. Для получения контрольной отрицательной сыворотки интактных кроликов выдерживают в карантине в течение 2 месяцев и исследуют сыворотки крови в РНГА. У клинически здоровых неиммунизированных животных, не содержащих при исследовании в РНГА специфических антител к сибиреязвенному антигену, проводят стерильное взятие крови из сердца. Кровь выдерживают в течение 30 минут в термостате при +37°С, затем обводят и отстаивают в холодильнике при +4°С в течение 24 часов. Отстоявшуюся сыворотку сливают в одну емкость в стерильных условиях, расфасовывают по флаконам по 1 мл, лиофилизируют и хранят при температуре +4°С в холодильнике.

Пример 4. Чувствительность и специфичность набора препаратов для определения антител в сыворотке крови исследуемых животных, вакцинированных против сибирской язвы реакцией непрямой агглютинации

Чувствительность набора определяется предельным титром антител в сыворотке крови вакцинированных животных, который может быть, в зависимости от срока вакцинации, в начале 1:4096 и в конце 1:4.

Специфичность набора определяется наличием специфических антител, дающих реакции - положительную с сибиреязвенным антигеном и отрицательную - с гетерологичными антигенами (бруцеллезный, сапной, мелиоидозный).

Пример. 5. Иллюстрация применения набора препаратов для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы реакцией непрямой агглютинации

Для проведения исследования используют сыворотку животных, вакцинированных против сибирской язвы. Реакцию проводят в течение 24 часов после взятия. Сыворотки хранят при температуре +4°С. Не используют объединенные сыворотки от разных животных. Гемолизированные и проросшие сыворотки исследованию не подлежат.

Подготовка компонентов для проведения РНГА

Физиологический раствор готовят: 8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. После полного растворения соли раствор фильтруют.

Лиофилизированные контрольные положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Взятые из холодильника контрольные положительную и отрицательную сыворотки инактивируют на водяной бане при 56-58°С в течение 30 минут.

Проведение РНГА

При проведении РНГА используют компоненты, входящие в набор препаратов для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы реакцией непрямой агглютинации.

Флаконы с эритроцитарным антигеном перед применением встряхивают до полного ресуспендирования осадка и вскрывают.

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в объеме 0,2 мл в полистироловом планшете, состоящем из 12 горизонтальных и 6 вертикальных лунок.

Для этого многоканальной пипеткой во все лунки трех рядов до 12 лунки полистиролового планшета вносят 0,2 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Затем в первую лунку первого горизонтального ряда вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки и смешивают с физраствором, затем из первой лунки 0,2 мл переносят во вторую, из второй 0,2 мл в третью и так далее до 10 лунки. Из 10 лунки 0,2 мл содержимого выливают в сливную чашку, чтобы в каждой лунке оставалось по 0,2 мл. 11 и 12 лунки без сыворотки. Контрольные - положительную и отрицательную сыворотки разводят, как и испытуемую. Затем во все лунки ряда (с 1 по 12) с испытуемой сывороткой, а также рядов с контрольными - положительной и отрицательной сыворотками планшета с помощью пипетки вносят по 0,05 мл (50 мкл) суспензии эритроцитарного сибиреязвенного антигена. 11 и 12 лунки, где находится только физраствор без сывороток, - это контроль на самоагглютинацию эритроцитарного сибиреязвенного антигена. Планшет осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1-1,5 часа.

Обработка результатов

Учет результатов РНГА проводят при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной сывороткой крови и 0,85% раствором хлорида натрия в виде «пуговки» или кольца различной величины.

Результат реакции оценивают визуально по следующей схеме:

++++ - реакция положительная, эритроциты выпадают на дне лунки тонким слоем в виде перевернутого «зонтика», иногда с фестончатыми оползающими краями;

- - реакция отрицательная, эритроциты выпадают в виде «пуговки» или кольца различной величины.

Количественную оценку реакции выражают в титрах. Обратная величина разведения сыворотки, способная вызвать агглютинацию эритроцитарного антигена, принимается за титр.

Оценку реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.

Титр положительной контрольной сыворотки крови должен быть не ниже 1:64.

Разработанный набор был апробирован на пробах сывороток крови животных (крупного и мелкого рогатого скота) из хозяйств районов Республики Татарстан: Арского, Зеленодольского, Нижнекамского, Кукморского, Лениногорского, Сармановского, Мензелинского в общем количестве 1411.

Пример. Из Арского района Республики Татарстан поступила 1 проба сыворотки крови для исследования на наличие антител после вакцинации животных против сибирской язвы.

Предлагаемый набор хранится в холодильной камере при температуре +4°С. Достаем его и отбираем требуемое количество диагностикума (1 флакон эритроцитарного сибиреязвенного антигена, 1 флакон положительной и 1 флакон отрицательной сывороток). Положительную и отрицательную сыворотки инактивируем при +56-58°С в течение 30 минут на водяной бане. Флакон с антигеном тщательно перемешиваем. В это же время готовим 96-луночный планшет (12 лунок по горизонтали, 6 по вертикали) и физиологический раствор, содержащий 1% нормальной кроличьей сыворотки. Определяем, сколько рядов планшета будет задействовано для проведения реакции. У нас одна проба и две контрольные сыворотки: положительная и отрицательная. Значит, берем три вертикальных ряда планшета: 1 - для испытуемой сыворотки, 2 - для контрольных.

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в объеме 0,2 мл. Для этого многоканальной пипеткой во все лунки трех рядов до 12 лунки полистиролового планшета вносят 0,2 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Затем в первую лунку первого горизонтального ряда вносим 0,2 мл испытуемой сыворотки и последовательными переносами - из первой 0,2 мл во вторую, из второй 0,2 мл в третью и так далее до 10 лунки. Из 10 лунки 0,2 мл содержимого выливаем сливную чашку, чтобы в каждой пробирке оставалось по 0,2 мл. 11 и 12 лунки без сыворотки. Контрольные - положительную и отрицательную сыворотки разводят, как и испытуемую. Затем во все лунки ряда (с 1 по 12) с испытуемой сывороткой, а также рядов с контрольными - положительной и отрицательной сыворотками планшета с помощью пипетки вносят по 0,05 мл (50 мкл) суспензии эритроцитарного сибиреязвенного антигена. 11 и 12 лунки, где находится только физраствор без сывороток, - это контроль на самоагглютинацию эритроцитарного сибиреязвенного антигена. Планшет осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1-1,5 часа.

Учет реакции проводят при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной сывороткой крови и физраствором в виде компактной точки на дне лунки. Результат реакции оценивают визуально по следующей схеме:

++++ - реакция положительная, эритроциты ровным слоем покрывают все дно лунки, образуя перевернутый "зонтик";

- - реакция отрицательная, на дне лунки компактная точка эритроцитов.

Оценку реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.

Таблица. РП и РНГА в сравнительном аспекте

Таким образом, полученный эритроцитарный антиген, представляющий собой 2,5%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных инактивированным антигеном сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, полученная контрольная положительная сыворотка путем гипериммунизации кроликов культурой сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ с активностью в РНГА 1:2048 и контрольная отрицательная сыворотка позволяют создать высокочувствительный и специфический набор для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции гемагглютинации со стойким образованием агглютината на дне лунки в виде перевернутого зонтика, четким однозначным результатом, простым в постановке, не требующим сложного оборудования, 100%-ным охватом вакцинированного поголовья, с минимальными материальными затратами и минимальным временем проведения противоэпизоотических мероприятий. Набор рассчитан для проведения анализа 60 проб сыворотки крови. Набор позволяет контролировать эпизоотическую ситуацию и своевременно выявлять толерантных, пропущенных и ошибочно непривитых животных, определить нарастание титра антител в начале иммунизации и понижение его к концу вакцинации.

Набор необходим для контроля поствакцинальных антител в животноводстве.

Предлагаемый набор актуален, востребован и необходим для животноводческих хозяйств и ветеринарных лабораторий.

Разработанный набор апробирован на пробах сывороток крови животных (крупного и мелкого рогатого скота) из хозяйств районов Республики Татарстан: Арского, Зеленодольского, Нижнекамского, Кукморского, Лениногорского, Сармановского, мензелинского в общем количестве 1411 проб и показал его высокочувствительность и специфичность, возможность владеть ситуацией о вакцинации против сибирской язвы, определить охват привитых животных, формирование и напряженность иммунитета в зависимости от срока вакцинации, выявить животных с низким титром антител и толерантных, своевременно принимать меры по профилактике.

Источники информации

1. Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Оценка эффективности 10-летнего применения вакцины против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ // Ветеринария. - 1994. - №8. - С. 11-15.

2. Барков A.M., Баркова И.А., Алексеев В.В. и др. Обнаружение антител к протективному антигену Bacillus anthracis с использованием реакции непрямой гемагглютинации и твердофазного иммуноферментного метода // Особо опасные болезни. - 2010. - №3.

3. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Метод оценки противосибиреязвенного иммунитета по привинтивным свойствам сыворотки // ЖМЭИ. - 1972. - №6.

4. Ветеринарные препараты. - М.: Колос. - 1981. - 447 с.

5. Галиуллин А.К., Файзуллин А.А., Адиятуллина Д.А. Оценка сибиреязвенного иммунитета у животных через разные сроки после вакцинации // Ветеринария. - 1994. - №8.

6. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. - М.: Агропромиздат. - 1986. - С. 11-112.

7. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф. Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы // ЖМЭИ. - 2006. - №1.

8. Руководство по диагностики и производству вакцин. - Издание МЭБ. - 2004. - С. 21-29.

9. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Стрижаков А.А. Сравнительное изучение методов оценки экспрессии протективного антигена В. anthracis // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Мат. 4-й Межгос. науч. практ. конф. государств-учасников СНГ. 30 сентября - 2 октября 2003. - Саратов. - 2003.

10. Smith Н., Keppie J., Stanley J. The specific toxin produced by B. anthracis in vivo // The hemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. - V. - BrJ. Exp. Path. - 1955. - V. 36. - №4.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы. Для этого способ включает предварительное получение фильтрата, помещение его в диализный мешочек, хранение в висячем положении в холодильнике при температуре +4°С до концентрации от первоначального объема, подготовку 2,5%-ной суспензии фомалинизированных эритроцитов. Предварительно проводят отбор крови интактных баранов во флаконы со стеклянными шарами, перемешивание в течение 15 минут, разведение 1:1 фосфатно-буферным раствором рН 6,4, добавление смеси из расчета 100 мл разведенной крови на 20 мл нейтрального формалина и 20 мл фосфатно-буферного раствора рН 7,2, помещение в термостат на 2 часа при температуре +37°С с постоянным перемешиванием. Последующее центрифугирование со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут, 4-кратное отмывание осевших эритроцитов и суспендирование в 400-500 мл фосфатно-буферном растворе рН 7,2, помещение эритроцитарной взвеси в холодильник при температуре +4°С. Проводят удаление через 48 часов надосадочной жидкости, 4-кратное отмывание осадка фосфатно-буферным раствором рН 7,2, разведение полученного осадка фосфатно-буферным раствором рН 6,4, приготовление 2,5% суспензии, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации. Далее 3-кратное отмывание 2,5%-ной полученной суспензии фосфатно-буферным раствором рН 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут на каждое с последующим смешиванием в равных объемах с танином, 20-минутной выдержкой в водяной бане при температуре +37°С и 3-кратным отмыванием на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждый. Дальнейшее удаление надосадочной жидкости и залив осадка фосфатно-буферным раствором рН 7,2, а после окончания отмывания разбавление осевших эритроцитов фосфатно-буферным раствором рН 6,4 из расчета получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации и дальнейшего 3-кратного отмывания на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое фосфатно-буферным раствором рН 7,2. Добавляют к полученным из расчета 100 мл отмытым формалинизированным эритроцитам 5 мл фильтрата, проводят сенсибилизацию в течение 2 часов на водяной бане при температуре +37°С в присутствии 0,2%-ного глютарового альдегида с дальнейшим отмыванием и добавлением 0,5%-ной инактивированной нормальной лошадиной сыворотки и приготовлением из осадка 2,5% взвеси эритроцитов. После чего полученный эритроцитарный сибиреязвенный антиген консервируют 1% формалином, расфасовывают по флаконам и хранят в холодильнике при температуре +4°С. Группа изобретений относится также к набору определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы. Использование данной группы изобретений позволяет получить чувствительный и достоверный метод определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в РНГА для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, выявить животных с низким титром антител и толерантных, своевременно принять меры по профилактике заболевания. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр., 1 табл.

1. Способ получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации, включающей предварительное получение фильтрата, помещение его в диализный мешочек, хранение в висячем положении в холодильнике при температуре +4°С до концентрации от первоначального объема, подготовку 2,5%-ной суспензии фомалинизированных эритроцитов, предусматривающую отбор крови интактных баранов во флаконы со стеклянными шарами, перемешивание в течение 15 минут, разведение 1:1 фосфатно-буферным раствором рН 6,4, добавление смеси из расчета 100 мл разведенной крови на 20 мл нейтрального формалина и 20 мл фосфатно-буферного раствора рН 7,2, помещение в термостат на 2 часа при температуре +37°С с постоянным перемешиванием и последующим центрифугированием со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут, 4-кратное отмывание осевших эритроцитов и суспендирование в 400-500 мл фосфатно-буферном растворе рН 7,2, помещение эритроцитарной взвеси в холодильник при температуре +4°С, удаление через 48 часов надосадочной жидкости, 4-кратное отмывание осадка фосфатно-буферным раствором рН 7,2, разведение полученного осадка фосфатно-буферным раствором рН 6,4, приготовление 2,5% суспензии, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации, предварительное 3-кратное отмывание 2,5%-ной полученной суспензии фосфатно-буферным раствором рН 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут на каждое с последующим смешиванием в равных объемах с танином, 20-минутной выдержкой в водяной бане при температуре +37°С, 3-кратным отмыванием на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждый, дальнейшим удалением надосадочной жидкости и заливом осадка фосфатно-буферным раствором рН 7,2, а после окончания отмывания разбавление осевших эритроцитов фосфатно-буферным раствором рН 6,4 из расчета получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации и дальнейшее 3-кратное отмывание на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое фосфатно-буферным раствором рН 7,2, добавление к полученным из расчета 100 мл отмытым формалинизированным эритроцитам 5 мл фильтрата, сенсибилизацию в течение 2 часов на водяной бане при темперетуре +37°С в присутствии 0,2%-ного глютарового альдегида, 3-4-кратное отмывание фосфатно-буферным раствором рН 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое с добавлением 0,5%-ной инактивированной нормальной лошадиной сыворотки и приготовление из осадка 2,5% взвеси эритроцитов, после чего полученный эритроцитарный сибиреязвенный антиген консервируют 1% формалином, расфасовывают по флаконам и хранят в холодильнике при температуре +4°С.

2. Способ получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена по п. 1, отличающийся тем, что приготовление фильтрата осуществляют путем выращивания штамма 55-ВНИИВВиМ Bacillus anthracis на МПА в матровых колбах в течение 3-х суток, смывания выросшей культуры 0,85%-ным раствором хлорида натрия и доведения до концентрации 20 млрд м. кл. в 1 мл суспензии, инактивирование ее путем автоклавирования в течение 30 минут при 1 атм, фильтрования в горячем виде, помещения фильтрата в диализный мешочек.

3. Набор для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации, отличающийся тем, что содержит:
1) эритроцитарный сибиреязвенный антиген, полученный по пп. 1 и 2;
2) контрольную положительную сыворотку, полученную путем гипериммунизации кроликов 3-суточной агаровой культурой из штамма 55-ВНИИВВиМ Bacillus anthracis, смытой 0,85%-ным раствором хлорида натрия с концентрацией 100 млн м. кл., введения в краевую ушную вену трехкратно: первого в дозе 0,5 мл, второго - 1 мл, третьего - 2 мл с интервалом между введениями 3-4 суток, обескровливания кроликов через 7 дней после последнего введения и проверки полученной сыворотки на активность в РНГА, сыворотку считают годной с титром антител не ниже 1:2048, расфасовывают во флаконы по 1 мл, лиофилизируют и хранят в холодильнике при температуре +4°С; и
3) контрольную отрицательную сыворотку.