Способ индикации токсинов СLоSтRIDIUм peRFRINGeNS Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к выявлению в первичных посевах исследуемого материала токсигенных штаммов возбудителя инфекционной энтеротоксемии, может быть рекомендовано производственным ветеринарным лабораториям для ускоренного обнаружения токсина Cl. perfringens.

Известен способ индикации токсинов с помощью реакции коагглютинации (РКОА) специфически направленного стафилококкового реагента (антительного диагностику- ма) и антигена исследуемого материала.

Недостатком известного способа является необходимость использования для изготовления специфически направленного стафилококкового реагента антител кроличьей антитоксической сыворотки CI. perfringens. изготовление и контроль которой требуют дополнительного времени, повышают стоимость конечного продукта (антительного диагностикума). Чувствительность реакции коагглютинации по известному способу не превышает 0,02 единицы связывания антигена.

Целью изобретения является повышение чувствительности и экономичности способа выявления токсинов Cl. perfringens при сохранении его специфичности.

Цель достигается процессом изготовления специфически направленного стафилококкового реагента (антительного диагностикума) и новой технологией постановки реакции козгглютинации.

Сущность изобретения заключается в том, что в реакции коагглютинации в качестве специфически направленного стафилококкового реагента применяют взвесь стафилококков, сенсибилизированных антителами овечьей иммунной стандартной сыворотки, а реакцию ставят в среде раствора глицин-HCI буфера, каждый из реагентов вносят при постановке реакции в равных объемных количествах.

/

С

VI

4

сл VI

ON 00

Способ осуществляют следующим обазом.

Чистые антитела Cl. perfrlngens из соотетствующих иммунных овечьих сывороток звлекают с помощью иммуиосорбции. Сыворотки диагностические антитоксические Cl. perfrlngens типов А, С, D, Е. предназначенные для диагностики заболеваний живоных, вызываемых микробами CI. perfrlngens. В качестве иммуносорбента используют цианбромированную агарозу 4В, на которой иммобилизован токсин CI. perfrlngens. Чистые антитела, элюирован- ные с иммуносорбента, фиксируют на 10%- ной взвеси стафилококка (штамм СО АН-ТУ 42.14) путем его сенсибилизации. Сенсибилизированный чистыми антителами стафилококк представляет собой специфически направленный стафилококковый реагент - СНСР - антительный диагностикум.

Стафилококковый реагент, содержащий белок А, сухой, выпускается по ТУ 42.14. для серологических исследований. Время изготовления диагностикума составляет 7 ч.

Специфически направленный стафилококковый реагент, изготовленный опи- санкым путем, обладает высокой чувствительностью и специфичностью при использовании его в реакции агглютинации, проводимой по предлагаемой технологии.

Предлагаемая технология постановки реакции коагглютинации при выявлении токсина С, psrfrlngens в исследуемом материале заключается в следующем. На пред- метное стекло наносят 0,05 мл ( 1 каплю) исследуемого материала (например, копро- фильтрата), затем добавляют 0,05 мл (1 каплю) СНСР и 0,05 мл глицин-HCI буферного раствора. Плавным покачиванием предметного стекла капли перемешивают. Реакцию учитывают в течение от 30 с до 3 мин. При наличии токсинов Cl. perfrlngens в исследуемом материале на стекле наблюдается четкая агглютинация с полным просветлением капли. Реакцию оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале: 1111 - полная коагглютинация. полное просветление смеси - резко положительная; +++ - хорошо выраженная коагглютинация, явное просветление смеси - положительная;

++ - неполная коагглютинация с заметным просветлением смеси - слабо положительная;

- отсутствие коагглютинации - отрицательная.

Заключение о принадлежности исследуемого антигена - токсина Cl. perfrlngens делают на основании положительной реакции коагглютинации не менее, чем на +++, при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле. Предлагаемый способ индикации токсинов Cl. perfrlngens позволяет выявлять

0,0007 летальной мышиной дозы (ДПМ) этого токсина.

П р и м е р 1. Чувствительность реакции коагглютинации по предлагаемому способу контролируют на последовательном ряде

0 разведений глицеринизированных токсинов Cl. perfrlngens.

Полученные данные приведены в табл.1.

Таким образом, предлагаемый способ

5 позволяет выявлять токсин в количестве 0,0007 ДЛМ, т. е. чувствительность его значительно выше чувствительности известного способа.

П р и м е р 2. Выявление токсинов CI.

0 perfrlngens в шестичасовых культурах-продуцентах токсинов Cl.perfrlngens типов В, С, D. Данные приведены в табл. 2.

Таким образом, при оценке токсиген- ных культур чувствительность предлагаемо5 го способа значительно превышает чувствительность известного.

ПримерЗ. Специфичность нового антительного диагностикума, изготовленного по описанной технологии, контролируют в ре0 акции коагглютинации по предлагаемому и известному способам с культурами E.Coll и анатоксинами Cf. Boty lnum (типы В и Е).

Полученные данные приведены в табл. 3.

5 Как видно из приведенных в табл. 3 данных, антительный диагностикум, изготовленный по предлагаемой технологии, не вступает в реакцию агглютинации с гетерогенными антигенами (культура К. Coll и ана0 токсин Cl. Botyilnum) при положительной реакции с антигенами Ci. perfrlngens, т. е. является специфическим.

Использование предлагаемого способа выявления токсинов Cl. perflngens в биоло5 гическом материале позволяет (по сравнению с существующим) резко снизить затраты на изготовление специфически направленного стафилококкового реагента (антительного диагностикума), так как отпа0 дает необходимость получения и контроля соответствующих кроличьих гипериммунных сывороток и делает возможным использование для сенсибилизации стафилококка стандартных овечьих иммунных сывороток,

5 выпускаемых биологической промышленностью.

Повышение чувствительности реакции коагглютинации при сохранении ее специфичности делает возможным выявление ми- иммадьного количества токсинов CI.

perfrbigens в исследуемом биологическом материале, не выявляемых с помощью известного способа.

Формула изобретения Способ индикации токсинов Clostrldlum perfrlngens путем постановки реакции коагглютинации исследуемых токсинов со стафилококковым реагентом, сенсибилизированным специфическими антителами, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, в качестве специфических антител 5 используют иммуноглобулины овцы, а реакцию ставят в глицин-HCI буферном растворе (рН 2,3-2.4), при 3TOfci компоненты реакции берут в равных объемах.

10Табл и цэ 1

Использование: ветеринарная микробиология, диагностика клостридиозов. Сущность изобретения: ставят реакцию коагглютинации со стафилококковым реагентом. В качестве антител берут иммуноглобулины овцы. Компоненты реакции в равных объемах в глицин-HCI буферном растворе. Повышается чувствительность способа, упрощается изготовление реагента. 3 табл.

Таблица 2

Разведения испытуемых препаратов в ДЛМ

Результаты РКОА при постановке по способу

предлагаемому

известному

Культура Е coll:

1,0

0,1

0.01

Анатоксин CI.Botylinum тип

В:

1,0

0,1

0;01

Анатоксин CI.Botylinum тип

Е:

0,1

0,01

Токсин Cl. Perfrlngens гип С 1,0 0,1 0.01

Таблица 3

известному