КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ СОЕДИНЕНИЯ ТРИАЗОЛОПИРИМИДИНА Российский патент 2021 года по МПК C07D487/04 A61K31/519 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Это изобретение относится к кристаллическим формам N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, фармацевтическим композициям, в состав которых он входит, и способам лечения с применением этих кристаллических форм, и способам получения этих кристаллических форм.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Белки группы Polycomb (PcG) представляют собой ферменты, модифицирующие хроматин, регуляция которых нарушена при многих онкологических заболеваниях у людей. Polycomb ингибиторный комплекс 2 (PRC2), который включает SUZ12 (супрессор локуса zeste 12), EED (субъединицу эмбрионального развития эктодермы) и каталитическую субъединицу - EZH2 (усилитель zeste гомолога 2), подавляет гены путем метилирования сердцевинного гистона H3 по лизину в 27 положении (H3K27me3) в промоторных участках целевых генов и вокруг них. PRC2 представляет собой критический компонент клеточного механизма, связанного с эпигенетическим регулированием транскрипции генов, и играет играет важную роль в развитии и в дифференцировке и восстановлении тканей. Хотя EZH2 и является каталитической субъединицей, для PRC2 требуются, по меньшей мере, EED и SUZ12 для выполнения его функции в качестве метилтрансферазы. При многих онкологических заболеваниях наблюдается свехэкспрессия EED, SUZ12 и EZH2, включая, но не ограничиваясь этим, рак молочной железы, рак простаты, печеночно-клеточный рак и т.п. Мутации, активирующие EZH2, были идентифицированы у пациентов с DLBCL (диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой) и у пациентов с FL (фолликулярной лимфомой). Ингибирование метилтрансферазной активности PRC2 соединениями, конкурирующими с кофактором S-аденозилметионином (SAM), в DLBCL обращает H3K27 метилирование, снова активирует экспрессию целевых генов и подавляет рост/пролиферацию опухоли. Поэтому PRC2 представляет фармакологическую мишень в случае DLBCL и других онкологических заболеваний.

При изготовлении фармацевтической композиции ищут такую форму терапевтического средства, в которой сбалансированы требуемые свойства, такие как, например, скорость растворения, растворимость, биодоступность и/или стабильность при хранении. О твердых фармацевтических соединениях известно, что они существуют во многих твердых формах, часто называемых полиморфами, и химическая и физическая стабильность, а также условия, необходимые при обращении с такими соединениями, часто зависят от того, какую твердую форму используют. Соответственно, выбор определенной твердой формы активного лекарственного начала (например, форма соли, гидратная или сольватированная форма, или полиморфная форма) часто очень важен при разработке надежного и воспроизводимого производственного процесса, а также при хранении, обращении и распространении безопасной и эффективной формы лекарственного вещества.

"Impurities: Guideline for Residual Solvents (Примеси: Руководство по остаточным растворителям)", - это рекомендации по содержанию остаточных растворителей, допустимому в фармацевтических средствах, которое было разработано Международной конференцией по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для медицинского применения для человека (ICH). Руководством рекомендовано применение менее токсичных растворителей при производстве лекарственных веществ и лекарственных форм, и установлены фармацевтические пределы содержания остаточных растворителей (органических летучих примесей) в лекарственных продуктах. Согласно этому руководству, основываясь на риске для здоровья, растворители поделены на три класса: Класс 1 растворителей, которые вызывают неприемлемую токсичность; Класс 2 растворителей с менее тяжелой токсичностью; и Класс 3 растворителей, обладающих низким токсическим потенциалом.

В соответствии с Руководством ICH, остаточные количества растворителей Класса 3, равные 50 мг в день или менее (соответствует 5000 м.д. или 0,5%), являются приемлемыми и не требуют обоснования. Пределы концентрации рассчитывали по следующему уравнению, принимая массу продукта, вводимую ежедневно, за 10 г:

Концентрация (м.д.)=(1000 X PDE)/доза

PDE (допустимое ежедневное воздействие) приводится из расчета мг/день и доза приведена в г/день. Бóльшие количества растворителей Класса 3 могут быть приемлемыми при условии, что они отражают реальные значения, обеспечиваемые возможностями производства и надлежащей производственной практикой.

В заявке на патент США за № 14/977273, которая включена в данный документ путем ссылки, раскрыты определенные соединения триазолопиримидина для лечения PRC2-опосредованных заболеваний или расстройств. Эта патентная заявка опубликована 23 июня 2016 г. за номером US 2016-0176882. Одним из соединений, раскрытых в данной заявке, является N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин (свободная форма) и его гидрохлорид. Свободная форма (называемая здесь Соединение А) имеет следующую структуру:

Соединение A

Гидрохлорид (называемый здесь Соединение Х) имеет следующую структуру:

Соединение X

Свободная форма - Соединение A - характеризуется низкой растворимостью в водных средах, как при физиологическом значении рН, равном 7,4, так и в искусственном желудочном соке (SGF). Было обнаружено, что в фармакокинетических исследованиях на грызунах воздействие соединения А было недостаточно пропорциональным при более высоких дозах, что может приводить к недостаточному и изменчивому воздействию в клинических условиях. Были проведены эксперименты с целью выявления подходящей соли с улучшенной растворимостью в водной среде. После тестирования ряда солей, которые также включали фосфат, фумарат, тартрат, сукцинат, малеат и мезилат, было обнаружено, что только гидрохлорид обеспечивает необходимое улучшение растворимости и имеет воздействие на грызунов, пропорциональное дозе.

В методике получения Соединения Х, описанной в US 14/977273, в качестве среды используется изопропанол (IPA, растворитель Класса 3). В разных партиях Соединения Х, полученных с использованием методики, описанной в US 14/977273, было обнаружено разное содержание IPA согласно определению с помощью ¹H ЯМР (как видно из записи 1 в Таблице 2 ниже), при этом массовая доля IPA в некоторых партиях составляла более 0,5%. Удалить остаточный IPA из конечного продукта также оказалось невероятно трудно. Кроме того, полученное таким образом соединение Х характеризуется низкой и непостоянной степенью кристалличности на сколько можно судить по XRPD-спектрам. Усилия по удалению остаточного IPA и улучшению степени кристалличности не дали результата. Поэтому, по-прежнему существует потребность в способах, которые позволили бы воспроизводимым образом получать Соединение Х в требуемой форме, т.е. в форме, по сути не содержащей остаточный органический растворитель, которая характеризуется улучшенной и устойчивой степенью кристалличности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены кристаллические формы Соединения X (N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида).

Варианты осуществления этих кристаллических форм включают те, которые охарактеризованы в данном документе как формы A, H_A и H_B, а также как комбинации или смеси этих кристаллических форм.

Таблица 1

Соединение X Форма Безводная A моногидрат H_A дигидрат H_B

Наименования, используемые в данном документе для охарактеризования конкретной формы, например, "H_A" и т.п., не должны рассматриваться как ограничительные в отношении какого-либо другого вещества, обладающего сходными или идентичными физическими и химическими признаками, напротив, эти обозначения являются всего лишь идентификаторами, которые следует интерпретировать в соответствии с информацией о характеристиках, также представленной в данном документе.

В настоящем изобретении предложены способы получения кристаллических форм Соединения X.

В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие кристаллическую(ие) форму(ы) Соединения Х и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или формообразующее. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство. Определенный интерес представляют собой дополнительные терапевтические средства, выбранные из: других противораковых средств, иммуномодуляторов, противоаллергических средств, противорвотных средств, болеутоляющих, цитопротекторов и их комбинаций.

Кристаллическую(ие) форму(ы) Соединения X настоящего изобретения можно применять в лечении заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2.

Кристаллическую(ие) форму(ы) Соединения X настоящего изобретения можно применять в терапевтическом лечении.

Кристаллическую(ие) форму(ы) Соединения X настоящего изобретения можно применять для производства лекарственного средства для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание графических материалов

На ФИГ. 1 изображена характерная порошковая рентгеновская дифракционная картина формы A (безводная форма).

На ФИГ. 2 изображены термограммы, полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)/термогравиметрического анализа (ТГА) формы А.

На ФИГ. 3 изображен график динамической сорбции паров (DVS) формы A при 25°C.

На ФИГ. 4 изображена характерная порошковая рентгеновская дифракционная картина формы Н_A (моногидратная форма).

На ФИГ. 5 изображены термограммы, полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)/термогравиметрического анализа (ТГА) формы Н_А.

На ФИГ. 6 изображен график динамической сорбции паров формы Н_А при 25°C.

На ФИГ. 7 изображен график динамической сорбции паров формы Н_А при 50°C.

На ФИГ. 8 изображена характерная порошковая рентгеновская дифракционная картина формы Н_В (дигидратная форма).

На ФИГ. 9 изображены термограммы, полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)/термогравиметрического анализа (ТГА) формы Н_В.

На ФИГ. 10 изображен график динамической сорбции паров формы Н_В при 25°C.

На ФИГ. 11 приведено сравнение формы A, полученной по процедуре (A), описанной в Примере 3 ниже, с полученной по процедуре (B) формой А, описанной в Примере 2 ниже (также описанной в US 14/977273).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Перечисленные далее варианты осуществления характеризуют данное изобретение:

1. Кристаллическая форма A N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, причем массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,5%.

2. Кристаллическая форма A N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, причем массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,2%.

3. Кристаллическая форма A N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, причем массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,1%.

4. Кристаллическая форма A Соединения X, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора до получения формы A Соединения X.

5. Кристаллическая форма A Соединения X любого из вариантов осуществления 1-3, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора до получения формы A Соединения X.

6. Кристаллическая форма A Соединения X варианта осуществления 5, полученная способом, в котором:

на стадии 1) смешивающийся с водой органический растворитель выбирают из группы, состоящей из этанола и ацетона;

на стадии 2) нагревают полученную суспензию до температуры от примерно 50 до 75 °C;

на стадии 3) подкисляют полученную суспензию до образования прозрачного раствора добавлением 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75 °C; и

на стадии 4) понижают температуру полученного раствора до получения формы A Соединения X.

7. Гидратированная твердая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида.

8. Гидратированная твердая форма варианта осуществления 7, где указанная гидратированная форма представляет собой моногидратную форму H_A.

9. Гидратированная твердая форма варианта осуществления 7, где указанная гидратированная форма представляет собой дигидратную форму H_В.

10. Кристаллическая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида (форма H_A), характеризующаяся порошковой рентгеновской дифракционной картиной со следующими значениями 2θ (CuKα λ=1,5418 Å): 13,8±0,1, 20,8±0,1, 26,2±0,1, 26,7±0,1 и 28,2±0,1. В некоторых вариантах осуществления форма H_A характеризуется одним или несколькими (например, 2, 3, 4 или 5) дополнительными значениями 2θ, выбранными из значений в Перечне 2.

11. Кристаллическая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида (форма H_В), характеризующаяся порошковой рентгеновской дифракционной картиной со следующими значениями 2θ (CuKα λ=1,5418 Å): 9,0±0,1, 17,1±0,1, 22,8±0,1, 26,9±0,1 и 35,3±0,1. В некоторых вариантах осуществления форма H_В характеризуется одним или несколькими (например, 2, 3, 4 или 5) дополнительными значениями 2θ, выбранными из значений в Перечне 3.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и форму A, описанную в любом из вариантов осуществления 1-6.

13. Фармацевтическая композиция варианта осуществления 12, дополнительно содержащая по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.

14. Фармацевтическая композиция варианта осуществления 13, где указанное дополнительное терапевтическое средство выбирают из других противораковых средств, иммуномодуляторов, противоаллергических средств, противорвотных средств, болеутоляющих, цитопротекторов и их комбинаций.

15. Кристаллическая форма А, описанная в любом из вариантов осуществления 1-6 для применения в терапии.

16. Применение формы A, описанной в любом из вариантов осуществления 1-6, в производстве лекарственного препарата для лечения заболевания или расстройства, опосредованного EED и/или PRC2.

17. Применение согласно варианту осуществления 16, где указанное заболевание или расстройство выбирают из диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, других типов лимфом, лейкемии, множественной миеломы, мезотелиомы, рака желудка, злокачественной рабдоидной опухоли, печеночно-клеточного рака, рака простаты, карциномы молочной железы, рака желчных протоков и рака желчного пузыря, рака мочевого пузыря, опухолей головного мозга, включая нейробластому, шванному, глиому, глиобластому и астроцитому, рака шейки матки, рака толстой кишки, меланомы, рака эндометрия, рака пищевода, рака головы и шеи, рака легкого, назофарингеальной карциномы, рака яичника, рака поджелудочной железы, почечно-клеточной карциномы, рака прямой кишки, рака щитовидной железы, опухолей околощитовидной железы, опухолей матки и сарком мягких тканей.

18. Способ получения кристаллической формы A Соединения X, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора до получения формы A Соединения X.

19. Способ получения кристаллической формы A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно массовая доля остаточного органического растворителя - менее 0,3%, более предпочтительно массовая доля остаточного органического растворителя - менее 0,1%, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

20. Способ согласно варианту осуществления 19, где:

на стадии 1) смешивающийся с водой органический растворитель выбирают из группы, состоящей из этанола и ацетона;

на стадии 2) нагревают полученную суспензию до температуры от примерно 50 до 75°C;

на стадии 3) подкисляют полученную суспензию до образования прозрачного раствора добавлением 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

на стадии 4) понижают температуру полученного раствора до получения формы A Соединения X.

Было сделано предположение о том, что IPA может быть захвачен и удержан кристаллической решеткой при образовании Соединения X в среде изопропанола, поскольку в ходе всего процесса образования соли материал находится в состоянии "взвеси" и никогда полностью не переходит в раствор. В Таблице 2 приведены результаты, полученные в экспериментах, выполненных с отобранными растворителями Класса 3 и их комбинациями. Неожиданно было обнаружено, что в смесях EtOH/вода и ацетон/вода (записи 11 и 12) оказалось возможным полностью растворить Соединение X, а также поддерживать состояние перенасыщения в течение оптимального периода, особенно при повышенных температурах. Эти комбинации позволяют получать кристаллические формы Соединения X, в которых практически отсутствуют органические растворители, например, массовая доля органического растворителя в них после нормальной сушки составляет не более 0,3% и, как правило, не более 0,1%.

Таблица 2

№ Растворитель Соединение A
растворимость
(мг/мл) Соединение X
растворимость
(мг/мл) 50°C к.т. 50°C к.т. 1 Ацетон <10 <10 <10 <10 2 ACN <10 <10 <10 <10 3 IPA <10 <10 <10 <10 4 MeOH <10 <10 >10 >10 5 EtOH <10 <10 <10 <10 6 EtOAc <10 <10 <10 <10 7 THF <10 <10 <10 <10 8 MTBE <10 <10 <10 <10 9 Гептан <10 <10 <10 <10 10 Вода <10 <10 <10 <10 11 EtOH/H₂O (1/1) <10 <10 >50 <50 12 Ацетон/H₂O (1/1) <10 <10 >50 <50

При использовании отобранной пары растворителей условия кристаллизации были дополнительно оптимизированы, как приведено в Таблице 3. Было показано, что при условиях, приведенных в записях 5 и 6 в Таблице 3, получен материал со значительно более низким содержанием остаточного органического растворителя и более высокой степенью кристалличности, при этом более высокий выход был получен в условиях, приведенных в записи 5. Условия, приведенные в записи 5, также можно воспроизвести при масштабировании до нескольких граммов, как видно из записи 7 в Таблице 3.

Таблица 3

Номер опыта Количество Условия Растворитель
остаток Содержание остаточного растворителя*
(%) Кристал
личность Выход
(%) Т-ра Растворитель, количество Кратность растворителя (разы) Внешний вид 1 6 г 50 °C IPA, 90 мл 15 x взвесь IPA 0,80 Низкая 98% 2 0,100 г 75 °C EtOH, 5 мл 50 x гомогенный EtOH 0,80 Средняя 79,3 3 0,050 г 75 °C EtOH, 4 мл 80 x гомогенный EtOH 0,36 Высокая 59,6 4 0,050 г 75 °C EtOH, 5 мл 100 x гомогенный EtOH 0,24 Высокая 55,2 5 0,100 г 75 °C 95% EtOH/H₂O, 5 мл 50 x гомогенный EtOH 0,16 Высокая 67,6 6 0,100 г 75 °C 90% EtOH/H₂O, 5 мл 50 x гомогенный EtOH 0,08 Высокая 54,9 7 4 г 75 °C 95% EtOH/H₂O, 200 мл 50 x гомогенный EtOH 0,04 Высокая 79,7

* Содержание остаточного растворителя определяли по ¹H ЯМР

Форма A Соединения X (безводная форма)

В одном варианте осуществления Соединение X предложено в виде кристаллического материала, содержащего форму A. Кристаллическая форма Соединения X содержит кристаллическую форму, называемую в данном документе "формой A" Соединения X.

В одном варианте осуществления форма А соединения Х характеризуется параметрами элементарной кристаллической ячейки, равными примерно следующему:

Размеры элементарной ячейки:

a=8,468(5) Å α= 102,58(2)°

b=9,615(5) Å β= 92,45(3)°

c=12,102(7) Å γ=99,26(3)°

Пространственная группа симметрии: P-1

Молекулы Соединения Х/асимметричная единица: 2

Объем/число молекул в элементарной ячейке=946,0(9) ų

Плотность (расчетная)=1,449 г/см³

где параметры элементарной кристаллической ячейки формы A Соединения X измерены при температуре примерно 100(±2) K (-173°C).

В одном варианте осуществления изобретения предложена форма A Соединения X, которая характеризуется картиной порошковой рентгеновской дифракции, содержащей пики при следующих значениях 2θ (CuKα λ=1,5418 Å): 12,5±0,1, 13,0±0,1, 25,2±0,1 и 30,8±0,1. В другом варианте осуществления в дополнение к указанным выше значениям 2θ форма А характеризуется одним или несколькими (например, 2, 3, 4 или 5) дополнительными значениями 2θ, выбранными из значений в Перечне 1. В еще одном варианте осуществления форма A характеризуется по сути такой же картиной порошковой рентгеновской дифракции, как представлена на Фигуре 1.

Перечень 1: Перечень XRPD-пиков формы A Соединения X (2θ: подчеркнуты пики с наибольшей интенсивностью)

Угол °2θ 7,3 9,5 10,6 12,5 13,0 14,2 14,7 15,8 18,7 20,2 20,7 22,1 22,9 24,5 25,2 26,0 26,9 28,7 30,8 31,9 32,6 35,1

В другом варианте осуществления форма A Соединения X характеризуется сильным эндотермическим эффектом в ходе ДСК при примерно 264 ± 1°C.

В другом варианте осуществления форма A Соединения X характеризуется постепенной потерей массы при ТГА, равной потере примерно 0,6% к моменту достижения 200°C.

Форма H_A Соединения X (моногидрат)

В одном варианте осуществления Соединение X предложено в виде моногидрата кристаллической формы, называемой здесь "форма H_A" Соединения X. Форма H_A Соединения X имеет стехиометрию, в которой одна молекула воды приходится на каждую молекулу Соединения X.

В одном аспекте данного изобретения предложена форма H_А Соединения X, картина порошковой рентгеновской дифракции которой содержит пики при следующих значениях 2θ (CuKα λ=1,5418 Å): 13,8±0,1, 20,8±0,1, 26,2±0,1, 26,7±0,1 и 28,2±0,1. В другом варианте осуществления в дополнение к указанным выше значениям 2θ форма Н_А характеризуется одним или несколькими (например, 2, 3, 4 или 5) дополнительными значениями 2θ, выбранными из значений в Перечне 2. В еще одном варианте осуществления форма Н_A характеризуется по сути такой же картиной порошковой рентгеновской дифракции, как представлена на Фигуре 4.

Перечень 2: Перечень XRPD-пиков формы Н_A Соединения X (2θ: подчеркнуты пики с наибольшей интенсивностью)

Угол °2θ 9,7 12,3 13,4 13,8 14,0 18,2 18,9 20,8 22,9 23,1 23,8 24,9 26,2 26,7 27,1 27,6 27,7 28,2 30,4 32,5

Было обнаружено, что моногидрат легко образуется в смесях вода/растворитель при водной активности выше 0,5~0,6, и он имеет приемлемую устойчивость к воздействию влажности и температуры.

В другом варианте осуществления форма Н_A Соединения X характеризуется сильным эндотермическим эффектом в ходе ДСК при примерно 256 ± 1°C.

В другом варианте осуществления форма Н_A Соединения X характеризуется постепенной потерей массы при ТГА, равной потере примерно 4,2% к моменту достижения 111°C.

Форма H_В Соединения X (дигидрат)

В одном варианте осуществления Соединение X предложено в виде дигидрата кристаллической формы, называемой здесь "форма H_В" Соединения X. Форма H_В Соединения X имеет стехиометрию, в которой две молекулы воды приходятся на каждую молекулу Соединения X.

В одном аспекте данного изобретения предложена форма H_B Соединения X, картина порошковой рентгеновской дифракции которой содержит пики при следующих значениях 2θ (CuKα λ=1,5418 Å): 9,0±0,1, 17,1±0,1, 22,8±0,1, 26,9±0,1 и 35,3±0,1. В другом варианте осуществления в дополнение к указанным выше значениям 2θ форма H_В характеризуется одним или несколькими (например, 2, 3, 4 или 5) дополнительными значениями 2θ, выбранными из значений в Перечне 3. В еще одном варианте осуществления форма Н_В характеризуется по сути такой же картиной порошковой рентгеновской дифракции, как представлена на Фигуре 8.

Перечень 3: Перечень XRPD-пиков формы Н_В Соединения X (2θ: подчеркнуты пики с наибольшей интенсивностью)

Угол °2θ 9,0 14,0 17,1 18,1 18,5 21,9 22,8 24,0 25,2 26,9 28,7 29,6 30,5 35,3 35,9 41,2

В другом варианте осуществления форма Н_В Соединения X характеризуется сильным эндотермическим эффектом в ходе ДСК при примерно 244 ± 1°C.

В другом варианте осуществления форма Н_В Соединения X характеризуется постепенной потерей массы при ТГА, равной потере примерно 8,5% к моменту достижения 122°C.

Присутствие реакционных примесей и/или производственных примесей можно определить, используя аналитические методики, известные в данном уровне техники, такие как, например, хроматография, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, масс-спектрометрия или инфракрасная спектроскопия.

В одном аспекте данного изобретения полиморфы данного изобретения обладают кристаллическими свойствами и являются кристаллическими по меньшей мере на 50%, более предпочтительно являются кристаллическими по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно являются кристаллическими по меньшей мере на 70%, и наиболее предпочтительно являются кристаллическими по меньшей мере на 80%. Кристалличность может быть установлена с помощью общепринятых методик рентгеновской дифрактометрии.

В некоторых вариантах осуществления твердая форма Соединения Х содержит одну или несколько форм, описываемых в данном документе. Твердая форма Соединения Х может включать в себя две или более этих форм, т.е. она может представлять собой смесь двух или более форм. В некоторых вариантах осуществления образец твердой формы в основном состоит из одной формы, выбранной из Форм A, H_A и H_B, что означает что 50% материала или более представляет собой одну твердую форму. Относительное содержание различных форм в смеси можно определять по данным XRPD. Как описано в данном документе, некоторые формы могут образовываться или переходить одна в другую в подходящих условиях, так например, форма A и H_A, которые могут находиться в смеси и могут переходить одна в другую в зависимости от относительной влажности и температуры, при которых находится материал.

В одном аспекте данного изобретения полиморфы данного изобретения являются кристаллическими на от 50%, 60%, 70%, 80% или 90% до 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

В настоящей спецификации пики в картине порошковой рентгеновской дифракции (выраженные в градусах 2θ) измерены с использованием рентгеновского излучения (меди) с длиной волны 1,5406 Å (альфа1) и 1,5444 Å (альфа2).

Кристаллические формы настоящего изобретения могут существовать либо в несольватированной, либо в сольватированной формах. Термин "сольват" используется в данном документе для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение настоящего изобретения и некоторое количество одного или нескольких фармацевтически приемлемых растворителей. Примеры фармацевтически приемлемых растворителей включают этанол и воду. Термин "гидрат" используется, если указанным растворителем является вода. Описываемые в данном документе два полиморфа Соединения Х представляют собой гидраты.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,5%.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,4%.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,3%.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,2%.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,1%.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму H_A Соединения X.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму H_В Соединения X.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х в сочетании с формой H_A Соединения X.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х в сочетании с формой H_A Соединения X.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х в сочетании с формой H_В Соединения X.

В другом варианте осуществления кристаллическая форма представляет собой форму А Соединения Х в сочетании с формой H_A Соединения X и формой H_В Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена композиция, содержащая одну твердую форму, выбранную из любого варианта осуществления, описанного выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая одну твердую форму, выбранную из любого варианта осуществления, описанного выше, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или формообразующее.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество одной твердой формы, выбранной из любого варианта осуществления, описанного выше, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или формообразующее.

Фармацевтическая композиция пригодна для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, как описано выше, дополнительно содержащая дополнительное(ые) терапевтическое(ие) средство(а).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена одна твердая форма, выбранная из любого варианта осуществления, описанного выше, для применения в терапевтическом лечении, сама по себе или необязательно в сочетании с другим соединением настоящего изобретения и/или по меньшей мере с одним терапевтическим средством другого типа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена одна твердая форма, выбранная из любого варианта осуществления, описанного выше, для применения в терапевтическом лечении, для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2, сама по себе и/или по меньшей мере с одним терапевтическим средством другого типа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества одной твердой формы, выбранной из любого варианта осуществления, описываемого выше, самого по себе и/или по меньшей мере одного терапевтического средства другого типа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества первого и второго терапевтического средства, где первое терапевтическое средство представляет собой одну твердую форму, выбранную из любого варианта осуществления, описываемого выше, и второе терапевтическое средство представляет собой одно терапевтическое средство другого типа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения также предложено применение одной твердой формы, выбранной из любого варианта осуществления, описанного выше, для производства лекарственного средства для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2, самой по себе или, необязательно, в сочетании по меньшей мере с одним терапевтическим средством другого типа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен комбинированный препарат из одной твердой формы, выбранной из любого варианта осуществления, описанного выше, и дополнительного(ых) терапевтического(их) средства(средств) для применения в терапевтическом лечении.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена комбинация одной твердой формы, выбранной из любого варианта осуществления, описанного выше, и дополнительного(ых) терапевтического(их) средства(средств) для одновременного или раздельного применения в терапевтическом лечении.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен комбинированный препарат из одной твердой формы, выбранной из любого варианта осуществления, описанного выше, и дополнительного(ых) терапевтического(их) средства(средств) для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2. Указанную твердую форму можно вводить в виде фармацевтической композиции, описанной в данном документе.

Примеры заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2, включают, но не ограничиваются ими: диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, другие типы лимфом, лейкемию, множественную миелому, мезотелиому, рак желудка, злокачественную рабдоидную опухоль, печеночно-клеточный рак, рак простаты, карциному молочной железы, рак желчных протоков и рак желчного пузыря, рак мочевого пузыря, опухоли головного мозга, включая нейробластому, глиому, глиобластому и астроцитому, рак шейки матки, рак толстой кишки, меланому, рак эндометрия, рак пищевода, рак головы и шеи, рак легкого, назофарингеальную карциному, рак яичника, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному, рак прямой кишки, рак щитовидной железы, опухоли околощитовидной железы, опухоли матки и саркомы мягких тканей, выбранные из рабдомиосаркомы (RMS), саркомы Капоши, синовиальной саркомы, остеосаркомы и саркомы Юинга.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения заболеваний или расстройств, опосредованных EED и/или PRC2, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества первого терапевтического средства и, необязательно, второго терапевтического средства, где первое терапевтическое средство представляет собой одну твердую форму, выбранную из любого варианта осуществления, описываемого выше, и второе терапевтическое средство представляет собой одно терапевтическое средство другого типа; где заболевания или расстройства выбирают из диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), фолликулярной лимфомы, других типов лимфом, лейкемии, множественной миеломы, рака желудка, злокачественной рабдоидной опухоли и печеночно-клеточного рака.

В другом варианте осуществления дополнительное(ые) терапевтическое(ие) средство(а), используемые в комбинированных фармацевтических композициях, или комбинированных способах, или комбинированных применениях, выбирают из одного или нескольких - предпочтительно от одного до трех - из следующих терапевтических средств: других противораковых средств, иммуномодуляторов, противоаллергических средств, противорвотных средств, болеутоляющих, цитопротекторов и их комбинаций.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной форме A, составляет менее чем 0,5%, предпочтительно - менее 0,2% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры не ниже примерно 50°C;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру не ниже примерно 50°C; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, включающий в себя стадии:

1) суспендирования Соединения А в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагрева полученной суспензии до температуры от примерно 50 до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора добавлением 0,5 н. раствора HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

4) понижения температуры раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования Соединения А в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагрева полученной суспензии до температуры от примерно 50 до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора добавлением 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

4) понижения температуры раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, которую можно получать способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, которую можно получать способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования Соединения А в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагрева полученной суспензии до температуры от примерно 50 до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора добавлением 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

4) понижения температуры раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры не ниже примерно 50°C;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, используя хлористоводородную кислоту, поддерживая при этом температуру не ниже примерно 50°C; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения кристаллической формы A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, включающий в себя стадии:

1) суспендирования Соединения А в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагрева полученной суспензии до температуры от примерно 50 до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора путем добавления 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

4) понижения температуры раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования Соединения А в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагрева полученной суспензии до температуры от примерно 50 до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора путем добавления 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

4) понижения температуры раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, которую можно получать способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, полученная способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно 50°C или выше;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, поддерживая при этом температуру при примерно 50°C или выше; и

4) понижения температуры полученного раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложена кристаллическая форма A Соединения X, массовая доля остаточного органического растворителя в которой составляет менее 0,5%, предпочтительно - менее 0,3% остаточного органического растворителя, более предпочтительно - менее 0,1% остаточного органического растворителя, которую можно получать способом, включающим в себя стадии:

1) суспендирования Соединения А в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагрева полученной суспензии до температуры от примерно 50 до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора путем добавления 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C; и

4) понижения температуры раствора, чтобы ускорить образование кристаллов, до получения формы A Соединения X.

В дополнительных вариантах осуществления вышеуказанного способа получения кристаллической формы А Соединения Х в настоящем изобретении предложены следующие предпочтительные соотношения смесей растворителей:

Соотношение H₂O и EtOH в смеси растворителей, где массовая доля EtOH составляет от 80 до 100%.

Соотношение H₂O и EtOH в смеси растворителей, где массовая доля EtOH составляет от 85 до 100%.

Соотношение H₂O и EtOH в смеси растворителей, где массовая доля EtOH составляет от 90 до 100%.

Соотношение H₂O и EtOH в смеси растворителей, где массовая доля EtOH составляет от 95 до 100%.

Соотношение H₂O и EtOH в смеси растворителей, где массовая доля EtOH составляет от 85 до 95%.

Соотношение H₂O и EtOH в смеси растворителей, где массовая доля EtOH составляет от 90 до 95%.

В дополнительных вариантах осуществления вышеуказанного способа получения кристаллической формы А Соединения Х в настоящем изобретении предложены следующие предпочтительные интервалы температур для стадии 2:

Температурный интервал от 50 до 75°C.

Температурный интервал от 60 до 75°C.

Температурный интервал от 70 до 75°C.

Различные (перечисленные) варианты осуществления настоящего изобретения описаны в данном документе. Необходимо понимать, что характеристики, описанные в каждом варианте осуществления, можно объединять с другими описанными характеристиками с получением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Также понятно, что каждый отдельный элемент вариантов осуществления является его собственным независимым вариантом осуществления.

Другие признаки настоящего изобретения должны стать очевидными в ходе приведенных выше описаний иллюстративных вариантов осуществления, которые приведены в качестве примера изобретения и не предназначены для его ограничения.

III. Определения

Общие термины, используемые ранее и далее, предпочтительно имеют в контексте настоящего изобретения следующие значения, если не указано иное, где более общие термины, которые могут использоваться независимо друг от друга, могут заменяться более конкретными определениями или не изменяться, таким образом определяя более подробные варианты осуществления изобретения.

Специалисты в данной области могут легче понять признаки и преимущества данного изобретения после прочтения следующего подробного описания. Следует иметь в виду, что некоторые особенности изобретения, которые для ясности описаны выше и ниже в контексте отдельных вариантов осуществления, могут также быть представлены комбинацией в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки данного изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также можно комбинировать так, чтобы образовывать их подкомбинации.

Формы «единственного числа», «множественного числа» и сходные термины, используемые в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), следует трактовать как охватывающие как формы единственного, так и формы множественного числа, если в данном документе не указано иное или это очевидно не опровергается контекстом.

Все числа, выражающие количества ингредиентов, массовые доли в процентах, температуры и т.д., перед которыми стоит слово "примерно", следует понимать только как приближенные, и таким образом, незначительные отклонения в сторону увеличения и уменьшения указанных значений можно использовать для достижения по существу таких же результатов, что и при помощи указанных значений. Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, перед которыми стоит слово "примерно", являются приближенными, и могут изменяться в зависимости от требуемых свойств, которые требуется получить. По крайней мере, и не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов объемом формулы изобретения, каждый числовой параметр должен по меньшей мере рассматриваться с точки зрения числа приведенных значимых единиц с применением обычных методов округления.

Названия, используемые в данном документе для охарактеризования конкретных форм, например, "H_A" и т.п., являются всего лишь идентификаторами, которые следует интерпретировать в соответствии с информацией о характеристиках, представленной в данном документе, и не должны ограничиваться таким образом, чтобы исключать какое-либо другое вещество, обладающее сходными или идентичными физическими и химическими признаками.

Всем измерениям присущи экспериментальные ошибки, и они охвачены объемом сущности изобретения.

Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или это явно не противоречит контексту. Применение какого-либо и всех примеров или иллюстративного пояснения (например, "такой как"), представленных в данном документе, предназначено лишь для лучшего освещения настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения, заявленный иным образом.

Фраза "фармацевтически приемлемый" указывает на то, что вещество или композиция должны быть совместимы химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и/или с млекопитающим, подвергающимся его действию.

В зависимости от условий процесса конечные продукты настоящего изобретения получают либо в свободной (нейтральной) форме, или в форме соли. Как свободная форма, так и соли этих конечных продуктов охвачены объемом данного изобретения. Если требуется, одну форму соединения можно преобразовать в другую форму. Свободное основание или кислота могут быть превращены в соль; соль может быть превращена в свободное соединение или другую соль; смесь изомерных соединений настоящего изобретения может быть разделена на отдельные изомеры.

Фармацевтически приемлемые соли настоящего изобретения можно синтезировать из исходного соединения, содержащего основный или кислотный фрагмент, с помощью стандартных химических способов. Такие соли обычно можно получить путем осуществления реакции этих соединений в форме свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде, или в органическом растворителе, или в смеси их обоих; обычно предпочтительны неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечни пригодных солей можно найти в Allen, L.V., Jr., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, London, UK (2012), изобретение которых путем ссылки включено в данный документ.

В данном контексте термин "полиморф(ы)" относится к кристаллической(им) форме(ам), имеющей(им) одну и ту же химическую структуру/композицию, но отличающейся(имися) пространственным расположением молекул и/или ионов, образующих кристаллы.

В данном контексте термин "аморфный" относится к твердой форме молекулы, атома и/или ионов, которая не является кристаллической. Аморфные твердые вещества не демонстрируют определенную рентгеновскую дифракционную картину.

Для фармакопейных целей "остаточные органические растворители" в фармацевтических препаратах определены как органические летучие химические вещества, которые используются или образуются при производстве лекарственных веществ или формообразующих или при изготовлении лекарственных продуктов. Остаточные органические растворители полностью не удаляются используемыми производственными методиками.

В данном контексте "смешивающийся с водой органический растворитель" относится к органическому растворителю, который представляет собой жидкость при комнатной температуре и полностью смешивается с водой, предпочтительно его выбирают из этанола или ацетона.

В данном контексте картина XRPD, "содержащая" несколько пиков, выбранных из оговоренной группы пиков, предназначена включать картины XRPD, имеющие дополнительные пики, которые не включены в оговоренную группу пиков.

"EED" относится к белковому продукту гена эмбрионального развития эктодермы.

"PRC2"относится к Polycomb ингибиторному комплексу 2.

Термин "PRC2-опосредованное заболевание или расстройство" относится к любому заболеванию или расстройству, которое непосредственно или опосредованно регулируется PRC2. Это включает, но не ограничивается этим, любое заболевание или расстройство, которое непосредственно или опосредованно регулируется EED.

Термин "заболевание или расстройство, опосредованное EED и/или PRC2" относится к заболеваниям или расстройствам, которые непосредственно или опосредованно регулируются EED и/или PRC2.

В данном контексте термин "пациент" охватывает все виды млекопитающих.

В данном контексте термин "субъект" относится к животному. Как правило, животное является млекопитающим. "Субъект" также относится к человеку или организму, отличающемуся от человека, который потенциально может получить пользу от лечения ингибитором EED. Субъект также относится, например, к приматам (например, людям), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошкам, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и т.п. В определенных вариантах осуществления субъектом является примат. В других вариантах осуществления субъектом является человек. Типичные субъекты включают людей любого возраста с факторами риска развития онкологического заболевания.

В данном контексте субъект "нуждается" в лечении, если от такого лечения такой субъект (предпочтительно человек) получит пользу с биологической, медицинской точки зрения или улучшится качество его жизни.

Используемый здесь термин "ингибировать", "подавление" или "ингибирование" относится к уменьшению или подавлению данного состояния, симптома или расстройства, или заболевания, или значительному снижению исходного уровня активности биологической активности или процесса.

Используемые в настоящем документе термины "лечить," "проводить лечение" или "лечение" любого заболевания/расстройства относятся к лечению заболевания/расстройства у млекопитающего, в частности человека, и включают: (a) облегчение тяжести состояния при заболевании/расстройстве, (т.е., замедление или остановку или уменьшение развития заболевания/расстройства, или по меньшей мере одного из их клинических симптомов); (b) облегчение или изменение течения заболевания/расстройства, (т.е., обеспечение регрессии заболевания/расстройства, либо физически, (например, стабилизации явного симптома), физиологически (например, путем стабилизации физического параметра), либо с помощью того и другого); (c) облегчение или улучшение, по меньшей мере, одного физического параметра, включая те, которые не могут быть различимы субъектом; и/или (d) предупреждение или задержку начала проявления или развития заболевания или расстройства у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к заболеванию или расстройству, но его наличие еще не было диагностировано.

В данном контексте выражение "предотвращать" или "предотвращение" охватывает профилактическое лечение (т.е. профилактику и/или уменьшение риска) доклинической стадии заболевания у млекопитающего, в частности, у человека, направленное на снижение вероятности возникновения клинической стадии заболевания. Пациенты отбираются для профилактической терапии на основе факторов, о которых известно, что они увеличивают риск развития клинического заболевания по сравнению с населением в целом. "Профилактические" терапии можно подразделять на (a) первичную профилактику и (b) вторичную профилактику. Первичная профилактика представляет собой лечение субъекта, у которого еще не наблюдается клиническая стадия заболевания, а вторичная профилактика представляет собой предотвращение повторного проявления такой же или сходной клинической стадии заболевания.

В данном контексте выражение "снижение риска" или "снижать риск" охватывает терапевтические лечения, которые уменьшают число случаев развития клинической стадии заболевания. Как таковые, первичная и вторичная профилактические терапии являются примерами снижения риска.

Предполагается, что понятие "терапевтически эффективное количество" включает в себя количество соединения настоящего изобретения, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, например снижение уровней или ингибирование EED и/или PRC2, или смягчать симптомы, облегчать состояния, замедлять или задерживать прогрессирование заболевания, или предупреждать заболевание или расстройство, опосредованное PRC2. В случае комбинации термин относится к объединенным количествам активных ингредиентов, которые приводят к профилактическому или терапевтическому эффекту, независимо от того, вводятся ли они в комбинации, последовательно или одновременно.

В данном документе используются следующие сокращения: "EtOH" - этанол, "1x" - один раз, "2x" - дважды, "3x" - трижды, "°C" - градусы Цельсия, "водн." - водный, "кол." - колонка, "экв." - эквивалент или эквиваленты, "г" - грамм или граммы, "мг" - миллиграмм или миллиграммы, "л" - литр или литры, "мл" - миллилитр или миллилитры, "мкл" - микролитр или микролитры, "н." - нормальность, "М" - молярность, "нМ" - наномолярность, "моль" - моль или моли, "ммоль" - миллимоль или миллимоли, "мин" - минута или минуты, "ч" - час или часы, "к.т." - комнатная температура, "RT" - время удерживания, "ON" - в течение ночи, "атм" - атмосфера, "psi" - фунты на квадратный дюйм, "конц." - концентрированный, "водн." - водный, "насыщ." - насыщенный, "MW" - молекулярная масса, "mw" или "μwave" - микроволновой, "Тпл" - точка плавления, "вес" - вес, "MS" или "масс-спек." - масс-спектрометрия, "ESI" - масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, "HR" - с высоким разрешением, "HRMS" - масс-спектрометрия с высоким разрешением, "LC-MS" - жидкостная хроматография с масс-спектрометрией, "ВЭЖХ" - высокоэффективная жидкостная хроматография, "ОФ-ВЭЖХ" - ВЭЖХ с обращенной фазой, "ТСХ" или "tlc" - тонкослойная хроматография, "ЯМР" - спектроскопия ядерного магнитного резонанса, "nOe" - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера, "¹H" - протон, "δ " - дельта, "s" - синглет, "d" - дублет, "t" - триплет, "q" - квартет, "m" - мультиплет, "br" - широкий сигнал, "Гц" - Герц, "ee" - "энантиомерный избыток" и "α", "β", "R", "S", "E" и "Z" - стереохимические обозначения, известные специалистам в данной области.

ОБЩИЕ МЕТОДИКИ

Следующие методы были использованы в иллюстрационных примерах, если не указано иное.

Кристаллические формы можно получать различными способами, включая, например, кристаллизацию или перекристаллизацию из подходящего растворителя, сублимацию, рост из расплава, превращение в твердом состоянии из другой фазы, кристаллизацию из сверхкритической жидкости и струйное распыление. Методы кристаллизации или перекристаллизации кристаллических форм из смеси растворителей включают, например, испарение растворителя, снижение температуры смеси растворителей, затравку кристаллами пересыщенной молекулами и/или солями смеси растворителей, лиофильную сушку смеси растворителей, и добавление антирастворителей (противорастворителей) к смеси растворителей. Для получения кристаллических форм, включая полиморфы, можно использовать высокопроизводительные методики кристаллизации.

В случае методик кристаллизации, в которых используется растворитель, выбор растворителя или растворителей обычно зависит от одного или нескольких факторов, таких как растворимость соединения, методика кристаллизации и давление паров растворителя. Можно использовать комбинации растворителей, например, соединение можно солюбилизировать в первом растворителе до получения раствора с последующим добавлением антирастворителя для уменьшения растворимости соединения в растворе с целью образования кристаллов. Антирастворитель - это растворитель, в котором соединение обладает низкой растворимостью.

В одном способе получения кристаллов соединение суспендируют и/или перемешивают в подходящем растворителе, получая взвесь, которую можно нагревать для ускорения растворения. Используемый здесь термин "взвесь" означает насыщенный раствор соединения, который также может содержать дополнительное количество соединения, чтобы получать гетерогенную смесь соединения и растворителя при данной температуре.

К любой кристаллизационной смеси можно добавлять затравку из кристаллов для ускорения кристаллизации. Затравку можно применять для регулирования роста определенного полиморфа или для регулирования гранулометрического состава кристаллического продукта. Как правило, затравка с малым размером необходима для эффективного регулирования роста кристаллов в партии. Затравку с малым размером можно получать путем просеивания, перемалывания или микронизации больших кристаллов, или путем микрокристаллизации из растворов. Следует обращать внимание на то, чтобы при перемалывании или микронизации кристаллов не происходило изменения кристаллической формы требуемой формы кристалла (т.е. изменения в аморфное состояние или в другой полиморф).

Охлажденную кристаллизационную смесь можно отфильтровывать под вакуумом, и выделенное твердое вещество можно промывать подходящим растворителем, таким как холодный растворитель для перекристаллизации, и сушить в токе азота с получением требуемой кристаллической формы. Выделенное твердое вещество можно анализировать любым подходящим спектроскопическим или аналитическим методом, таким как твердотельный ядерный магнитный резонанс, дифференциальная сканирующая калориметрия, порошковая рентгеновская дифракция и т.п., для подтверждения образования предпочтительной кристаллической формы продукта. Получаемая кристаллическая форма, как правило, образуется с фактическим выходом в количестве более 70 (вес)%, предпочтительно с фактическим выходом более 90 (вес)%, в пересчете на вес соединения, изначально используемого в процессе кристаллизации. Продукт можно перемалывать на конусной мельнице или пропускать через сетчатое сито для удаления при необходимости кусков продукта.

Кристаллические формы можно получать непосредственно из реакционной среды последнего процесса получения Соединения X. Этого можно достичь, например, путем использования на последней стадии процесса растворителя или смеси растворителей, из которых можно кристаллизовать Соединение (I). Альтернативно, кристаллические формы можно получать методами перегонки или добавления растворителя. Подходящие растворители для этой цели включают, например, вышеупомянутые неполярные растворители и полярные растворители, включая протонные полярные растворители, такие как спирты, и апротонные полярные растворители, такие как кетоны.

Порошковая рентгеновская дифракция (XRPD)

Данные порошковой рентгеновской дифракции (XRPD) были получены на приборе Bruker D8 Discover с CuKα анодом. Порошкообразные образцы помещали на стеклянное смотровое стекло и отцентровывали в рентгеновском луче. Расстояние от образца до детектора составляло примерно 30 см, совмещали три рамки. Источником излучения был CuKα (λ=1,5418 Å). Данные регистрировали для 2<2θ<45°, при этом время экспозиции образца составляло не менее 270 секунд.

Рассчитанные атомные параметры (координаты и температурные факторы) уточняли с помощью полной матрицы наименьших квадратов. Функцией, сводимой к минимуму при приближениях, являлась Σ_w(|F_o| - |F_c|)². R определяется как Σ||F| - |F||/Σ|F_o|, а R_w=[Σ_w(|F_o| - |F_c|)²/Σ_w |F_o|²]^1/2, где w является подходящей весовой функцией, основанной на погрешности в значениях наблюдаемых интенсивностей. Разностные карты были рассмотрены на всех этапах приближения. Атомы водорода вводили в идеализированных положениях с изотропными температурными факторами, но параметры водорода не изменяли. Прибор Bruker AXS DiscoverD8 Детектор PXC-VANTEC-500 Излучение CuKα (0,15406 нм) Мощность рентгеновского источника 40 кВ, 40 мА Диапазон сканирования от 2° до 45° (значение 2 тета) Время сканирования 90 с/рамку, 3 рамки Рентгеновские оптические приспособления Монохроматор Расстояние до детектора ~30 см

Термогравиметрический анализ

Термогравиметрический анализ выполняли для каждой кристаллической формы на ТГА приборе TA Discovery TGA. При каждом анализе ТГА ячейку/камеру для образца продували сверхчистым газом азотом с расходом 20 мл/мин. Калибровку по весу выполняли, используя стандартные веса в токе азота. Скорость нагревания составляла 10°C в минуту и температура изменялась от к.т. до 300°C. Изменение веса в процентах (вес%) откладывали относительно измеряемой температуры образца.

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Дифференциальную сканирующую калориметрию выполняли для каждой кристаллической формы на ДСК приборе TA Discovery DSC. При каждом анализе ДСК ячейку/камеру для образца продували сверхчистым газом азотом с расходом 50 мл/мин. Прибор калибровали по высокочистому индию. Скорость нагревания составляла 10°C в минуту и температура изменялась от 30 до 300°C. Тепловой поток, нормализованный по весу образца, откладывали относительно измеряемой температуры образца. Данные представляли в единицах Ватт/грамм ("Вт/г"). На графике эндотермические пики направлены вниз. Эндотермический пик плавления (точка плавления) устанавливали по экстраполированной температуре начала плавления.

Динамическая сорбция паров (ДСП)

Динамическую сорбцию паров выполняли на приборе Surface Measurement Systems DVS Advantage. В кювету для образцов загружали примерно 10 мг материала. Образцы подвергали циклической сорбции/десорбции при 10% относительной влажности (RH), которую изменяли ступенчато как 50%-90%-0%-90%-50% RH при 25°C и 50°C. Была установлена цель для достижения равновесного условия, представлявшего собой изменение массы менее 0,002% за 5 мин, при минимальном и максимальном равновесных периодах, составлявших 10 и 360 мин, соответственно. Газом-носителем являлся азот при скорости потока 100 мл/мин. Систему калибровали по насыщенным растворам солей. Изменение веса образца в процентах (вес.%) на каждой стадии измеряли и откладывали относительно целевого парциального давления.

ТГА Прибор TA Discovery TGA Интервал температур 30-300°C Скорость сканирования 10 K/мин Расход азота 25 мл/мин ДСК Прибор TA Discovery DSC Интервал температур 30-300°C Скорость сканирования 10 K/мин Расход азота 50 мл/мин ДСП Прибор SMS DVS Advantage Масса образца Примерно 10 мг Температура 25°C и 50°C dm/dt 0,002%/мин

ЯМР для охарактеризования примеров

Спектры ¹H ЯМР были получены на спектрометрах Bruker с преобразованием Фурье, работающих на следующих частотах: ¹H ЯМР: 400 МГц (Bruker). ¹³C ЯМР 100 МГц (Bruker). Спектральные данные приведены в формате: химический сдвиг (мультиплетность, число атомов водорода). Химические сдвиги указаны в ppm в сторону слабого поля от внутреннего стандарта тетраметилсилана (δ единицы, тетраметилсилан=0 ppm) и/или по отношению к пикам растворителя, которые в спектре ¹H ЯМР видны при 2,49 ppm для CD₂HSOCD₃, 3,30 ppm для CD₂HOD, 1,94 для CD₃CN, и 7,24 ppm для CDCl₃, и которые в спектре ¹³C ЯМР видны при 39,7 ppm для CD₃SOCD₃, 49,0 ppm для CD₃OD и 77,0 ppm для CDCl₃. Все спектры ¹³C ЯМР снимали в режиме подавления спин-спинового взаимодействия с протонами. Измерения выполняли при комнатной температуре, если не указано иное. Содержание остаточного растворителя рассчитывали интегрированием по наиболее представительным атомам водорода в соответствующем спектре ¹H ЯМР.

V. ПРИМЕРЫ

Следующие примеры были подготовлены, выделены и охарактеризованы с использованием способов, раскрытых в данном документе. Следующие примеры не предназначены ограничивать объем данного изобретения.

Пример 1. Получение Соединения A (N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин)

Промежуточное соединение 3: 8-бром-5-(метилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин

5-Бром-4-гидразинил-2-(метилтио)пиримидин (2): К раствору 5-бром-4-хлор-2-(метилтио)пиримидина (1, 49,0 г, 0,205 моль) в этаноле (1000 мл) добавляли гидразин (21,5 г, 0,430 моль). Реакционную смесь перемешивали при к.т. в течение 4 ч. Полученную суспензию фильтровали, промывали гексаном и сушили в вакууме, получая указанное в заголовке соединение (44,1 г, 92%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ ppm 2,42 (s, 3H), 8,08 (s, 1H). LC-MS: [M+H]⁺=234,9; 236,9.

Промежуточное соединение 3: 5-Бром-4-гидразинил-2-(метилтио)пиримидин (2) (40,0 г, 0,17 моль) растворяли в 200 мл триэтоксиметана. Смесь нагревали с обратным холодильником и перемешивали в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью флэш-хроматографии (ЕА: PE=1:15~1:1), получая указанное в заголовке соединение (38,3 г, 92%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (400 МГц, метанол-d₄) δ ppm 2,82 (s, 3H), 8,03 (s, 1H), 8,87 (s, 1H). LC-MS: [M+H]⁺=245,0; 247,0.

Промежуточное соединение A1: 8-бром-N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин

2-Бром-4-(2,2-диэтоксиэтокси)-1-фторбензол (A1.1): К раствору 3-бром-4-фторфенола (500 г, 2,62 моль) и 2-бром-1,1-диэтоксиэтана (670 г, 3,4 моль) в 2,0 л DMF за один раз добавляли K₂CO₃ (1085 г, 7,86 моль). Суспензию нагревали при 110°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере N₂. После охлаждения до к.т. реакционную смесь разбавляли 10,0 л H₂O, и экстрагировали с помощью EtOAc (2,0 л × 3). Объединенную органическую фазу дважды промывали соляным раствором, сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (EtOAc/гексан=0:100-5:100), получая указанное в заголовке соединение (810 г, 80%), в виде желтого масла. ¹H-ЯМР (400 МГц, метанол-d4) δ ppm 1,27 (t, 6 H), 3,65 (q, 2 H), 3,78 (q, 2 H), 3,97 (d, 2 H), 4,82 (t, 1 H), 3,97 (d, 2 H), 6,84 (dd, 1 H), 7,04 (dd, 1 H), 7,13 (d, 1 H).

4-Бром-5-фторбензофуран (A1.2a наряду с региоизомером A1.2b): К раствору PPA (1324 г, 3,93 моль) в толуоле (2,0 л) добавляли A1.1 (810 г, 2,62 моль) за 30 мин при 95 °C. Реакционную смесь перемешивали при 95°C в течение 2 ч. После охлаждения до к.т., медленно добавляли 4,0 л ледяной воды. Смесь экстрагировали, используя PE (2,0 L × 2), объединенную органическую фазу промывали соляным раствором (2,0 л × 2), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (EtOAc/PE=0:100-5:100), получая смесь A1.2a и A1.2b (A1.2a: A1.2b=1:0,7, 310 г, выход 55%) в виде желтого масла.

5-Фторбензофуран-4-карбонитрил (A1.3): В смесь A1.2a и A1.2b (310 г, 1,44 моль) и Zn(CN)₂ (253 г, 2,16 моль) в 1,0 л DMF вносили Pd(PPh₃)₄ (162 г, 0,14 моль) в токе N₂. Реакционную смесь нагревали при 100°C и перемешивали в течение 18 ч. После охлаждения до к.т. смесь разбавляли 5,0 л воды и экстрагировали, используя EtOAc (1,0 л × 2). Объединенную органическую фазу промывали соляным раствором (1 л), сушили над Na₂SO₄(безводный), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (подвижная фаза: EtOAc/PE=1:70 за 30 мин, время удерживания =11 мин, расход: 120 мл/мин), получая указанное в заголовке соединение (92 г, 40%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (400 МГц, метанол-d₄) δ ppm 7,07 (d, 1H), 7,30 (dd, 1H), 7,89 (dd, 1H), 8,10 (dd, 1H).

Трет-бутил-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)карбамат (A1.4): В раствор A1.3 (44,5 г, 276,4 ммоль) и Boc₂O (90,0 г, 414,6 ммоль) в 1,0 л MeOH вносили Pd/C (5 г, 10 (вес.%)). Реакционную смесь дегазировали, используя H₂, и перемешивали в атмосфере H₂ в течение ночи. Смесь фильтровали через целит, промывали, используя EtOH (300 мл × 2), фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток перекристаллизовывали из PE, получая указанное в заголовке соединение (61,0 г, 93%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ ppm 1,38 (s, 9H), 3,21 (t, 2H), 4,12 (d, 2H), 4,53 (t, 2H), 6,63 (dd, 1H), 6,86 (dd, 1H), 7,25 (br s, 1H). LC-MS: [M- ^tBu +H]⁺=212,1.

(5-Фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метанамин (A1.5): Раствор A1.4 (18,3 г, 68,5 ммоль) в 50 мл HCl/диоксан (4 моль/л) перемешивали при к.т. в течение 4 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли смешанным растворителем (МеОН: MeCN=1:10, 500 мл), затем добавляли K₂CO₃ (18,0 г, 342,5 ммоль). Смесь нагревали при 60°C и перемешивали в течение 3 ч, охлаждали до к.т., фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт очищали на силикагеле (МеОН: EtOAc=0:100-1:4), получая указанное в заголовке соединение (9,2 г, 80%) в виде желтого масла. ¹H-ЯМР (400 МГц, метанол-d₄) δ ppm 3,27 (t, 2H), 3,77 (s, 2H), 4,56 (t, 2H), 6,59 (dd, 1H), 6,81 (dd, 1H). LC-MS: [M+H]⁺=168,1.

Промежуточное соединение A1: Смесь A1.5 (1,41 г, 8,2 ммоль) и 8-бром-5-(метилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидина (3) (1,0 г, 4,1 ммоль) нагревали при 40 °C и перемешивали в течение 16 ч. После охлаждения до к.т. смесь разбавляли, используя EtOAc (35 мл). Осадок отфильтровывали и промывали, используя EtOAc (3 мл × 3), сушили в вакууме, получая указанное в заголовке соединение (1,0 г, 67%) в виде белого твердого вещества. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO) δ ppm 3,27 (t, 2H), 4,53 (t, 2H), 4,66 (d, 2H), 6,71 (dd, 1H), 6,95 (t, 1H), 7,85 (s, 1H), 8,75 (t, 1H), 9,48 (s, 1H). LC-MS: [M+H]⁺=363,7; 365,7.

К смеси A1 (40 мг, 0,110 ммоль) в 1,4-диоксане (3 мл), MeCN (0,30 мл) и воде (0,30 мл) добавляли (2-метилпиридин-3-ил)бороновую кислоту (30,1 мг, 0,220 ммоль), карбонат калия (45,5 мг, 0,330 ммоль) и Pd(Ph₃P)₄ (12,69 мг, 10,98 мкмоль). Полученную смесь перемешивали в токе N₂ при 110°C в течение 3 ч. охлаждали до к. т. и выпаривали под вакуумом. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM: MeOH =10:1), получая N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин в виде белого твердого вещества (20 мг, 46,0%).

В альтернативном варианте N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин получали указанным ниже методом. В суспензию А1 (25,5 г, 70 ммоль), 2-метил-3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридина (30,6 г, 140 ммоль) и NaHCO₃ (35,3 г, 420 ммоль) в растворе смеси, состоящем из 1,4-диоксана (300 мл) и H₂O (100 мл), вносили PdCl₂(dppf) (5,94 г, 612 ммоль). Смесь дегазировали в токе N₂, нагревали при 110 °C в течение 1 ч. Полученную смесь охлаждали до к.т. и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (EtOAc: MeOH=20:1), получая 14 г требуемого продукта. К продукту добавляли 200 мл ацетона и полученную суспензию нагревали при 50 °C в течение 2 ч. Твердое белое вещество отфильтровывали и сушили под вакуумом, получая N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин (13,6 г, 52%) ¹H-ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆) δ ppm 2,40 (s, 3H), 3,33 (t, 2H), 4,56 (t, 2H), 4,72 (s, 2H), 6,72 (dd, 1H), 6,96 (dd, 1H), 7,31 (dd, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,74 (d, 1H), 8,51 (d, 1H), 8,72 (t, 1H), 9,49 (s, 1H). LC-MS: [M+H]⁺=376,9.

Пример 2: Получение формы A Соединения X (N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида) с использованием изопропанола (IPA) (запись 1 в Таблице 2)

К суспензии N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (6,0 г, 15,94 ммоль) в 100 мл IPA по каплям добавляли раствор 0,5 н. HCl в IPA (33,0 мл, 16,50 ммоль) при к.т. Суспензию перемешивали при 50°C в течение 12 ч, затем охлаждали до к.т. и перемешивали в течение 5 ч. Полученное твердое вещество отфильтровывали и сушили при 40°C под вакуумом 2 дня, получая гидрохлоридную соль формы A Соединения X в виде белого твердого вещества (6,5 г, 98%) ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ ppm 2,65 (s, 3H), 3,35 (t, 2H), 4,57 (t, 2H), 4,74 (d, 2H), 6,73 (dd, 1H), 6,97 (dd, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,85-7,94 (m, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,80 (dd, 1H), 9,07 (t, 1H), 9,58 (s, 1H). LC-MS: [M+H]⁺=376,9. Остаточное содержание растворителя рассчитывали на основании интегрирования наиболее представительных атомов водорода на соответствующем ¹H ЯМР спектре. В частности, интегрирование по δ 1,04, соответствующему 6 атомам водорода в метильных группах IPA, дает 0,31, в то время как интегрирование по 3 атома водорода метильной группы 2-метил-пиридина при δ 2,64 дает 3. Поэтому, мольный процент IPA рассчитывают следующим образом: 0,31/6 (1+0,31/6)=4,9%; а массовую долю IPA в процентах рассчитывают следующим образом: 60 × (0,31/6) /{(376,38+36,46+60 × (0,31/6)}=0,74% {MW(IPA)=60, MW (соединения A)=376,40 и MW (HCl)=36,46)}.

Пример 3. Получение формы A Соединения X (N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида) с использованием EtOH/H₂O (запись 7 в Таблице 2)

К 4,0 г N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина в 500 мл колбе добавляли 200 мл EtOH/H₂O (95/5, об./об.) и смесь перемешивали с помощью механической мешалки. Полученную суспензию нагревали при 75°C на масляной бане и поддерживали эту температуру в течение 1 ч. К суспензии, температура которой поддерживалась на уровне 75°C, по каплям добавляли 23,38 мл 0,5 н. HCl в EtOH (1,1 экв.). Смесь становилась прозрачной после добавления соляной кислоты. Полученный раствор перемешивали при 75°C в течение 2 ч. Затем смесь охлаждали до к.т. за 3 ч и полученное Соединение X в виде белого твердого вещества (3,5 г, 79,7%) отфильтровывали и сушили в течение 6 ч под вакуумом. Содержание остаточного EtOH рассчитывали интегрированием по атомам водорода в спектре ¹H ЯМР. В частности, интегрирование по δ 1,06, соответствующему 3 атомам Н в метильных группах EtOH, дает 0,01, в то время как интегрирование по 3 атомам водорода метильной группы 2-метил-пиридина при δ 2,65 дает 3. Поэтому, мольный процент EtOH рассчитывают следующим образом: 0,01/3 (1+0,01/3)=0,33%; а массовое содержание EtOH в процентах рассчитывали следующим образом: 46,07 x (0,01/3) /{(376,38+36,46+x (0,01/3)}=0,04% {MW(EtOH) =46,07, MW (соединения A)=376,40 и MW (HCl)=36,46).

Пример 4: Получение формы H_A Соединения X

1,0 г формы A соединения X вносили в 10 мл смеси этанол/вода (3:1) с получением суспензии. Суспензию перемешивали при к.т. в течение 3 дней. Полученное твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и сушили при к.т. в течение ночи. Форму H_A Соединения X (0,81 г) получали с выходом 77%.

Пример 5: Получение формы H_В Соединения X

200 мг формы A Соединения X растворяли в минимальном количестве смеси ацетон/вода (1:1) при 60°C, получая прозрачный раствор. Раствор выпаривали при к.т. в течение от 3 до 5 дней. Полученное твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и сушили при к.т. в течение ночи. Получали форму H_В Соединения X.

Приготовление 0,5 н. HCl в EtOH или ацетоне:

4,0 мл доступной в продаже водной концентрированной HCl (36,5%, вес/вес, в воде) вносили в 96,0 мл EtOH или ацетона (необязательно при пониженной температуре), и раствор хорошо перемешивали, получая 0,5 н. HCl в EtOH или ацетоне.

Экспериментальные процедуры сведены в Таблицу 2:

К 10 мг соединения X в пробирке при 50°C по каплям добавляли выбранный растворитель. Добавление растворителя прекращали, когда образовывался прозрачный раствор или количество растворителя достигало 1 мл. Полученную смесь непрерывно перемешивали при 50°C в течение 2 ч. и затем охлаждали до к.т. и перемешивали в течение ночи. Растворимость при 50°C и к.т. определяли по гомогенности полученной смеси.

Экспериментальные процедуры сведены в Таблицу 3.

Эксперименты, внесенные в Таблицу 3 как записи №№ 1-6, выполняли согласно процедуре, описанной при образовании соли в Примере 3 выше, но при других параметрах, приведенных в Таблице 3.

VI. ФАРМАКОЛОГИЯ И ПОЛЕЗНОСТЬ

Ключевой компонент PRC2 комплекса - EED - не обладает естественной ферментативной активностью. Однако это является необходимым для нормального функционирования PRC2. EED непосредственно связывается с H3K27me3 и факт этого связывания локализует комплекс PRC2 к субстрату хроматина и аллостерически активирует активность метилтрансферазы. Нацеливание на аллостерический сайт в пределах регуляторной EED субъединицы PRC2 может представлять собой новый уникальный подход, который обладает преимуществом или дополнительно действует при непосредственном нацеливании на механизм конкуренции SAM EZH2 или PRC2. Таким образом, нацеливание на EED представляет собой очень привлекательную стратегию для разработки новых способов терапевтического лечения многих форм онкологических заболеваний. В частности, существует потребность в малых молекулах, ингибирующих активность PRC2 через нацеливание на EED. Было найдено, что производные триазолопиримидина, как раскрывается в данном документе, полезны для нацеливания на EED для лечения EED или PRC2-опосредованных заболеваний или расстройств, особенно онкологических заболеваний.

Полезность Соединения Х настоящего изобретения может быть продемонстрирована с использованием любой из следующих исследовательских процедур. Соединение X оценивали в отношении его способности ингибировать активность PRC2 в пятимерном комплексе EZH2, SUZ12, EED, Rbap48 и AEBP в биохимических анализах. Способность соединений настоящего изобретения ингибировать клеточную активность PRC2 оценивали путем анализа метилирования гистона H3 по лизину в 27 положении в клеточных линиях человека. Вывод о способности Соединения Х подавлять онкологические заболевания делали на основании его способности модулировать активность клеточных линий рака человека, у которых наблюдается специфическая зависимость от активности PRC2 для поддержания роста злокачественного новообразования.

Анализ конкурентного связывания пептида EED-H3K27Me3 с использованием AlphaScreen (α-screen)

Для оценки силы действия соединений в анализе конкурентного связывания EED-H3K27Me3 соединения разбавляли серийно в три раза в DMSO, получая в общей сложности двенадцать концентраций. Затем соединения при каждой концентрации (75 нл каждой) переносили, используя Mosquito, в 384-луночные планшеты Perkin Elmer ProxiPlate 384 plus. 8 мкл растворов, содержащих 30 нМ EED (1-441)-His белка и 15 нМ пептида биотин-H3K27Me3 (19-33) в буфере (25 мМ HEPES, pH 8, 0,02% Tween-20, 0,5% BSA), вносили в лунки и затем инкубировали с соединением в течение 20 мин. Смесь микросфер AlphaScreen для детектирования готовили непосредственно перед использованием путем смешивания никель-хелатных микросфер-акцепторов со стрептавидиновыми микросферами-донорами в соотношении 1:1 (Perkin Elmer, продукт № 6760619C/M/R) в буфере, описанном выше. Затем 4 мкл смеси микросфер для детектирования вносили в планшет и инкубировали в темноте при к.т. в течение 1 ч. Конечная концентрация микросфер доноров и акцепторов составляла 10 мкг/мл каждого. Планшеты считывали на EnVision (PerkinElmer), устанавливая прибор AlphaScreen для оптимального детектирования сигнала с 615 нм фильтром, после возбуждения образца при 680 нм. Испускаемый сигнал при 615 нм использовали для количественного измерения ингибирования соединениями. Сигналы AlphaScreen нормализовали по считыванию, поступающему от положительного (контроль максимального сигнала) и отрицательного контролей (контроль минимального сигнала), получая процент от оставшейся активности. Затем уравнение зависимости ответа от дозы приводили в соответствие с данными, используя программное обеспечение Helios (Novartis) для расчета значений IC50. Helios представляет собой программу для оценки данных анализа, разработанную компанией Novartis с использованием методов, описанных в работах Normolle, D. P., Statistics in Medicine, 12:2025-2042 (1993); Formenko, I. et al., Computer Methods and Programs in Biomedicine, 82, 31-37 (2006); Sebaugh, J. L., Pharmaceutical Statistics, 10:128-134 (2011); Kelly, C. et al., Biometrics, 46(4):1071-1085 (1990); и Kahm, M. et al., Journal of Statistical Software, 33(7): (2010) (grofit: Fitting Biological Growth Curves with R, стр. 1-21, на сайте http://www.jstatsoft.org/).

Каждое соединение подвергали обратному скринингу для определения возможного нежелательного взаимодействия с микросферами AlphaScreen. Соединения разбавляли, как описано в предыдущем разделе, и анализ выполняли путем внесения 12 мкл 10 нМ пептида биотин-miniPEG-His6 в вышеуказанном буфере и инкубировали в течение 20 мин при к.т. до внесения 10 мкг/мл микросфер каждого. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при к.т. в темноте перед считыванием на EnVison.

LC-MS анализ EED

Типичные соединения настоящего изобретения разбавляли в сериях и отдельно разбавляли в три раза в DMSO, получая в общей сложности восемь или двенадцать концентраций. Затем исследуемые соединения при каждой концентрации (120 нл каждого) переносили, используя Mosquito, в 384-луночные планшеты Perkin Elmer ProxiPlate 384 plus. Растворы (6 мкл) 24 нМ комплекса PRC2 (wtPRC2) дикого типа и добавляли 2 мкМ SAM в реакционном буфере (20 мМ Tris, pH 8,0, 0,1% BSA, 0,01% Triton, 0,5 мМ DTT) в лунки, которые затем инкубировали с исследуемым соединением в течение 20 мин. Затем вносили 6 мкл раствора 3 мкМ пептида субстрата H3K27Me0 (гистон H3[21-44]-биотин) в реакционном буфере с целью инициировать каждую реакцию. Конечные компоненты реакционного раствора включали 12 нМ комплекса wtPRC2, 1 мкМ SAM и 1,5 μM пептида H3K27me0 с изменяющейся концентрацией соединений. Положительный контроль состоял из фермента, 1 мкМ SAM и 1,5 мкМ субстрата в отсутствие соединения, а отрицательный контроль состоял только из 1 мкМ SAM и 1,5 мкМ субстрата. Каждую реакционную смесь инкубировали при к.т. в течение 120 мин, затем реакцию останавливали добавлением 3 мкл в каждую гасящего раствора (2,5% TFA с 320 мМ d4-SAH). Реакционную смесь центрифугировали (центрифуга Eppendorf 5810, Rotor A-4-62) в течение 2 мин при 2000 об/мин и считывали на тройном квадрупольном масс-спектрометре API 4000 с Turbulon Spray (Applied Biosystem) в сочетании с Prominence UFLC (Shimadzu). Уровни продуцирования SAH затем нормализовали на основании значений, поступающих от положительного и отрицательного контролей, получая процентную ферментную активность. Затем уравнение зависимости ответа от дозы приводили в соответствие с данными, используя программное обеспечение Helios для расчета значений IC₅₀ исследуемого соединения.

Анализ ELISA (метилирование H3K27)

Типичные соединения настоящего изобретения разбавляли в сериях и отдельно разбавляли в три раза в DMSO, получая в общей сложности восемь или двенадцать концентраций. Затем соединения вносили в клетки G401, культивированные в 384-луночном планшете при разведении 1:500 с получением наивысшей концентрации, равной 20 мкМ. Клетки дополнительно культивировали в течение 48 ч перед проведением ELISA.

Экстракция гистона: Клетки в 384-луночном планшете промывали, используя PBS (10 x PBS буфера (80 г NaCl (Sigma, S3014), 2 г KCl (Sigma, 60128), 14,4 г Na₂HPO₄ (Sigma, S5136), 2,4 г KH₂PO₄ (Sigma, P9791), доведенного до 1 л водой, до pH 7,4), и лизировали добавлением буфера для лизиса (0,4 н. HCl; 45 мкл на лунку). Планшеты осторожно встряхивали при 4°C в течение 30 мин. Лизат клеток нейтрализовали нейтрализующим буфером (0,5 M двухосновный фосфат натрия, pH 12,5, 1 мМ DTT; 36 мкл на лунку). Планшеты встряхивали, чтобы лизаты были хорошо перемешаны перед проведением анализа ELISA.

Протокол ELISA: Лизаты клеток переносили в лунки 384-луночного планшета и конечный объем в каждой лунке доводили до 50 мкл, используя PBS. Планшеты герметично закрывали, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 2 мин и инкубировали при 4°C в течение примерно 16 ч. Планшеты промывали буфером TBST (1 x TBS (10x TBS: 24,2 г Tris (Sigma, T6066), 80 г NaCl (Sigma, S3014) объем доводили до 1 л водой и pH доводили до 7,6, используя HCl) с 0,1% Tween-20). Блокирующий буфер (TBST, 5% BSA; 50 мкл на лунку) вносили в планшет и инкубировали в течение 1 ч при к.т. Блокирующий буфер удаляли и вносили первичное антитело (30 мкл на лунку). Следующие разведения выполняли, используя блокирующий буфер: в случае антитела к H3K27me3 (Cell Signaling Technology, № 9733) разведение составляло 1:1000; в случае антитела к H3K27me2 (Cell Signaling Technology, № 9288) разведение составляло 1:100; для антитела к H3 (Abcam, Кат. № 24834) разведение составляло 1:1000. Первичное антитело инкубировали в планшете при к.т. в течение 1 ч. Лунки промывали TBST и инкубировали со вторичным антителом в течение 1 ч при к.т. В случае вторичных антител выполняли следующие разведения блокирующим буфером: антитело к антителу кролика (Jackson ImmunoResearch, № 111-035-003), разведение составляло 1:2000; и в случае антитела к антителу мыши (Cell signaling technology, № 7076) разведение составляло 1:1000. Через 1 ч инкубирования при к.т. лунки промывали, используя TBST. Субстрат ECL (Pierce, № 34080) вносили в количестве 30 мкл на лунку и планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 2 мин. Сигнал считывали на считывающем устройстве PerkinElmer Envision Reader. Полученные данные по метилированию H3K27 нормализовали по H3 сигналу, а затем процент ингибирования рассчитывали относительно образцов, обработанных DMSO. Затем кривую зависимости ответа от дозы приводили в соответствие с данными, используя программное обеспечение Helios для расчета значений IC₅₀ исследуемого соединения.

Вестерн-блот анализ

Типичные соединения настоящего изобретения анализировали в отношении их способности избирательно ингибировать PRC2. Вестерн-блоттинг проводили с использованием стандартных методик молекулярной биологии. Клетки лизировали в буфере SDS для лизиса (Millipore, Кат. № 20-163) и измеряли концентрацию белка, используя белковый анализ BCA (Pierce, Кат. № PI-23221). Антитела для Вестерн-блоттинга: антитело к EZH2 (№ 3147), антитело к H3 (№ 9715), антитело к H3K4me1 (№ 9723), антитело к H3K4me2 (№ 9725), антитело к H3K4me3 (№ 9727), антитело к H3K9me2 (№ 9753), антитело к H3K36me2 (№ 9758), антитело к H3K27me2 (№ 9755) и антитело к H3K27me3 (№ 9756) приобретали у компании Cell Signaling Technology (Данверс, Массачусетс, США). Антитело к H3K9me1 (№ 07-395), антитело к H3K27me1 (№07-448) и антитело к H3K36me1 (№ 07-548) приобретали у компании Millipore (Биллерика, Массачусетс, США). Антитело к H3K36me3 (ab9050-100) приобретали у компании Abcam (Кембридж, Великобритания). Антитело к H3K9me3 (№ 39161) приобретали у компании Active Motif (Карлсбад, Калифорния, США).

Соединения настоящего изобретения специфично ингибируют метилирование субстрата PRC2 - H3K27. Это можно продемонстрировать путем их способности ингибировать H3K27me2 и H3K27me3 в ряде клеточных линий рака человека, примеры которых включают рабдоидные клетки (G401) и клетки лимфомы (WSU-DLCL2, KARPAS422, SU-DHL4). Селективность профилировали с рядом других метилирующих меток, например: H3K4me2; H3K9me2; H3K36me3; и H3K79me3.

Анализ клеточной пролиферации

Клетки KARPAS422 клеточной лимфомы культивировали, используя стандартные условия для клеточных культур в RPMI-1640 (Invitrogen, Кат. № 11875), дополненные 15% FBS (Invitrogen, Кат. № 10099-141) во влажном инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂. Для оценки эффекта от ингибирования PRC2 на клеточную пролиферацию засевали клетки с экспоненциальным ростом с плотностью 1 × 10⁵ клеток/мл в 12-луночный планшет (Corning, Кат. № CLS3513). Вслед за посевом клеток в клеточную среду вносили соединение настоящего изобретения (при концентрации, изменяющейся от 0 до 100 мкМ, в сериях из 3x разведений). Число жизнеспособных клеток определяли каждые 3-4 дня вплоть до 14 дней, используя Vi-CELL (счетчик Beckman). В дни подсчета клеток добавляли свежую среду для роста и соединение, и клетки снова разделяли до плотности 1 × 10⁵ клеток/мл. Общее количество клеток выражается в виде скорректированных по расщеплению жизнеспособных клеток на мл. Кривые зависимости доза-ответ и значения IC₅₀ получали, используя Prism.

Анализ фармакокинетических свойств

Фармакокинетические свойства соединений, как здесь раскрывается, можно определять, используя описанный ниже протокол.

Типичное соединение настоящего изобретения растворяли в 10% PEG300, 10% Solutol HS 15 и 80% pH 4,65 ацетатного буфера, получая конечную концентрацию 0,2 мг/мл для внутривенного (IV) и перорального (PO) введения.

Для ФК исследований на крысах использовали в целом по три самца крыс Sprague Dawley для каждого IV и PO ФК исследования соответственно. Раствор препарата вводили через одну болюсную IV линию в дозе 1 мг/кг и один пероральный желудочный зонд (PO) в дозе 2 мг/кг, соответственно. Образцы крови (примерно 150 мкл) отбирали с помощью яремной канюли в соответствующие моменты времени.

Для ФК исследования на мышах использовали в целом двенадцать самцов мышей ICR для IV и PO исследования, соответственно. Раствор препарата вводили через одну болюсную IV линию в дозе 1 мг/кг и один пероральный желудочный зонд (PO) в дозе 2 мг/кг, соответственно. Образцы крови (примерно 150 мкл) отбирали с помощью ретроорбитальной пункции (~150 мкл/мышь) после анестезирования изофлураном или путем сердечной пункции (последний отбор образца) в соответствующие моменты времени (n=3).

Образцы отбирали в пробирки, содержащие K3-EDTA, и хранили на льду до проведения центрифугирования. Образцы крови центрифугировали при примерно 8000 об/мин в течение 6 мин при 2-8°C и полученную плазму отделяли и хранили в замороженном виде при примерно -80°C. После введения внутреннего стандарта проводили количественный анализ образцов плазмы с помощью LC-MS/MS, используя калибровочную кривую. ФК параметры, включая площадь под кривой концентрации (AUC), среднее время удерживания (MRT), плазменный клиренс (Cl), объем распределения в равновесном состоянии (Vdss), время полувыведения (t_1/2), максимальную концентрацию (Cmax), время достижения максимальной концентрации (Tmax) и пероральную биодоступность (F %) рассчитывали по следующим уравнениям:

t - время и C - концентрация в плазме в этот момент времени (t);

Доза_iv - это доза при внутривенном введении; и Доза_oral - это доза при пероральном введении.

Cl=Доза_iv/AUC

t_1/2=0,693 x MRT

Vdss=Cl * MRT

F %=(Доза_iv x AUC_oral)/Доза_oral x AUC_iv) x 100%

Протокол высокопроизводительного анализа равновесной растворимости

Соединения данного изобретения сначала солюбилизировали в 10 мМ чистого DMSO. 20 мкл каждого из исходных растворов DMSO затем переносили в 6 лунок на 96-луночном планшете. Растворитель DMSO сушили, используя испаритель растворителя GeneVac при 30°C, под вакуумом 1 мбар в течение 1 ч. После добавления 200 мкл буферных растворов (pH 6,8 или FaSSIF) планшеты герметично закрывали и встряхивали при 160 об/мин в течение 24 ч при к.т. Планшеты центрифугировали при 3750 об/мин в течение 20 мин, 5 мкл надосадочной жидкости смешивали с 495 мкл MeOH/H₂O (1:1). Для калибровочных кривых исходные растворы 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ получали серийным разведением. Надосадочную жидкость подвергали количественному анализу на ВЭЖХ или LC/MS, используя калибровочную кривую. Высокопроизводительную равновесную растворимость определяли на основании концентрации надосадочной жидкости.

Исследование эффективности действия на мышиной ксенотрансплантатной модели

Все эксперименты проводили на самках бестимусных Nude-nu мышей в сертифицированной по AAALAC лаборатории. Животных держали в условиях, соответствующих SPF, в индивидуальных проветриваемых клетках при постоянной температуре и влажности воздуха (т.е. 20-26°C; 40-70%) с 5 или меньше мышами в каждой клетке. У животных был свободный доступ к гранулированному сухому корму, стерилизованному радиацией, и стерильной питьевой воде. Все процедуры и протоколы были утверждены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.

Клетки Karpas 422 человеческой B-клеточной лимфомы выращивали в среде RPMI-1640 (Gibco; 11875-093), дополненной 15% FBS (Gibco; 10099-141) и 1% Pen Strep (Gibco; 15140-122) при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в воздухе. Клетки выдерживали в суспендированных культурах при концентрациях в пределах 0,5-2×10⁶ клеток/мл. Клетки делили в соотношении 1:3 каждые 2-4 дня. С целью создания ксенотрансплантированных моделей опухолей клетки собирали, суспендировали в PBS, смешивали с Matrigel (BD Bioscience) в объемном соотношении 1:1 при концентрации 1×10⁸ клеток/мл и затем вводили подкожно путем инъекции в правый бок «голым» мышам balb/c (Vital River) с концентрацией 5×10⁶ клеток на животное.

Соединение формулировали в виде суспензии в 0,5% метилцеллюлозе (MC) и 0,5% Tween 80 в 50 мМ pH 6,8 буфере (приготовлено внутри компании в соответствии с USP) и вводили мышам путем желудочного зонда в определенных дозах.

Обработку начинали, когда средний объем опухоли достигал 100-300 мм³. За ростом опухоли и весом тела наблюдали через равные промежутки времени. Два наибольших диаметра - ширина (W) и длина (L), ксенотрансплантатных опухолей измеряли вручную, используя штангенциркуль, и объем опухоли определяли по формуле: 0,5 x L x W².

Если применимо, результаты представлены как среднее значение ± SEM. Графическое представление и статистический анализ выполняли, используя GraphPad Prism 5.00 (программное обеспечение GraphPad). Данные изменения опухоли и веса тела анализировали статистически. Если дисперсия данных имела нормальное распределение (критерий Барлетта для равных дисперсий), то данные анализировали, используя однофакторный ANOVA с апостериорным критерием Даннетта для сравнения группы, прошедшей лечение, с контрольной группой. Апостериорный критерий Тьюки использовали для сравнения внутри группы. В противном случае использовали ранговый критерий Крускала-Уоллиса апостериорного критерия Даннетта.

В качесвте меры эффективности рассчитывали значение %T/C в конце эксперимента согласно:

(Δобъема опухоли^{обработанной}/Δобъема опухоли^{контроль})*100

Уменьшение опухоли рассчитывали согласно уравнению:

-(Δобъема опухоли^{обработанной}/объем опухоли^{обработанной в начале})*100

Где Δобъема опухоли представляет собой средний объем опухоли на день осмотра минус средний объем опухоли в начале эксперимента.

N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин тестировали в EED (a) квалифицирующем Alphascreen связывании, (b) квалифицирующем LC-MS и (c) квалифицирующем ELISA анализах, описанных выше, причем было обнаружено, что он обладает ингибиторной активностью в отношении EED.

IUPAC наименование (a)
IC₅₀ (мкМ) (b)
IC₅₀ (мкМ) (c)
IC₅₀ (мкМ) N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин 0,0059 0,0089 0,0026

Антипролиферативная активность (значения IC₅₀) клеток KARPAS422 B-клеточной лимфомы после 14 дней обработки для N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина составляла 0,0030 мкМ.

Соответственно, было обнаружено, что N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амин ингибирует EED и по этой причине является полезным в лечении заболеваний или расстройств, ассоциированных с EED и PRC2, которые включают, но не ограничиваются ими: диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, другие типы лимфом, лейкемию, множественную миелому, мезотелиому, рак желудка, злокачественную рабдоидную опухоль, печеночно-клеточный рак, рак простаты, карциному молочной железы, рак желчных протоков и рак желчного пузыря, рак мочевого пузыря, опухоли головного мозга, включая нейробластому, глиому, глиобластому и астроцитому, рак шейки матки, рак толстой кишки, меланому, рак эндометрия, рак пищевода, рак головы и шеи, рак легкого, назофарингеальную карциному, рак яичника, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному, рак прямой кишки, рак щитовидной железы, опухоли околощитовидной железы, опухоли матки и саркомы мягких тканей, выбранные из рабдомиосаркомы (RMS), саркомы Капоши, синовиальной саркомы, остеосаркомы и саркомы Юинга.

V. Фармацевтические композиции и комбинации

"Фармацевтически приемлемый носитель (разбавитель или формообразующее)" относится к среде, в целом принятой в области техники для доставки биологически активных средств животным, в частности, млекопитающим, включая, обычно считающиеся безопасными (GRAS) растворители, дисперсионные среды, оболочки, ПАВ, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные и противогрибковые средства), изотонические и замедляющие абсорбцию средства, соли, консерванты, стабилизаторы лекарств, связующие, буферные вещества (например, малеиновая кислота, винная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, бикарбонат натрия, фосфат натрия и т.п.), разрыхляющие средства, смазывающие вещества, подсластители, вкусовые добавки, красители и т.п. и их комбинации, как это известно специалистам в данной области техники (см., например, Allen, L.V., Jr. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2 Volumes), 22nd Edition, Pharmaceutical Press (2012). Составы можно получать, используя обычные процедуры растворения и смешивания. Например, основная лекарственная субстанция (т.е. соединение настоящего изобретения или стабилизированная форма соединения (например, комплекс с производным циклодекстрина или другим известным комплексообразующим агентом)) растворяется в подходящем растворителе в присутствии одного или нескольких из формообразующих, описанных выше.

Соединение Х можно вводить любому из потребителей, описанных в данном документе, любым подходящим образом, например, перорально, как например, это могут быть таблетки, капсулы (каждая из которых включает составы с замедленным или синхронизированным высвобождением), пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, настойки, суспензии (в том числе наносуспензии, микросуспензии, высушенные распылением дисперсии), сиропы и эмульсии; под язык; буккально; парентерально, как например, подкожной, внутривенной, внутримышечной или внутрибрюшинной инъекцией или методами вливания (например, в виде стерильных инъекционных водных или неводных растворов или суспензий); через нос, включая введение через носовые перегородки, как например, путем вдыхания спрея; наружно, как например, в виде крема или мази; или ректально, как например, в форме суппозитория. Их можно вводить сами по себе, но обычно их вводят с фармацевтическим носителем, выбранным в соответствии с выбранным путем введения и стандартной фармацевтической практикой.

Соединение X обычно составляют в фармацевтические лекарственные формы, чтобы обеспечить легко контролируемую дозировку лекарственного средства и дать пациенту элегантный продукт, легкий в обращении. Схема дозирования для соединений настоящего изобретения будет, конечно же, варьироваться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного средства и его метод и путь введения; вид, возраст, пол, состояние здоровья, заболевание и вес реципиента; характер и степень симптомов; вид одновременного лечения; частота лечения; путь введения, почечная и печеночная функция пациента и желаемый эффект. Соединение Х можно вводить в виде однократной суточной дозы, или общую суточную дозировку можно вводить разделенными дозами два, три или четыре раза в сутки.

В некоторых случаях может быть лучше вводить Соединение Х в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным фармацевтическим (или терапевтическим) средством, таким как другие противораковые средства, иммуномодуляторы, противоаллергические средства, противорвотные средства, болеутоляющие, цитопротекторы и их комбинации.

Термин "комбинированная терапия" относится к введению двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического заболевания, расстройства или состояния, описанного в настоящем изобретении. Такое введение включает совместное введение этих терапевтических средств по существу одновременно, например, в одной капсуле, имеющей фиксированное соотношение активных ингредиентов. Альтернативно, такое введение охватывает совместное введение в нескольких или в отдельных контейнерах (например, в капсулах, порошках и жидкостях) для каждого активного ингредиента. Соединение Х и дополнительные терапевтические средства можно вводить одним и тем же путем введения или разными путями введения. Порошки и/или жидкости могут быть восстановлены или разбавлены до желаемой дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательным образом, либо приблизительно в одно и то же время, либо в разное время. В любом случае схема лечения будет обеспечивать благоприятные эффекты комбинации лекарственных средств при лечении состояний или расстройств, описанных здесь.

Общие химиотерапевтические агенты, рассматриваемые для использования в комбинированной терапии, включают анастрозол (Arimidex®), бикалутамид (Casodex®), блеомицина сульфат (Blenoxane®), бусульфан (Myleran®), бусульфан в инъекциях (Busulfex®), капецитабин (Xeloda®), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin®), кармустин (BiCNU®), хлорамбуцил (Leukeran®), цисплатин (Platinol®), кладрибин (Leustatin®), циклофосфамид (Cytoxan® или Neosar®), цитарабин, цитозин арабинозид (Cytosar-U®), цитарабин липосомальный для инъекций (DepoCyt®), дакарбазин (DTIC-Dome®), дактиномицин (актиномицин D, космеган), даунорубицина гидрохлорид (Cerubidine®), даунорубицина цитрат липосомальный для инъекций (DaunoXome®), дексаметазон, доцетаксел (Taxotere®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin®, Rubex®), этопозид (Vepesid®), флударабина фосфат (Fludara®), 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®), флутамид (Eulexin®), тезацитибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевина (Hydrea®), идарубицин (Idamycin®), ифосфамид (IFEX®), иринотекан (Camptosar®), L-аспарагиназа (ELSPAR®), лейковорин кальция, мелфалан (Alkeran®), 6-меркаптопурин (Purinethol®), метотрексат (Folex®), митоксантрон (Novantrone®), милотарг, паклитаксел (Taxol®), наб-паклитаксел (Abraxane^®), феникс (иттрий90/MX-DTPA), пентостатин, полифепрозан 20 с кармустиновым имплантатом (Gliadel®), тамоксифена цитрат (Nolvadex®), тенипозид (Vumon®), 6-тиогуанин, тиотепа, тирапазамин (Tirazone®), топотекана гидрохлорид для инъекций (Hycamptin®), винбластин (Velban®), винкристин (Oncovin®) и винорелбин (Navelbine®).

Антираковые средства, представляющие определенный интерес для комбинирования с Соединением X, могут включать: ингибиторы циклин-зависимой киназы (CDK), ингибиторы киназы контрольной точки (CHK), ингибиторы C-RAF, ингибиторы фосфинозитид 3-киназы (PI3K), ингибиторы BCL-2, ингибиторы митоген-активированной протеинкиназы (MEK), ингибиторы топоизомеразы II, ингибиторы SRC, ингибиторы гистондеацетилаз (HDAC), противоопухолевые антибиотики, деметилирующие средства и анти-эстрогены.

Некоторые пациенты могут испытывать аллергические реакции на соединения настоящего изобретения и/или другие противораковые средства во время или после введения; поэтому часто вводят противоаллергические средства, чтобы минимизировать риск аллергической реакции. Подходящие противоаллергические средства включают кортикостероиды (Knutson, S., et al., PLoS One, DOI:10.1371/journal.pone.0111840 (2014)), такие как дексаметазон (например, Decadron®), беклометазон (например, Beclovent®), гидрокортизон (также известный как кортизон, гидрокортизон натрия сукцинат, гидрокортизон натрия фосфат, и продаваемый под торговыми названиями Ala-Cort®, гидрокортизон фосфат, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® и Lanacort®), преднизолон (продаваемый под торговыми названиями Delta-Cortel®, Orapred®, Pediapred® и Prelone®), преднизон (продаваемый под торговыми названиями Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® и Orasone®), метилпреднизолон (также известный как 6-метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолон натрия сукцинат, продаваемый под торговыми названиями Duralone®, Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® и Solu-Medrol®); антигистамины, такие как дифенгидрамин (например, Benadryl®), гидроксизин и ципрогептадин; и бронхорасширяющие, такие как агонисты бета-адренергических рецепторов, альбутерол (например, Proventil®) и тербуталин (Brethine®).

Иммуномодуляторы, представляющие определенный интерес для комбинирования с соединениями настоящего изобретения включают один или несколько из: активатора костимулирующей молекулы или ингибитора молекулы контрольной точки иммунного ответа (например, один или несколько ингибиторов PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 или CTLA4) или любую их комбинацию.

В определенных вариантах осуществления иммуномодулятор представляет собой активатор костимулирующей молекулы. В одном варианте осуществления агонист костимулирующей молекулы выбирают из агониста (например, агонистического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или растворимого белка слияния) лигандов OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 или CD83.

В определенных вариантах осуществления иммуномодулятор представляет собой ингибитор молекулы контрольной точки иммунного ответа. В одном варианте осуществления иммуномодулятор представляет собой ингибитор PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 и/или TGFR бета. В одном варианте осуществления ингибитор молекулы контрольной точки иммунного ответа ингибирует PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 или CTLA4 или любую их комбинацию. Термин "ингибирование" или "ингибитор" включает в себя снижение определенного параметра, например, активности данной молекулы, например, ингибитор контрольных точек иммунного ответа. Например, этот термин включает ингибирование активности, например, активности PD-1 или PD-L1, на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или больше. Таким образом, ингибирование не должно быть 100%.

Некоторые пациенты могут испытывать тошноту в ходе и после введения соединения настоящего изобретения и/или другого(их) противоракового(ых) средства(средств); поэтому используют противорвотные средства для предотвращения тошноты (верхний отдел желудка) и рвоты. Пригодными противорвотными средствами являются апрепитант (Emend®), ондансетрон (Zofran®), гранисетрон HCl (Kytril®), лоразепам (Ativan®), дексаметазон (Decadron®), прохлорперазин (Compazine®), казопитант (Rezonic® и Zunrisa®) и их комбинации.

Лекарственные средства для утоления боли, возникающей в период лечения, часто прописывают для облегчения состояния пациента. Часто используют такие обычные доступные без рецепта анальгетики, как Tylenol®. Однако, опиоидные анальгетики, такие как гидрокодон/парацетамол или гидрокодон/ацетаминофен (например, Vicodin®), морфин (например, Astramorph® или Avinza®), оксикодон (например, OxyContin® или Percocet®), оксиморфона гидрохлорид (Opana®) и фентанил (например, Duragesic®) также полезны в случаях умеренной или сильной боли.

С целью защиты нормальных клеток от токсичности, обусловленной лечением, и лимитирования токсичности по отношению к органам, можно использовать цитопротекторы (такие как нейропротекторы, поглотители свободных радикалов, кардиопротекторы, нейтрализаторы антрациклина, вызывающего кровоизлияния, питательные вещества и т.п.) в качестве вспомогательной терапии. Пригодные цитопротекторные средства включают амифостин (Ethyol®), глютамин, димесна (Tavocept®), месна (Mesnex®), дексразоксан (Zinecard® или Totect®), ксалипроден (Xaprila®) и лейковорин (также известный как лейковорин кальция, цитроворум-фактор и фолиновая кислота).

Структура активных соединений, определяемая кодовыми номерами, общими или торговыми названиями, может быть взята из фактического издания стандартного сборника "The Merck Index" или из баз данных, например, Patents International (например, IMS World Publications).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие Соединение X вместе с фармацевтически приемлемым носителем, подходящим для введения субъекту - человеку или животному, либого самого по себе, или вместе с другими противораковыми средствами.

В одном варианте осуществления изобретения предложены способы лечения субъекта - человека или животного - страдающего пролиферативным клеточным заболеванием, таким как рак. В настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта - человека или животного, нуждающегося в таком лечении, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения настоящего изобретения (например, соединения настоящего изобретения) или его фармацевтически приемлемой соли либо самого по себе, либо в сочетании с другими противораковыми средствами.

В частности, композиции будут либо составлены вместе в виде комбинированного терапевтического средства, либо вводиться отдельно.

При комбинированной терапии для лечения злокачественного новообразования Соединение Х и другое(ие) противораковое(ые) средство(а) можно вводить одновременно, параллельно, либо последовательно без конкретных промежуточных временных пределов, где такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента.

В предпочтительном варианте осуществления Соединение Х и другое(ие) противораковое(ые) средство(а), как правило, вводят последовательно в любом порядке путем вливания или перорально. Схема дозирования может варьироваться в зависимости от стадии заболевания, физического состояния пациента, профилей безопасности отдельных лекарств и переносимости отдельных лекарств, а также от других критериев, хорошо известных лечащему врачу и медицинскому(им) работнику(ам), вводящему(им) эту комбинацию. Соединение данного изобретения и другое(ие) противораковое(ые) средство(а) можно вводить с интервалом в несколько минут, часов, дней или даже недель, в зависимости от конкретного цикла, используемого при лечении. Кроме того, цикл может включать в себя более частое введение одного лекарства по сравнению с другими в ходе лечебного цикла и в разных дозах на одно введение лекарства.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены наборы, включающие Соединение Х и его партнера по комбинации, как раскрыто в данном документе. Типичные наборы включают (а) Соединение X, (b) по меньшей мере одного партнера по комбинации, например, как указано выше, причем такой набор может содержать вкладыш в упаковку или другую маркировку, включая инструкции по применению.

Соединение X также можно использовать для получения преимущества в сочетании с известными терапевтическими способами, например, введением гормонов или, особенно, лучевой терапии. В частности, Соединение X можно использовать в качестве радиосенсибилизатора, особенно для лечения опухолей, которые проявляют недостаточную чувствительность к лучевой терапии.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены наборы, включающие Соединение Х и его партнера по комбинации, как раскрыто в данном документе. Типичные наборы включают (а) Соединение X, (b) по меньшей мере одного партнера по комбинации, например, как указано выше, причем такой набор может содержать вкладыш в упаковку или другую маркировку, включая инструкции по применению.

В комбинированных терапиях данного изобретения Соединение X и другое терапевтическое средство могут быть изготовлены и/или составлены одним и тем же или разными производителями. Кроме того, Соединение Х и другой терапевтический препарат (или фармацевтическое средство) могут совмещаться в комбинированной терапии: (i) до того, как комбинированный продукт попадает к лечащим врачам (например, в случае набора, в который входят Соединение X и другое терапевтическое средство); (ii) самими лечащими врачами (или под наблюдением лечащего врача) незадолго до введения; (iii) в самих пациентах, например, в ходе последовательного введения Соединения X и другого терапевтического средства.

Фармацевтическая композиция (или состав) для применения может быть упакована различными способами в зависимости от способа, используемого для введения лекарственного средства. Как правило, изделие для распространения включает в себя контейнер, в который помещен фармацевтический состав в соответствующей форме. Подходящие контейнеры хорошо известны специалисту в данной области техники и включают такие материалы, как бутылки (пластиковые и стеклянные), пакетики, ампулы, пластиковые пакеты, металлические цилиндры и т.п. Контейнер также может включать защищенную от несанкционированного доступа сборку для предотвращения несанкционированного доступа к содержимому упаковки. Кроме того, на контейнере нанесена этикетка, которая описывает содержимое контейнера. Этикетка также может содержать соответствующие предупреждения.

Изобретение относится к кристаллической форме N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, характеризующейся картиной порошковой рентгеновской дифракции, содержащей пики при следующих значениях 2θ (CuKα λ=1,5418 Å), равных 12,5±0,1, 13,0±0.1, 14.2±0.1, 18.7±0.1, 25,2±0,1 и 30,8±0,1. Изобретение также относится к способу получения указанной кристаллической формы N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, который включает следующие стадии: 1) суспендирование N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя выбранного из группы состоящей из этанола и ацетона; 2) нагревание полученной суспензии до температуры примерно от 50°C до 75°C; 3) подкисление полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора, при поддержании температуры при примерно от 50°C до 75°C; и 4) понижение температуры полученного раствора до получения кристаллической формы гидрохлорида N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной кристаллической форме, составляет менее чем 0,5%. Технический результат - получена кристаллическая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, которая может найти применение в медицине в лечении заболевания или расстройства, опосредованного PRC2. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Кристаллическая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, характеризующаяся картиной порошковой рентгеновской дифракции, содержащей пики при следующих значениях 2θ (CuKα λ=1,5418 Å), равных 12,5±0,1, 13,0±0.1, 14.2±0.1, 18.7±0.1, 25,2±0,1 и 30,8±0,1.

2. Кристаллическая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида по п. 1, полученная способом, включающим стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из этанола и ацетона;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно от 50°C до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии хлористоводородной кислотой до образования прозрачного раствора, при поддержании температуры при примерно от 50°C до 75°C; и

4) понижения температуры полученного раствора до получения кристаллической формы гидрохлорида N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина, где массовая доля остаточного органического растворителя, содержащаяся в указанной кристаллической форме, составляет менее чем 0,5%.

3. Кристаллическая форма N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида полученная способом по п. 2, где:

на стадии 3) полученную суспензию подкисляют хлористоводородной кислотой путем добавления 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру примерно от 50 до 75°C.

4. Способ получения кристаллической формы N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, характеризующегося картиной порошковой рентгеновской дифракции, содержащей пики при следующих значениях 2θ (CuKα λ=1,5418 Å), равных 12,5±0,1, 13,0±0.1, 14.2±0.1, 18.7 ±0.1, 25,2±0,1 и 30,8±0,1, включающий в себя стадии:

1) суспендирования N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина (Соединения A) в смеси воды и смешивающегося с водой органического растворителя, где смешивающийся с водой органический растворитель представляет собой этанол;

2) нагревания полученной суспензии до температуры примерно от 50°C до 75°C;

3) подкисления полученной суспензии до образования прозрачного раствора, используя хлористоводородную кислоту, поддерживая при этом температуру при примерно от 50°C до 75°C; и

4) понижения температуры полученного раствора до получения кристаллической формы N-((5-фтор-2,3-дигидробензофуран-4-ил)метил)-8-(2-метилпиридин-3-ил)-[1,2,4]триазоло[4,3-c]пиримидин-5-амина гидрохлорида, содержащей массовую долю остаточного органического растворителя в менее чем 0,5%.

5. Способ по п. 4, где:

на стадии 3) подкисляют суспензию добавлением 0,5 н. HCl в смесь воды и указанного смешивающегося с водой органического растворителя, поддерживая при этом температуру от примерно 50 до 75°C.

6. Способ по п. 4, где полученная кристаллическая форма содержит массовую долю остаточного органического растворителя менее чем 0,2%.

7. Способ по п. 4, где полученная кристаллическая форма содержит массовую доля остаточного органического растворителя менее чем 0,1%.