БЕССЫВОРОТОЧНАЯ СРЕДА И СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК КРОВИ, ВКЛЮЧАЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2025 года по МПК C12N5/789 C12N5/10 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] В соответствии с настоящим изобретением предложены композиция бессывороточной (в частности, без альбумина) среды и способ культивирования, подходящие для культивирования клеток крови, таких как гемопоэтические стволовые клетки. В соответствии с настоящим изобретением предложен способ культивирования клеток крови, таких как гемопоэтические стволовые клетки человека. Данный способ может включать приведение клеток крови, таких как гемопоэтические стволовые клетки человека, в контакт с полиэтиленгликолем, модифицированным группой, содержащей связанные блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Для культивирования гемопоэтических стволовых клеток было исследовано применение среды определенного химического состава для их пролиферации. Для гемопоэтических стволовых клеток мыши было показано, что их можно культивировать в среде определенного химического состава (непатентная литература 1).

Перечень литературы

Непатентная литература

[0003] Непатентная литература 1: Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] В соответствии с настоящим изобретением предложены способ культивирования и композиция среды (например, бессывороточной среды (например, бессывороточной среды без альбумина или бессывороточной среды без цитокинов, такой как бессывороточная среда без альбумина и без цитокинов)), подходящие для культивирования клеток крови, таких как гемопоэтические стволовые клетки человека.

[0005] Авторы настоящего изобретения обнаружили и сообщили, что гемопоэтические стволовые клетки мыши (которые иногда называют клетками KSL вследствие способа их выделения) можно растить в больших количествах в течение длительного периода времени путем добавления поливинилового спирта (ПВС) в бессывороточную среду без альбумина (Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019). Тем не менее не был установлен способ размножения гемопоэтических стволовых клеток человека в бессывороточной среде без альбумина. Авторы настоящего изобретения недавно обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки человека демонстрируют выраженную пролиферацию в присутствии полиэтиленгликоля, модифицированного сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, даже в бессывороточной среде без альбумина, при этом сохраняются их свойства стволовых клеток. Кроме того, также было обнаружено, что в это время пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток можно поддерживать даже в условиях без цитокинов. Дополнительно к гемопоэтическим стволовым клеткам, также было обнаружено, что различные клетки крови, включая эритробласты, мегакариоциты и лейкоциты (например, Т-клетки, В-клетки, макрофаги, нейтрофилы), могут пролиферировать при таких же условиях.

[0006] В соответствии с настоящим изобретением предложены следующие пункты изобретения.

[1] Способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, включающий:

культивирование гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда представляет собой содержащую поливиниловый спирт среду без альбумина (в частности, среду без сывороточного альбумина), и содержит:

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО, так что

Указанное культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[2] Способ согласно пункту [1], отличающийся тем, что получают повышенное количество указанных гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[3] Способ согласно пункту [1] или [2], отличающийся тем, что указанная культуральная среда содержит активатор PI3K и не содержит фактор стволовых клеток (SCF).

[4] Способ согласно любому из пунктов [1] - [3], отличающийся тем, что указанная культуральная среда содержит активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[5] Способ согласно пункту [4], отличающийся тем, что указанная культуральная среда не содержит ни SCF, ни ТРО.

[5А] Способ согласно пункту [4] или [5], отличающийся тем, что указанная культуральная среда представляет собой среду без цитокина.

[6] Способ согласно любому из пунктов [1] - [5], отличающийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит 4-N-[2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо[4,5-b] индол-4-ил]циклогексан-1,4-диамин (UM171).

[7] Способ согласно пункту [6], отличающийся тем, что указанное культивирование осуществляют в течение периода, составляющего 7 или более дней.

[8] Композиция без альбумина, содержащая

гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека, поливиниловый спирт и

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[9] Композиция согласно пункту [8], отличающаяся тем, что указанная композиция содержит активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[10] Композиция согласно пункту [8] или [9], дополнительно содержащая 4-N-[2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил]циклогексан-1,4-диамин (UM171).

[11] Гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека, полученные с помощью способа согласно любому из пунктов [1] - [7].

[12] Содержащая поливиниловый спирт культуральная среда без альбумина для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, содержащая:

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[0007] {1} Способ культивирования или получения гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, включающий:

культивирование гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда содержит поливиниловый спирт и

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО, так что

указанное культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

{2} Способ согласно пункту {1}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда представляет собой бессывороточную среду.

{3} Способ согласно пункту {1}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда представляет собой среду определенного химического состава.

{4} Способ согласно любому из пунктов {1} - {3}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда по существу не содержит альбумин.

{5} Способ согласно любому из пунктов {1} - {4}, отличающийся тем, что получают повышенное количество указанных гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

{6} Способ согласно любому из пунктов {1} - {5}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда содержит активатор PI3K и не содержит фактор стволовых клеток (SCF).

{7} Способ согласно любому из пунктов {1} - {6}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда содержит активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

{8} Способ согласно пункту {7}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда не содержит ни SCF, ни ТРО.

{8А} Способ согласно пункту {7} или {8}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда представляет собой среду без цитокинов.

{9} Способ согласно любому из пунктов {1} - {8}, отличающийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит 4-N-{2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо{4,5-b}индол-4-ил}циклогексан-1,4-диамин (UM171).

{10} Способ согласно пункту {9}, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в течение периода, составляющего 7 или более дней.

{11} Композиция, содержащая гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека, поливиниловый спирт в качестве альтернативы альбумину, и

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

{12} Композиция согласно пункту {11}, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

{13} Композиция согласно пункту {11} или {12}, дополнительно содержащая 4-N-{2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо{4,5-b}индол-4-ил}циклогексан-1,4-диамин (UM171).

{14} Гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека, полученные с помощью способа согласно любому из пунктов {1} - {10}.

{15} Содержащая поливиниловый спирт в качестве альтернативы альбумину культуральная среда для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, содержащая:

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

{16} Культуральная среда согласно пункту {15}, которая представляет собой бессывороточную среду.

{17} Культуральная среда согласно пункту {15}, которая представляет собой среду определенного химического состава.

{18} Культуральная среда согласно любому из пунктов {15} - {17}, которая не содержит альбумин.

{19} Способ согласно любому из пунктов {1} - {8}, отличающийся тем, что указанные клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека.

{20} Композиция согласно любому из пунктов {11} - {13}, отличающаяся тем, что указанные клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека.

{21} Способ согласно любому из пунктов {1} - {8}, отличающийся тем, что указанные клетки человека представляют собой клетки крови человека.

{22} Композиция согласно любому из пунктов {11} - {13}, отличающаяся тем, что клетки человека представляют собой клетки крови человека.

{23} Культуральная среда, содержащая клетки человека, полученные с помощью способа согласно любому из пунктов {1} - {8}, {19} и {21}.

{24} Культуральная среда согласно пункту {23}, которая представляет собой бессывороточную среду без альбумина и без цитокинов.

[0008] В соответствии с настоящим изобретением также предложены следующие пункты изобретения.

[1В] Способ культивирования клеток человека, включающий

культивирование клеток человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда содержит полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[2В] Способ согласно пункту [1В], отличающийся тем, что получают повышенное количество клеток человека.

[3В] Способ согласно пункту [1В] или [2В], отличающийся тем, что клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека.

[4В] Композиция культуральной среды для культивирования клеток человека, содержащая полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[5В] Композиция, содержащая клетки человека и полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[6В] Композиция согласно пункту [4В] или [5В], отличающаяся тем, что клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека.

[7В] Клетки человека, полученные с помощью способа согласно любому из пунктов [1В] - [3В].

[8В] Способ согласно пункту [3В], отличающийся тем, что клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека.

[9В] Композиция согласно пункту [6В], отличающаяся тем, что клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека.

[10В] Способ согласно пункту [3В], отличающийся тем, что клетки человека представляют собой клетки крови человека.

[11В] Композиция согласно пункту [6В], отличающаяся тем, что клетки человека представляют собой клетки крови человека.

[12В] Культуральная среда, содержащая клетки человека, полученные с помощью способа согласно любому из пунктов [1В] - [3В].

[13В] Культуральная среда согласно пункту [12В], которая представляет собой бессывороточную среду без альбумина и без цитокинов.

[14В] Способ согласно любому из пунктов [1В] - [3В], [8В] и [10В], композиция согласно любому из пунктов [4В] - [6В], [9В] и [11В], или культуральная среда согласно пункту [12] или [13], отличающиеся тем, что полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, представляет собой полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[0009] [1С] Способ культивирования клеток человека, включающий

культивирование клеток человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда представляет собой среду без сывороточного альбумина и содержит вспомогательное вещество, указанное вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из поливинилового спирта и модифицированного полиалкиленгликоля, и дополнительно содержит

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или (3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО, так что

культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[2С] Способ согласно пункту [1С], отличающийся тем, что клетки человека представляют собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток крови человека.

[3С] Способ согласно пункту [1С], отличающийся тем, что клетки человека представляют собой клетки крови, отличные от гемопоэтических стволовых клеток.

[4С] Способ согласно пункту [3С], отличающийся тем, что вспомогательное вещество представляет собой поливиниловый спирт.

[5С] Способ согласно пункту [1С] или [2С], отличающийся тем, что вспомогательное вещество представляет собой модифицированный полиалкиленгликоль.

[6С] Способ согласно пункту [5С], отличающийся тем, что модифицированный полиалкиленгликоль представляет собой полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[7С] Способ согласно пункту [6С], отличающийся тем, что модифицированный полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0010] [Фигура 1] На ФИГ. 1 показаны результаты культивирования, в присутствии 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) мыши или человека и 100 нг/мл тромбопоэтина (ТРО), гемопоэтических стволовых клеток мыши (клеток KSL мыши) или гемопоэтических стволовых клеток человека (клеток CD34⁺CD38^-) в бессывороточной среде без альбумина, содержащей поливиниловый спирт (ПВС).

[Фигура 2] На ФИГ. 2 представлены диаграммы, на которых указана степень фосфорилирования каждого фактора сигнального пути ниже SCF и ТРО в гемопоэтических стволовых клетках мыши или человека в присутствии 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) и 100 нг/мл тромбопоэтина (ТРО), в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Подпись «m» обозначает гемопоэтические стволовые клетки мыши, и «h» обозначает гемопоэтические стволовые клетки человека.

[Фигура 3] На ФИГ. 3 показаны результаты культивирования в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС, гемопоэтических стволовых клеток человека в среде, содержащей 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) человека и 100 нг/мл тромбопоэтина человека в присутствии активатора AKT II (AKTa) или активатора PI3K (PI3Ka).

[Фигура 4] На ФИГ. 4 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день после культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС и 100 нг/мл тромбопоэтина человека (ТРО). На ФИГ. 4 сравнивают условия в присутствии SCF и условия в отсутствие SCF. ФИГ. 4 свидетельствует о том, что не было обнаружено статистически значимого различия в количестве всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день культивирования между двумя условиями.

[Фигура 5] На ФИГ. 5 показано количество культивированных гемопоэтических стволовых клеток человека в динамике в присутствии альбумина или ПВС, при этом ТРО заменяли на каждый агонист рецептора ТРО. Подпись «Бути» обозначает бутизамид, «Элт» обозначает элтромбопаг и «Ава» обозначает аватромбопаг.

[Фигура 6] На ФИГ. 6 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в присутствии альбумина или ПВС, при этом ТРО заменяли на каждый агонист рецептора ТРО.

[Фигура 7] На ФИГ. 7 указано количество всех клеток, количество CD34⁺клеток или количество колоний GEmM на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в культуральной среде, содержащей активатор PI3K и ТРО или бутизамид (Бути) в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Типы колоний идентифицировали под микроскопом после того, как отбирали каждую колонию под микроскопом, получали образец цитоцентрифугирования и проводили окрашивание образца по Гимзе. G обозначает «гранулоциты», Е обозначает «эритробласты», m обозначает «макрофаги» и М обозначает «мегакариоциты».

[Фигура 8] На ФИГ. 8 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K, агонист рецептора ТРО или их комбинацию.

[Фигура 9] На ФИГ. 9 показана скорость роста каждой популяции клеток в культуре, полученной на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[Фигура 10] На ФИГ. 10 показана динамика количества всех клеток или количества CD34⁺ клеток на 7 и 14 дни, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[Фигура 11] На ФИГ. 11 показаны результаты гейтирования клеток, полученных на 14 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. На левой панели показаны результаты проточной цитометрии с использованием CD34 и CD38 в качестве маркеров, а на правой панели показаны результаты проточной цитометрии с использованием CD41a и CD42b в качестве маркеров. Фотография на ФИГ. 11 представляет собой оптическую микрофотографию полученной культуры.

[Фигура 12] На ФИГ. 12 показаны результаты анализа колониеобразования с использованием клеток, полученных на 14 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. Типы колоний идентифицировали под микроскопом после того, как отбирали каждую колонию под микроскопом, получали образец цитоцентрифугирования и проводили окрашивание образца по Гимзе. G обозначает содержащую «гранулоциты» колонию, Е - содержащую «эритробласты», m - содержащую «макрофаги» и М - содержащую «мегакариоциты».

[Фигура 13] На ФИГ. 13 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 14 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K; агонист рецептора ТРО; и SR1 и/или UM171.

[Фигура 14] На ФИГ. 14 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток или количество CD41⁺ клеток на 14 день, когда соответствующие клетки культивировали при условиях 1-3.

[Фигура 15] На ФИГ. 15 показаны результаты проточной цитометрии с использованием клеток в культуре на 14 день, когда соответствующие клетки культивировали при условиях 1-3. На верхних панелях показаны результаты при использовании маркеров CD34 (ось абсцисс) и CD38 (ось ординат), а на нижних панелях показаны результаты при использовании маркеров CD41a (ось абсцисс) и CD42b (ось ординат).

[Фигура 16] На ФИГ. 16 представлены диаграммы, на которых показано приживление гемопоэтических стволовых клеток человека в периферической крови мыши через 12 недель после культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека при соответствующих условиях 1-3, а затем их трансплантации на 7 день каждой мыши.

[Фигура 17] На ФИГ. 17 показано количество всех клеток, процент CD34⁺ клеток, процент жизнеспособных клеток или количество CD34⁺ клеток в культуре, полученной после того, как отделяли моноциты из указанной пуповинной крови и культивировали их в течение 14 дней при условиях в присутствии или отсутствие UM171 в культуральной среде без любого из альбумина, SCF или ТРО, но с добавлением ПВС, активатора PI3K и агониста рецептора ТРО.

[Фигура 18] На ФИГ. 18 показаны результаты экспериментов по культивированию in vitro гемопоэтических стволовых клеток мыши в отсутствие альбумина. В каждую среду для культивирования гемопоэтических стволовых клеток мыши добавляли указанный компонент в конечной концентрации 0,1%. В частности, использовали каждую культуральную среду, содержащую, в конечной концентрации 0,1%, Коллифор BASF (товарный знак) Р188 bio (188 bio), Коллифор (товарный знак) Р 188 Geismar (188 Geismar), Солюплюс (Sol+), Коллифор (товарный знак) Р 407 Geismar (407 Geismar), Коллидон (товарный знак) 30 Origin USA (30 USA), Коллидон (товарный знак) 17 PF (17 PF), Коллидон (товарный знак) 25 (25), Коллидон (товарный знак) 90F (90F), или Коллидон (товарный знак) 12PF (12PF)

[Фигура 19] На ФИГ. 19 показаны результаты анализа колониеобразования in vitro с применением гемопоэтических стволовых клеток мыши в бессывороточной среде без альбумина в присутствии ПВС или полимера А.

[Фигура 20] На ФИГ. 20 показан процент (%) положительных по маркеру стволовых клеток CD201 гемопоэтических стволовых клеток мыши, культивированных в бессывороточной среде без альбумина в присутствии ПВС или полимера А.

[Фигура 21] На ФИГ. 21 представлена схема (слева), на которой показано как осуществляли трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток мыши, культивированных в бессывороточной среде без альбумина в присутствии ПВС или полимера А, в облученную мышь, и показан процент химеризма в периферической крови мыши через 4 недели после трансплантации. Процент химеризма указывает на долю клеток, происходящих из трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток, от всех клеток крови.

[Фигура 22] На ФИГ. 22 указан процент положительных по CD34 клеток среди гемопоэтических стволовых клеток мыши, культивированных в бессывороточной среде без альбумина в присутствии ПВС или полимера А.

[Фигура 23] На ФИГ. 23 показано изменение количества гемопоэтических стволовых клеток мыши, культивированных в бессывороточной среде без альбумина в присутствии ПВС или полимера А.

[Фигура 24] На ФИГ. 24 представлены диаграммы, показывающие степень фосфорилирования каждого фактора сигнального пути ниже SCF и ТРО в гемопоэтических стволовых клетках мыши или человека в присутствии 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) и 100 нг/мл тромбопоэтина (ТРО), в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Подпись «m» обозначает гемопоэтические стволовые клетки мыши и «h» обозначает гемопоэтические стволовые клетки человека.

[Фигура 25] На ФИГ. 25 показаны результаты культивирования, в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС, гемопоэтических стволовых клеток человека в среде, содержащей 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) человека и 100 нг/мл тромбопоэтина человека в присутствии активатора AKTII (AKTa) или активатора PI3K (PI3Ka).

[Фигура 26] На ФИГ. 26 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день после культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС и 100 нг/мл тромбопоэтина человека (ТРО). На ФИГ. 9 сравнивают условия в присутствии SCF и условия в отсутствие SCF. ФИГ. 4 свидетельствует о том, что не было обнаружено статистически значимого различия в количестве всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день культивирования между двумя условиями.

[Фигура 27] На ФИГ. 27 показано количество культивированных гемопоэтических стволовых клеток человека в динамике в присутствии альбумина или ПВС, при этом ТРО заменяли на каждый агонист рецептора ТРО. Подпись «Бути» обозначает бутизамид, «Элт» обозначает элтромбопаг и «Ава» обозначает аватромбопаг.

[Фигура 28] На ФИГ. 28 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в присутствии альбумина или ПВС, при этом ТРО заменяли на каждый агонист рецептора ТРО.

[Фигура 29] На ФИГ. 29 указано количество всех клеток, количество CD34⁺ клеток или количество колоний GEmM на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в культуральной среде, содержащей активатор PI3K и ТРО или бутизамид (Бути) в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Типы колоний идентифицировали под микроскопом после того, как отбирали каждую колонию под микроскопом, получали образец цитоцентрифугирования и проводили окрашивание образца по Гимзе. G обозначает «гранулоциты», Е обозначает «эритробласты», m обозначает «макрофаги», и М обозначает «мегакариоциты».

[Фигура 30] На ФИГ. 30 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K, агонист рецептора ТРО или их комбинацию.

[Фигура 31] На ФИГ. 31 показана скорость роста каждой популяции клеток в культуре, полученной на 7 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[Фигура 32] На ФИГ. 32 показана динамика количества всех клеток или количества CD34⁺ клеток на 7 и 14 дни, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[Фигура 33] На ФИГ. 33 показаны результаты гейтирования клеток, полученных на 14 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. На левой панели показаны результаты проточной цитометрии с использованием CD34 и CD38 в качестве маркеров, а на правой панели показаны результаты проточной цитометрии с использованием CD41a и CD42b в качестве маркеров. Фотография на ФИГ. 16 представляет собой оптическую микрофотографию полученной культуры.

[Фигура 34] На ФИГ. 34 показаны результаты анализа колониеобразования клеток, полученных на 14 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. Типы колоний идентифицировали под микроскопом после того, как отбирали каждую колонию под микроскопом, получали образец цитоцентрифугирования и проводили окрашивание образца по Гимзе. G обозначает содержащую «гранулоциты» колонию, Е - содержащую «эритробласты», m - содержащую «макрофаги» и М - содержащую «мегакариоциты».

[Фигура 35] На ФИГ. 35 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток на 14 день, когда гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС в культуральной среде без SCF или ТРО, но содержащей активатор PI3K; агонист рецептора ТРО; и SR1 и/или UM171.

[Фигура 36] На ФИГ. 36 показана скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток или количество CD41⁺ клеток на 14 день, когда соответствующие клетки культивировали при условиях 1-3.

[Фигура 37] На ФИГ. 37 показаны результаты проточной цитометрии с использованием клеток в культуре на 14 день, когда соответствующие клетки культивировали при условиях 1-3. На верхних панелях показаны результаты при использовании маркеров CD34 (ось абсцисс) и CD38 (ось ординат), и на нижних панелях показаны результаты при использовании маркеров CD41a (ось абсцисс) и CD42b (ось ординат).

[Фигура 38] На ФИГ. 38 представлены диаграммы, на которых показано приживление гемопоэтических стволовых клеток человека в периферической крови мыши через 12 недель после культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека при соответствующих условиях 1-3, а затем их трансплантации на 7 день каждой мыши.

[Фигура 39] На ФИГ. 39 показано количество всех клеток, процент CD34⁺ клеток, процент жизнеспособных клеток или количество CD34⁺ клеток в культуре, полученной после того, как отделяли моноциты из данной пуповинной крови и культивировали их в течение 14 дней при условиях в присутствии или отсутствие UM171 в культуральной среде без любого из альбумина, SCF или ТРО, но с добавлением ПВС, активатора PI3K и агониста рецептора ТРО.

[Фигура 40] На ФИГ. 40 показан рост Т-клеток человека в среде без альбумина и без цитокинов в присутствии ПВС или Солюплюс (товарный знак).

[Фигура 41] На ФИГ. 41 показаны результаты экспериментов по дифференцировке гемопоэтических стволовых клеток человека в среде без альбумина в присутствии ПВС или Солюплюс (товарный знак). Продемонстрировано, что указанные гемопоэтические клетки пролиферируют и дифференцируются (в частности, пролиферируют) в широкий диапазон линий клеток крови.

[Фигура 42] На ФИГ. 42 показана способность к росту клеток хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) в среде без альбумина и без цитокинов в присутствии ПВС или Солюплюс (товарный знак). На диаграммах «ИМ+» означает присутствие иматиниба, а «ИМ-» означает отсутствие иматиниба.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] В данной заявке «гемопоэтические стволовые клетки» относятся к стволовым клеткам, способным дифференцироваться в клетки крови. Гемопоэтические стволовые клетки можно собрать из костного мозга, пуповины, плаценты или периферической крови. Гемопоэтические стволовые клетки человека представляют собой положительные по CD34 клетки. Известно, что у людей среди гемопоэтических стволовых клеток многочисленна фракция положительных по CD34, отрицательных по CD38 клеток. Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки человека могут быть положительными по CD34 и отрицательными по CD38. Гемопоэтические стволовые клетки могут представлять собой клетки, полученные путем дифференцировки ex vivo плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые (ЭС) клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки.

[0012] В данной заявке «клетки крови» представляют собой гемопоэтические стволовые клетки или клетки, дифференцированные из гемопоэтических стволовых клеток. Клетки крови преимущественно классифицируют на гемопоэтические стволовые клетки, гемопоэтические предшественники и гемопоэтические клетки в соответствии с их стадией дифференцировки. Гемопоэтические стволовые клетки дифференцируются через гемопоэтических предшественников в гемопоэтические клетки. В частности, гемопоэтические стволовые клетки могут дифференцироваться через лимфобласты в лимфоциты (например, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки). Гемопоэтические стволовые клетки также могут дифференцироваться через гемопоэтические предшественники и монобласты в моноциты. Гемопоэтические стволовые клетки также могут дифференцироваться через гемопоэтические предшественники, миелобласты, промиелоциты, миелоциты, постмиелоциты и палочкоядерные клетки в нейтрофилы. Гемопоэтические стволовые клетки также могут дифференцироваться через гемопоэтические предшественники и миелобласты в гранулоцитарные лейкоциты, такие как эозинофилы или базофилы, или макрофаги. Гемопоэтические стволовые клетки также могут дифференцироваться через гемопоэтические предшественники, проэритробласты, базофильные эритробласты, полихроматические эритробласты и ортохроматические эритробласты в эритроциты. Гемопоэтические стволовые клетки также могут образовать тромбоциты после прохождения через стадии гемопоэтических предшественников, промегакариоцитов и мегакариоцитов. Все клетки, в которые можно дифференцировать гемопоэтические стволовые клетки, представляют собой клетки крови. Примеры клеток крови включают раковые клетки или нераковые клетки. Примеры раковых клеток включают клетки хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) или стволовые клетки ХМЛ.

[0013] В данной заявке термин «ех vivo» означает вне организма. В данной заявке термин «ех vivo» используют в противоположность термину in vivo (внутри организма), и он означает, что клетки, присутствующие внутри организма, выносят наружу из организма. Культивирование можно осуществить ex vivo.

[0014] В данной заявке «положительный по» означает, что в клетке обнаружена экспрессия молекулы, указанной в непосредственно следующем за этим термине. В данной заявке «положительный» иногда просто обозначают «⁺».

[0015] В данной заявке «поливиниловый спирт» (ПВС) означает полимер винилового спирта. Поливиниловый спирт можно получить путем омыления поливинилацетата, который получен путем полимеризации мономера винилацетата. Средневзвешенная молекулярная масса (MW) поливинилового спирта может составлять, например, от 1 кДа до 20 кДа, от 3 кДа до 17 кДа, от 5 кДа до 15 кДа или от 7 кДа до 13 кДа. В случае омыления поливинилацетата для получения ПВС с помощью указанного выше способа, процент омыления может составлять 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, или 99% или более.

[0016] В данной заявке «альбумин» представляет собой белок, известный как компонент плазмы. Утверждают, что альбумин составляет 60% от всех белков плазмы и в большом количестве присутствует в крови, сыворотке и плазме. Считают, что альбумин отвечает за поддержание осмотического давления крови in vivo и за перенос биологических веществ, таких как жирные кислоты и гормоны, посредством связывания с ними. Также известно, что сывороточный альбумин важен для поддержания и культивирования гемопоэтических стволовых клеток. Сывороточный альбумин человека (в дальнейшем иногда обозначают «САЧ») представляет собой сывороточный альбумин человека, который может являться, например, белком, имеющим последовательность аминокислот, зарегистрированную под номером доступа в GenBank: AAN17825.1, или сывороточный альбумин человека, имеющий соответствующую последовательность аминокислот.

[0017] В данной заявке «агонист» относится к веществу, которое может активировать белок, такой как рецептор или фермент.

[0018] В данной заявке «PI3K» означает фосфатидилинозитол-3-киназу. PI3K представляет собой фермент, который может фосфорилировать инозитсодержащие фосфолипиды, компонент клеток. Фосфорилированный фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP3) опосредует фосфорилирование Akt (также известного как протеинкиназа В) и передает сигнал ниже. В данной заявке «активатор PI3K» означает агонист рецептора с тирозинкиназной активностью и вещество, которое может активировать PI3K. Активатор PI3K может быть селективным к PI3K.

[0019] В данной заявке «ТРО» означает тромбопоэтин. ТРО представляет собой белок, ответственный за дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток в мегакариоциты. Известно, что ТРО формально участвует в поддержании гемопоэтических стволовых клеток. Тромбопоэтин человека, например, представляет собой белок, имеющий последовательность аминокислот, зарегистрированную под номером доступа в GenBank: ААВ33390.1, или тромбопоэтин, имеющий соответствующую последовательность аминокислот.

В данной заявке «агонист рецептора ТРО» означает вещество, отличное от ТРО, которое может активировать рецептор ТРО. Примеры агониста рецептора ТРО включают каждый вариант ТРО, отличный от ТРО, каждый пептид или каждое соединение, которое может активировать рецептор ТРО. В данной заявке «соединение» представляет собой понятие, в объем которого входят органические соединения. Агонист рецептора ТРО может быть селективным к рецептору ТРО.

[0020] В данной заявке «фактор стволовых клеток» (SCF) представляет собой гемопоэтический фактор роста клеток, который активен на ранних стадиях кроветворения (гемопоэза). Человеческий фактор стволовых клеток, например, представляет собой белок, имеющий последовательность аминокислот, зарегистрированную под номером доступа в GenBank: ААА85450.1, или SCF, имеющий соответствующую последовательность аминокислот.

[0021] В данной заявке «культивирование» означает инкубацию клеток при условиях, подходящих для их роста или поддержания. Инкубацию можно осуществить, в случае клеток человека, в атмосфере предпочтительно при 37°С и 5% СО₂. Если «культивирование» включает пролиферацию, то понимают, что «культивирование» включает получение размноженных клеток. В данной заявке «культивирование» можно осуществить в бессывороточной среде. В данной заявке «культивирование» можно осуществить в культуральной среде определенного химического состава (или в полностью синтетической среде). Культуральная среда определенного химического состава представляет собой бессывороточную среду.

[0022] В данной заявке «культуральная среда» означает среду, применяемую для культивирования клеток. Культуральную среду можно получить путем добавления компонентов, необходимых для основной среды. Необходимые компоненты могут включать модификатор рН, источник сахара, такой как глюкоза, антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин), и незаменимые аминокислоты, такие как глутамин, а также вспомогательные вещества для культивирования, такие как инсулин, трансферрин, селен (например, селенит натрия) и/или этаноламин.

[0023] В данной заявке термин «без» означает, что некоторый материал не содержится в концентрациях выше предела обнаружения или не содержится вообще. Например, бессывороточная среда или бессывороточная среда без альбумина представляет собой среду без альбумина и без сыворотки или альбумина. Термин «без альбумина» означает, что альбумин не содержится в концентрациях, равных или выше предела обнаружения, или не содержится вообще. Термин «без цитокинов» означает, что любой цитокин не содержится в концентрациях, равных или выше предела обнаружения, или не содержится вообще. Среда может быть без альбумина. Среда может быть без цитокинов. Среда может быть без альбумина и без цитокинов.

[0024] В данной заявке «цитотоксичность» означает свойство осуществления действия, направленного на уменьшение количества клеток или уничтожение клеток во время культивирования. В данной заявке «нецитотоксический» относится к способности не приводить к уменьшению количества клеток во время культивирования. Повышенная концентрация некоторого вещества может вызывать цитотоксичность. В данном случае, даже если концентрация снижается до уровня, который не вызывает цитотоксичность, ожидаемое действие указанного вещества все еще может произойти. Этот случай можно определить как отсутствие цитотоксичности. В данной заявке упоминание среды без какого-либо цитотоксического агента или агента, оказывающего цитотоксическое действие, означает, что среда не содержит какой-либо цитотоксический агент или агент, оказывающий цитотоксическое действие, в количествах, достаточных чтобы вызвать цитотоксичность. Соответственно, если агент цитотоксичен при высоких концентрациях, и его применяют при концентрациях, которые не вызывают цитотоксичность, указанный агент не является ни цитотоксическим агентом, ни агентом, оказывающим цитотоксическое действие.

[0025] Авторы настоящего изобретения обнаружили и сообщили, что гемопоэтические стволовые клетки мыши (которые иногда называют клетками KSL вследствие способа их выделения) можно растить в больших количествах в течение длительного периода времени путем добавления поливинилового спирта (ПВС) в среду без альбумина и без сыворотки (Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019). Тем не менее не был установлен способ размножения гемопоэтических стволовых клеток человека в бессывороточной среде без альбумина. Теперь авторы настоящего изобретения обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки человека могут выраженно пролиферировать, при этом их свойства как стволовых клеток сохраняются в присутствии полиэтиленгликоля, модифицированного сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что в гемопоэтических стволовых клетках человека, культивированных в присутствии ПВС, SCF и ТРО, даже в бессывороточной среде без альбумина, активация различных сигнальных путей, включая пути PI3K и Akt, слаба. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки человека и клетки крови человека могут пролиферировать при добавлении активатора PI3K в присутствии ПВС, SCF и ТРО, даже в бессывороточной среде без альбумина. Авторы настоящего изобретения дополнительно обнаружили, что активатор PI3K может полностью заменить SCF в присутствии ПВС, даже в бессывороточной среде без альбумина. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что ТРО можно заменить на агонист рецептора ТРО в присутствии ПВС и активатора PI3K, даже в бессывороточной среде без альбумина. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека могут благоприятно пролиферировать в присутствии полиэтиленгликоля, модифицированного сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, активатора PI3K и агониста рецептора ТРО, даже в бессывороточной среде без альбумина. В это время, не требуется добавлять SCF и ТРО в среду. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки человека можно поддерживать и размножать в течение длительного периода времени путем добавления UM171 в среду.

[0026] В соответствии с настоящим изобретением предложен способ культивирования клеток человека, включающий:

культивирование клеток человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда представляет собой среду без сывороточного альбумина и содержит вспомогательное вещество, указанное вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из поливинилового спирта и модифицированного полиалкиленгликоля, и дополнительно содержит

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО, так что культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество

гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[0027] Клетки человека могут представлять собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток крови человека. Кроме того, клетки человека также могут представлять собой клетки крови, отличные от гемопоэтических стволовых клеток. Клетки крови могут представлять собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических предшественников и гемопоэтических клеток. Клетки крови могут представлять собой одну или более клеток, выбранных из группы, состоящей из лимфобластов, лимфоцитов (например, Т-клеток, В-клеток, NK-клеток и NKT-клеток), положительных по CD3 клеток, миелобластов, промиелоцитов, миелоцитов, постмиелоцитов, палочкоядерных клеток и нейтрофилов, миелобластов, гранулоцитов (например, эозинофилов и базофилов), макрофагов, проэритробластов, базофильных эритробластов, полихроматических эритробластов, ортохроматических эритробластов, эритроцитов, а также промегакариоцитов и мегакариоцитов. Клетки человека могут представлять собой, например, одну или более клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) и стволовых клеток ХМЛ.

[0028] В некотором варианте реализации вспомогательное вещество может представлять собой вспомогательное вещество, которое может заменить альбумин. Указанное вспомогательное вещество, в некотором варианте реализации, представляет собой модифицированный полиалкиленгликоль. В некотором варианте реализации модифицированный полиалкиленгликоль может представлять собой, например, модифицированный полиэтиленгликоль. Модифицированный полиалкиленгликоль или модифицированный полиэтиленгликоль предпочтительно может быть модифицирован сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[0029] В некотором варианте реализации вспомогательное вещество может представлять собой поливиниловый спирт.

[0030] В соответствии с настоящим изобретением можно добавить ПВС или модифицированный полиалкиленгликоль. Это позволит уменьшить количество альбумина, такого как сывороточный альбумин, добавленного в культуральную среду, предпочтительно делая культуральную среду свободной от альбумина. В некотором варианте реализации культуральная среда может представлять собой бессывороточную среду, например, бессывороточную среду без альбумина.

[0031] В соответствии с настоящим изобретением активатор PI3K может заменить SCF. При этом, в настоящем изобретении, агонист рецептора ТРО может заменить ТРО. Таким образом, в настоящем изобретении, количество SCF или ТРО, добавленное в культуральную среду, можно уменьшить и, предпочтительно, культуральную среду можно приготовить без цитокинов. В некотором варианте реализации культуральная среда может представлять собой бессывороточную среду, например, бессывороточную среду без цитокинов.

[0032] В некотором варианте реализации в культуральную среду можно добавить ПВС или модифицированный полиалкиленгликоль. Это позволит уменьшить количество альбумина, такого как сывороточный альбумин, добавленного в культуральную среду. Кроме того, в культуральную среду можно добавить активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. Это позволит уменьшить количества SCF и ТРО, добавленных в культуральную среду. В некотором варианте реализации культуральная среда может представлять собой среду без альбумина, без цитокинов, без сыворотки.

[0033] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложен способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, включающий:

культивирование гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда содержит поливиниловый спирт, совсем не содержит альбумин и содержит:

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[0034] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложен способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в культуральной среде, включающий:

приведение, в культуральной среде, гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в контакт с поливиниловым спиртом и

приведение, в культуральной среде, гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в контакт с:

(1) активатором фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одним соединением, выбранным из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонистом рецептора ТРО и по меньшей мере одним соединением, выбранным из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатором PI3K и агонистом рецептора ТРО.

В этом варианте реализации культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[0035] В настоящем изобретении используемый активатор PI3K не цитотоксичен для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Другими словами, активатор PI3K, используемый в настоящем изобретении, не цитотоксичен.

Кроме того, агонисты рецептора ТРО, используемые в настоящем изобретении, не цитотоксичны для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Являются ли активаторы PI3K цитотоксическими или нет могут проверить специалисты в данной области, при необходимости, используя анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека. Здесь анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека можно осуществить, применяя среду IMDM, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 100 нг/мл ТРО и 0,1% ПВС. Являются ли агонисты рецептора ТРО цитотоксическими или нет могут проверить специалисты в данной области, при необходимости, используя анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека. Здесь анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека можно осуществить, применяя среду IMDM, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 10 нг/мл SCF и 0,1% ПВС.

[0036] В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой культуральную среду для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, указанная среда содержит:

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[0037] В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой культуральную среду для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, указанная среда содержит:

поливиниловый спирт или модифицированный полиалкиленгликоль и

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[0038] В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой культуральную среду для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, указанная среда не содержит альбумин (особенно сывороточный альбумин), и указанная среда содержит:

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[0039] В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой культуральную среду для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, указанная среда содержит:

поливиниловый спирт, но не альбумин, и

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

[0040] Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может содержать эффективное количество нецитотоксического активатора PI3K и эффективное количество ПВС, чтобы размножать гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека в отсутствие альбумина. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать SCF и/или ТРО. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может содержать эффективное количество нецитотоксического агониста рецептора ТРО вместо ТРО. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может содержать эффективное количество нецитотоксического активатора PI3K, эффективное количество ПВС, эффективное количество ТРО и/или нецитотоксического агониста рецептора ТРО, и UM171.

[0041] В соответствии с настоящим изобретением способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека может представлять собой способ получения клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки из гемопоэтических стволовых клеток человека. В этом варианте реализации культуральная среда, применяемая в способе культивирования, может представлять собой культуральную среду, содержащую активатор PI3K и агонист рецептора ТРО, причем активатор PI3K представляет собой 740Y-P, и агонист рецептора ТРО представляет собой бутизамид. В этом конкретном варианте реализации культуральная среда может не содержать UM171.

[0042] В некотором варианте реализации настоящего изобретения способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением может включать культивирование в присутствии 4-N-[2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо[4,5b]индол-4-ил]циклогексан-1,4-диамина (UM171). В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может дополнительно содержать UM171. Это может способствовать поддержанию свойств гемопоэтических стволовых клеток человека или ингибировать дифференцировку в клетки мегакариоцитарной линии (например, предшественники мегакариоцитов и мегакариоциты).

[0043] В некотором варианте реализации настоящего изобретения способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением не включает культивирование в присутствии 4-N-[2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил]циклогексан-1,4-диамина (UM171). В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно не содержит UM171. Это способствует дифференцировке гемопоэтических стволовых клеток человека в клетки мегакариоцитарной линии (например, предшественники мегакариоцитов и мегакариоциты).

[0044] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложен способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, включающий:

культивирование гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда содержит полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

В этом способе, среда для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека может не содержать альбумин. В этом способе культуральная среда может дополнительно содержать:

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. В этом варианте реализации культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[0045] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложен способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в культуральной среде, включающий:

приведение, в культуральной среде, гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в контакт с полиэтиленгликолем, модифицированным сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата. В этом способе, среда для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека может не содержать альбумин. Этот способ дополнительно включает:

приведение, в культуральной среде, гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в контакт с:

(1) активатором фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одним соединением, выбранным из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО) и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонистом рецептора ТРО и по меньшей мере одним соединением, выбранным из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатором PI3K и агонистом рецептора ТРО.

В этом варианте реализации культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

[0046] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые соединения, включая некоторые агонисты рецептора ТРО, могут быть цитотоксическими для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС.

В настоящем изобретении активатор PI3K в данной заявке нецитотоксичен для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС.

Кроме того, агонист рецептора ТРО, применяемый в данной заявке, нецитотоксичен для гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Является ли активатор PI3K цитотоксическим или нет, могут проверить специалисты в данной области, при необходимости, используя анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека. Здесь анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека можно осуществить, применяя среду IMDM, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 100 нг/мл ТРО и 0,1% ПВС. Является ли агонист рецептора ТРО цитотоксическим или нет, могут проверить специалисты в данной области, при необходимости, используя анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека. Здесь анализ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека можно осуществить, применяя среду IMDM, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 10 нг/мл SCF и 0,1% ПВС.

[0047] В некотором варианте реализации настоящего изобретения активатор PI3K может представлять собой пептид, представленный последовательностью аминокислот RQIKIWFQNRRMKWKKSDGGYMDMS, где Y может быть фосфорилирован (также называют «740Y-P»).

[0048] В некотором варианте реализации настоящего изобретения агонист рецептора ТРО может представлять собой 3-[4-[[[4-[2-метокси-3-(1-трет-бутил-2-оксапентан-1-ил)фенил]тиазол-2-ил]амино]карбонил]-2,6-дихлорфенил]-2-метилпропеновую кислоту (в дальнейшем иногда называют «бутизамидом»).

[0049] В некотором варианте реализации настоящего изобретения активатор PI3K представляет собой 740Y-P, и агонист рецептора ТРО представляет собой бутизамид.

[0050] В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой бессывороточную среду. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой среду определенного химического состава. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой среду без альбумина, без цитокинов или без альбумина и без цитокинов (предпочтительно бессывороточную среду и более предпочтительно среду определенного химического состава). В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая представляет собой среду без альбумина. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая представляет собой среду без цитокинов. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая представляет собой среду без альбумина, без цитокинов. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая представляет собой среду без альбумина и без цитокинов и которая содержит поливиниловый спирт, активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая содержит полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая может содержать: полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата; активатор PI3K вместо SCF; и агонист рецептора ТРО вместо ТРО. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой среду без альбумина, без цитокинов, без сыворотки (предпочтительно среду определенного химического состава), которая может содержать: полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата; активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой бессывороточную среду (предпочтительно среду определенного химического состава), которая может содержать: полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата; активатор PI3K вместо SCF; агонист рецептора ТРО вместо ТРО; и 4-N-[2-бензил-7-(2-метилтетразол-5-ил)-9Н-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил]циклогексан-1,4-диамин (UM171). В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой среду без альбумина, без цитокинов, без сыворотки (предпочтительно среду определенного химического состава), которая может содержать: полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата; активатор PI3K; агонист рецептора ТРО и UM171. В данной заявке формулировка «указанная культуральная среда содержит В вместо А» означает, что культуральная среда не содержит А, но указанная культуральная среда содержит В.

[0051] В некотором варианте реализации настоящего изобретения среда для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека содержит полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, и

(1) активатор PI3K и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из ТРО и агонистов рецептора ТРО;

(2) агонист рецептора ТРО и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора ТРО.

В этом варианте реализации культуральная среда может не содержать альбумин. Упомянутая выше среда для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека может дополнительно содержать UM171. Упомянутую выше среду для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека можно применять в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением. Среду для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в соответствии с настоящим изобретением можно применять, чтобы размножить гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека. Среду для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в соответствии с настоящим изобретением можно применять для сохранения стволовости гемопоэтических стволовых клеток человека. Среду для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека в соответствии с настоящим изобретением можно применять, чтобы размножить гемопоэтические стволовые клетки человека, при этом сохраняя их стволовость.

[0052] Культуральную среду, подходящую для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, можно применять, при необходимости, в качестве указанной культуральной среды. Примеры основной (базальной) среды, которую можно применять, включают среду S-clone SF-3, среду F12, StemSpan (Stem Cell technologies), STEMa (STEM ALFA), бессывороточную среду StemPro-34 (Gibco Invitrogen), бессывороточную среду StemPro MSC (Invitrogen), среду HSC-CFU (Miltenyl Biotech), бессывороточную среду S-Clone (SF-02, SF-03, CM-B, SF-B) (Sanko Junyaku), среду HPGM (Sanko Junyaku), среду AIM V (Invitrogen), среду для костного мозга Marrow MAX (Invitrogen), среду KnockOut DMEM/F-12 (Invitrogen), ростовую среду для гемопоэтических стволовых клеток Stemline (Sigma), бессывороточную среду SYN (SYN Н, SYN В) (AbCys SA), среду SPE IV (AbCys SA), среду MyeloCult (StemCell Technologies), бессывороточную среду HPG (Lonza), среду UltraCULTURE (Lonza), среду Opti-MEM (Gibco Invitrogen и другие), среду MEM (Gibco Invitrogen и другие), среду МЕМа (Gibco Invitrogen и другие), среду DMEM (Gibco Invitrogen и другие), среду IMDM (Gibco Invitrogen и другие), среду PRMI1640 (Gibco Invitrogen и другие), среду Ham F-12 (Gibco и другие) или среду RD. Культуральная среда включает основную среду. Культуральная среда может содержать один или более или все из следующих компонентов, например: инсулин, трансферрин (ало), селенит натрия и/или этаноламин. Культуральная среда может содержать HEPES, пируват натрия, витамины, аминокислоты, гепарин, гепарансульфат и/или хондроитинсульфат. Культуральная среда может содержать антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин). Культуральная среда может содержать глутамин. Культуральная среда может содержать, например, инсулин, трансферрин (апо), селенит натрия, этаноламин и антибиотики и может дополнительно содержать HEPES.

[0053] Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может содержать полиалкиленгликоль (например, полиэтиленгликоль), модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

[0054] Во всех вариантах реализации настоящего изобретения, полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, может быть представлен следующей химической формулой:

[0055] [Химическая формула 1]

где n представляет собой любое натуральное число от 5 до 50, m представляет собой любое натуральное число от 10 до 100, и 1 представляет собой любое натуральное число от 10 до 200.

[0056] В некотором варианте реализации п может представлять собой любое натуральное число от 5 до 20 или от 10 до 20, m может представлять собой любое натуральное число от 20 до 50 или от 30 до 40, и 1 может представлять собой любое натуральное число от 30 до 100 или от 50 до 60.

[0057] Модифицированный полиалкиленгликоль может представлять собой соединение, в котором звено этиленгликоля представляет собой звено алкиленгликоля. Алкилен может представлять собой С_1-10, например, C_1-5, и предпочтительно представляет собой С₂ или С₃ алкилен.

[0058] Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением разработана, чтобы размножать гемопоэтические стволовые клетки человека или гемопоэтические клетки человека в присутствии полиэтиленгликоля, модифицированного сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, и может содержать эффективное количество нецитотоксического активатора PI3K и эффективное количество полиалкиленгликоля (например, полиэтиленгликоля), модифицированного сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата. Здесь, культуральная среда может не содержать альбумин. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать SCF и/или ТРО. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может содержать эффективное количество нецитотоксического агониста рецептора ТРО вместо ТРО. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может содержать эффективное количество нецитотоксического активатора PI3K, эффективное количество ПВС, эффективное количество ТРО и/или нецитотоксического агониста рецептора ТРО, и UM171.

[0059] В соответствии с настоящим изобретением, способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека может представлять собой способ получения клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки из гемопоэтических стволовых клеток человека. В этом варианте реализации культуральная среда, применяемая в способе культивирования, может представлять собой культуральную среду, содержащую активатор PI3K и агонист рецептора ТРО, причем активатор PI3K представляет собой 740Y-P, и агонист рецептора ТРО представляет собой бутизамид. В этом конкретном варианте реализации культуральная среда может не содержать UM171.

[0060] В некотором варианте реализации настоящего изобретения способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать культивирование в присутствии UM171. В некотором варианте реализации настоящего изобретения культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может дополнительно содержать UM171.

[0061] Гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека в соответствии с настоящим изобретением можно культивировать при условиях, подходящих для выращивания гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека. В настоящем изобретении, указанный способ может дополнительно включать выделение гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека из культуры. Гемопоэтические стволовые клетки человека можно выделить с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники, такого как проточная цитометрия с применением маркеров гемопоэтических стволовых клеток. Гемопоэтические стволовые клетки человека можно получить в виде гемопоэтических стволовых клеток человека, или их можно далее дифференцировать в другие клетки перед применением. Когда гемопоэтические стволовые клетки человека дифференцируют в другие клетки, указанные подлежащие дифференцировке клетки можно культивировать при условиях, подходящих для дифференцировки указанных других клеток. Клетки крови человека также можно выделить с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники, такого как проточная цитометрия с применением маркеров клеток крови человека.

[0062] В соответствии с настоящим изобретением предложены гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека, полученные с помощью способа культивирования в соответствии с настоящим изобретением. Гемопоэтические стволовые клетки человека, полученные с помощью способа культивирования в соответствии с настоящим изобретением, можно очистить, используя в качестве маркеров CD34 и предпочтительно CD38. У гемопоэтических стволовых клеток человека, полученных с помощью способа культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может быть лучше приживаемость после трансплантации реципиенту, чем у гемопоэтических стволовых клеток человека, полученных с помощью обычных способов. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложены гемопоэтические стволовые клетки человека, полученные с помощью способа культивирования в соответствии с настоящим изобретением и имеющие лучшую приживаемость после трансплантации реципиенту, чем у таковых перед культивированием.

[0063] В способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением культивирование можно осуществить в присутствии фибронектина. Способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением можно осуществить при условиях, позволяющих контакт между гемопоэтическими стволовыми клетками и фибронектином. Культивирование предпочтительно осуществляют способом культивирования в соответствии с настоящим изобретением, например, так что внутренняя часть (например, дно) посуды для культивирования покрыта фибронектином.

[0064] Среда без альбумина, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, содержит менее чем 0,1 (масса/объем)%, 0,05 (масса/объем)%, 0,01 (масса/объем)%, 0,005 (масса/объем)%, 0,001 (масса/объем)%, 0,0005 (масса/объем)% или 0,0001 (масса/объем)% сывороточного альбумина, или альбумин полностью отсутствует в ней.

[0065] Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать рекомбинантный ТРО. Рекомбинантный ТРО может представлять собой, например, рекомбинантный ТРО млекопитающего или рекомбинантный ТРО человека. В некотором варианте реализации настоящего изобретения концентрация ТРО составляет предпочтительно от 20 до 200 нг/мл, более предпочтительно от 30 до 150 нг/мл и еще более предпочтительно от 40 до 150 нг/мл, и может составлять, например, 100 нг/мл.

[0066] Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может дополнительно содержать рекомбинантный SCF. Рекомбинантный SCF может представлять собой, например, рекомбинантный SCF млекопитающего или рекомбинантный SCF человека. В некотором варианте реализации настоящего изобретения концентрация SCF составляет предпочтительно от 1 до 200 нг/мл, более предпочтительно от 1 до 150 нг/мл, еще более предпочтительно от 1 до 100 нг/мл (например, от 1 до 50 нг/мл), еще более предпочтительно от 1 до 30 нг/мл, и еще более предпочтительно от 1 до 20 нг/мл (например, от 5 до 15 нг/мл).

[0067] Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать рекомбинантный ТРО и рекомбинантный SCF. В этом варианте реализации концентрация ТРО составляет предпочтительно от 20 до 200 нг/мл, более предпочтительно от 30 до 150 нг/мл, еще более предпочтительно от 40 до 150 нг/мл (например, 100 нг/мл), и концентрация SCF составляет предпочтительно от 1 до 200 нг/мл, более предпочтительно от 1 до 150 нг/мл, еще более предпочтительно от 1 до 100 нг/мл (например, от 1 до 50 нг/мл), еще более предпочтительно от 1 до 30 нг/мл, и еще более предпочтительно от 1 до 20 нг/мл (например, от 5 до 15 нг/мл). В предпочтительном варианте реализации среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать от 40 до 150 нг/мл рекомбинантного ТРО и от 1 до 50 нг/мл рекомбинантного SCF. В предпочтительном варианте реализации среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать концентрацию ТРО, выше чем концентрация SCF, и концентрация ТРО может представлять собой, например, любую из концентраций в указанном выше диапазоне концентраций, и может быть в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более раз выше.

[0068] Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может дополнительно содержать FLT3L (в частности, FLT3L человека). FLT3 представляет собой рецептор на поверхности клетки (также называемый CD135), известный как FMS-подобная тирозинкиназа 3. FLT3 экспрессируется на поверхности, например, каждой гемопоэтической стволовой клетки. FLT3L представляет собой лиганд FLT3 и участвует в нормальном развитии гемопоэтических стволовых клеток и гемопоэтических предшественников. Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, также может содержать, дополнительно к FLT3L, IL-3 и/или GM-CSF. Интерлейкин-3 (IL-3) представляет собой гемопоэтический фактор роста и играет важную роль в пролиферации и выживаемости миелоидных клеток-предшественников. GM-CSF представляет собой гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и цитокин, который вызывает дифференцировку в гемопоэтические стволовые клетки. GM-CSF, действующий совместно с IL-3 и IL-5, может вызывать дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток в миелоидные клетки-предшественники. Например, GM-CSF может вызывать дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток, например, во взрывообразующую единицу эритроидного ряда (BFU-E), колониеобразующие единицы гранулоцитов-моноцитов (CFU-GM), колониеобразующие единицы эозинофилов (CFU-Eo) и колониеобразующие единицы базофилов (CFU-Ba). GM-CSF отвечает за дифференцировку CFU-GM в нейтрофилы и моноциты и дифференцировку CFU-Eo в эозинофилы. CFU-Ba можно дифференцировать в эозинофилы с помощью IL-3 или IL-5. Таким образом, культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать FLT3L и может дополнительно содержать IL-3 и/или GM-CSF. Кроме того, способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением можно осуществить при условиях, подходящих для пролиферации и/или дифференцировки каждой клетки крови. Такие условия культивирования хорошо известны как условия культивирования для содержащей альбумин среды, и аналогичным образом применимы для способа культивирования в соответствии с настоящим изобретением с применением среды с пониженным содержанием альбумина или вовсе без альбумина.

[0069] Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать активатор PI3K вместо SCF и/или агонист рецептора ТРО вместо ТРО. Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать активатор PI3K вместо SCF и агонист рецептора ТРО вместо ТРО. Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой среду без цитокинов, которая содержит активатор PI3K и агонист рецептора ТРО. Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может содержать активатор PI3K вместо SCF и агонист рецептора ТРО вместо ТРО, а также может дополнительно содержать UM171. Культуральная среда, применяемая в способе культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой среду без цитокинов, которая содержит активатор PI3K, агонист рецептора ТРО и UM171.

[0070] Способ культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать побуждение гемопоэтических стволовых клеток к пролиферации при условиях, достаточных для поддержания и/или пролиферации гемопоэтических стволовых клеток. В этом варианте реализации, например, гемопоэтические стволовые клетки заставляют размножиться в 10, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 или более раз относительно исходной культуры.

[0071] Условия, достаточные для поддержания и/или пролиферации гемопоэтических стволовых клеток человека, могут представлять собой, например, условия, в которых их культивируют в описанной выше культуральной среде. Условия, достаточные для поддержания и/или пролиферации гемопоэтических стволовых клеток человека, предпочтительно могут представлять собой, например, условия в присутствии фибронектина или могут представлять собой условия, при которых гемопоэтические стволовые клетки человека могут находиться в контакте с фибронектином.

[0072] Способ культивирования клеток крови человека в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать побуждение клеток крови человека к пролиферации при условиях, достаточных для поддержания и/или пролиферации клеток крови человека. В этом варианте реализации, например, гемопоэтические стволовые клетки заставляют размножиться в 10, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 или более раз относительно исходной культуры.

[0073] Способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать

сбор размноженных гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека из культуральной среды.

Собранные гемопоэтические стволовые клетки человека или клетки крови человека далее могут быть обогащены или выделены. Можно осуществить обогащение гемопоэтическими стволовыми клетками человека или клетками крови человека или выделить их, используя маркер(ы) поверхности клетки. Примеры маркера(-ов) поверхности клетки, которые можно применять для обогащения или выделения гемопоэтических стволовых клеток человека, включают CD34 и/или CD38. Можно осуществить обогащение гемопоэтическими стволовыми клетками человека или клетками крови человека или выделить их, применяя устройство для сортировки клеток.

[0074] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложен способ получения ex vivo гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, включающий способ культивирования в соответствии с настоящим изобретением. Способ получения в соответствии с настоящим изобретением делает возможным получение функциональных гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека.

В данной заявке термин «функциональный» означает, что гемопоэтическая система может быть восстановлена у человека (реципиента), которому трансплантировали гемопоэтические стволовые клетки человека.

Примеры

[0075] Эталонный пример 1: Анализ роста гемопоэтических стволовых клеток при применении культуральной среды без альбумина.

В этом Эталонном примере исследовали рост гемопоэтических стволовых клеток мыши (KSL) и гемопоэтических стволовых клеток человека (CD34⁺CD38^-), применяя культуральную среду без альбумина. Культуральная среда представляла собой бессывороточную среду, содержащую поливиниловый спирт (ПВС) и не содержащую альбумин, описанную в Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019.

[0076] В частности, для культивирования гемопоэтических стволовых клеток мыши, культуральная среда представляла собой среду F12, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSX), 10 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 100 нг/мл тромбопоэтина мыши (mTPO) и 10 нг/мл фактора стволовых клеток мыши (mSCF). Упомянутая выше среда содержала ПВС в конечной концентрации 0,1%. Для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека, культуральная среда представляла собой среду IMDM, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSX), 25 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 100 нг/мл тромбопоэтина человека и 10 нг/мл фактора стволовых клеток человека (hSCF). Упомянутая выше среда содержала ПВС в конечной концентрации 0,1%.

В качестве всех сред, используемых в следующих Примерах, использовали среду IMDM (далее также называют «обычной средой»), содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSX), 25 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин и ПВС, если не указано иное. Таким образом, далее авторы настоящего изобретения сосредоточат внимание на компонентах, добавленных в обычную среду, и опишут среду. Например, поскольку упомянутая выше среда содержит ТРО и SCF дополнительно к обычной среде, упомянутую выше среду для удобства назвали средой TPO+SCF. Если концентрация каждого фактора также отражена, то это можно записать как SCF10+TPO100 или сокращенно как S10+T100.

[0077] Клетки KSL из костного мозга мыши использовали в качестве гемопоэтических стволовых клеток мыши. В частности, клетки костного мозга мыши выделяли из большеберцовой кости, бедренной кости и подвздошной кости таза и окрашивали антителом APC-c-KIT. Проводили обогащение c-KIT⁺ клетками, применяя магнитные гранулы против АРС и колонку LS (Miltenyi Biotec). Обогащенные c-KIT клетки затем окрашивали коктейлем антител против линий дифференцировки (биотинилированных CD4, CD8, CD45R, TER119, LY-6G/LY-6C и CD127) перед окрашиванием антителом против CD34, антителом против cKIT, антителом против SCA1 и стрептавидином-APC/eFluor 780 в течение 90 мин. Популяции клеток затем очищали с помощью FACS Aria II (BD) путем непосредственной сортировки в лунки, содержащие среду, при этом применяя йодид пропидия в качестве маркера для окрашивания мертвых клеток.

[0078] Применяемые гемопоэтические стволовые клетки человека представляли собой CD34⁺CD38^- клетки из костного мозга человека. В частности, покупали доступные для приобретения клетки костного мозга человека, положительные по CD34 (Lonza 2С-101).

[0079] Результаты представлены на ФИГ. 1. Согласно Wilkinson et al., 2019, гемопоэтические стволовые клетки мыши не могли сохранять длительную пролиферацию в бессывороточной среде без альбумина даже в присутствии SCF и ТРО. Тем не менее Wilkinson et al., 2019, показали, что добавление ПВС в среду позволяет гемопоэтическим стволовым клеткам мыши пролиферировать в течение длительного периода времени в бессывороточной среде без альбумина. Как показано и наблюдается на ФИГ. 1, гемопоэтические стволовые клетки мыши хорошо пролиферировали в содержащей ПВС бессывороточной среде без альбумина, но гемопоэтические стволовые клетки человека не пролиферировали хорошо в этой среде.

[0080]

Эталонный пример 2. Различия в передаче сигналов между гемопоэтическими стволовыми клетками мыши и человека.

Проанализировали сигнальные пути гемопоэтических стволовых клеток мыши и человека в присутствии SCF и ТРО.

[0081] Иммуноокрашивание фосфорилирования использовали, чтобы проанализировать степень фосфорилирования каждого фактора сигнального пути ниже SCF и ТРО в гемопоэтических стволовых клетках мыши или человека в присутствии 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) и 100 нг/мл тромбопоэтина (ТРО), в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Сначала детектировали, насколько много каждого фактора в сигнальном пути ниже SCF и ТРО было фосфорилировано, применяя антитело, специфическое к каждой форме фосфорилирования фактора. В частности, использовали антитела против фосфорилированных форм типичных сигнальных молекул, таких как Akt, PI3K и Stat5, и приводили их в контакт с клетками, стимулированными цитокинами, и проводили количественный анализ интенсивности флуоресценции каждого антитела, прореагировавшего с указанными клетками, с помощью флуоресцентной микроскопии.

[0082] На ФИГ. 2 показано, что среди семи исследованных факторов, у нескольких факторов были обнаружены различные статусы фосфорилирования между гемопоэтическими стволовыми клетками мыши и человека. В том числе, для PI3K и Akt, у гемопоэтических стволовых клеток мыши была высокая потребность в фосфорилированных формах PI3K и Akt через 24 ч после добавления SCF и ТРО, тогда как гемопоэтические стволовые клетки человека содержали небольшое количество или не содержали фосфорилированных форм, или содержали меньшие уровни фосфорилированных форм, чем гемопоэтические стволовые клетки мыши.

[0083] Затем гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в культуральной среде, дополненной 0,3 мкМ AKTa (Sigma-Aldrich, № продукта 123871) или 20 мкМ PI3Ka. Клетки подсчитывали после 3, 5 и 7 дней инкубации, и рассчитывали относительное количество клеток в каждый момент времени, причем количество клеток в первый день инкубации установили равным 1. В следующих примерах 740Y-P (название поставщика: Tocris, № продукта 1983) использовали в качестве PI3Ka. На ФИГ. 3 показано, что у гемопоэтических стволовых клеток человека выявили выраженную пролиферацию в присутствии PI3Ka. Напротив, не наблюдали пролиферативного действия AKTa на гемопоэтические стволовые клетки человека в условиях этого эксперимента.

[0084] Затем культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека, чтобы исследовать, может ли PI3Ka полностью заменить SCF. Гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в течение 7 дней в указанной выше культуральной среде для гемопоэтических стволовых клеток человека с 20 мкМ PDKa (S10+PI3Ka20+T100) или в указанной выше культуральной среде с 20 мкМ PI3Ka, но без SCF (PI3Ka20+Т100). Затем определяли количество всех клеток и количество выделенных CD34⁺ клеток, полученных путем сортировки клеток с применением антитела против CD34. Результаты представлены на ФИГ. 4. На ФИГ. 4 показано, что, когда добавляли PI3Ka, не наблюдали значимого различия в количестве всех клеток или CD34⁺ клеток с SCF или без него.

[0085] Затем культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека, чтобы исследовать, можно ли заменить ТРО на агонист рецептора ТРО. Примеры известных агонистов рецептора ТРО включают бутизамид, элтромбопаг или аватромбопаг. Культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека в среде, содержащей 0,1 мкМ бутизамид, 3 мкг/мл элтромбопага или 3 мкМ аватромбопаг в присутствии 0,1% рекомбинантного сывороточного альбумина человека (Albumin Biosciences) или в присутствии ПВС в указанной выше культуральной среде без ТРО. В этом эксперименте клетки Mp132D использовали в качестве гемопоэтических стволовых клеток человека. Результаты представлены на ФИГ. 5. На ФИГ. 5 показано, что, в присутствии альбумина, бутизамид, элтромбопаг или аватромбопаг были способны поддерживать пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие ТРО. Наоборот, в присутствии ПВС (в отсутствие альбумина), бутизамид оказывал выраженное способствующее пролиферации действие на гемопоэтические стволовые клетки человека в отсутствие ТРО, тогда как указанное действие было незначительным у аватромбопага и почти отсутствовало у элтромбопага.

[0086] Кроме того, приобретенные CD34⁺ клетки костного мозга человека (название поставщика: Lonza, № продукта 2С-101) или CD34⁺ клетки, выделенные с применением микрогранул из этой свежей пуповинной крови, использовали в экспериментах по культивированию. Указанные эксперименты проводили в 24-луночных планшетах при плотности от 0,2 до 1,0×10⁵ клеток на лунку, причем ТРО удаляли из культуральной среды для гемопоэтических стволовых клеток человека и заменяли на один из указанных выше агонистов рецептора ТРО (далее иногда обозначают «TPOago»). Определяли количество клеток на седьмой день культивирования относительно количества клеток в первый день культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 6. На ФИГ. 6 показано, что выявили значительную пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека только в присутствии бутизамида в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. В отсутствие альбумина и в присутствии ПВС, присутствие аватромбопага или элтромбопага вызывало гибель гемопоэтических стволовых клеток. Тем не менее в условиях in vivo эти агонисты рецептора ТРО являются безопасными соединениями, применяемыми для лечения пациентов с циррозом, которых лечат хирургическим путем, или пациентов с апластической анемией. Результаты этого Примера свидетельствуют о том, что некоторые агонисты рецептора ТРО могут быть цитотоксическими для гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Это также позволяет предположить, что некоторые агонисты рецептора ТРО цитотоксичны для гемопоэтических стволовых клеток человека, и что применения каждого агониста, который не цитотоксичен для гемопоэтических стволовых клеток человека, достаточно для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека.

[0087] Затем исследовали, можно ли заменить SCF и ТРО или нет на PI3Ka и агонист рецептора ТРО в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. В следующих примерах в качестве агониста рецептора ТРО использовали бутизамид. Кроме того, приобретенные CD34⁺ клетки костного мозга человека (название поставщика: Lonza, № продукта 2С-101) или CD34⁺ клетки, выделенные с применением микрогранул из этой свежей пуповинной крови, как описано выше, использовали в экспериментах по культивированию. Сначала распределяли по 0,2-1,0×10⁵ клеток на лунку 24-луночного планшета и культивировали в среде с композицией, в которой SCF был заменен на 20 мкМ PI3Ka (PI3Ka20 мкМ+ТРО100), и в среде с композицией, в которой SCF был заменен на 20 мкМ PI3Ka и ТРО был заменен на 0,1 мкМ бутизамид (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), соответственно. Через 7 дней определяли количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток определяли с помощью проточной цитометрии. После этого определяли скорость роста относительно таковой в начале инкубации. Результаты представлены на ФИГ. 7. ФИГ. 7 явно демонстрирует, что бутизамид может полностью заменить ТРО. Кроме того, CD34⁺ клетки сортировали до и после инкубации, применяя устройство для сортировки клеток, и 100 клеток высевали в Methocult Н4415 для анализа колониеобразования. Через две недели каждую колонию отбирали под микроскопом, получали образец цитоцентрифугирования и проводили окрашивание образца по Гимзе. Затем идентифицировали тип колонии под микроскопом. Подсчитывали количество колоний GEmM на 50 CD34+ клеток и определяли уровень увеличения количества колоний относительно такового перед культивированием. Затем было обнаружено, что бутизамид может полностью заменить ТРО в отношении возможности образования колоний GEmM.

[0088] Затем культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека в среде, содержащей 20 мкМ PI3Ka и/или 0,1 мкМ TPOago, в контексте культуральной среды без SCF или ТРО. На 7 день культивирования подсчитывали количество всех клеток и количество содержащихся в них CD34⁺ клеток с помощью проточной цитометрии, и определяли скорость роста относительно таковой в начале культивирования. Как показано на ФИГ. 8, обнаружили, что PI3Ka отдельно или бутизамид отдельно не вызывают увеличения количества клеток, но обнаружили, что присутствие как PI3Ka, так и TPOago вызывает выраженное увеличение количества клеток.

[0089] Кроме того, следующий этап состоял в определении того, какая популяция клеток более вероятно будет пролиферировать в среде, в которой SCF и ТРО заменили на PI3Ka и TPOago. Указанную свежую пуповинную кровь использовали для выделения CD34⁺ клеток путем применения микрогранул, как описано выше, и указанные клетки использовали в экспериментах по культивированию. Клетки затем фракционировали с помощью устройства для сортировки клеток, применяя антитело против CD34-PE-Cy7 (название поставщика BD Biosciences, № продукта 348791), антитело против CD38-V450 (название поставщика BD Biosciences, № продукта 646851), антитело против CD133-PE (название поставщика Miltenyi Biotec, № продукта 130-080-801), антитело против CD45RA-APC (название поставщика BioLegend, № продукта 304112) и антитело против CD49f-PE (название поставщика BioLegend, № продукта 313611). Для каждой из фракции CD34⁺, фракции CD34⁺CD38^-CD133⁺ или фракции CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD49f⁺, указанные молекулы были описаны как маркеры для очистки гемопоэтических стволовых клеток человека, происходящих из пуповинной крови человека, подсчитывали количество всех клеток и количество содержащихся в них CD34⁺ клеток с помощью проточной цитометрии на 7 день после начала культивирования, и определяли скорость роста относительно таковой в начале культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 9. На ФИГ. 9 показано, что наблюдали значимую пролиферацию клеток во всех фракциях клеток, но во фракции CD34⁺CD38^-CD133⁺ и фракции CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD49f⁺, особенно во фракции CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD49f⁺, наблюдали выраженный рост клеток.

[0090] Эталонный пример 3. Эксперимент по долговременному культивированию гемопоэтических стволовых клеток человека.

Культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека в указанной выше культуральной среде для гемопоэтических стволовых клеток человека, указанная среда содержала 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago вместо SCF и ТРО. Количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток определяли, как описано выше, на 7 и 14 дни после начала культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 10. На ФИГ. 10 показано, что количество всех клеток возрастало с увеличением количества дней инкубации, тогда как количество CD34+ клеток снижалось на 14 день по сравнению с днем 7.

[0091] Когда для наблюдения за культивированными клетками использовали оптический микроскоп, на 14 день обнаружили гигантские клетки. Для того чтобы проверить вероятность того, что эти гигантские клетки представляли собой мегакариоциты или предшественники мегакариоцитов, указанные клетки фракционировали с помощью проточной цитометрии, применяя антитело против CD41a-FITC (название поставщика BD Pharmingen, № продукта 555466) и антитело против CD42b (название поставщика BD Pharmingen, № продукта 555473). Как показано на ФИГ. 11, результаты показали, что большая часть клеток на 14 день после начала культивирования представляли собой CD41a⁺CD42b⁺ клетки. Тем не менее на ФИГ. 11 показано, что CD34⁺CD38^- клетки все еще пролиферировали при данных условиях.

[0092] Кроме того, CD34⁺ клетки получали из культуры на 14 день после начала культивирования, и 100 клеток высевали в Methocult Н4415 для анализа колониеобразования. через 2 недели собирали колонии и получали образцы цитоцентрифугирования. Затем проводили окрашивание образцов по Гимзе и определяли типы колоний под микроскопом. Результаты представлены на ФИГ. 12. В отношении типов колоний, G означает колонии, содержащие «гранулоциты», Е - «эритробласты», m - «макрофаги» и М - «мегакариоциты». На ФИГ. 12 показано, что большинство колоний клеток содержали мегакариоциты.

[0093] Эталонный пример 4. Дополнительное исследование условий, подходящих для долговременного культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека.

Предприняли попытку долговременного культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека в присутствии соединений, способных обеспечивать рост гемопоэтических стволовых клеток человека.

[0094] Получали описанную выше культуральную среду для гемопоэтических стволовых клеток человека, указанная среда содержала 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago вместо SCF и ТРО (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), или указанная среда содержала SR-1 (500 нМ) и/или UM171 (35 нМ) (+SR-1,+UM171 или +SR-1+UM171). Кроме того, приобретенные CD34⁺ клетки костного мозга человека (название поставщика: Lonza, № продукта 2С-101) или CD34⁺ клетки, выделенные с применением микрогранул из этой свежей пуповинной крови, как описано выше, использовали в экспериментах по культивированию. Сначала распределяли по 0,2-1,0×10⁵ клеток на лунку 24-луночного планшета и культивировали CD34⁺ клетки в полученной среде. Количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток определяли, как описано выше, на 14 день после начала культивирования, и определяли скорость роста относительно таковой в начале культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 13. На ФИГ. 13 показано, что количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток были выше в культуральной среде, дополнительно содержащей UM171, и скорость роста CD34⁺ клеток была значительно выше в среде, содержащей UM171, чем в среде без UM171. Наоборот, SR-1 вызывал гибель клеток при указанных условиях эксперимента.

[0095] Кроме того, скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток определяли путем культивирования CD34⁺ клеток при трех условиях: условие 1: культивирование в течение 14 дней в культуральной среде для гемопоэтических стволовых клеток человека, описанной выше, указанная среда содержала 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago вместо SCF и ТРО (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), условие 2: на 7 день или позже, культивирование в среде без бутизамида (День7-без Бути), и условие 3: культивирование в течение 14 дней в среде (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), дополнительно содержащей UM171 (+UM171). Количество CD41⁺ клеток определяли, применяя проточный питометр. Результаты представлены на ФИГ. 14. На ФИГ. 14 показано, что количество CD34⁺ клеток повышалось и количество CD41⁺ клеток снижалось при условии 2, в котором клетки культивировали в среде без бутизамида, на 7 день или позже после начала культивирования, по сравнению с условием 1. На ФИГ. 14 показано, что при условии 3, в котором клетки культивировали в среде, дополнительно содержащей UM171, скорость роста CD34⁺ клеток была значительно выше и количество CD41⁺ клеток было значительно ниже по сравнению с условием 1 или 2. Таким образом, при условиях бессывороточной среды в присутствии ПВС, PI3Ka и TPOago, было обнаружено, что UM171 вызывает пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека и ингибирует их дифференцировку в предшественники мегакариоцитов и мегакариоциты (см. ФИГ. 15).

[0096] Эталонный пример 5. Эксперимент по трансплантации CD34+ клеток после культивирования.

CD34⁺ клетки человека, культивированные в течение 7 дней при каждом из условий 1-3, трансплантировали облученным мышам NOG, чтобы проверить приживление клеток. В частности, 1×10⁴ культивированных CD34⁺ клеток человека трансплантировали каждой мыши NOG, облученной дозой 1,5 Гр γ-лучей. Через двенадцать недель после трансплантации собирали периферическую кровь каждой мыши NOG, и анализировали клеточные компоненты в периферической крови, применяя проточный цитометр. Результаты представлены на ФИГ. 16. На ФИГ. 16 показано, что при условиях 1 и 2 скорости приживления HSC (гемопоэтических стволовых клеток) возрастали с 14,9% и 11,1%, когда трансплантировали CD34⁺ клетки до культивирования, до 66,6% и 54,9%, соответственно, когда трансплантировали CD34⁺ клетки после культивирования. При условии 3, скорость приживления HSC возрастала с 17%, когда трансплантировали CD34⁺ клетки до культивирования, до 67%, когда трансплантировали CD34⁺ клетки после культивирования.

[0097] Полученные результаты выявили, что активатор PI3K и агонист рецептора ТРО могут вызывать эффективную пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека при условиях бессывороточной среды в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС, и что указанные пролиферировавшие CD34⁺ клетки человека могут сохранять свои свойства HSC, и уровень приживления после трансплантации другим индивидам может быть улучшен. Кроме того, гемопоэтические стволовые клетки человека имеют тенденцию к пролиферации как CD34⁺ клетки, тогда как некоторые из них дифференцируются в мегакариоциты, когда их культивируют при указанных условиях в течение длительного периода, тем самым образуя мегакариоциты. Добавление UM171 к клеткам повышало скорость роста CD34⁺ клеток и ингибировало их дифференцировку в мегакариоциты.

[0098] Затем мононуклеарные клетки человека выделяли из свежей пуповинной крови человека. При условиях 1 и 3, полученные клетки (5×10⁵ клеток) культивировали, и определяли каждые из: количества всех клеток, количества CD34⁺ клеток, процента CD34⁺ клеток от всех клеток и жизнеспособности клеток на 7 день и 14 день после начала культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 17. На ФИГ. 17 показано, что при любых условиях, количество всех мононуклеарных клеток, полученных из пуповинной крови человека, уменьшалось при инкубации. С другой стороны, при условии 3, процент CD34⁺ клеток от всех клеток был заметно больше, чем при условии 1. Жизнеспособность клеток также была значительно выше при условии 3, чем при условии 1. Кроме того, выявили выраженное увеличение количества CD34⁺ клеток при условии 3, при этом количество клеток эффективно сохранялось при условии 1, тогда как не наблюдали увеличения количества клеток.

[0099] Пример 1. Анализ роста гемопоэтических стволовых клеток с применением культуральной среды без альбумина.

В данном примере исследовали рост гемопоэтических стволовых клеток мыши (KSL) и гемопоэтических стволовых клеток человека (CD34⁺CD38^-), применяя культуральную среду без альбумина. Культуральная среда представляла собой бессывороточную среду без альбумина, описанную в Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019, которая содержала каждый вид полимера вместо поливинилового спирта (ПВС).

[0100] В частности, для культивирования гемопоэтических стволовых клеток мыши, культуральная среда представляла собой среду Хама F12, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSX), 10 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 100 нг/мл тромбопоэтин мыши (mTPO) и 10 нг/мл фактора стволовых клеток мыши (mSCF).

Для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека, культуральная среда представляла собой среду IMDM, содержащую 1% инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSX), 25 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин, 100 нг/мл тромбопоэтина человека (hTPO) и 10 нг/мл фактор стволовых клеток человека (hSCF). В следующих примерах, если не указано иное, приведенную выше культуральную среду применяли для культивирования гемопоэтических стволовых клеток.

[0101] Полимер, который добавляли в среду, был таким, как описано далее: поливинилпирролидон K12, повидон K17, повидон, полиоксиэтилен, полиоксипропиленгликоль, привитый сополимер поливинилкапролактам-поливинилацетат-полиэтиленгликоль (далее обозначают «полимер А»). В частности, получали каждую культуральную среду, содержащую, в конечной концентрации 0,1% Коллифор BASF (товарный знак) Р188 bio (188 bio), Коллифор (товарный знак) Р 188 Geismar (188 Geismar), Солюплюс (Sol+), Коллифор (товарный знак) Р 407 Geismar (407 Geismar), Коллидон (товарный знак) 30 Origin USA (30 USA), Коллидон (товарный знак) 17 PF (17 PF), Коллидон (товарный знак) 25 (25), Коллидон (товарный знак) 90F (90F) или Коллидон (товарный знак) 12PF (12PF).

[0102] Фракцию клеток KSL из CD34^-CD150⁺ клеток костного мозга мыши использовали в качестве гемопоэтических стволовых клеток мыши. В частности, клетки костного мозга мыши выделяли из болыпеберцовой кости, бедренной кости и подвздошной кости таза и окрашивали антителом АРС-с-KIT. Осуществляли обогащение c-KIT^- клетками, применяя магнитные гранулы против АРС и колонку LS (Miltenyi Biotec). Обогащенные c-KIT клетки затем окрашивали коктейлем антител против линий дифференцировки (биотинилированных CD4, CD8, CD45R, TER119, LY-6G/LY-6C и CD127) перед окрашиванием антителом против CD34, антителом против cKIT, антителом против SCA1 и стрептавидин-APC/eFluor 780 в течение 90 мин. Популяции клеток затем очищали с помощью FACS Aria II (BD) путем сортировки напрямую в лунки, содержащие среду, при этом применяя йодид пропидия в качестве маркера, окрашивающего мертвые клетки.

[0103] Используемые гемопоэтические стволовые клетки человека представляли собой CD34⁺CD38^- клетки из костного мозга человека. В частности, приобретали доступные положительные по CD34 клетки костного мозга человека (Lonza 2С-101).

[0104] Гемопоэтические стволовые клетки мыши культивировали в каждой среде в течение одной недели, и подсчитывали количество клеток после культивирования.

[0105] Результаты представлены на ФИГ. 18. На ФИГ. 18 показано, что гемопоэтические стволовые клетки мыши хорошо пролиферировали в бессывороточной среде без альбумина, содержащей ПВС, но не в присутствии любого из других исследованных соединений вместо ПВС, и только в присутствии соединения А.

[0106] Солюплюс (товарный знак) представляет собой соединение со следующей структурой:

[Химическая формула 2]

где n равен 13, m равен 30 и 1 равен 57.

[0107] Стоит отметить, что, согласно Wilkinson et al., 2019, гемопоэтические стволовые клетки мыши не могли поддерживать долговременную пролиферацию в бессывороточной среде без альбумина, даже в присутствии SCF и ТРО. Тем не менее Wilkinson et al., 2019, показали на фигуре 2b, что добавление ПВС в среду позволяет гемопоэтическим стволовым клеткам мыши пролиферировать в течение длительного периода времени в бессывороточной среде без альбумина.

[0108] Это показало, что гемопоэтические стволовые клетки мыши хорошо пролиферировали в присутствии ПВС или полимера А, даже в бессывороточной среде без альбумина.

[0109] Гемопоэтические стволовые клетки мыши распределяли при плотности 50 клеток/лунку и культивировали в присутствии 0,1% ПВС или полимера А и SCF и ТРО. Результаты представлены на ФИГ. 19. На ФИГ. 19 показано, что гемопоэтические стволовые клетки мыши хорошо образовывали каждую колонию в присутствии ПВС или полимера А, даже в бессывороточной среде без альбумина. Это указало на то, что гемопоэтические стволовые клетки обладают способностью к митозу в присутствии ПВС или полимера А.

[0110] Процент положительных по CD201 клеток среди пролиферировавших клеток проверяли, применяя конъюгированное с щелочной фосфатазой антитело против CD201 мыши (eBio1560). Затем, как показано на ФИГ. 20, гемопоэтические стволовые клетки мыши, культивированные в присутствии полимера А, содержали больший процент положительных по CD201 клеток, чем в присутствии ПВС. CD201 представляет собой известный маркер гемопоэтических стволовых клеток, и высокий процент положительных по CD201 клеток позволяет предположить, что стволовость лучше сохранялась после пролиферации.

[0111] Кроме того, гемопоэтические стволовые клетки мыши культивировали в присутствии полимера А или ПВС в конечной концентрации 0,1% в течение 1 недели, а затем трансплантировали облученным мышам. Через четыре недели после трансплантации, анализировали периферическую кровь каждой облученной мыши, чтобы определить уровень химеризма клеток крови, происходящих из трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток. В результате, у гемопоэтических стволовых клеток, культивированных в присутствии полимера А, выявили уровень химеризма (уровень вклада), сопоставимый с таковым для гемопоэтических стволовых клеток, культивированных в ПВС. Это свидетельствует о том, что способность восстанавливать костный мозг у гемопоэтических стволовых клеток, культивированных в присутствии полимера А, была эквивалентна таковой у гемопоэтических стволовых клеток, культивированных в присутствии ПВС.

[0112] Пример 2. Различия в передаче сигналов между гемопоэтическими стволовыми клетками мыши и человека.

Анализировали сигнальные пути гемопоэтических стволовых клеток мыши и человека в присутствии SCF и ТРО.

[0113] Иммуноокрашивание фосфорилирования применяли, чтобы проанализировать степень фосфорилирования каждого фактора сигнального пути ниже SCF и ТРО в гемопоэтических стволовых клетках мыши или человека в присутствии 10 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) и 100 нг/мл тромбопоэтина (ТРО), в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Сначала детектировали, насколько сильно был фосфорилирован каждый фактор сигнального пути ниже SCF и ТРО, применяя антитело, специфическое к каждой форме фосфорилирования указанного фактора. В частности, применяли антитела против фосфорилирования типичных сигнальных молекул, таких как Akt, PI3K и Stat5, и приводили в контакт с клетками, стимулированными цитокинами, и проводили количественный анализ интенсивности флуоресценции каждого антитела, прореагировавшего с клетками, с помощью флуоресцентной микроскопии.

[0114] На ФИГ. 24 показано, что среди семи исследованных факторов, у нескольких факторов были обнаружены различные статусы фосфорилирования между гемопоэтическими стволовыми клетками мыши и человека. В том числе, для PI3K и Akt, наблюдали высокую потребность в фосфорилированных формах PI3K и Akt в гемопоэтических стволовых клетках мыши через 24 ч после добавления SCF и ТРО, тогда как в гемопоэтических стволовых клетках человека содержалось небольшое количество или не содержалось фосфорилированных форм, или их уровни были меньше, чем уровни фосфорилированных форм в гемопоэтических стволовых клетках мыши.

[0115] Затем гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в культуральной среде, дополненной 0,3 мкМ AKTa (Sigma-Aldrich, № продукта 123871) или 20 мкМ PI3Ka. Клетки подсчитывали через 3, 5 и 7 дней инкубации, и рассчитывали относительное количество клеток в каждый момент времени, причем количество клеток в первый день инкубации установили равным 1. В следующих примерах, 740Y-P (название поставщика: Tocris, № продукта 1983) использовали в качестве PI3K. На ФИГ. 25 показано, что у гемопоэтических стволовых клеток человека выявили выраженную пролиферацию в присутствии PI3Ka. Напротив, не наблюдали пролиферативного действия AKTa на гемопоэтические стволовые клетки человека в условиях этого эксперимента.

[0116] Затем культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека, чтобы исследовать, может ли PI3Ka полностью заменить SCF. Гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в течение 7 дней в указанной выше культуральной среде для гемопоэтических стволовых клеток человека с 20 мкМ PI3Ka (S10+PI3Ka20+T100) или в указанной выше культуральной среде с 20 мкМ PI3Ka, но без SCF (PI3Ka20+Т100). Затем определяли количество всех клеток и количество выделенных CD34⁺ клеток, полученных путем сортировки клеток с применением антитела против CD34. Результаты представлены на ФИГ. 26. На ФИГ. 26 показано, что при добавлении PI3Ka не наблюдали значимого различия в количестве всех клеток или CD34⁺ клеток с добавлением или без SCF.

[0117] Затем культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека, чтобы исследовать, можно ли заменить ТРО на агонист рецептора ТРО. Примеры известных агонистов рецептора ТРО включают бутизамид, элтромбопаг или аватромбопаг. Культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека в среде, содержащей 0,1 мкМ бутизамид, 3 мкг/мл элтромбопага или 3 мкМ аватромбопаг, в присутствии 0,1% рекомбинантного сывороточного альбумина человека (Albumin Biosciences) или в присутствии ПВС в указанной выше культуральной среде без ТРО. В этом эксперименте клетки Mp132D использовали в качестве гемопоэтических стволовых клеток человека. Результаты представлены на ФИГ. 27. На ФИГ. 27 показано, что, в присутствии альбумина, бутизамид, элтромбопаг или аватромбопаг были способны поддерживать пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие ТРО. Наоборот, в присутствии ПВС (в отсутствие альбумина) бутизамид оказывал выраженное способствующее пролиферации действие на гемопоэтические стволовые клетки человека в отсутствие ТРО, тогда как указанное действие было незначительным у аватромбопага и почти отсутствовало у элтромбопага.

[0118] Кроме того, приобретенные CD34⁺ клетки костного мозга человека (название поставщика: Lonza, № продукта 2С-101) или CD34⁺ клетки, выделенные с применением микрогранул из этой свежей пуповинной крови, использовали в экспериментах по культивированию. Эксперименты проводили в 24-луночных планшетах при плотности 0,2-1,0×10⁵ клеток на лунку, причем ТРО удаляли из культуральной среды для гемопоэтических стволовых клеток человека и заменяли на один из указанных выше агонистов рецептора ТРО (далее иногда обозначают «TPOago»). Определяли количество клеток на седьмой день культивирования относительно количества клеток в первый день культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 28. На ФИГ. 28 показано, что выявили значительную пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека только в присутствии бутизамида в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. В отсутствие альбумина и в присутствии ПВС, присутствие аватромбопага или элтромбопага вызывало гибель гемопоэтических стволовых клеток. Тем не менее в условиях in vivo эти агонисты рецептора ТРО являются безопасными соединениями, применяемыми для лечения пациентов с циррозом, которых лечат хирургическим путем, или пациентов с апластической анемией. Результаты этого Примера свидетельствуют о том, что некоторые агонисты рецептора ТРО могут быть цитотоксическими для гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. Это также позволяет предположить, что некоторые агонисты рецептора ТРО цитотоксичны для гемопоэтических стволовых клеток человека, и что применения каждого агониста, который не цитотоксичен для гемопоэтических стволовых клеток человека, достаточно для культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека.

[0119] Затем исследовали, можно ли заменить SCF и ТРО или нет на PI3Ka и агонист рецептора ТРО в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС. В следующих примерах в качестве агониста рецептора ТРО использовали бутизамид. Кроме того, приобретенные CD34⁺ клетки костного мозга человека (название поставщика: Lonza, № продукта 2С-101) или CD34⁺ клетки, выделенные с применением микрогранул из этой свежей пуповинной крови, как описано выше, использовали в экспериментах по культивированию. Сначала распределяли по 0,2-1,0×10⁵ клеток на лунку 24-луночного планшета и культивировали в среде с композицией, в которой SCF был заменен на 20 мкМ PI3Ka (PI3Ka20 мкМ+ТРО100), и в среде с композицией, в которой SCF был заменен на 20 мкМ PI3Ka и ТРО был заменен на 0,1 мкМ бутизамид (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), соответственно. Через 7 дней определяли количество всех клеток и определяли количество CD34⁺ клеток с помощью проточной цитометрии. После этого определяли скорость роста относительно таковой в начале инкубации. Результаты представлены на ФИГ. 29. ФИГ. 29 явно демонстрирует, что бутизамид может полностью заменить ТРО. Кроме того, CD34⁺ клетки сортировали до и после инкубации, применяя устройство для сортировки клеток, и 100 клеток высевали в Methocult Н4415 для анализа колониеобразования. Через две недели каждую колонию отбирали под микроскопом, получали образец цитоцентрифугирования и проводили окрашивание образца по Гимзе. Затем идентифицировали тип колонии под микроскопом. Подсчитывали количество колоний GEmM на 50 CD34⁺ клеток и определяли уровень увеличения количества колоний относительно такового перед культивированием. Затем было обнаружено, что бутизамид может полностью заменить ТРО в отношении возможности образования колоний GEmM.

[0120] Затем культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека в среде, содержащей 20 мкМ PI3Ka и/или 0,1 мкМ TPOago, в контексте культуральной среды без SCF или ТРО. На 7 день культивирования подсчитывали количество всех клеток и количество содержащихся в них CD34⁺ клеток с помощью проточной цитометрии, и определяли скорость роста относительно таковой в начале культивирования. Как показано на ФИГ. 30, обнаружили, что PI3Ka отдельно или бутизамид отдельно не вызывают увеличения количества клеток, но обнаружили, что присутствие как PI3Ka, так и TPOago вызывает выраженное увеличение количества клеток.

[0121] Кроме того, следующий этап состоял в определении того, какая популяция клеток более вероятно будет пролиферировать в среде, в которой SCF и ТРО заменили на PI3Ka и TPOago. Указанную свежую пуповинную кровь использовали для выделения CD34⁺ клеток путем применения микрогранул, как описано выше, и указанные клетки использовали в экспериментах по культивированию. Клетки затем фракционировали с помощью устройства для сортировки клеток, применяя антитело против CD34-PE-Cy7 (название поставщика BD Biosciences, № продукта 348791), антитело против CD38-V450 (название поставщика BD Biosciences, №продукта 646851), антитело против CD133-PE (название поставщика Miltenyi Biotec, № продукта 130-080-801), антитело против CD45RA-APC (название поставщика BioLegend, № продукта 304112) и антитело против CD49f-PE (название поставщика BioLegend, № продукта 313611). Для каждой из фракции CD34⁺, фракции CD34⁺CD38^-CD133⁺ или фракции CD34⁺CD38^-CD45RACD49f⁺, указанные молекулы были описаны как маркеры для очистки гемопоэтических стволовых клеток человека, происходящих из пуповинной крови человека, подсчитывали количество всех клеток и количество содержащихся в них CD34⁺ клеток с помощью проточной цитометрии на 7 день после начала культивирования, и определяли скорость роста относительно таковой в начале культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 31. На ФИГ. 31 показано, что наблюдали значимую пролиферацию клеток во всех фракциях клеток, но во фракции CD34⁺CD38^-CD133⁺ и фракции CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD49f⁺, особенно во фракции CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD49f⁺ наблюдали выраженный рост клеток.

[0122] Пример 3. Эксперимент по долговременному культивированию гемопоэтических стволовых клеток человека.

Культивировали гемопоэтические стволовые клетки человека в указанной выше культуральной среде для гемопоэтических стволовых клеток человека, указанная среда содержала 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago вместо SCF и ТРО. Количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток определяли, как описано выше, на 7 и 14 дни после начала культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 32. На ФИГ. 32 показано, что количество всех клеток возрастало с увеличением количества дней инкубации, тогда как количество CD34+ клеток снижалось на 14 день по сравнению с днем 7.

[0123] Когда для наблюдения за культивированными клетками использовали оптический микроскоп, на 14 день обнаружили гигантские клетки. Для того чтобы проверить вероятность того, что эти гигантские клетки представляли собой мегакариоциты или предшественники мегакариоцитов, указанные клетки фракционировали с помощью проточной цитометрии, применяя антитело против CD41a-FITC (название поставщика BD Pharmingen, № продукта 555466) и антитело против CD42b (название поставщика BD Pharmingen, № продукта 555473). Как продемонстрировано на ФИГ. 33, результаты показали, что большая часть клеток на 14 день после начала культивирования представляли собой CD41a⁺CD42b⁺ клетки. Тем не менее на ФИГ. 33 показано, что CD34⁺CD38^- клетки все еще пролиферировали при данных условиях.

[0124] Кроме того, CD34⁺ клетки получали из культуры на 14 день после начала культивирования, и 100 клеток высевали в Methocult Н4415 для анализа колониеобразования. Через 2 недели собирали колонии и получали образцы цитоцентрифугирования. Затем проводили окрашивание образцов по Гимзе и определяли типы колоний под микроскопом. Результаты представлены на ФИГ. 34. В отношении типов колоний, G означает колонии, содержащие «гранулоциты», Е - «эритробласты», m - «макрофаги» и М - «мегакариоциты». На ФИГ. 34 показано, что большинство колоний клеток содержали мегакариоциты.

[0125] Пример 4. Дополнительное исследование условий, подходящих для долговременного культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека.

Предприняли попытку долговременного культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека в присутствии соединений, способных обеспечивать рост гемопоэтических стволовых клеток человека.

[0126] Получали описанную выше культуральную среду для гемопоэтических стволовых клеток человека, указанная среда содержала 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago вместо SCF и ТРО (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), или указанная среда содержала SR-1 (500 нМ) и/или UM171 (35 нМ) (+SR-1,+UM171 или +SR-1+UM171). Кроме того, приобретенные CD34⁺ клетки костного мозга человека (название поставщика: Lonza, № продукта 2С-101) или CD34⁺ клетки, выделенные с применением микрогранул из этой свежей пуповинной крови, как описано выше, использовали в экспериментах по культивированию. Сначала, распределяли по 0,2-1,0×10⁵ клеток на лунку 24-луночного планшета, и культивировали CD34⁺ клетки в полученной среде. Количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток определяли, как описано выше, на 14 день после начала культивирования, и определяли скорость роста относительно таковой в начале культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 35. На ФИГ. 35 показано, что количество всех клеток и количество CD34⁺ клеток были выше в культуральной среде, дополнительно содержащей UM171, и скорость роста CD34⁺ клеток была значительно выше в среде, содержащей UM171, чем в среде без UM171. Наоборот, SR-1 вызывал гибель клеток при указанных условиях эксперимента.

[0127] Кроме того, определяли скорость роста всех клеток или CD34⁺ клеток путем культивирования CD34⁺ клеток при трех условиях: условие 1: культивирование в течение 14 дней в культуральной среде для гемопоэтических стволовых клеток человека, описанной выше, указанная среда содержала 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago вместо SCF и ТРО (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), условие 2: на 7 день или позже, культивирование в среде без бутизамида (День7 - без Бути), и условие 3: культивирование в течение 14 дней в среде (PI3Ka20 мкМ+TPOago0,1 мкМ), дополнительно содержащей UM171 (+UM171). Количество CD41⁺ клеток определяли, применяя проточный цитометр. Результаты представлены на ФИГ. 36. На ФИГ. 36 показано, что количество CD34⁺ клеток было выше и количество CD41⁺ клеток было ниже при условии 2, в котором клетки культивировали в среде без бутизамида, на 7 день или позже после начала культивирования, по сравнению с условием 1. На ФИГ. 36 показано, что при условии 3, в котором клетки культивировали в среде, дополнительно содержащей UM171, скорость роста CD34⁺ клеток была значительно выше и количество CD41⁺ клеток было значительно ниже по сравнению с условием 1 или 2. Таким образом, было обнаружено, что при условиях бессывороточной среды в присутствии ПВС, PI3Ka и TPOago, UM171 вызывает пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека и ингибирует их дифференцировку в предшественники мегакариоцитов и мегакариоциты (см. ФИГ. 37).

[0128] Пример 5. Эксперимент по трансплантации CD34⁺ клеток после культивирования. CD34⁺ клетки человека, культивированные в течение 7 дней при каждом из условий 1-3, трансплантировали облученным мышам NOG, чтобы проверить приживление клеток. В частности, 1×10⁴ культивированных CD34⁺ клеток человека трансплантировали каждой мыши NOG, облученной дозой 1,5 Гр γ-лучей. Через двенадцать недель после трансплантации собирали периферическую кровь каждой мыши NOG и анализировали клеточные компоненты в периферической крови, применяя проточный цитометр. Результаты представлены на ФИГ. 38. На ФИГ. 38 показано, что при условиях 1 и 2 скорости приживления HSC (гемопоэтических стволовых клеток) возрастали с 14,9% и 11,1%, когда трансплантировали CD34⁺ клетки до культивирования, до 66,6% и 54,9%, соответственно, когда трансплантировали CD34⁺ клетки после культивирования. При условии 3, скорость приживления HSC возрастала с 17%, когда трансплантировали CD34⁺ клетки до культивирования, до 67%, когда трансплантировали CD34⁺ клетки после культивирования.

[0129] Полученные результаты выявили, что активатор PI3K и агонист рецептора ТРО могут вызывать эффективную пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток человека при условиях бессывороточной среды в отсутствие альбумина и в присутствии ПВС, и что указанные пролиферировавшие CD34⁺ клетки человека могут сохранять свои свойства HSC, и уровень приживления после трансплантации другим индивидам может быть улучшен. Кроме того, гемопоэтические стволовые клетки человека имеют тенденцию к пролиферации как CD34⁺ клетки, тогда как некоторые из них дифференцируются в мегакариоциты, когда их культивируют при указанных условиях в течение длительного периода, тем самым продуцируя мегакариоциты. Добавление UM171 к клеткам повышало скорость роста CD34⁺ клеток и ингибировало их дифференцировку в мегакариоциты.

[0130] Затем мононуклеарные клетки человека выделяли из свежей пуповинной крови человека. При условиях 1 и 3, культивировали полученные клетки (5×10⁵ клеток) и определяли каждые из: количества всех клеток, количества CD34⁺ клеток, процента CD34⁺ клеток от всех клеток и жизнеспособности клеток на 7 день и 14 день после начала культивирования. Результаты представлены на ФИГ. 39. На ФИГ. 39 показано, что при любых условиях количество всех мононуклеарных клеток, полученных из пуповинной крови человека, уменьшалось при инкубации. С другой стороны, при условии 3, процент CD34⁺ клеток от всех клеток был заметно больше, чем при условии 1. Жизнеспособность клеток также была значительно выше при условии 3, чем при условии 1. Кроме того, выявили выраженное увеличение количества CD34⁺ клеток при условии 3, при этом количество клеток эффективно сохранялось при условии 1, при этом не наблюдали увеличения количества клеток.

[0131] Пример 6. Эксперимент по культивированию гемопоэтических стволовых клеток человека в присутствии полимера А.

В описанных выше Примерах обнаружили, что гемопоэтическим стволовым клеткам человека, в отличие от гемопоэтических стволовых клеток мыши, требуется активация пути PI3K, и что ТРО можно заменить на бутизамид, агонист рецептора ТРО. Также было обнаружено, что гемопоэтические стволовые клетки человека можно культивировать в отсутствие UM171, когда их не культивируют в течение длительного периода времени, но что дифференцировку в мегакариоцитарные линии дифференцировки можно ингибировать путем культивирования гемопоэтических стволовых клеток человека в присутствии UM171, когда их культивируют в течение длительного периода времени.

[0132] В экспериментах в данном примере гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в присутствии полимера А, активатора PI3K, агониста рецептора ТРО и UM171, тогда как ПВС был заменен на полимер А в указанных выше экспериментах. В качестве контрольного эксперимента, гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в присутствии ПВС, активатора PI3K, агониста рецептора ТРО и UM171. PI3Ka использовали в качестве активатора PI3K, а бутизамид - в качестве агониста рецептора ТРО, и концентрации были такими, как в Примерах выше.

[0133] Результаты представлены на ФИГ. 22. Затем, как показано на ФИГ. 22, среди гемопоэтических стволовых клеток человека, культивированных в присутствии полимера А вместо ПВС, был выше процент положительных по CD34 клеток. Кроме того, процент положительных по CD34 клеток был выше в присутствии полимера А, чем в присутствии ПВС. Это позволило предположить, что гемопоэтические стволовые клетки человека хорошо пролиферировали в присутствии полимера А и при условиях, в которых активировался путь PI3K (и в отсутствие SCF). Полученные результаты также позволили предположить, что гемопоэтические стволовые клетки человека могут хорошо пролиферировать даже когда ТРО заменяют на агонист рецептора ТРО при этих условиях. Также было обнаружено, что гемопоэтические стволовые клетки человека могут хорошо пролиферировать в присутствии UM171.

[0134] Кроме того, наблюдали изменения количества клеток с течением времени. В этом эксперименте гемопоэтические стволовые клетки человека культивировали в течение 3 недель, применяя культуральную среду, дополненную набором для размножения Т-клеток (Т Cell Expansion Kit, Miltenyi Biotec) и IL-2 человека (Peprotech). Результаты представлены на ФИГ. 23. На ФИГ. 23 показано, что гемопоэтические стволовые клетки человека равно пролиферировали в присутствии ПВС или в присутствии полимера А.

[0135] Пример 7. Для культивирования положительных по CD3 клеток человека.

Положительные по CD3 клетки человека стимулировали антителами против CD28 и против CD3, применяя набор Т Cell Activation/Expansion Kit, human (Miltenyi Biotec), при обычных условиях и культивировали в основной среде без альбумина и без цитокинов (среда IMDM, содержащая 1% ITSX и 1% пенициллин), содержащей 0,1% ПВС или 0,1% Солюплюс (товарный знак), в течение 6 недель. Исходное количество клеток составляло 1000 клеток. Результаты представлены на ФИГ. 40.

[0136] Как показано на ФИГ. 40, продемонстрировали, что положительные по CD3 клетки (преимущественно Т-клетки) хорошо пролиферировали в присутствии любого из Солюплюс или ПВС. Это продемонстрировало, что культуральную среду без альбумина можно применять для поддержания и пролиферации Т-клеток человека.

[0137] Пример 8. Дифференцировка положительных по CD34 клеток человека в гемопоэтические клетки.

Положительные по CD34 клетки человека (гемопоэтические стволовые клетки) культивировали в основной среде без альбумина, содержащей ПВС или Солюплюс (товарный знак). Исходное количество клеток составляло 1000 клеток. Гемопоэтические стволовые клетки дифференцировали в гемопоэтические клетки путем добавления в среду коктейля цитокинов. Культивирование осуществляли в течение 10 дней. Результаты представлены на ФИГ. 41.

[0138] На панели А ФИГ. 41 показано, что количество положительных по CD34 клеток, культивированных в указанной культуральной среде, эффективно повышалось в присутствии любого из Солюплюс или ПВС. На панели В ФИГ. 41 показано, что клетки в культуральной среде, полученные путем культивирования в присутствии Солюплюс, содержали мегакариоциты, эритробласты, нейтрофилы и макрофаги. Результаты продемонстрировали, что были получены почти все клетки линий клеток крови, и что каждая из них пролиферировала, указывая на то, что клетки крови человека могут хорошо размножаться, поддерживаться и дифференцироваться в присутствии вспомогательного вещества, такого как ПВС или Солюплюс, даже в среде без альбумина.

[0139] Пример 9. Для культивирования клеток хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ).

Каждый из образцов клеток костного мозга из пациентов с ХМЛ (хроническим миелоидным лейкозом) культивировали в течение одной недели в условиях культивирования без альбумина и без цитокинов. Используемая культуральная среда представляла собой основную среду, содержащую 0,1% ПВС, 20 мкМ PI3Ka и 0,1 мкМ TPOago. Культивирование осуществляли в присутствии или в отсутствие ингибитора (иматиниба (ИМ)) Bcr-Abl - гена, ответственного за ХМЛ. Результаты представлены на ФИГ. 42.

[0140] Как показано на ФИГ. 42, результаты продемонстрировали 0,5% пролиферации клеток в отсутствие ИМ по сравнению с количеством всех клеток перед культивированием. В частности, наблюдали более чем 30-кратное размножение/поддержание положительных по CD34 клеток, фракции стволовых клеток лейкоза, то есть, более чем 6-кратное размножение/поддержание в абсолютном количестве клеток. Напротив, не наблюдали значимого размножения клеток в присутствии ИМ, указывая на то, что клетки, пролиферирующие в ИМ+, представляли собой лейкемические стволовые клетки ХМЛ.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ культивирования клеток человека, включающий культивирование клеток человека в культуральной среде, причем указанная культуральная среда представляет собой среду без сывороточного альбумина и содержит вспомогательное вещество в эффективном количестве, где указанное вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из поливинилового спирта и модифицированного полиалкиленгликоля, и способ культивирования клеток человека, включающий культивирование клеток человека в культуральной среде, причем указанная культуральная среда содержит полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, в эффективном количестве. Также раскрыты композиции для пролиферации и культивирования клеток человека, содержащие полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата. Изобретение используется для культивирования клеток крови человека. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 42 ил., 9 пр.

1. Способ культивирования клеток человека, включающий

культивирование клеток человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда представляет собой среду без сывороточного альбумина и содержит вспомогательное вещество в эффективном количестве, где указанное вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из поливинилового спирта и модифицированного полиалкиленгликоля, и дополнительно содержит

(1) активатор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из тромбопоэтина (TPO) и агонистов рецептора TPO;

(2) агонист рецептора TPO и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF) и активаторов PI3K; или

(3) активатор PI3K и агонист рецептора TPO, так что

указанное культивирование позволяет увеличить или поддерживать количество гемопоэтических стволовых клеток человека или клеток крови человека, и

при этом указанные клетки человека представляют собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток крови человека.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные клетки человека представляют собой клетки крови, отличные от гемопоэтических стволовых клеток.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанное вспомогательное вещество представляет собой поливиниловый спирт.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное вспомогательное вещество представляет собой модифицированный полиалкиленгликоль.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный модифицированный полиалкиленгликоль представляет собой полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный модифицированный полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата.

7. Способ культивирования клеток человека, включающий

культивирование клеток человека в культуральной среде, причем

указанная культуральная среда содержит полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, в эффективном количестве, и

при этом указанные клетки человека представляют собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток крови человека.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что получают повышенное количество указанных клеток человека.

9. Способ по п. 7 или 8, отличающийся тем, что указанные клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека.

10. Композиция культуральной среды для культивирования клеток человека, содержащая полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, в эффективном количестве,

при этом указанные клетки человека представляют собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток крови человека.

11. Композиция для пролиферации клеток крови, содержащая клетки человека и полиалкиленгликоль, модифицированный сополимером, содержащим блок поливинилкапролактама и блок поливинилацетата, в эффективном количестве,

при этом указанные клетки человека представляют собой клетки, выбранные из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток крови человека.

12. Композиция по п. 10 или 11, отличающаяся тем, что указанные клетки человека представляют собой гемопоэтические стволовые клетки человека.